Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung für die automatisierte Chromo- phor-unterstützte Laser/Licht-Inaktivierung (CALI) gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1 sowie auf ein Verfahren zur Identifikation der Funktion biologischer Moleküle mittels Chromophor-unterstützter Licht-Inaktivierung.

Im Stand der Technik ist die Chromophor-unterstützte Licht-Inaktivierung auf der Basis eines Lasers als Lichtquelle bekannt geworden. Die Chromophor- unterstützte Laser-Inaktivierung wurde erstmalig in Jay, D. G., Selective Destruc- tion of Protein Function By Chromophore-Assisted Laser Inactivation, Procee- dings of National Academy of Science, USA 85 (15) : 5454-8, beschrieben. Diese bekannte Technik kann selektiv zur zeitlich und räumlich auflösenden Inaktivie- rung von Proteinen eingesetzt werden. Mit Hilfe dieser Technik wird dabei ein Farbstoff, welcher normalerweise das Chromophor Malachitgrün (MG) ist, che- misch an einen Antikörper gekoppelt, welcher Spezifität für ein Zielmolekül be- sitzt. Nach erfolgter Bindung des MG-Antikörpers wird der Komplex mit gepul- stem, hochenergetischem Laserlicht beschossen. Dies führt lokal über das MG zur Bildung von reaktiven, kurzlebigen (10-"s) Hydroxylradikalen, welche das Ziel- molekül modifizieren und dadurch zu dessen Inaktivierung führen können. Dies ist beschrieben in Liao, J. C., et al., Chormophore-Assisted Laser Inactivation of Proteins Is Mediated by the Photogeneration of Free Radicals, in Proceedings of the National Academy of Science, USA 91 (7) : 2659-63. In jüngster Zeit sind für die Chromophor-unterstützte Laser-Inaktivierung außer MG auch der Fluores-

zenzfarbstoff Fluorescein (FITC) und ein Laser mit kontinuierlicher Welle, d. h. ein kontinuierlicher Laser, erfolgreich eingesetzt worden. Dies ist beschrieben in Surrey, T. et al., Chormophore-Assisted Light Inactivation and Self-Organiszation of Microtubules And Motors, Proceedings of the National Academy of Science, USA 95 : 4293-8. Dabei zeigte sich, daß FITC im Vergleich zu MG potenter ist und schneller zur Zielmolekül-Inaktivierung führt. Dabei zeigte sich auch, daß bei Verwendung von FITC auch deutlich weniger leistungsstarke kontinuierliche La- ser zu einem vergleichbaren Effekt erforderlich waren wie wesentlich leistungs- stärkere gepulste oder kontinuierliche Laser bei Verwendung von MG. Daraus ist ersichtlich, daß CALI noch breite Entwicklungsspielräume bietet und damit ver- besserungsfähig und verbesserungswürdig ist. Unter dem Begriff Chromophore werden im Sinne dieser Anmeldung auch Fluorophore verstanden.

Zum Beispiel sind eine ganze Reihe weiterer Farbstoffe CALI-tauglich oder kön- nen sich sogar den bisher benutzten Farbstoffen als überlegen zeigen.

Des weiteren wurde der gesamte CALI-Vorgang bisher nahezu ausschließlich manuell ausgeführt, wodurch der Durchsatz gering war, eine Standardisierungs- möglichkeit außerordentlich begrenzt war, menschliche Fehlerquellen einge- schlossen waren sowie Gefahren für den Experimentator bestanden.

Des weiteren kam CALI überwiegend in seiner Mikrovariante für die Inaktivie- rung von Zielmolekülen auf Einzelzellniveau mittels eines mikroskopisch fokus- sierten Laserstrahls zum Einsatz. Um jedoch die vollen Möglichkeiten der Ma- krovariante von CALI beispielsweise für die Protein-Inaktivierung in massiven Screening-Ansätzen ausschöpfen zu können, ist es wünschenswert, den gesamten Vorgang zu automatisieren, zu standardisieren und kostengünstig zu gestalten.

Im einzelnen ist in dem zitierten Artikel von Jay et al. sowie bei Lindan, K. G. et al., Spacial Specificity of Chromophore-Assisted Laser Inactivation of Protein Function, in Biophys. J. 61 (4) : 956-62, die Verwendung eines Farbstofflasers in

Form eines Quanta Ray DCR3 (z. B. von Spectra Physics Inc., Mountain View, CA) Nd : YAG (Neodynium-Yttrium-Aluminium Garnet), ein gepulster Infrarotla- ser mit 10 Hz, 8,5 nm Pulslänge und 1064 Nanometer Wellenlänge, dargestellt, um mit dessen zweiter harmonischer Wellenlänge (532 nm Wellenlänge) einen nachgeschalteten Farbstofflaser (Quanta Ray PDL2, von Spectra Physics) zu be- treiben, welcher den zirkulierenden, fluoreszierenden Laserfarbstoff DCM (Exci- ton Chemical CO., Dayton, OH) enthielt. Das generierte, gepulste Laserlicht von 620 nm liegt in der Nähe des Absorptionsmaximums von Malachitgrün. Dieser Strahl wurde mittels eines Rechtwinkelprismas durch Totalreflexion in die Verti- kale umgelenkt und durch eine Konvexlinse auf den gewünschten Durchmesser von ca. 2 mm fokussiert. Die Ausgabeenergie des Laserstrahls mit 620 nm wurde in CALI-Experimenten bei 10 bis 15 mJ/Puls mit einer Pulsfrequenz von 10 Hz festgelegt. Dies entsprach einer durchschnittlichen Spitzenleistungsdichte pro Puls von 37 bis 57 MW/cm2 und einer durchschnittlichen Laserausgangsleistung von ca. 80 bis 100 mW. Es wurde ein molares Verhältnis von ca. 20 : 1 für MG- gekoppelte Antikörper (100 ug/ml) zu ß-Galaktosidase-Zielmolekül (5,5 gg/ml) eingesetzt. Das Kopplungsverhältnis für den Antikörper betrug ca. 6,5 MG Mole- küle pro Antikörper. Die halbmaximale Inaktivierungszeit von ß-Galaktosidase betrug unter diesen Bedingungen ca. 150 s.

Des weiteren ist in dem oben beschriebenen Artikel von Surrey et al. beschrieben, daß ein Argon-gepumpter einstellbarer (justierbarer) Farbstofflaser mit kontinu- ierlicher Welle (coherent 599 standing wave dye laser with rhodamine 6G, Co- herent Radiation, Palo Alto, CA) für CALI Malachitgrün benutzt wurde. Die er- zeugten Wellenlängen betrugen 620 nm und 488 nm, wobei die Wellenlänge von 488 nm im Bereich des zweiten Absorptionsmaximum von MG liegt, bei einer Leistung von 225 mW. Eine konstante Leistung von 7,2 W/cm'wurde zur Inakti- vierung von ß-Galaktosidase in vitro benutzt. Es wurde ein molares Verhältnis von ca. 20 : 1 für MG-gekoppelten Antikörper (200 llg/ml) zu ß-Galaktosidase- Zielmolekül (10 pg/ml) eingesetzt. Das Kopplungsverhältnis für den Antikörper betrug ca. 2,8 MG-Moleküle pro Antikörper. Die halbmaximale Inaktivierungszeit

von ß-Galaktosidase betrug unter diesen Bedingungen 8,5 s bei einer Wellenlänge von 620 nm und 13 s bei einer Wellenlänge von 488 nm. Ein schwächerer Argon- Ionenlaser mit einer kontinuierlichen Welle einer Wellenlänge von 488 nm und einer konstanten Leistung von 2 mW wurde für CALI mit FITC verwendet. Dies entsprach einer konstanten Leistung von 0,065 W/cm2. Es wurde ein molares Verhältnis von ca. 20 : 1 fiir MG-gekoppelten Antikörper (10 pg/ml) zu ß- Galaktosidase-Zielmolekül (5,5 ug/ml) eingesetzt. Das Kopplungsverhältnis für den Antikörper betrug ca. 2,3 FITC-Moleküle pro Antikörper. Die halbmaximale Inaktivierungszeit von ß-Galaktosidase betrug unter diesen Bedingungen 18 s.

Des weiteren ist in Jean, B. et al., Selective Laser-Induced Inactivation of Proteins (SLIP) by Labelling with Chromophores, 1992, Med. & Biol. Eng. & Comput., 30, CE17-CE20, beschrieben, daß ein Argon-gepumpter einstellbarer (justierba- rer) Farbstofflaser mit einer kontinuierlichen Welle (Meditech Dye Laser With Rhodamine 6G) für SLIP (Selective Laser-Induced Inactivation of Proteins) mit FITC bei einer Wellenlänge von 488 nm benutzt wurde. Die Proben wurden mit einer Leistung von 3 W bestrahlt. Im Falle von SLIP wurde der Farbstoff direkt an das zu inaktivierende Molekül gekoppelt (Antikörper und Enzym Meerrettich- Peroxidase). Die Kopplungseffizienzen lagen zwischen 1 : 1 und 2 : 1. Es wurden 8 bis 10 Pulse von 1 s Dauer gewählt. Dies führte zu einer halbmaximalen Inaktivie- rung von Meerrettich-Peroxidase bei einer Energiedichte von ca. 7500 J/cm2. Die- ser Wert erscheint ungewöhnlich hoch, da zum Vergleich etwa während 150 s halbmaximaler Inaktivierungszeit mit einem gepulsten Hochleistungs-Nd : YAG- Laser lediglich ca. 480 J/cm2 auf die Probe einwirken.

Im Hinblick auf die bekannten Gerätesysteme liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein flexibles, kostengünstiges, höchst zuverlässiges auto- matisierbares CALI-System/-Verfahren zu schaffen, welches eine hohe Durch- satzleistung hinsichtlich der zu inaktivierenden Proben ermöglicht und insbeson- dere flexibel im Hinblick auf die eingesetzte Lichtquelle ist.

Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 bzw. 10 und durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 27 ge- löst.

Zweckmäßige Weiterbildungen sind in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen definiert.

Die Vorrichtung für die automatisierte Chromophor-unterstützte Laser-Inakti- vierung gemäß der Erfindung weist eine Laservorrichtung zur Bestrahlung von Proben mittels eines Laserstrahls zur Identifizierung der Funktion von biologi- schen Molekülen, eine Steuereinrichtung zur Steuerung von beispielsweise me- chanischen, optischen und thermischen Parametern der Vorrichtung und zumin- dest einen Probenhalter auf. Mindestens ein Antrieb ist vorgesehen, um eine Re- lativbewegung zwischen dem aus der Laservorrichtung austretenden Laserstrahl und dem Probenhalter in zumindest zwei, vorzugsweise senkrecht zueinander ste- henden, Richtungen zu erzeugen. Mittels dieser Relativbewegung werden die Proben mit dem Laserstrahl bestrahlt bzw. sind über diesen Laserstrahl abtastbar. Erfindungsgemäß ist der Laserstrahl mittels einer Strahlmodifikations-vorrichtung in seiner Form und/oder Intensität an die Probengröße und/oder die Probenart und/oder die Probenanzahl anpaßbar. Um diese Anpassung zu realisieren, ist es möglich, als Strahlmodifikationseinrichtung eine Strahlaufweitvorrichtung (beam expander) und/oder einen Strahlteiler (beam splitter) einzusetzen. Mit dem Strahlteiler wird der Lichtstrahl so aufgeteilt, daß im Interesse eines hohen Durch- satzes zu behandelnder Proben mehrere Proben gleichzeitig bestrahlbar sind. Die Steuereinrichtung ist gemäß der Erfindung so ausgebildet, daß der Antrieb für die Relativbewesung zwischen dem aus der Laservorrichtung austretenden Laser- strahl und dem Probenhalter und der Antrieb fur die Strahlaufweitvorrichtung bzw. den Strahlteiler mittels dieser Steuereinrichtung zentral mittels einer System- software steuerbar sind.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird der automatisierte CALI-Vorgang hinsichtlich der in einer Zeiteinheit zu behandelnden Proben erheblich beschleu- nigt und optimiert, werden seine Kosten beträchtlich reduziert und wird gleich- zeitig seine Genauigkeit der Einstellung im Hinblick auf das Ausschließen menschlicher Fehlerquellen und damit die Sicherheit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöht. Durch das Verwenden einer einzigen Software zur Steuerung zumindest der wesentlichen Teile der CALI-Vorrichtung wird eine erhebliche Vereinfachung in der Funktion und im Betreiben der Vorrichtung erreicht.

Durch Verwenden einer Strahlaufweitvorrichtung ist es möglich, die Intensität und den Querschnitt des Lichtstrahls nicht nur an die jeweilige Probe anzupassen, sondern auch an unterschiedliche Abmessungen der Kavitäten für die einzelnen Proben in den Probenhaltern. Damit wird eine hohe Flexibilität des Einsatzes für unterschiedlichste Probengrößen und unterschiedlichste Untersuchungszwecke erreicht.

Bei Verwendung eines Stahlteilers bzw. bei Modifikation der Strahlaufweit- vorrichtung derart, daß der Lichtstrahl in mehrere einzelne Lichtstrahlen aufgeteilt wird, wie es bei Verwendung eines ebenfalls an sich bekannten Strahlteilers der Fall ist, ist es möglich, mehrere Proben parallel der Protein-Inaktivierung auszu- setzen, wodurch der Durchsatz der erfindungsgemäßen CALI-Vorrichtung weiter erhöht werden kann.

Vorzugsweise weitet die Strahlaufweitvorrichtung den Laserstrahl im Querschnitt eindimensional, insbesondere als gerade Linie, oder zweidimensional als Fläche unterschiedlicher Konfiguration auf, wobei die Querschnittsfläche des Laser- strahls vorzugsweise rechteckig, kreisförmig oder ellipsenförmig ist. Diese Flexi- bilität im Querschnitt dient dem Einsatz für unterschiedliche, im Probenhalter vorgesehene, die Probe aufnehmende Kavitäten.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Strahlaufweitvorrichtung so aus- gebildet, daß zumindest zwei Proben gleichzeitig bestrahlbar sind, wobei dies entweder durch einen entsprechend aufgeweiteten Laserstrahl oder durch Auftei- lung des Laserstrahls nach Verlassen der Strahlaufweitvorrichtung in zwei sepa- rate Strahlen möglich ist. Dabei ist jedoch zu beachten, daß die Anzahl der die Strahlaufweitvorrichtung bzw. den Strahlteiler verlassenden Strahlen von der Lei- stung des Lasers abhängig ist, wobei höhere erforderliche Leistungen des einge- setzten Lasers mit höheren Kosten der Vorrichtung verbunden sind.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist die Steuereinrichtung so ausgebil- det, daß sie den die Laservorrichtung verlassenden Strahl in seinem Querschnitt, seiner Intensität, in der Bestrahlungsdauer und der Abmessung in Abhängigkeit von der Bewegung des Probenhalters und der Anzahl und/oder der Art der Proben variiert. Die Abstimmung zwischen Parametern des Laserstrahls und Relativbe- wegung zwischen Laserstrahl und Probenhalter dient ebenfalls der Erhöhung des Durchsatzes der CALI-Vorrichtung sowie der Erhöhung der Genauigkeit und Re- produzierbarkeit der Ergebnisse aufgrund eines exakten Timings.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Lichtquellenvorrichtung eine Laservorrichtung, und zwar vorzugsweise ein gepulster Laser, insbesondere ein Nd : YAG-Infrarot-Laser. Zum Betreiben eines optischen parametrischen Oszilla- tors (Infinity-XPO, Coherent Radiation) zur Wellenlängenänderung wird die dritte harmonische Wellenlänge des gepulsten Infrarot-Lasers verwendet.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Laservorrichtung ein konti- nuierlicher Laser, und zwar insbesondere ein Argon-gepumpter justierbarer Farb- stofflaser. Es ist jedoch auch möglich, einen Argon-Ionen-Gas-Laser oder einen Helium-Neon-Laser zu verwenden.

Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung erfolgt die Bestrah- lung von Proben zur Identifikation der Funktion von biologischen Molekülen

mittels aus einer Lichtquellenvorrichtung ausgesendeten Lichtes auf der Basis einer automatisierten Chromophor-unterstützten Licht-Inaktivierung (CALI = Chromophore-Assisted Light Inactivation). Die Vorrichtung weist eine Steuerein- richtung zur zentralen Steuerung aller zu steuernden Elemente/Baugruppen der Vorrichtung und zumindest einen Probehalter auf. Erfindungsgemäß ist die Licht- quellenvorrichtung ein Beleuchtungskörper, bei welchem zumindest ein Teil der Wellenlänge seines ausgesendeten Lichts im sichtbaren Bereich liegt. Als Be- leuchtungskörper wird vorzugsweise eine Glühlampe, Quarzlampe, Leuchtstoff röhre oder Leuchtdiode oder eine Kombination aus diesen eingesetzt, wobei der Beleuchtungskörper insbesondere eine Weißlichtquelle ist. Das bedeutet, daß bei- spielsweise eine handelsübliche Glühlampe unter Verwendung geeigneter Chro- mophore in der Lage ist, die ansonsten gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel erforderliche Inaktivierung biologischer Moleküle zu erzielen, ohne daß eine La- servorrichtung Anwendung finden muß.

Vorzugsweise ist das durch die Lichtquellenvorrichtung ausgesendete Licht mit- tels einer Strahlmodifikationseinrichtung in seiner davon ausgesandten Form und/oder Intensität an verschiedene Parameter der Proben anpaßbar. Insbesondere sind dies die Probengröße, die Probenart bzw. die Probenanzahl, wobei das ausge- sendete Licht an einen, mehrere oder alle aufgeführten Probenparameter anpaßbar ist. Damit wird die Flexibilität der erfindungsgemäßen Vorrichtung enorm erhöht, weil unterschiedlichste Proben mit hoher Durchsatzleistung, großer Zuverlässig- keit und sehr großer Bandbreite untersuchbar sind.

Des weiteren ist vorzugsweise gemäß einer Weiterbildung der Erfindung eine Steuereinrichtung vorgesehen, mittels welcher ein Antrieb zur Bewegung des Probenhalters und die Strahlmodifikationseinrichtung zentral über eine System- software steuerbar sind. Die Steuereinrichtung ist dafür vorgesehen, mittels der zentralen Systemsoftware sämtliche steuerbaren Komponenten der erfindungsge- mäßen Vorrichtung zu steuern. Vorzugsweise weist die Strahlmodifikationsein-

richtung Masken, insbesondere mit variablen Öffnungen/Blenden auf. Die Mas- ken mit den variablen Öffnungen bzw. Blenden dienen dazu, das ausgesendete Licht gezielt auf mehrere auf dem Probenhalter angeordnete Proben gleichzeitig zur Bestrahlung zu richten, wobei vorzugsweise auch alle auf einem Standardpro- benhalter in Form einer Mikrotiterplatte angeordneten vorzugsweise 96 Proben gleichzeitig bestrahlbar sind, wodurch extrem hohe Durchsätze durch die erfin- dungsgemäße Vorrichtung möglich sind.

Vorzugsweise ist das Licht zumindest ein Lichtstrahl. Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist es jedoch auch möglich, daß gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Licht diffuses Licht ist. Bei Verwendung von diffusem Licht sind optische Einrichtungen zwischen der Lichtquellenvorrichtung und den Proben in der Regel nicht erforderlich, sondern das diffus ausgesendete Licht wird zur gleichzeitigen Bestrahlung einer möglichst großen Anzahl von auf dem Probenhalter angeordneter Proben benutzt. Bei Verwendung einer solchen diffusen Weißlichtquelle ist eine Einzelstrahlteilung nicht erforderlich, wobei im Falle einer erforderlichen Beschränkung der Bestrahlung auf bestimmte Proben, um nicht sämtliche Proben gleichzeitig bestrahlen zu müssen, die Verwendung geeigneter Lochmasken vorgesehen ist. Das bedeutet, daß mit der Verwendung einer diffusen Weißlichtquelle eine besonders hohe Parallelisierung der Probenbe- strahlung unter Verwendung einer Lochmaskenblende erreichbar ist. Diese Paral- lelisierung der Probenbestrahlung ist besonders hoch im Vergleich zum fokus- sierten Laserstrahl gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel, bei welchem ein suk- zessives Abtasten der einzelnen, in Kavitäten auf einer Mikrotiterplatte auf dem Probenhalter angeordneten Proben erfolgt.

Bei Verwendung einer an sich bekannten Weißlichtglühlampe kann die erfin- dungsgemäße Vorrichtung besonders einfach im Aufbau und vor allem auch ko- stengünstig bereitgestellt werden. Bei Verwendung einer Weißlichtglühlampe ist entweder die diffuse, gleichzeitige Bestrahlung vieler Proben über eine Lochmak-

se möglich, oder es ist mittels relativ einfacher konstruktiver optischer Baugrup- pen möglich, das von der Lichtquellenvorrichtung ausgesendete Licht nach einer entsprechenden Bündelung wieder so zu teilen, daß eine möglichst große Anzahl von Proben gleichzeitig bestrahlbar wird. Eine Bestrahlung auch ohne optische Baugruppen ist ebenfalls möglich. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Weißlichtglühlampen zur Bestrahlung besteht unter anderem darin, daß Gefah- renquellen für Bedienpersonen im Vergleich zur Verwendung einer Laservor- richtung als Lichtquellenvorrichtung deutlich reduziert werden.

Für die jeweiligen Proben ist unter Beachtung der Tatsache, ob eine Strahlauf- weitvorrichtung und/oder ein Strahlteiler im Zusammenhang mit einer Laservor- richtung oder mit einer Weißlichtglühlampe vorgesehen ist, d. h., um die für die jeweiligen Proben erforderlichen Leistungen bzw. Lichtausbeuten der jeweils verwendeten Lichtstrahlen einstellen zu können, vorzugsweise ein Leistungsmes- ser zur Bestimmung der von der Lichtquellenvorrichtung abgegebenen Leistung vorgesehen. Mit einem derartigen Leistungsmesser ist somit auch eine höhere Reproduzierbarkeit der Untersuchungsbedingungen gegeben.

Um eine hohe Flexibilität bezüglich der Relativbewegung zwischen Lichtstrahl und Probenhalter sowie um ein rasches Bestrahlen der am Probenhalter ange- brachten Mikrotiterplatten mit den entsprechenden Proben zu gewährleisten, weist der Probenhalter einen Positioniertisch auf, welcher zumindest eine Mikrotiter- platte trägt, vorzugsweise jedoch zwei Mikrotiterplatten aufweist, und welcher in x, y-Richtung positionierbar ist. Die Positionierung in x, y-Richtung wird mittels rechtwinklig zueinander angeordneter Verschiebemechanismen realisiert, welche mittels Schrittmotoren angetrieben sind. Die Schrittmotoren basieren auf Voll- schritt-oder Halbschritt-Technologie und erlauben ein sehr genaues, im Zusam- menhang mit den entsprechenden Verschiebemechanismen auch weitgehend spielfreies Einstellen exakt gewünschter Positionen des Positioniertisches mit den Mikrotiterplatten. Ein derartiger x, y-Positioniertisch ist insbesondere bei Verwen- dung einer Laservorrichtung als Lichtquellenvorrichtung erforderlich.

Vorzugsweise sind die Verschiebemechanismen schienengeführt, wobei zur Übertragung der Bewegung vom jeweiligen Schrittmotor Kugelspindeln vorgese- hen sind, welche eine hohe Positioniergenauigkeit im Hinblick auf die durch den elektronisch angesteuerten Schrittmotor verursachte Bewegung realisieren.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung stellt den zentralen Teil eines CALI-Systems zur Identifizierung der Funktion von biologischen Molekülen dar und umfaßt ge- mäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung zur weiteren Erhöhung der Flexibilität des Gesamtsystems noch zusätzlich eine Liganden-Bindungs- partner (LBP)-Screening-Maschine zur Erzeugung spezifischer, gegen spezielle Zielmoleküle/Liganden gerichtete LBPs, ggf. eine Chromophor- Synthesevorrichtung zur Produktion von Chromophoren, eine LBP-Chromophor- Kopplungsvorrichtung zur Verknüpfung der ausgewählten LBPs und der syntheti- schen Chromophore, eine Beladungsvorrichtung zum Überführen von LBP-Tags in in der Mikrotiterplatte angeordnete Kavitäten, eine Einrichtung zum Bewegen der Mikrotiterplatte in die CALI-Vorrichtung und eine Vorrichtung zum Ablesen der Aktivität der zu inaktivierenden Zielmoleküle.

Eine diese genannten weiteren Baugruppen umfassende Vorrichtung stellt damit eine Vorrichtung mit hoher Flexibilität dar, welche eine weitestgehende automati- sierte Beschickung, Bestrahlung, Untersuchung und Austausch bereits untersuch- ter gegen neue Proben ermöglicht und des weiteren auch ein automatisiertes Able- sen und Abspeichern der durch die Untersuchung gewonnenen Ergebnisse. Insbe- sondere durch die Verwendung eines zentralen Steuersystems für sämtliche Kom- ponenten des Gesamtsystems wird ein leichtes und übersichtliches Handling so- wie ein optimales Betreiben der gesamten Vorrichtung ermöglicht.

Um neugewonnene Ergebnisse mit bisherigen Ergebnissen vergleichen zu kön- nen, um Trends der Untersuchung von bestimmten Proben rechtzeitig erkennen zu

können und um auch später Zugriff auf einmal gewonnene Untersuchungsergeb- nisse zu haben, werden die Ableseergebnisse in einer Datenbank abgespeichert.

Neben der Steuerung der Screening-Maschine, der LBP-Chromophor- Kopplungsvorrichtung, der Beladungsvorrichtung und der Einrichtung zum Be- wegen der Mikrotiterplatte wird auch ein weiterer Antrieb zur Bewegung einer zwischen der Strahlmodifikationsvorrichtung und dem Probenhalter angeordneten optischen Linse mittels der Steuereinrichtung über die Systemsoftware zentral gesteuert. Dadurch wird die Flexibilität des Gesamtsystems weiter erhöht, wobei gleichzeitig seine Zuverlässigkeit steigt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein Gehäuse zu- mindest um eine Mikrotiterplatte des Probenhalters derart angeordnet, daß es die- se umschließt, vorzugsweise jedoch um den gesamten Probenhalter samt Bewe- gungsmechanik angeordnet. Das Gehäuse ist dabei mit äußeren Versorgungssy- stemen derart verbunden, daß bestimmte, vorher eingestellte gewünschte Zu- standsbedingungen im Gehäuse steuerbar sind. Diese Zustandsbedingungen sollen insbesondere Zustandsbedingungen der die jeweilige Probe bzw. Mikrotiterplatte umgebenden Atmosphäre umfassen. Dazu zählen insbesondere der Kohlendioxid- gehalt, die Feuchtigkeit, die Temperatur, der Druck usw. der Atmosphäre. Unter Versorgungssystemen sei im folgenden die Versorgung über spezielle zentrale oder dezentrale Leitungssysteme mit entsprechenden Ventilen verstanden, wobei die Ventile bzw. auch in den Versorgungssystemen vorgesehene Pumpen so steu- erbar sind, daß die Zustandsbedingungen auf einen bestimmten Wert oder ent- sprechend einer gewünschten Anderungskurve einstellbar bzw. auf bestimmte Zustandswerte einregelbar sind. Vorzugsweise sind die entsprechenden Pumpen bzw. Ventile in den Versorgungssystemen ebenfalls über die Steuereinrichtung über die Systemsoftware zentral steuerbar. Zur Flexibilitätserhöhung der Gesamt- anlage werden die Mikrotiterplatten mit Kavitäten unterschiedlicher Abmessun- gen verwendet, so daß Proben unterschiedlichster Konsistenz und unterschiedlich- ster Zusammensetzung je nach Bedarf angeordnet werden können.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird für das erfindungsgemäße Ver- fahren zur Identifikation der Funktion eines Liganden zur für eine Inaktivierung erforderlichen Bestrahlung ein Beleuchtungskörper, insbesondere in Form einer Weißlichtquelle, eingesetzt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Probe mit einem Komplex aus einem Liganden und einem Ligandenbindungs- partner (LBP)-lichtaktiverbaren-Marker (Tag) mit einem Lichtstrahl aus dem Be- leuchtungskörper bestrahlt. Der Beleuchtungskörper in Form einer Weißlicht- quelle weist eine herkömmliche Glühlampe, Quarzlampe, Leuchtstoffröhre und/oder Leuchtdiode auf. Bei dem durch den Beleuchtungskörper ausgesendeten Licht handelt es sich um Weißlicht, wobei unter Weißlicht ein Licht mit einem Wellenlängenspektrum verstanden werden soll, welches zumindest teilweise im sichtbaren Bereich liegt, welches jedoch kein von einer Laservorrichtung ausge- sendetes Licht ist.

Hinsichtlich weiterer Ausbildungen des Verfahrens und einzelner Verfahrens- schritte zur Realisierung der Identifikation der Funktion eines biologischen Mole- küls im Wege der Inaktivierung, die zum technischen Erfolg der Erfindung beitra- gen und für die Schutz begehrt wird, wird auf die am 24. November 1998 unter der Anmeldenummer 198 54 195.3 eingereichte deutsche Patentanmeldung des- selben Anmelders verwiesen, wobei auf den Offenbarungsgehalt dieser Anmel- dung, insbesondere sämtliche Merkmale der Ansprüche 1-6, voll inhaltlich Be- zug genommen wird.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung wer- den nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen anhand von Ausfüh- rungsbeispielen detailliert erläutert. Es zeigen : Fig. l den prinzipiellen Aufbau der erfindungsgemäßen CALI- Vorrichtung ;

Fig. 2 eine Draufsicht eines als Positioniertisch ausgebildeten Probenhal- ters ; Fig. 3 eine Seitenansicht des Positioniertisches gemäß Fig. 2 ; Fig. 4 eine mit Peltier-Element ausgebildete Unterlage auf dem Positio- niertisch zur Aufnahme von Mikrotiterplatten ; Fig. 5 eine perspektivische Ansicht eines als Inkubator um den CALI- Positioniertisch gemäß Fig. 2 ausgebildeten Gehäuses ; Fig. 6 eine Darstellung von Versuchsergebnissen bezüglich einer Inakti- vierung von ß-Galaktosidase bei Verwendung von MG ; Fig. 7 Versuchsergebnisse hinsichtlich der Potenz von MG-CALI und von FITC-CALI ; Fig. 8 Versuchsergebnisse bezüglich der Inaktivierung von ß- Galaktosidase bei Verwendung von FITC unter Licht und unter Dunkelbedingungen ; Fig. 9 den Einfluß von Tageslicht auf die Inaktivierung von p- Galaktosidase mittels FITC-markiertem Antikörper ; Fig. 10 den spezifischen Inaktivierungsgrad von ß-Galaktosidase mittels FITC-CALI in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdauer mit einer diffusen Weißlichtquelle ;

Fig. 11.1 bis 11.3 das Flußbild der in der Steuereinrichtung verwendeten zentralen Systemsoftware ; und Fig. 12.1 und 12.2 den prinzipiellen Gesamtaufbau der erfindungsgemäßen CALI- Vorrichtung bei Verwendung einer Weißlichtquelle.

Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau der CALI-Vorrichtung gemäß der Erfin- dung. Die im Rahmen eines vollautomatisierten Laboruntersuchungsvorganges eingesetzte CALI-Vorrichtung 1 weist eine Laservorrichtung 2 auf, aus welcher ein Laserstrahl 3 austritt. Der Laserstrahl 3 dient der Bestrahlung von Proben zur Identifikation der Funktion von biologischen Molekülen, welche in Kavitäten an- geordnet sind, welche sich in Mikrotiterplatten 10 befinden, wobei die Mikrotiter- platten 10 auf einem Probenhalter 5 montiert sind. Der Probenhalter 5 weist einen Positioniertisch 13 in Form eines Kreuztisches mit Verschiebemechanismen 11, 12 auf, so daß die die Mikrotiterplatte 10 tragende Baugruppe entlang der Ver- schiebemechanismen 11,12 in die x-und y-Richtung verschiebbar ist. Der Ver- schiebemechanismus weist zwei mit Verschiebeschienen versehene Bauteile auf : Eine erste, der Bewegung der Mikrotiterplatte 10 in x-Richtung dienende Gleit- führung 11 und eine zweite, der Verschiebung der Mikrotiterplatte 10 in die y- Richtung dienende Gleitführung 12. Um eine entsprechende Verschiebung der Mikrotiterplatte 10 in die x-Richtung bzw. die y-Richtung auszuführen, sind An- triebe für die jeweiligen Gleitführungen vorgesehen, so daß entsprechend der Ver- schiebung in die jeweilige Richtung die in der jeweiligen Mikrotiterplatte 10 vor- handenen mehreren Kavitäten zur Aufnahme der Proben nacheinander bei im we- sentlichen feststehendem Laserstrahl 3 der Bestrahlung mittels der Laservorrich- tung 2 ausgesetzt werden können. Zur Erhöhung der Flexibilität der CALI- Vorrichtung ist zwischen Austritt des Laserstrahls 3 aus der Laservorrichtung 2 und Eintritt in ein im Bereich der Mikrotiterplatte 10 angeordnetes Prisma 9 eine Strahlmodifikationseinrichtung 6 vorgesehen. Mittels dieser Strahlmodifikations-

einrichtung 6 wird der Laserstrahl 3 an die jeweilige Probe angepaßt. Das bedeu- tet, daß der Laserstrahl 3 in seiner Form an die Probe bzw. die Größe der Kavität in der Mikrotiterplatte 10 und auch hinsichtlich seiner Intensität an die jeweilige Probengröße anpaßbar ist. Des weiteren ist die Strahlmodifikationseinrichtung 6 so ausgebildet, daß der Laserstrahl an die Probenart und/oder auch die Probenan- zahl anpaßbar ist. Durch eine zur CALI-Vorrichtung gehörende zentrale Steuer- einrichtung 4, welche eine zentrale Systemsoftware 4.1 XCALIbur anwendet, werden sämtliche Bewegungsabläufe, Leistungen und Zustandsbedingungen der automatisierten CALI-Vorrichtung 1 gesteuert bzw. auf bestimmte vorgegebene Werte eingeregelt.

Um eine Reproduzierbarkeit der Untersuchungen durchführen zu können und um die an die jeweiligen Probenart angepaßte Intensität des Laserstrahls 3 einstellen und überwachen zu können, ist am Austritt der Laservorrichtung 2 ein Leistungs- messer 7 vorgesehen, welcher die austretende Leistung des Laserstrahls 3 anzeigt bzw. registriert. Die gesamte Vorrichtung ist auf einem optischen Tisch 8 als Ein- heit angeordnet.

Als Pumplaser wird ein gepulster Nd : YAG-Infrarot-Laser benutzt, beispielsweise von der Firma Infinity, Coherent, dessen dritte harmonische Wellenlänge von 355 nm verwendet wird, um einen optischen parametrischen Oszillator (Infinity-XPO, Coherent) zu betreiben. Der Pumplaser und der XPO werden jeweils getrennt über zwei benutzerfreundliche Menüprogramme (Steuermodule 4.2,4.3) über die Steu- ereinrichtung 4 mit XCALIbur zentral computergesteuert. Pulsenergien von mehr als 30 mJ/Puls sind erzeugbar, wobei die Pulswiederholungsfrequenzen im Be- reich von I-30 Hz frei wählbar sind. Die typische Pulslänge liegt bei 3 ns. Die erzeugbaren Wellenlängen des Nutzsignalstrahls reichen von 420 bis 709 nm und die des unbenutzten sog."Idler"-Strahls von 2300 bis 709 nm.

Um bei einer On-Line-Messung mit Strahlauskopplung die Laserausgabeleistung während des Experiments bzw. der Bestrahlung mittels des Leistungsmessers 7

zuverlässig steuern zu können, werden ca. 2% des aus dem XPO austretenden Strahls mittels einer Auskopplungsoptik (25,4 mm Durchmesser, Coherent, Ka- talog-Nr. 44-2343) vom Laserstrahl 3 abgetrennt und auf einen thermischen Ener- giemeßkopf (LMP 10i, Coherent, Katalog-Nr. 33-1173) geleitet. Die auftreffende Energie wird durch einen Energie-/Leistungsanalysator (wie beispielsweise einen Fieldmaster-GSTM, Coherent, Katalog-Nr. 33-0498) angezeigt. Dieser Energie- /Leistungsanalysator ist über eine RS-232-Schnittstelle zur Dokumentation der on-line gewonnenen Meßdaten in die"XCALIbur"genannte zentrale Steuersoft- ware 4.1 integriert.

Für die Laserstrahl-Durchmesserregulierung (zoom beam expander) wird ein Prä- zisions-Laseraufweiter (Coherent, Auburn Group, Katalog-Nr. 31-2505) mit ei- nem Aufweitungsfaktor von 1 mal bis 8 mal eingesetzt. Durch eine Antireflexbe- schichtung ist die Lichttransmission bei 630 nm, d. h. in der Nähe der für die CA- LI-Untersuchungen mit MG benutzten Wellenlänge, optimiert (> 94%).

Vor dem Auftreffen des Laserstrahls 3 auf die jeweilige Probe ist der Laserstrahl 3 durch ein Rechtwinkelprisma 9 mit 40 mm Seitenlänge (Produkt-Nr.

01PRA029, Melles Griot, Zevenaar, NL) geführt, dessen Hypotenuse eine Silber- beschichtung zur Totalreflexion und dessen Kathete mit Breitband- Antireflexbeschichtung HebbarTM (415-700 nm, Produkt-Nr./078) versehen sind.

Damit wird der Laserstrahl 3 aus der Horizontalen um 90° in die Vertikale in Richtung auf den Positioniertisch 13, d. h. die Kavität mit der Probe in der Mikro- titerplatte 10, umgelenkt. Um den Probendurchsatz bei der Laserbestrahlung zu erhöhen, wird ein Breitbandstrahlteiler (25,4 mm Durchmesser, 50 : 50 Strahltei- lung bei 420 bis 700 nm, Coherent, Katalog-Nr. 44-2168) vor dem Rechtwin- kelprisma 9 eingeführt, welcher die Hälfte des eingehenden Laserstrahls 3 bzw. dessen Energie im 90°-Winkel zum durchgelassenen Strahlanteil auskoppelt. Je nach fur eine jeweilige Probe zur Gewährleistung von CALI-Inaktivierung benö- tigter Energie, und zwar in Abhängigkeit vom verwendeten Farbstoff, ist eine 3- fache, 4-fache oder gegebenenfalls 8-fache Strahlteilung durch serielles Einfügen

von Strahlteilern mit einem jeweiligen geeigneten Auskopplungsverhältnis vorge- sehen. Dabei ist eine entsprechende Kombination von 1,2,3,5 und 9 : 1- Auskopplern von Coherent möglich.

In Fig. 2 ist die Draufsicht auf den als Kreuztisch ausgebildeten Probenhalter 5 zur Aufnahme der Mikrotiterplatte 10 dargestellt. Der Probenhalter 5 weist eine Gleitführung 12 auf, auf welcher der eigentliche, die Mikrotiterplatte 10 tragende Positioniertisch 13 an einer entsprechenden Führung angebracht ist. Der Antrieb zur Bewegung des Tisches in die y-Richtung erfolgt mittels Schrittmotor 14.

Die Gleitführung 12 ihrerseits ist auf einer weiteren, rechtwinklig dazu angeord- neten, die Bewegung in die x-Richtung realisierenden Gleitführung 11 angeord- net. Der Antrieb der Gleitführung 12 zu deren Bewegung auf der Gleitführung 11 in die x-Richtung erfolgt ebenfalls mit einem Schrittmotor 14.

In Fig. 3 ist eine Schnitt-Seitenansicht des Positioniertisches 13 dargestellt. Dar- aus ist ersichtlich, daß die Gleitführungen 11,12 im Huckepack-Prinzip überein- ander angeordnet und relativ zueinander bewegbar sind, so daß durch die Bewe- gungen in die x-Richtung und die y-Richtung die auf dem eigentlichen Positio- niertisch 13 angeordneten Mikrotiterplatte 10 innerhalb eines Flächenbereiches zuverlässig bewegbar sind. Eine hohe Genauigkeit der Bewegung der jeweiligen Gleitführungen 11,12 und damit der Mikrotiterplatte 10 wird durch Kugelspin- deln 15 realisiert.

Die Kugelspindeln 15 sind in Antriebswirkverbindung mit den Schrittmotoren 14, welche als 3-Phasen-Schrittmotoren, wie beispielsweise Schrittmotoren der Firma Berger, VDRM 368, ausgebildet sind. Die Steuerung dieser Schrittmotoren 14 erfolgt über ein CNC-Steuermodul 4.4 in Form einer industriellen CNC-Standard- Steuervorrichtung, wie z. B. SM300, SM Electronics GmbH. Dieses CNC- Steuermodul 4.4 arbeitet im Befehlsmodus und ist über entsprechende elektroni-

sche Verbindungen direkt mit der Steuereinrichtung 4 gekoppelt bzw. ist ein Teil davon.

Die auf dem Positioniertisch 13 angeordneten zwei Mikrotiterplatten 10 mit den Kavitäten zur Aufnahme der Proben weisen in an sich bekannter Weise jeweils 96 Kavitäten auf, so daß es möglich ist, 192 Proben nacheinander zu untersuchen bzw. zu bestrahlen, ohne daß es erforderlich ist, daß eine Bedienperson eingreift. Selbstverständlich ist es auch möglich, andere Mikrotiterplatten auf dem Positio- niertisch 13 anzuordnen, welche eine von 96 verschiedene Anzahl von Kavitäten aufweisen.

Die Verbindung des CNC-Steuermoduls 4.4 für die 3-Phasen-Schrittmotoren 14 der Kugelspindel-Antriebe ist über ein serielles Kabel mit dem RS-232-Port der Steuereinrichtung 4 verbunden.

Der Einsatz von Kugelspindeln 15 ermöglicht neben der exakten Einstellung eine Wiederholbarkeitsgenauigkeit von mindestens 0,1 mm. Dies ist notwendig, damit der Laserstrahl 3 stets die Mitte der Mikrotiterplatten-Kavität trifft und dadurch die Probe vollständig bestrahlt wird und Strahlstreuung an den Rändern der Ka- vität vermieden wird.

In Fig. 4 ist der prinzipielle Aufbau eines Trägers 16 bzw. Rezeptors ftir Mikroti- terplatten 10 dargestellt. Der Träger 16 weist eine Sandwich-Struktur mit 6 Pel- tier-Elementen 20, vorzugsweise von CONRAD ELECTRONIC, 7105, auf, wel- che zwischen zwei schwarz anodisierten Stahlplatten 17,18 montiert sind. Die gesamte Sandwich-Struktur ist mittels Schrauben 19 mit dem Positioniertisch 13 verbunden. Es ist jedoch auch möglich, eine anderweitige Verbindung, beispiels- weise durch WIagnete zu realisieren, um eine Automatisierung des gesamten Ver- fahrensablaufs zu ermöglichen bzw. zu erleichtern. Die Mikrotiterplatten 10 soll- ten bei einer moderaten Temperatur mit Hilfe dieser Peltier-Elemente 20 über

einen Bereich von etwa 15°C bis 45°C unabhängig gehalten werden, wobei die Temperatur über nicht dargestellte externe oder interne Sensoren überwacht wird.

Der Einfachheit der Darstellung wegen ist in Verbindung mit den Fig. 1 bis 4 nicht beschrieben worden, daß der Positioniertisch 13 mit den Mikrotiterplatten 10 (CALI-Kreuztisch) von einem Gehäuse (nicht dargestellt in Fig. 4) umgeben ist, welches aufgrund der Tatsache, dal3 innerhalb des Gehäuses eine definierte Atmosphäre für jeweilige Proben aufrechterhalten bzw. eingestellt wird, auch als Inkubator bezeichnet wird. Dieser Inkubator 25 ist in prinzipieller perspektivi- scher Ansicht in Fig. 5 dargestellt. Der Inkubator 25 weist in Seitenwänden einen Durchbruch 24 für die Bestrahlungssoptik sowie Durchbrüche 21 für Versor- gungsleitungen, wie z. B. elektrische Versorgungsleitungen, Luftleitungen, Gas- leitungen, etc., auf. Des weiteren weist der Inkubator 25 eine verschließbare grö- ßere Öffnung in Form einer Klappe 22 auf, durch welche beispielsweise die Mi- krotiterplatte 10 in den Inkubator 25 eingebracht werden kann. Dies kann bei- spielsweise mit einem Roboterarm geschehen. Die verschließbare Klappe 22 ist im verschlossenen Zustand je nach Zustandsbedingungen im Inneren des Inkuba- tors 25 gasdicht bzw. temperaturisoliert abgedichtet. Am Boden des Inkubators 25 sind weitere Öffnungen 23 in Form von Befestigungsöffnungen vorgesehen, wel- che der Befestigung des Inkubators 25 auf dem optischen Tisch 8 dienen.

Nicht dargestellt sind entsprechende Ventile in den Versorgungsleitungen, mittels welcher eine Einstellung der atmosphärischen Zustandsbedingungen im Inneren des Inkubators 25 erfolgt.

Die in Fig. l dargestellte, mit der zentralen Systemsoftware 4.1 arbeitende Steuer- einrichtung 4 ist so ausgebildet, daß die Ventile (nicht dargestellt) der Versor- gungsleitungen ansteuerbar und betätigbar sind, so daß die atmosphärischen Zu- standsbedingungen im Inneren des Inkubators 25 einstellbar sind. Gleichermaßen ist es möglich, die Öffnungsklappe 22 mit einem Antrieb zu versehen, welcher über die zentrale Steuereinrichtung 4 betätigbar ist, so daß auch die Beschickung

des Inkubators 25 mit auf insbesondere der Mikrotiterplatte 10 angeordneten Pro- ben im automatisierten CALI-Vorgang erfolgen kann.

Die zentrale Steuersoftware 4.1 (XCALIbur) bildet das Nutzer-Interface für sämt- liche Bewegungs-und Steuervorgänge der gesamten CALI-Vorrichtung 1. Wäh- rend die Steuerung des Positioniertisches 13 über eine serielle Schnittstelle (RS- 232) der System-Steuereinrichtung 4, welche ein PC ist, erfolgt, wird die Steue- rung der Laservorrichtung 2 mittels Windows DDE-Server durchgeführt, welche in die Software für das Lasersteuermodul 4.2 und die XPO 4.3 integriert sind, wodurch ein fehlerhafter Betrieb der Laservorrichtung 2 durch den Nutzer ausge- schlossen ist. Die XCALIbur-Steuersoftware 4.1 ermöglicht auch die Bedienung des Inkubators 25 einschließlich der darin einzustellenden atmosphärischen Be- dingungen.

Ein Nutzer kann bei Verwendung der XCALIbur-Software jede einzelne Kavität und damit jede einzelne Probe in der Mikrotiterplatte 10 anwählen und sämtliche Laserparameter bzw. Lichtstrahlparameter der in der jeweiligen Kavität angeord- neten Probe differenziert zuordnen. Die Reihenfolge der Bestrahlung wird eben- falls einfach per Mausklick durch den Nutzer vorgegeben.

In den Figuren 6 bis 10 sind die wichtigsten Ergebnisse eines experimentellen Protokolls zur Probenvorbereitung und Ausführung von in vitro CALI am Bei- spiel von ß-Galaktosidase zusammengefaßt. Zur Kopplung des Farbstoffes an das Effektor-Molekül (Antikörper) wurde Malachitgrün-Isothiocyanat (MG) oder Fluoreszein-isothiocyanat (FITC) verwendet. Als spezifischer Antikörper wurde gereinigtes polyklonales Kaninchenanti-Galaktosidase IgG-Antiserum verwendet.

Als Negativkontrolle diente gereinigtes IgG von nichtimmunisierten Kaninchen.

Die Antikörper wurden zuerst gegen PBS, pH 7,4 dialysiert, und zwar 3 Stunden mit einem Molekulargewichtsausschluß von 3500 Da. Danach wurden 600 ig Antikörper zusammen mit der gleichen Menge Rinderserumalbumin (RSA) im Falle von MG und ca. 400 ig Antikörper ohne Rinderserumalbumin im Falle von

FITC zur Kopplung eingesetzt. MG und FITC wurden in einer Konzentration von 10 mg/ml in Dimethylsulfoxid gelöst. Das Koppeln fand für MG in 600 ul 0,5 M NaHC03, pH 9,5 statt bei maximal 10% Antikörperbeitrag zum Volumen. MG wurde in kleine Aliquots auf Eis zum Antikörper zugegeben, und zwar 5 mal lgl nach je 1 min, nach weiteren 5 min 2,5 ptl und nach 2,5 min nochmals 2,5 pl, nach 5 min il und nach weiteren 10 min nochmals 5 1, abschließend 30 min Inkuba- tion, d. h. insgesamt 20 gl MG mit ca. 1 Stunde Kopplungszeit. Anschließend wurde nichtgekoppeltes MG mittels Gelfiltration abgetrennt. Dies erfolgte mittels einer nicht dargestellten PD 10-Säule mit Sephadex G25 Matrix, beispielsweise von der Firma Pharmacia. Dazu wurde die Säule zuerst in PBS, pH 7,4 (4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl) equilibriert. Die Kopplungsreaktion wurde mit PBS auf lml aufgefüllt und auf die Säule geladen. Danach wurde mit 2 ml PBS gewaschen und anschließend der MG-gekoppelte Antikörper in 1,5 ml PBS eluiert. Das Kopplungsverhältnis der Probe durch Absorptionsmessung bei 620 nm (MG-Anteil) und Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bradford As- say (Antikörperanteil) bestimmt. Für die Kopplung mit FITC wurde das Protokoll des Herstellers befolgt. 400 µg Antikörper in 180 ml PBS wurden mit 40 gl 0,5 M NaHCO3, pH 9,5 versetzt, wobei ein in Abhängigkeit von der Proteinkonzentrati- on errechnetes Volumen von 3,2 gl FITC zugegeben wurde. Die Kopplung fand lichtgeschützt während l Stunde bei Raumtemperatur statt, wobei die Kopplungs- reaktion ebenfalls über eine Gelfiltrationssäule gereinigt wurde. Das Kopplungs- verhältnis der Probe wurde durch Absorptionsmessung bei 494 nm (FITC-Anteil) und 280 nm (Proteinkonzentrationsbestimmung) unter Berücksichtigung entspre- chender Korrekturfaktoren (nach der Formel von Molecular Probes) bestimmt.

Die Vorbereitung der Proben und die Laser-bzw. Lichtbestrahlung erfolgte wie folgt : Die Proben wurden zuerst in Eppendorf-Reaktionsgefäßen angesetzt, und zwar 15 ul Gesamtvolumen pro Probe, und l Stunde lang auf Eis vorinkubiert, um eine

Antikörper-Antigenbindung zuzulassen. Zu einer konstanten Menge gereinigter ß- Galaktosidase (0,67 U/ml, 1,3 ug/ml ; Reinheitsgrad X, Sigma) wurde die ge- wünschte Menge Farbstoff-gekoppelter Antikörper zugegeben, und zwar zwi- schen 3,75 und 240 tg/ml, wobei mit ca. 60 pg/ml gewöhnlich die nahezu maxi- male Inaktivierung erzielt wurde, was einem molaren Verhältnis von Enzym : Antikörper von etwa 1 : 45 entspricht. Neben der Zugabe der gewünschten Menge an Farbstoff-gekoppeltem Antikörper wurden 250 llg/ml RSA als Träger zugege- ben, um eine unspezifische Absorption des Enzyms an dem Reaktionsgefäß zu verhindern. Danach wurde mit 1 x PBS, pH 7,4 auf 15gl pro Probe aufgefüllt.

Nach der Vorinkubation wurde das Probenvolumen mit 1 x PBS auf 50 ptl aufge- füllt (Verdünnungsfaktor 3,3 x) und die RSA-Konzentration im Ansatz wieder auf 250 llg/ml gebracht. Die Proben wurden als unabhängige Dreifachbestimmungen pro Behandlungstyp (Probentyp) in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten, einer sog. Flachboden-Mikrotiterplatte, überführt und einer Laserbe- strahlung unter den gewünschten Bedingungen ausgesetzt.

Für das CALI-Verfahren unter Verwendung einer Laservorrichtung 2 wurde der Laser üblicherweise mit ca. 270 mJ/Puls Infrarotenergie mit einer Wellenlänge von 1064 nm betrieben, was einer Bestrahlungsenergie von ca. 13 mJ/Puls bei 620 nm und 15 mJ/Puls bei 494 nm entsprach, und zwar gemessen mit dem Fieldma- ster-Energiemeßgerät über ca. 2% Auskopplung des Strahls. Der Laserstrahl 3 hatte einen Durchmesser von ca. 5 mm und überstrich die Gesamtfläche einer Ka- vität. Die Bestrahlungsdauer lag gewöhnlich zwischen 1 bis 5 min.

Bei Anwendung von FITC für CALI in Kombination mit diffusem Licht wurde eine Weißlichtglühlampe verwendet und eine gewöhnliche Schreibtisch- Schirmlampe mit 18 cm Durchmesser senkrecht über den Proben in ca. 20 cm Abstand aufgestellt, und die in einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten auf Eis befindlichen Proben 0 bis 60 min lang bestrahlt.

Nach erfolgter Bestrahlung wurde der Inaktivierungsgrad bestimmt. Der Inakti- vierungsgrad von ß-Galaktosidase wurde über das ONPG (Orthonitrophenylga- lactosidase)-Nachweisverfahren bestimmt. Dazu wurden zu den 50 ul Probe 50 Ll Reaktionspuffer A gegeben (100 mM NaH2PO4, pH 7,5 ; 10 mM KC1,1mM MgS04) sowie 50 ul ONPG-Lösung (4 mg/ml in 100 mM NaH2PO4, pH 7,2) ge- geben. Dieses Gemisch wurde bei 37°C eine definierte Zeit lang (zumeist 30 min) inkubiert und die Reaktion danach mit 90 ptl 1 M Na2CO3 gestoppt. Der Umset- zungsgrad des ONPG-Substrates (Gelbfärbung) wurde in den einzelnen Proben bei 405 nm in einem ebenfalls nicht direkt beschriebenen Mikrotiterplatten- Absorptionsspektrophotometer (Tecan) bestimmt.

Die in den Fig. 6 bis 10 dargestellten Ergebnisse lassen sich wie folgt interpretie- ren. Um die Effektivität des neuen CALI-Systems mittels des eingesetzten Nd : YAG-Lasers zu testen, wurde die CALI-Inaktivierung am Beispiel von ß- Galaktosidase durchgeführt. Die bereits als CALI-tauglich beschriebenen ver- schiedenen Farbstoffe MG und FITC wurden eingesetzt. Die Bestrahlungsbedin- gungen, die Bestrahlungsabfolge und die Bestrahlungsintensität wurde mittels der XCALIbur-Software programmiert, wobei die Proben damit automatisch abgear- beitet wurden.

In Fig. 6 ist eine Titration der Konzentration der verwendeten MG-gekoppelten Antikörper gezeigt (ONPG-Assay). Alle Proben wurden in unabhängigen Drei- fachansätzen behandelt. Der Standardfehler mit dem neuen automatisierten CALI- System lag generell bei < 10%. Die halbmaximale Inaktivierung von ß- Galaktosidase war unter den gegebenen Bedingungen, welche bei 5 min, 620 nm, 30 Hz, 13 mJ/Puls lagen, bei ca. 5 ug/ml spezifischem anti-ß-Gal-Antikörper er- reicht (ca. 10-facher Antikörperüberschuß). Die Sättigung des Inaktivierungsef- fektes, welcher einem Wert von 60% spezifischer CALI-vermittelter Inaktivierung

entspricht, trat bei 35 llg/ml auf (ca. 70-facher Antikörperüberschuß). Das ver- wendete polyklonale anti-ß-Gal-Serum zeigte bereits ohne Laserbestrahlung einen inhibitorischen Effekt, welcher jedoch durch Laserbestrahlung wesentlich ver- stärkt wurde. Das verwendete Kontroll-IgG-Serum bewirkte mit und ohne Laser- bestrahlung keinen inhibitorischen Effekt.

Die Verwendung von FITC, welches eine ca. 5-fach bessere Kopplung zum Anti- körper aufwies als MG (10 : 1 FITC gegenüber 2 : 1 MG), bewirkte eine schnellere und stärkere CALI-vermittelte Inaktivierung als MG, wie aus Fig. 7 und 8 er- sichtlich ist. Nach 1 min Bestrahlung waren 47 % Inaktivierung mit FITC gegen- über 20 % mit MG erreicht (Fig. 7). Nach 2 min Laserbestrahlung mit 494 nm bei 30 Hz und 15 mJ/Puls waren 80% der ß-Galaktosidaseaktivität (ONPG-Assay) inaktiviert, und zwar bei 45-fachem Antikörperüberschuß (Fig. 8). Dieses Expe- riment wurde soweit als möglich im Dunkeln durchgeführt. Bei Durchführen des gleichen Experiments unter Einfluß von Tageslicht zeigte sich bereits ohne Laser- bestrahlung eine signifikante Inaktivierung von ß-Galaktosidase in Gegenwart des spezifischen, FITC-gekoppelten Antikörpers (siehe Fig. 8).

In einem weiteren Experiment, bei welchem der Einfluß der Dauer der Einwir- kung von Tageslicht bestimmt wurde, zeigte sich, daß mit zunehmender Inkubati- onsdauer bei Licht der Laser-unabhängige Inaktivierungsgrad stieg, wie aus Fig. 9 ersichtlich (vergl. dazu die Inaktivierung nach 1 und nach 1,5 Stunden).

Um diesen FITC-abhängigen Effekt deutlicher herauszuarbeiten, wurde eine Lichtquelle auf der Basis von Weißlicht einer definierten Stärke (Glühlampe mit 60 W Leistung) eingesetzt. Dabei wurde der spezifische Inaktivierungsgrad von ß- Galaktosidase in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdauer bestimmt. Dies ist in Fig. 10 dargestellt. Aus Fig. 10 ist ersichtlich, daß nach ca. 10 bis 15 min eine

halbmaximale Inaktivierung erreicht wurde, und nach ca. 30 min eine Sättigung des Inaktivierungseffektes eintrat.

In den Fig. 11.1 bis 11.3 ist das Flußdiagramm XCALIbur beschrieben. a) Fig. 11.1 Schritt 100 : Nach dem Start des Programms wird zunächst geprüft, ob bereits auf die- sem Rechner eine Instanz des XCALIbur-Programmes aktiv ist. Sollte dies der Fall sein, wird ein entsprechender Marker (AnotherInstance) gesetzt, der Einfluß auf die weitere Programmausftihrung hat. Dieses Vorgehen ist notwendig, um sicherzustellen, daß nur eine Instanz des XCALIbur- Programmes die Kontrolle über den Laser und den Positioniertisch hat.

Schritt 200 : Wird nur ausgeführt, wenn das gestartete Programm die erste Instanz auf diesem Computer ist. Dem Nutzer wird angeboten, einen Referenzlauf des Positioniertisches zu dessen Kalibrierung durchzufiihren. Sollte der Nutzer zustimmen, wird der Referenzlauf durchgeführt (Schritt 210).

Schritt 300 : Der Nutzer befindet sich nun in der Eingabemaske, in der die Definition der einzelnen Probenpositionen erfolgt. Die Reihenfolge, in der der Nutzer die Proben definiert, bestimmt die Reihenfolge der späteren Laserbestrah- lung. Der Nutzer hat die Möglichkeit, die Definition für den Bestrah- lungslauf fur spätere oder sofortige Nutzung abzuspeichern. Es sind die gängigen Editierfunktionen wie Kopieren, Einsetzen und Löschen verfüg- bar.

Schritt 400 :

Nachdem die Definition des Bestrahlungslaufes abgeschlossen ist, wird der Zustand des Markers AnotherInstance ausgewertet. Im Zustand "TRUE"wird geprüft, ob der Nutzer das Programm beenden möchte (Schritt 410) oder ob er weitere Läufe definieren möchte (zurück zu Schritt 300). Es ist somit möglich, mehrere Bestrahlungsläufe im voraus zu pro- grammieren, auch wenn auf dem Computer bereits eine andere Instanz des Programmes einen aktuellen Bestrahlungslauf durchführt.

Schritt 500 : Sollte der Zustand des Markers Anotherlnstance nicht den Zustand "TRUE"haben, kann der Nutzer den Bestrahlungslauf starten, weitere Läufe definieren oder auch das Programm beenden.

Schritt 600 : Sollte der Nutzer sich in Schritt 500 für den Start des Laufes entschieden haben, wird der Positioniertisch in die sogenannte Ladeposition am vorde- ren Rand gefahren. In dieser Position ist es sehr einfach möglich, die Mi- krotiterplatten auf den entsprechenden Haltern am Positioniertisch zu befe- stigen, ohne dabei Teile der strahlablenkenden Optik (Strahlmodifikations- einrichtung) zu berühren.

Schritt 610 : Es werden der optimale Weg zur Bestrahlung der Proben sowie die Ge- samtlaufzeit berechnet.

Schritt 620 : Es wird ein Befehl an das CNC-Steuermodul 4.4 ausgegeben, gemäß wel- chem mittels dem Positioniertisch nacheinander in x-und in y-Richtung Kalibrierläufe durchführbar sind.

Schritt 700 : Ein Fehlerzähler wird auf Null gesetzt. b) Fig. 11.2 Schritt 710 : Über die DDE-Schnittstelle der Coherent-Laser-Steuersoftware wird der Laser in den Standby-Modus geschaltet.

Schritt 720/730/740/750 : Aus Sicherheitsgründen wird jetzt geprüft, ob der Laser sich auch tatsäch- lich im Standby-Modus befindet. Sollte dies nicht der Fall sein, wird der Fehlerzähler inkrementiert. Sollte der Fehlerzähler den Wert 3 überschrei- ten (entspricht drei erfolglosen Versuchen, den Laser in den Standby- Modus zu schalten), wird die Laserenergie auf Null gesetzt (Schritt 1500) und eine Fehlermeldung ausgegeben (Schritt 1600). Danach hat der Nutzer die Möglichkeit, das Problem zu beheben und den Lauf neu zu starten oder das Programm zu beenden.

Schritt 800 : Ein Fehlerzähler wird auf Null gesetzt.

Schritt 810 : Die Laserparameter (Leistung, Wellenlänge, etc.) für die erste Probe wer- den auf einer Sicherheitsposition (außerhalb der Bestrahlungsfläche) ein- gestellt. Das Einstellen des Lasers erfolgt ausschließlich über die DDE- Schnittstelle der Coherent-Laser-Software, so daß Fehlsteuerungen des La- sers durch falsche Parameter ausgeschlossen sind, da diese von der Coher- rent-Software abgefangen werden.

Schritt 820/830/840/850 : Es wird geprüft, ob die eingestellten Laserparameter erreicht wurden.

Sollte dies nicht der Fall sein, wird der Fehlerzähler inkrementiert und das Überprüfen der Laserparameter fortgesetzt. Wenn die Parameter nach drei Versuchen nicht erreicht wurden, wird die Laserenergie auf Null gesetzt (Schritt 1500) und ein Fehlermeldung ausgegeben (Schritt 1600). Danach hat der Nutzer die Möglichkeit, das Problem zu beheben und den Lauf neu zu starten oder das Programm zu beenden.

Schritt 900 : Ein Fehlerzähler wird auf Null gesetzt.

Schritt 910 : Der Positioniertisch wird auf die Position der zu bestrahlenden Probe ge- fahren.

Schritt 920/930/940/950 : Es wird geprüft, ober der Positioniertisch die entsprechende Position er- reicht hat. Sollte dies nicht der Fall sein, wird der Fehlerzähler inkremen- tiert und erneut in die Position des Positioniertisches abgefragt. Nach drei erfolglosen Versuchen wird die Laserenergie auf Null gesetzt (Schritt 1500) und eine Fehlermeldung ausgegeben (Schritt 1600). Danach hat der Nutzer die Möglichkeit, das Problem zu beheben und den Lauf (oder einen anderen) neu zu starten oder das Programm zu beenden. c) Fig. 11.3 Schritt 1000 : Die Probe wird mit den eingestellten Laserparametern und der program- mierten Strahlungsdauer bestrahlt.

Schritt 1100 : Es wird geprüft, ob weitere Proben zur Bestrahlung vorgesehen sind.

Sollte dies der Fall sein, wird zu Schritt 800 zurückgekehrt.

Schritt 1200 : Die Laserenergie wird auf Null gesetzt, und der Laser aus Sicherheits- gründen auf"External Triggering"geschaltet. Da kein externer Trigger anliegt, kann der Laser auch nicht versehentlich wieder eingeschaltet wer- den.

Schritt 1300 : Der Positioniertisch wird wieder in die Ladeposition gefahren, um ein si- cheres Entnehmen der Mikrotiterplatte (n) zu ermöglichen.

Schritt 1400 : Das Programm kann nun beendet werden oder der Nutzer kann zu Schritt 300 zurückkehren, um einen weiteren Lauf zu programmieren.

In Fig. 12.1 ist der prinzipielle Gesamtaufbau der CALI-Vorrichtung unter Ver- wendung einer Beleuchtungskörpereinheit in Seitenansicht dargestellt. Fig. 12.2 stellt die Draufsicht der Gesamtanordnung dar. Analog zu dem Ausführungsbei- spiel der CALI-Vorrichtung mit Laservorrichtung gemäß dem ersten Ausfüh- rungsbeispiel weist die Vorrichtung gemäß diesem zweiten Ausführungsbeispiel eine Steuereinheit 4, einen Probenhalter 5 mit einem Positioniertisch 13, auf wel- chem eine oder auch mehrere Mikrotiterplatten 10 angeordnet sind und welcher zumindest zur Beladung der CALI-Vorrichtung in eine Richtung, vorzugsweise die x-Richtung bewegbar ist, und eine Gleitführung 11 auf, welche mit einem als Antrieb dienenden Schrittmotor 14 verbunden ist. Auf dem Positioniertisch 13 ist ein Träger 16 für die Mikrotiterplatte 10 vorgesehen. Über der Mikrotiterplatte 10 ist eine klimatisierbare Bestrahlungskammer 26 angeordnet, über welche als

Lichtquellenvorrichtung eine Beleuchtungskörpereinheit 27 angebracht ist. Die Beleuchtungskörpereinheit 27 kann einfache Glühlampen, Quarzlampen oder her- kömmliche Leuchtstoffröhren oder eine Kombination daraus aufweisen. Bei Ver- wendung von herkömmlichen Glühlampen erfolgt deren Anordnung in einem Array, wobei auch anstelle der Glühlampen Leuchtdioden möglich sind, welche dann entsprechend den zu bestrahlenden Proben eingeschaltet werden können.

Die erfindungsgemäße CALI-Vorrichtung mit Beleuchtungskörpereinheit in Form einer Weißlichtquelle weist eine derartige Anordnung der Lichtquelle auf, daß der gesamte Bereich der Mikrotiterplatte 10 überdeckt ist. Sollen aus Gründen der Untersuchungsabfolge für die einzelnen Proben einzelne auf der Mikrotiterplatte 10 angeordnete Proben bezüglich ihrer Bestrahlung ein-bzw. ausgeblendet wer- den, so ist es möglich, beispielsweise ferroelektrische LC-Shutter 30 (z. B. Scitec FLC 2436) einzusetzen. Die Steuerung der Shutter 30 erfolgt ebenfalls über ein zur zentralen Steuereinrichtung 4 gehörendes Softwaremodul der zentralen XCA- LIbur-Software. Die Programmierung dieses Steuermoduls bei Verwendung meh- rerer Mikrotiterplatten 10 kann dabei im voraus erfolgen, wobei die einzelnen Programme bis zu deren Abarbeitung speicherbar sind.

Die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen CALI-Vorrichtung sind in einem ebenfalls klimatisierbaren Gehäuse 25 angeordnet, welcher gegenüber der Umgebung ebenfalls abdichtbar ist und in welchem bestimmte definierte Bedin- gungen erzeugt werden können. Die Beschickung dieses Gehäuses 25, welches ebenfalls als Inkubator bezeichnet wird, mit einem neuen Set von zu untersuchen- den Proben erfolgt über eine in Form einer Klappe 28 in einer Wand des Inkuba- tors 25 angeordneten Öffnung, durch welche der Positioniertisch 13 mittels der durch Servomotoren 14 angetriebenen Gleitführung 11 aus dem Inkubator 25 her- ausfahrbar ist, mit neuen Mikrotiterplatten beladbar ist und anschließend wieder in den Inkubator 25 einfahrbar ist.

Zur Erhöhung des Durchsatzes ist es selbstverständlich auch möglich, zwei oder mehrere Beleuchtungskörpereinheiten (Bestrahlungsgeräte) 26 parallel anzuord- nen und zu betreiben, wobei deren Steuerung ebenfalls von der zentralen Software XCALIbur erfolgt. Diese Steuerungssoftware sorgt für die Koordination der Be- wegung der einzelnen Geräte, der Untersuchungen der einzelnen Proben sowie des externen automatischen Transportsystems.

Die erfindungsgemäße CALI-Vorrichtung ist aufgrund des einfachen Aufbaus leicht in eine bestehende Laborautomatisierung einzubinden, wobei die Beschik- kung und Entleerung der CALI-Vorrichtung durch zur Gesamtlabor- Automatisisierungsausstattung gehörende entsprechende Transportroboter erfol- gen kann (z. B. CRS Linear Robot).

Mit der CALI-Vorrichtung ist das Aufrechterhalten von Zellkulturbedingungen wie beispielsweise Kohlendioxidgehalt, Luftfeuchte und Temperatur während der gesamten Dauer der Bestrahlung möglich. Für bestimmte Untersuchungen ist es des weiteren möglich, flexibel Veränderungen der Zellkulturbedingungen über die Zeit ebenfalls mit einzubeziehen. Des weiteren ist es ebenfalls möglich, definierte Bereiche der Mikrotiterplatte von der Bestrahlung auszunehmen oder mit unter- schiedlicher Strahlungsdauer zu bestrahlen. Damit wird die Flexibilität der Unter- suchung weiter erhöht, und es werden Kontrollexperimente ohne weiteres mög- lich.

Aufgrund der Verwendung einer Beleuchtungskörpereinheit 27 ist es somit auf einfache Art und Weise ohne Verwendung eines Lasers möglich, ein effektives, kostengünstiges und zuverlässig arbeitendes Gerät zur Durchführung des CALI- Verfahrens zu realisieren.

Bezugszeichenliste 1$CALI-Vorrichtung 2 Laservorrichtung 3 Laserstrahl 4 Steuereinrichtung 4.1. zentrale Systemsteuersoftware 4.2 Lasersteuermodul 4. 3 Steuermodul für optischen parametrischen Oszillator (XPO) 4.4 CNC-Steuermodul 5 Probenhalter 6 Strahlmodifikationseinrichtung 7 Leistungsmesser 8 optischer Tisch 9 optisches Prisma 10 Mikrotiterplatten inx-Richtung11Gleitführung 12 Gleitführung in y-Richtung 13 Positioniertisch 14 Schrittmotoren 15 Kugelspindeln 16 Träger/Rezeptor fiir Mikrotiterplatten 17,18 Stahlplatten 19 Schrauben 20 Peltier-Elemente fürVersorgungsleitungen21Durchbruch 22 Klappe 23 Befestigungsöffnungen fürBestrahlungsoptik24Durchbruch 25 Inkubator 26 Bestrahlungskammer 27 Lichtquellenvornchtung/Beleuchtungskörpereinheit 28 Klappe 29 Zuleitungen 30 Shutter