PROCEDIMIENTO Y DISPOSITIVO DE REGISTRO AUTOMÁTICO DE LA LOCOMOCIÓN DE NEMATODOS U ORGANISMOS PEQUEÑOS DE TAMAÑOS SIMILARES POR INTERFEROMETRÍA TEMPORAL DE MICROHACES DE LUZ.

CAMPO DE LA TÉCNICA

La detección y cuantificación automática de la actividad locomotora de organismos diminutos posee aplicaciones en los campos de descubrimiento de nuevos compuestos farmacológicos, veterinarios, agroquímicos, como así también nutracéuticos y estudios de interacciones microbiológicas. Más específicamente, se ha reportado su utilización en ensayos de toxicidad, resistencia a estrés, búsqueda de nuevos antibióticos, antiparasitarios, moduladores de metabolismo y estudios de envejecimiento.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los métodos de detección de comportamiento de organismos pequeños mediante sistemas ópticos se basan principalmente en técnicas de captura y procesamiento de imágenes.

Existen diverso dispositivos y procedimientos para el registro del movimiento de pequeños organismos y hasta células como espermatozoides.

La solicitud de patente china CN 107760757 describe un dispositivo y procedimiento para el registro de los movimientos de nematodos en tiempo real para la evaluación de drogas de efecto antibacteriano. El dispositivo comprende medios emisores de luz, una placa de cultivo poroso, una pluralidad de cámaras, una placa de protección de luz hueca dispuesta sobre la placa de cultivo porosa, y una placa de seis pocilios se coloca en el centro de la estructura superior, y la placa de seis pocilios contiene el inserto microporoso, el medio de cultivo y el nematodo. Para poder registrar, cuantificar y determinar los movimientos del nematodo necesita detectar de manera precisa y clara la silueta de cada nematodo, utilizando específicamente una cámara de alta definición y proceso de imágenes que reconocen el contorno generando archivos de video voluminosos.

La solicitud de patente china CN 103941752 describe un sistema de imágenes de seguimiento automático en tiempo real de nematodos que comprende un dispositivo de fuente de luz (que proporciona iluminación de campo brillante para el nematodo), un dispositivo de movimiento de objetos en movimiento de cuatro ejes, un dispositivo de recolección de imágenes y un dispositivo de control. El dispositivo móvil de objetos en movimiento de cuatro ejes se utiliza para colocar una placa de Petri que contiene un nematodo, que comprende una etapa de traslación de dos ejes y una mesa giratoria, y ajustar la posición en el plano vertical del eje vertical del nematodo de acuerdo con el control instrucción del dispositivo de control principal, lo que hace que la región de interés del nematodo esté siempre en el centro del área de recolección del dispositivo de captura de imágenes.

La patente US4896967 describe un método y dispositivo para el estudio de la motilidad de espermatozoides que comprende una lente de formación de imágenes, una fuente de iluminación que consiste en al menos un LED (preferentemente entre 3 y 12) con un colimador de única abertura para direccionar el haz de luz sobre la muestra, medios de detección de la radiación transmitida y dispersada, entre otros. La radiación emitida por los LED es infrarroja en los 880nm.

La patente US5915332, describe un sistema combinado para detectar y analizar la actividad animal. Combina el uso de una matriz de luz IR con un sistema de desplazamiento de fase ultrasónico. El subsistema de matriz de luz IR se usa para registrar la posición horizontal de un animal dentro de una jaula. En cada dirección (eje X, Y o Z), se fijan veinticuatro pares de transmisores y receptores de luz IR en la pared de la jaula. El movimiento horizontal y la pista del animal se detectan mediante luz infrarroja, las condiciones de cómo la luz infrarroja se interrumpe en el medio por la variación del animal sujeto a medida que el animal se mueve. El circuito de decodificación decodifica los datos del subsistema de matriz de luz IR e inicia un transmisor y receptor de par apropiado del subsistema de cambio de fase ultrasónico para detectar el cambio de comportamiento vertical.

La solicitud de patente US2015204773 describe un sistema para imágenes tridimensionales de objetos móviles (específicamente espermatozoides) contenidos en una muestra que comprende: un sensor de imagen; un soporte de muestra configurado para contener la muestra, el soporte de muestra dispuesto adyacente al sensor de imagen; una primera fuente de iluminación del tipo LED (rojo en los 65nm) que tiene una primera longitud de onda y se coloca en relación con el soporte de la muestra en una primera ubicación para iluminar la muestra; una segunda fuente de iluminación (LED azul en los 470nm) que tiene una segunda longitud de onda, diferente de la primera longitud de onda, y posicionada con respecto al portamuestras en una segunda ubicación, diferente de la primera ubicación. También proporciona un método para el seguimiento tridimensional de objetos móviles mediante la obtención de una pluralidad de cuadros de imagen a lo largo del tiempo de los objetos móviles con un sensor de imagen dispuesto adyacente al portamuestras. La imagen de los objetos móviles se reconstruye digitalmente en función de la iluminación que se origina en la primera y la segunda fuente de iluminación para luego determinar las posiciones x, y, yz de los objetos móviles.

Gernat y col. (2018) desarrollaron un sistema para monitorear automáticamente la trofallaxis con una alta resolución espaciotemporal durante largos períodos de tiempo. El sistema permitió la identificación y el seguimiento confiables de cada individuo en una colonia a partir de secuencias de imágenes digitales. Para detectar la trofilaxis, se utiliza información sobre la posición y orientación de cada abeja para identificar los pares de abejas que estaban en la posición correcta. Las abejas se alojaron en una colmena de observación con paredes de vidrio (a) que contenía un panal de un solo lado y se conectaba a un agujero en la pared que permitía el acceso ilimitado al exterior para alimentarse. La colmena se iluminó con ocho luces LED infrarrojas montadas en un marco de aluminio (b). Para facilitar el análisis automático de la imagen, el panal fue retroiluminado con una serie de luces infrarrojas montadas detrás de la colmena (c, oculta). Las imágenes se grabaron con una cámara monocromática de alta resolución (d) que controlaba las luces infrarrojas a través de un panel de ruptura.

Berh y col. (2017) muestran un sistema de monitoreo de larvas de Drosophila. Utilizan la reflexión interna total frustrada (FTIR, por sus siglas en inglés) en combinación con una configuración de múltiples cámaras / microcomputadoras. Para inducir el efecto FTIR, disponen de 12 LED IR con una longitud de onda dominante de 860 nm. Cuando la luz IR ingresa al cuerpo del animal semitranslúcido, se dispersa por el tejido de la larva. El proceso de dispersión produce rayos de luz con ángulos de incidencia por debajo del ángulo crítico. Estos rayos de luz ya no se reflejan completamente. Están frustrados y pueden pasar a través del cristal que conduce al efecto FTI R. Esta luz es capturada por las cámaras circundantes. Por lo tanto, las imágenes capturadas muestran un alto contraste, ya que solo es visible la luz dispersada por las larvas.

Perni y col. (2018) han desarrollado una amplia plataforma de rastreo de nematodos (WF-NTP), que permite la investigación simultánea de múltiples lecturas fenotípicas en grandes poblaciones de gusanos. El WF-NTP monitorea hasta 5000 animales en paralelo, y la lectura fenotípica incluye múltiples parámetros paralelos. Combinan una cámara monocromática GS3-U3-60QS6M Grasshopper USB 3.0 de 1 "(Point Grey, Richmond, CA; 14 bits; 2736 x 2192 píxeles) con una lente de alta resolución de 16 mm de distancia focal f / 1.8 - f / 16 para obtener una imagen de 6 a 14 cm o un dispositivo de múltiples pocilios con iluminación de campo claro (retroiluminación lateral blanca Al de 8 "x 8") (Edmund Optics Ltd.). Yu y col. (2014) describen una técnica simple y económica de pozos múltiples para obtener imágenes de hasta 24 gusanos de cualquier etapa de desarrollo durante períodos de varios días. Los gusanos individuales se segregan en pequeños pozos de vidrio, lo que permite rastrear a cada animal de forma independiente y en alta resolución. El sistema de imágenes consiste en una cámara, una lente, un iluminador LED y componentes mecánicos. El iluminador era una tira de tira de LED flexible roja (48 cm de largo, 210 lúmenes, longitud de onda máxima 619 nm).

Winbush y col. (2015) diseñaron herramientas de análisis de imágenes para extraer características de movimiento (es decir, actividad, trayectorias, flexiones del cuerpo) y forma (es decir, longitud del cuerpo) de videos grabados durante varios días de múltiples animales que se arrastran en la superficie de una placa de agar. Usando este enfoque de población, se obtienen mediciones de la actividad locomotora circadiana de animales de tipo salvaje y mutantes de Caenorhabditis elegans inducida por ciclos de temperatura. La configuración de imágenes consiste en una cámara digital, una lente, un iluminador LED de luz roja y partes mecánicas. Los animales en la placa de ensayo se iluminan utilizando un anillo LED de luz roja de ángulo bajo con un diámetro interno de 110 mm y una longitud de onda de luz de 630 nm. Esta iluminación de campo oscuro mostraba a los animales como objetos blancos sobre un fondo relativamente oscuro.

La solicitud internacional AR058206 (A1) (del mismo inventor de la presente invención) describe un procedimiento y dispositivo para el registro locomotor de organismos pequeños, registro de comportamiento obtenido y uso del mismo. El procedimiento consta de hacer incidir un microhaz de luz infrarroja (l=940 nm, con potencia igual o menor a 1 mW/cm2) sobre el recipiente (placa de microtitulación de 96 pocilios, donde hay 1 gusano por pocilio; extrapolare a placas de entre 12 y 1536 pocilios) donde se encuentra el pequeño organismo (nematodo) y la detección de la dispersión de la luz generada por la difracción del cuerpo del organismo. Cada pocilio debe ser irradiado por al menos un microhaz. Posteriormente la señal se procesa digitalmente para determinar la actividad locomotora del organismo. Para generar los microhaces, se debe hacer incidir el haz proveniente de al menos un LED sobre una matriz con microagujeros. La matriz de microagujeros está comprendido por una placa acrílica (2, 5 mm de ancho) con microagujeros de 100 pm alineados con los LED. La luz dispersada por el cuerpo del organismo cuando este pasa por el microhaz es detectada por fototransistores. Esta patente, si bien utiliza microhaces de luz para detectar el pasaje de microorganismos móviles por refracción y tiene un índice de señal/ruido adecuado para medios líquidos con baja absorbancia en el espectro infrarrojo, su índice señal/ruido pierde sensibilidad al utilizarse con otros medios más difusos como los sólidos, semisólidos o particulados, tampoco es posible, mediante el dispositivo y método empleado poder determinar la posición espacial de más de un organismo por recipiente. El método aquí propuesto es superador en cuanto a la resolución espacial obtenida, además de lograr una mayor sensibilidad de detección (>1.5x comparado al método original) permitiendo una mayor señal a ruido con el umbral de fondo y mejorando la detección de los organismos, y por consiguiente su actividad locomotora, en medios de cultivo semiopacos tales como agar o cultivos de bacterias.

Ninguno de los documentos citados menciona o sugiere el empleo de una grilla de microhaces paralelos adyacentes, ni hace mención a la mejora en la relación señal/ruido generada por el efecto de interferometría de microhaces de luz para detectar el movimiento de los organismos, ni es posible de utilizar con sistemas de detección de baja resolución.

De esta manera, la presente invención provee un procedimiento y dispositivo que utiliza una configuración tal que permite un efecto de amplificación de la relación señal/ruido para la detección del movimiento de organismos diminutos mediante una grilla de microhaces paralelos adyacentes, capaz de ser utilizados con sistemas de detección de baja resolución y procesamiento en tiempo real.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Esquema de dispositivo de seguimiento de la actividad locomotora.

Figura 3: Procesamiento de la señal para obtener la cuantificación de la actividad locomotora. A: bloque esquemático del flujo de procesamiento. B: representación gráfica del procesamiento de la señal.

Figura 4: Registro continuo de la actividad locomotora de 25 C.elegans adultos cultivados en placas de cultivo sólido (NGM) para 2 condiciones del tóxico levamisol.

Figura 5: Mediciones de envejecimiento y localización gráfica XY de los organismos: 20 gusanos adultos fueron cultivados en placas de 35mm durante 10 días y registrados por 30 minutos, 1 vez al día.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un procedimiento para seguir la actividad locomotora de nematodos u organismos pequeños de tamaños similares que comprende las siguientes etapas: a. disponer de una pluralidad de organismos pequeños que deben ser registrados en un recipiente que comprende al menos un receptáculo donde se colocan al menos un organismo;

b. irradiar dicho recipiente con una pluralidad de microhaces de luz paralelos y adyacentes entre sí, separados por una distancia de hasta 4 mm, con las características adecuadas para producir una interferencia mensurable con el cuerpo del organismo sin alterar el comportamiento o fisiología del organismo, donde dichos microhaces son generados por luz previamente filtrada a través de una grilla de microagujeros que precede al recipiente;

c. detectar la intensidad o la potencia de los microhaces que cruza el recipiente;

d. determinar si hay fluctuación o atenuación en la intensidad o potencia de los microhaces medidos causada por la interferencia del cuerpo del organismo cuando alguno de dichos microhaces lo atraviesa, de acuerdo con un umbral de detección, e. y registrar la actividad locomotora, incluyendo la forma y la localización espacial del movimiento del organismo ubicado dentro del recipiente, sobre la base de la determinación de fluctuaciones de los parámetros determinados de los microhaces.

Donde el recipiente contiene un medio de cultivo, con una absorbancia óptica baja en el rango óptico de la longitud de onda de los microhaces. Preferentemente, dicho medio de cultivo es seleccionado del conjunto comprendido por: axénico, complejo, con fuente de alimento vivo, líquido, semisólido, y sólido.

Por otra parte, dichos microhaces de luz son infrarrojos. En una forma de realización de la presente invención, dichos microhaces de luz son generados por al menos una lámpara LED infrarroja que emite la radiación infrarroja y dicha radiación es separada en microhaces mediante una grilla de microagujeros, con una longitud de onda de entre 700 a 1000nm, preferentemente, comprenden una longitud de onda de entre 850 a 950nm. La potencia de dichos microhaces de luz es menor que 10mW/cm2.

En otra forma de realización de la presente invención, dichos microhaces son generados por una pluralidad de LEDs, cada uno separado por una distancia de entre 1 a 5mm.

En otra forma de llevar a cabo la presente invención dichos microhaces son generados por una pluralidad de entre 1 a 1000 LEDs, cada uno separado por una distancia de entre 1 a 5mm.

De acuerdo a una forma de realización de la presente invención, dicha grilla de microagujeros comprende un espesor de al menos 1 mm, y dichos microagujeros comprenden diámetro de un entre 50 y 150pm separados por una distancia de hasta 1 mm entre sí, preferentemente dicha distancia de separación es de hasta 0,5mm. De forma preferida, dicha grilla de microagujeros puede ser un material oscuro, con baja transmitancia en el espectro de la fuente de luz.

En otro aspecto alternativo de realización de la presente invención, previo al filtrado de la luz, los microhaces de luz se homogenizan mediante un difuminador.

Además, la presente invención comprende un sistema de detección que incluye la conversión de la señal medida a un valor analógico directamente proporcional a la luz incidente. También, sistema de conversión análogo digital de la luz incidente, donde dicho sistema de conversión comprende al menos una cámara con resolución de al menos 100x100 pixeles.

Por otra parte, las etapas de detección de la fluctuación o atenuación en la intensidad o potencia de los microhaces medidos y de registro de la actividad locomotora del organismo incluyen:

a. adquirir al menos dos imágenes a tiempos diferentes;

b. calcular la diferencia entre ambos tiempos para cada pixel;

c. estimar para cada uno de los pixeles si el valor absoluto de las diferencias es superior a un valor de umbral, donde dicho valor de umbral es determinado empíricamente como el valor máximo de ruido obtenido en placas que no contienen organismos; incrementar un contador específico de cada pixel en caso que se supere el umbral; d. calcular la actividad total mediante la suma de todos los contadores calculados en dicho paso c).

La presente invención, además, describe un dispositivo para medir la actividad locomotora de nematodos u organismos pequeños de tamaños similares, que comprende:

un recipiente con al menos un recipiente adecuado para cultivar dichos organismos;

una pluralidad de respectivos medios generadores de microhaces infrarrojos (1); una grilla de microagujeros de al menos 1 mm de espesor, donde dichos microagujeros comprenden un diámetro de entre 50 y 150pm separados por una distancia de hasta 1 mm entre sí;

al menos un medio receptor de microhaces infrarrojos (4);

unos medios de circuitos receptores para detectar variaciones en la señal de salida; y un registro vinculado a la salida de los medios de circuitos detectores para registrar la actividad locomotora, forma y posición del movimiento del organismo sobre la base de las variaciones detectadas en la intensidad o potencia de los microhaces.

Donde el receptáculo contiene un medio con absorbancia óptica infrarroja baja. Y donde, dichos medios generadores de microhaces comprende lámparas LED de longitud de onda de entre 850 a 950nm, con una potencia de salida menor que 10mW/cm ² . Además, la separación de dichos microagujeros es preferentemente de hasta 1 mm; más preferentemente, la separación de dichos microagujeros es de hasta 0,5mm entre sí.

En una forma alternativa, el dispositivo de la presente invención, comprende además un difuminador ubicado entre dichos medios generadores de microhaces y dicha grilla de microagujeros.

En un aspecto preferido de realización de la presente invención dicho medio receptor comprende un conversor análogo digital. Este conversor análogo digital comprende una cámara fotográfica o de video que puede ser de baja resolución. Además, comprende un circuito procesador conectado a la salida del conversor análogo digital y contiene algoritmos de procesamiento de la señal de imagen adquirida.

Por otra parte, el dispositivo de la presente invención, puede incluir unos medios para irradiar dichos hábitats con ciclos diarios de luz-oscuridad.

La presente invención, describe además, un registro de comportamiento obtenido por el procedimiento descrito y los usos que pueden ser: caracterización de organismos mutantes, toxicidad de compuestos, mediciones de envejecimiento y/o pruebas farmacológicas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El objeto de la presente invención comprende un procedimiento para seguir la actividad locomotora de nematodos u organismos pequeños de un tamaño de entre 10pm y 20mm. Además comprende un dispositivo mediante el cual es posible reproducir el procedimiento de la presente invención que está representado en la figura 1.

Mediante el procedimiento y dispositivo de la presente invención es posible seguir la actividad locomotora de uno o varios organismos pequeños de manera simultánea. No solo permite conocer y seguir un patrón de movimientos, sino también la forma y la localización espacial del o los organismo/s.

Para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención se deben disponer de los organismos pequeños, que son colocados en un recipiente o superficie. Este recipiente puede ser una placa de cultivo de 35mm de diámetro, o también puede ser microplacas de cultivos conteniendo una pluralidad de receptáculos, o superficies lisas como portaobjetos y tiras plásticas. En una forma preferida, el recipiente es seleccionado de un conjunto comprendido por: placa de cultivo de 35mm de diámetro, microplacas de 384, 96, 48, 12 y 6 receptáculos (pocilios), e incluso portaobjetos.

Dicho recipiente debe contener un medio cultivo que puede ser sólido, semisólido o líquido, axénico, complejo o conteniendo fuente de alimento viva. Preferentemente con absorbancia despreciable (OD<1.0) en el rango de luz en la cual se basa el método de detección.

Posteriormente, se debe hacer incidir una pluralidad de microhaces de luz infrarroja sobre dicho receptáculo conteniendo dichos organismos. Estos microhaces deben ser paralelos y adyacentes entre sí, y además deben estar separados a una distancia no mayor a 1 mm entre sí. Esta distancia es fundamental en el procedimiento de la presente invención debido a que de ello depende la sensibilidad del procedimiento para el registro de la actividad locomotora de los organismos. A distancias de separación menores o iguales a 1 mm, los microhaces son paralelos y adyacentes, esto causa una interferencia entre ellos y como efecto se produce un incremento significativo en la calidad de la señal. A distancias mayores a 1 mm, se pierde la interferencia entre los microhaces debido a que ya no son adyancentes. En la figura 2 se muestra el efecto de amplificación de la relación señal/ruido obtenida en función de la distancia entre los microhaces vecinos. Se puede observar que mientras menor sea la distancia de separación entre los microhaces, mejora significativamente la señal de detección de los microorganismos y por ende el procedimiento posee una mayor sensibilidad.

Dichos microhaces pueden ser generados por al menos una lámpara LED infrarroja, dispuesta por debajo del recipiente. Dichas lámparas LED poseen una longitud de onda que no afectan al organismo. Es conocido en el estado de la técnica que dicha longitud de onda varía entre 700 y 1000 nm. Preferentemente entre 800 y 950nm. En una forma alternativa de realización, la fuente generadora de luz infrarroja es una disposición de lámparas LED de 10 x10 separados entre 0.5 y 10 mm entre sí.

Para generar dichos microhaces a partir de dichas lámparas LED se debe colocar una grilla de microagujeros por la cual se hace incidir la luz infrarroja emitida por dichas lámparas. Esta grilla de microagujeros es de al menos 1 mm de espesor, y comprende al microagujeros de entre 50 y 150pm de diámetro separados por una distancia de hasta 1 mm entre sí. De esta manera los microhaces se generan debido a la incidencia de la luz infrarroja de dichas lámparas LED sobre dicha grilla de microagujeros. Es importante el espesor de la placa ya que al incidir la luz, los microagujeros de la placa de dicho espesor generarán un efecto túnel que hará que los haces sean coherentes entre sí.

En una forma alternativa de realización, dicha grilla comprende una separación de microagujeros de entre 0.1 y 1 mm. Preferentemente dicha la separación es de entre 0,5 y 1 mm.

En una forma alternativa de llevar a cabo el procedimiento de la presente invención, para homogenizar la iluminación del recipiente por los microhaces de luz infrarroja, se puede utilizar un difuminador. Este difumador puede ser realizado en placa acrilica color blanco lechoso de 6mm apoyado justo encima de los leds y antes de la placa con microagujeros.

Luego de que los microhaces inciden y atraviesan dicho recipiente conteniendo los organismos y medio de cultivo, la intensidad de algunos de los microhaces cambia debido a que impactan con el organismo a seguir. Este cambio en la intensidad o también llamado variación, interferencia o perturbación de los haces de luz luego de atravesar el cuerpo del organismo, es sensado por un medio receptor o sensor que comprende un sistema de conversión análogo digital de la luz. Este sistema comprende una cámara de fotografía o de video que puede ser de baja resolución. A dicha cámara puede adosarse un lente asférico para mejorar el direccionamiento de los haces. La información de la intensidad de pixeles es recogida por un sistema de adquisición basado en placa Arduino-Mega™ o equivalente, a una tasa de adquisición de 1 cuadro por segundo y transmitida a 1 Mega Baudio a un ordenador asociado.

Para poder analizar las fluctuaciones sensadas, se debe proceder de acuerdo al esquema representado en la figura 3. Brevemente, se deben adquirir al menos dos imágenes a tiempos diferentes; luego se debe calcular la diferencia entre ambos tiempos para cada pixel. Posteriormente se debe estimar para cada uno de los pixels si el valor absoluto de las diferencias es superior a un valor de umbral, donde dicho valor de umbral es determinado empíricamente como el valor máximo de ruido obtenido en placas que no contienen organismos, e incrementar un contador específico de cada pixel en caso que se supere el umbral; y por último, calcular la actividad total mediante la suma de todos los contadores calculados.

Para poder extraer el movimiento de los organismos en el medio, se realiza una sustracción de cuadros de imágenes consecutivos. La imagen resultante contendrá el valor de diferencia de pixeles. A fin de distinguir los organismos del ruido de fondo de la adquisición se busca que el valor de diferencia de pixeles cambie significativamente respecto a la señal de ruido de fondo (determinada empíricamente como el valor umbral), tal como se ilustra en la figura 3A. Al detectar un evento de movimiento debido a la variación de la intensidad de los microhaces salientes del recipiente, se incrementa un acumulador de actividad global, además de guardar los datos en una matriz XY que indica los lugares espaciales donde se detectó actividad. Una vez barrida toda el área, se informa la actividad locomotora detectada, finalizando el cálculo mediante la integración de actividad. De esta manera, se obtendrá un conteo dinámico de la actividad locomotora de la población de los nematodos en el tiempo con información espacial de su movimiento. Esta información espacial toma relevancia al momento de hacer estudios de distribución poblacional en ensayos de quimiotaxis, estudios sociales o modelos de enfermedades que afectan los patrones de movimiento. Además, es un dato clave en la aplicación de algoritmos que realicen el seguimiento de organismos individuales.

Para realizar el procedimiento anteriormente descrito, es necesario un dispositivo (representado en la figura 1) que cuente con:

Fuente de iluminación constituida por una pluralidad de lámparas LED infrarrojas (1 1) de potencia y longitud de onda de acuerdo a lo descrito previamente;

Una placa microperforada (grilla de microagujeros) para generar los microhaces de luz paralelos y adyacentes entre sí (12);

Receptáculo de alojamiento de los organismos (13);

Organismo/s pequeño/s a monitorear (14), los que son atravesados por los microhaces paralelos de luz (15) y cuyo movimiento es posteriormente sensado;

Medio/s receptor/es de luz (sensor) (16) que capta/n las alteraciones en los microhaces que atraviesan el receptáculo conteniendo los organismos. Este medio sensor comprende un medio de conversión análogo digital que a su vez puede estar constituido por una cámara de baja resolución, por ejemplo, una ov7670 de 640x480pixels, funcionando a una resolución de 140x140pixels.

Circuitos receptores (microcontrolador) para captar, detectar las variaciones, y enviar (17) a un medido de registro (18), que adquiere los datos y los procesa de acuerdo a un algoritmo de análisis matemático para detectar movimiento.

Los siguientes son ejemplo de realización de la presente invención los que deben ser tomados como tales sin limitar el espectro de protección.

Ejemplo 1. Forma preferida de realización de la invención. Para la realización de la experiencia se construyó el dispositivo de acuerdo a la figura 1. A este modelo se le agregó una placa difuminadora. A continuación se detalla el procedimiento y las características de cada uno de los componentes del dispositivo de la presente invención.

Para el registro o seguimiento de la actividad locomotora se utilizó como organismo pequeño el nematodo C.elegans. Se colocó en un medio de cultivo semisólido llamado NGM (Nutrient Growth médium). Dicha aplicación es totalmente válida para organismos del mismo orden de tamaño con el ajuste de las condiciones de cultivo correspondientes.

A fin de cuantificar el comportamiento poblacional, se alojan 20 gusanos adultos en un recipiente de un receptáculo, como una placa de Petri de 35mm con 3ml de medio NGM + monocapa de bacteria Escheríchia coli (cepa OP50) como alimento de los nematodos. El procedimiento también es válido para otros formatos de recipientes, como microplacas de 384, 96, 48, 24, 12 y 6 pocilios; con diferentes medios de cultivo sólidos, semisólidos y líquidos.

Al recipiente conteniendo a los nematodos se los ilumina con una grilla de microhaces infrarrojos (longitud de onda lumínica monocromática de entre 850 a 950nm) que no afecta al comportamiento de los animales, permitiendo una medición no invasiva. Se han utilizado satisfactoriamente como emisores de luz formado por una disposición de 10x10 lámparas LED OSRAM SFH 4356 (850nm) separados 4.5mm entre sí, y alimentados con una corriente pulsante de 10mA 1 Khz. Esta configuración permite una emisión infrarroja de 1 mW a 8mW por LED. Se observó mejor homogeneización de la iluminación LED mediante el uso de un difuminador realizado en placa acrílica color blanco lechoso de 6mm dispuesta justo por encima de los LED y antes de la grilla con microagujeros. La grilla con microagujeros ha sido realizada por un sistema de pantógrafo corte láser, conteniendo microagujeros de 100 pm de diámetro separados 0.5mm entre sí, realizados en una placa plástica de alto impacto negro de 2mm de espesor.

Luego de atravesar el medio de cultivo, los haces son capturados por un sistema de conversión análogo digital de la luz. En el caso ejemplo, se utilizó una cámara CCD de resolución 640x480 pixeles (módulo de cámara ov7670, Omnivision ® o similar) con una configuración de adquisición de datos de luminancia a una resolución de cuadro QCIF (176 x 144 pixeles). A dicha cámara puede adosarse un lente asférico para mejorar el direccionamiento de los haces. La información de la intensidad de pixeles es recogida por un sistema de adquisición basado en placa Arduino-Mega™ , a una tasa de adquisición de 1 cuadro por segundo y transmitida a 1 MB audio a una PC asociada. La señal adquirida es procesada en un ordenador personal tipo IBM por un programa ad hoc realizado en Visual Basic (.NET), pudiendo también utilizarse sistemas de captura en Python en otras plataformas.

El procesamiento de la imagen capturada se lleva a cabo en tiempo real de acuerdo al algoritmo descrito en la figura 3 que comprende los siguientes pasos: i. se adquieren los valores de intensidad lumínica de la imagen a través de una comunicación Serial con el microcontrolador ARDUINO y se guardan en un array de memoria, indexados con su par de posición espacial XY correspondiente

¡i. A los valores individuales de intensidad, se le resta el valor de la imagen previa (n-1) y se guarda la diferencia en otro vector llamado delta_imagen(x,y)

MI. se hace un bucle de barrido del vector delta_imagen(x,y) comparando con un valor_umbral. Si para cada punto, el valor absoluto del vector delta_imagen(x,y) es mayor al valor_umbral, entonces se incrementa un contador específico para dicha posición espacial de la imagen: contador(x.y) = contador(x,y)+1 iv. Al finalizar el bucle de barrido se hace la sumatoria de todos los contadores (x,y) y se los guarda en otro array Actividad_total(t) que posee un índice de tiempo adosado. v. se repiten los pasos anteriores hasta finalizar el periodo de adquisición deseado por el usuario, que puede variar de 1 minuto a varios días. vi. Al finalizar el periodo de adquisición, se reporta en una tabla la actividad_total(t) con su valor de tiempo correspondiente. Con esta información el usuario podrá graficar una cinética de actividad de los organismos en un gráfico de actividad vs tiempo, o podrá integrar estos valores para obtener la actividad global en el periodo determinado.

Ejemplo 2. Aplicación del registro para la medición del efecto de toxicidad de compuestos.

El experimento se llevó a cabo de acuerdo al ejemplo 1 con las modificaciones necesarias para evaluar la toxicidad de ciertas drogas en los nematodos. Como recipiente, se utilizó placas de Petri de 35mm con NGM conteniendo concentraciones de Levamisol (antiparasitario de efecto conocido) a concentraciones de OmM, 0.1 mM y 0.2mM por duplicado. Luego de agregar 25 gusanos a cada placa, se midió la actividad locomotora por el lapso de 2 horas. Luego se gráfico la actividad acumulada en bloques de 10 minutos para todas las placas. En la figura 4 puede apreciarse un registro continuo de la actividad locomotora de 25 C.elegans adultos cultivados en placas de cultivo sólido (NGM) para 2 condiciones del tóxico levamisol. Cada punto consiste en el promedio de duplicados experimentales, agrupando la actividad en bloques de a 10 minutos. Puede apreciarse que los controles (placas sin tratar) presentan una actividad constante en el tiempo, mientras que 0.1 mM y 0.2mM decaen rápidamente de manera dosis dependiente.

Ejemplo 3. Aplicación del registro para la medición del envejecimiento de nematodos. Se utilizó al modelo C.elegans como animal experimental debido a su tasa de envejecimiento elevada. Para el experimento se utilizaron como recipiente, placas de Petri de 35mm con NGM con 100uM de FuDr (Fluorodeoxiuridina, inhibidor de la reproducción de los nematodos)+ E.Coli (OP50) por sextuplicado. Se agregaron 20 gusanos larva 4 (L4) a cada placa y se midió la actividad locomotora de cada placa 1 vez al día, 1 hora, por 10 días consecutivos a partir del día 3 de adulto; agregando una gota de OP50 adicional cada 6 días para evitar el hambreado de los mismos. En la figura 5 puede apreciarse que el dispositivo y procedimiento son capaces de detectar el decaimiento de la actividad locomotora con la edad de los gusanos, con relevancia en el campo de descubrimiento de nuevas drogas y genes involucrados en el retardo del envejecimiento y/o senescencia. En la figura 5A se observa para 3 días diferentes los puntos XY de captura de las placas experimentales en donde se ha detectado movimiento a diferentes mediciones temporales. Las manchas negras dentro del círculo corresponden a píxeles que han sobrepasado el umbral de detección en el periodo de 30 minutos. Puede apreciarse que el decaimiento de la actividad poblacional con la edad de los nematodos es detectable por este método. En la figura 5B gráfico de barras mostrando la cuantificación de la actividad locomotora (duplicados experimentales) y su decaimiento con la edad de los nematodos.