Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zellprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur sowie eine Vorrichtung zur Zellprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur. Die vorliegende Erfindung findet ihre Anwendung insbesondere bei der Untersuchung der Auswirkungen von neuen Medikamenten, potentiell toxischen Stoffen und anderen Substraten auf lebende Zellen, insbesondere menschliche oder tierische Zellen. Dies stellt ein Hauptaufgabengebiet der Verträglichkeitstestungen neuer Wirkstof- fe dar. Solche Untersuchungen erfolgen zunächst an im Labor isolierten und gezüchteten Zellkulturen, an denen die Verträglichkeit solcher Substanzen getestet wird, bevor sie am Menschen oder am Tier selbst erfolgen. Entsprechende Untersuchungen, d.h. Verfahren zur Zellprobendiagnostik an Zellproben oder Zellkulturen, sind be- kannt.

Bei bekannten Verfahren zur Zellprobendiagnostik werden gezüch- tete Zellen mit dem zu untersuchenden Stoff inkubiert und es wird beobachtet, welche Auswirkungen die Stoffe auf die Vitalität der Zellen haben. Untersucht wird dabei das Verhalten von Zellen nach Zugabe von Testreagenzien, die die Vitalität, die Stoffwechselleis- 5 tungen oder einzelne Funktionen der Zellen insgesamt beurteilen lassen. Anstelle oder zusätzlich zu der Zugabe von zu untersuchenden Stoffen können auch beispielsweise physische oder physikalische Reize angewandt werden, wie beispielsweise die Anlegung elektromagnetischer Wechselfelder, eine Steuerung von Lichtinten-o sität oder Temperatur und dergleichen, was jeweils entweder für die gesamte Zellprobe oder Zellkultur oder lokal begrenzt erfolgen kann.

In einer bekannten Klasse von Verfahren zur Zeilprobendiagnostik5 werden durch Zugabe von Farbstoffen lebendige und tote Zellen voneinander differenziert. Diese Farbstoffe bzw. Änderungen von Farbtönen werden üblicherweise in der Zellsuspension insgesamt gemessen. Es können jedoch auch einzelne Zellen fluoreszenzoptisch oder mikroskopisch untersucht werden. Abgestorbene Zelleno können auch ohne Farbzusätze in einigen Fällen lichtmikroskopisch erkannt werden.

Die Messung von Stoffwechselleistungen von Zellen erfolgt in der Regel durch die Zugabe von Substraten, die durch die Zellen umge-5 setzt werden. Die Stoffwechselleistung wird in diesem Fall indirekt über das Ausmaß der Umsetzung der zugegebenen Substrate gemessen. Konzentrationsänderungen von Testsubstanzen in der gesamten Zellsuspension geben Aufschluss über die Aktivität der Zellen. Außerdem sind bei speziellen Fragestellungen Messungen vono elektrischen Potentialen auf Zelloberflächen möglich, die indirekt

Aufschluss über den Zustand der Zellen in der Kultur geben. Mit Ausnahme der lichtmikroskopischen Diagnostik von toten Zellen beruhen alle messtechnisch bisher verwendeten Verfahren auf der Zugabe von Testsubstanzen oder der Einbringung von Testvorrichtungen in die Zellkultur, zusätzlich zur Einbringung der zu untersu- chenden Wirkstoffe bzw. Schadstoffe. Diese Testsubstanzen, meistens Farbstoffe oder radioaktiv markierte Testsubstanzen, greifen selbst mit in die Testumgebung ein und sind oft selbst toxisch, so dass sie die ermittelten Testergebnisse in erheblichem Maße verändern können. Die Testergebnisse beruhen daher nicht alleine auf der Reaktion der Zellen auf die untersuchenden Wirk- bzw. Schadstoffe. Es ist oft nicht bekannt, inwieweit die Applikation der Untersuchungsreagenzien die eigentliche Interpretation der Ergebnisse verändert. Weiterhin ist bei bekannten Verfahren meist nur ein einzelner Test mit einer Zellprobe gleichzeitig möglich. Langzeitbeobachtungen mit einer wiederholten Applikation von Testsubstanzen und Farbstoffen sind hingegen oft nicht möglich. Mit bekannten Testverfahren, insbesondere bei der Messung von

Farbumschlägen in der gesamten Zellkultur oder dem gelösten Überstand, ist die Ortsauflösung häufig nicht ausreichend, um Zellschädigungen im Einzelnen zu begutachten. Viele Testverfahren beruhen auf der Messung der Freisetzung von intrazellulären Enzymen und Eiweißen. Diese Freisetzung erfolgt mit der Auflösung der Zellmembran, also zu einem sehr späten Zeitpunkt, wenn die Zelle bereits komplett abgestorben ist und die Integrität der Zellwand aufgehoben ist.

Bei der Verwendung von Zellkulturgemischen ist eine Zuordnung von bei Zelltod freigesetzten Substanzen zu den einzelnen Zellarten - A -

aufgrund der fehlenden Ortsauflösung dieser Tests nicht möglich. Dadurch bedingt sind lediglich Aussagen zur gesamten Zellkultur möglich. Eine gewisse Differenzierung ist über färberische Verfahren zum

Nachweis des Zelluntergangs prinzipiell auch mit einer entsprechenden Ortsauflösung unter dem Mikroskop möglich. Jedoch zeigen unterschiedliche Zellarten häufig auch ein unterschiedliches färberisches Verhalten, so dass eine sichere Interpretation der Er- gebnisse nicht immer möglich ist.

Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit der eine Zeilprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur ermöglicht wird, mit denen eine schnelle, genaue und schadensspezifische sowie zelltypenspezifische ortsaufgelöste Analyse möglich ist.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Zellprobendiag- nostik an einer Zellprobe oder Zellkultur, das dadurch weitergebildet ist, dass a) wenigstens ein Ausschnitt der Zellprobe oder Zellkultur über einen vorgebbaren Messzeitraum videomikroskopisch erfasst wird, b) wenigstens eine Zelle der Zellprobe oder Zellkultur im erfass- ten Videosignal über wenigstens einen Teil des Messzeitraums individualisiert wird, c) wenigstens eine Eigenschaft der wenigstens einen individualisierten Zelle mit ihrer zeitlichen Veränderung erfasst wird, d) die mit ihrer zeitlichen Veränderung erfasste Eigenschaft der individualisierten Zelle mit wenigstens einem Vergleichswert bezüglich der erfassten Eigenschaft verglichen wird und e) aus der Übereinstimmung oder Abweichung der erfassten Eigenschaft der individualisierten Zelle mit oder von dem Vergleichswert der Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustand der Zelle und dessen zeitliche Veränderung bestimmt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Beobachtung, dass sich tierische und menschliche Zellen bei Änderung ihrer Umgebung nach speziellen Verhaltensmustern verhalten und bewegen. Neben für den Zelluntergang charakteristischen Veränderungen der Zellform sind für bestimmte Schädigungsmuster etwa spezifische

Veränderungen der Bewegungen bzw. Bewegungs- oder Verhaltensmuster der Zellen nachzuweisen. Diese Änderungen der Verhaltensmuster werden mit dem Videosignal erfasst und bezüglich ihrer zeitlichen Veränderung oder Veränderlichkeit ausgewertet. In ein- zelnen Eigenschaften sind diese zeitlichen Veränderungen und die

Dynamik dieser Veränderungen sehr charakteristisch und signifikant, so dass eine geringe Anzahl von individualisierten Zellen bereits ausreicht, unter Umständen bereits auch eine einzelne individualisierte Zelle.

Für das erfindungsgemäße Verfahren werden tierische oder humane Zellen oder andere Zellen auf einer Glasplatte, in einer Petrischale oder in einer Speziallösung, beispielsweise einer speziellen Nährlösung gehalten. Geeignete Probenträger sind beispielsweise auch Knochenersatzstoffe oder andere Trägermaterialien, die beispielsweise für Biokompatibilitätstests eingesetzt werden. Typische Zelltypen, die in dieser Weise untersucht werden, sind beispielsweise Bindegewebszellen, Leberzellen, Bauchfellzellen, Blutzellen oder Nervenzellen, wobei die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht auf diese Zelltypen beschränkt ist. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der optischen Erfassung von Zellen in wenigstens einem Ausschnitt der Zellprobe bzw. Zellkultur, die eine Kultur von Einzelzellen oder ein Zellenteppich bzw. Zellrasen oder eine mehrdimensionale Rekonstruktion von Zellhaufen oder Zellen auf Trägermaterialien sein kann. Die Erfas- sung erfolgt beispielsweise im optisch sichtbaren Bereich über

Grauwertanalysen oder über Farbnuancen. Neben der Lichtmikroskopie sind auch die Phasenkontrastmikroskopie, die Fluoreszenzmikroskopie sowie auch die Laser-Raster-Mikroskopie zur Anwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Die Laser- Raster-Mikroskopie bietet insbesondere die vorteilhafte Möglichkeit, dreidimensionale Aufnahmen auszuwerten.

Die Auswertung des Videosignals kann on-line während der Aufnahme erfolgen oder off-line anhand der abgeschlossenen Video- aufnähme.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann alleine durchgeführt werden oder mit herkömmlichen Verfahren, die oft noch parallel durchgeführt werden, verglichen werden. Es ermöglicht den u. a. auch direk- ten Vergleich der Auswirkungen verschiedener Wirkstoffkonzentrationen und die Bewertung der Reaktionen der Zelle darauf.

Eine erfindungsgemäß erfasste Eigenschaft ist vorzugsweise eine Zellform, ein Zeilumfang, eine Zellfläche, eine Anzahl oder Größe von Zellausläufern, ein Verhältnis von Größen von Zellausläufern, eine Lokalisation des Zellkerns im Zellplasma, ein Größenverhältnis von Zellkern zu Plasma, ein Verhältnis von Zelloberfläche zu Zell- ausläufern, ein Bewegungsmuster mit einer Bewegungsrichtung und einer Bewegungsgeschwindigkeit oder eine Anzahl von Zellteilungen oder Zellverschmelzungen. Bei Kontakt mit Reiz-, Wirk- oder Schadstoffen sind diese Größen charakteristisch veränderlich.

In einer vorteilhaften Ausbildung ist eine erfasste Eigenschaft ein Bewegungsmuster mit Ortsveränderungen, wobei Interaktionen zwischen Nachbarzellen erfasst werden, insbesondere zwischen verschiedenen Zellen desselben Typs und/oder zwischen Zellen ver- schiedenen Typs und/oder Spezies, oder wobei das Verhältnis von

Eigenbewegung der wenigstens einen individualisierten Zelle zu Zellkollektivbewegungen erfasst wird. Beispielsweise ist eine charakteristische Reaktion auf einen lokalen Stimulus eine Bewegung der Zelle von einem Schädigungsreiz weg oder auf einen Lockstoff zu. Auch kompliziertere Reaktionsmuster treten bei der Ortsveränderung von Zellen bzw. der Veränderung ihrer Interaktionen auf, bei denen auch zwei oder mehr der oben genannten Eigenschaften in bestimmter weise sich verändern. Die genannten Parameter sind typische Parameter der Zellerscheinungsform und des Bewegungs- und Aktivitätsmusters der Zellen, die auf den Zusatz von Stoffen oder physikalischen Reizen reagieren. So kann sich eine Zelle, die geschädigt wird, entweder ausbreiten oder zusammenziehen, der Zellkern kann seine Form oder Grö- ße verändern, die Aktivität der Ausläufer und die Anzahl und das

Ausmaß der Ausläufer können sich verringern oder vergrößern, die Anzahl der Zellkontakte, Verschiebung von Nachbarzellen, Durchdringung von Zellansammlungen oder Nachbarzellen, Zellverschmelzungen, Abstoßungen, Zellteilungen oder Auflösungen kann sich vergrößern oder verkleinern, geschädigte individualisierte Zellen können sich entgegen Zellkollektivbewegungen bewegen usw. Es gibt eine Vielzahl möglicher Veränderungen dieser Parameter, die für den jeweiligen Zelltyp und für das jeweilige Schädigungsbild charakteristisch sind.

Die erfindungsgemäße Analyse der individualisierten Zelle bzw. ZeI- len beruht auf einer, insbesondere dynamischen, Vermessung der

Zellform und deren Veränderungen. Dazu ist in einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass die videomikroskopische Erkennung von Eigenschaften der individualisierten Zelle anhand von Einzelaufnahmen des Videosignals, insbesondere automatisch, geschieht, wobei zu jeder Einzelaufnahme des Videosignals eine oder mehrere der folgenden Schritte kumulativ ausgeführt werden: a) Detektion der Zellwand und insbesondere Berechnung des Flä- cheninhalts der Zelle, sowie insbesondere Bestimmung der Position der Zelle im erfassten Ausschnitt, b) Detektion des Zellkerns und der Zellkerngrenze und insbesondere Berechnung des Flächeninhalts des Zellkerns, der Kern- Plasma-Relation und/oder der Orientierung des Zellkerns in der

Zelle, c) Detektieren von Zellorganellen und/oder Einschlüssen und Bestimmung ihrer Position relativ zum Zellkern und der Zellwand.

Unter kumulativer Ausführung wird in diesem Zusammenhang verstanden, dass wenigstens der Verfahrensschritt a), oder die Verfahrensschritte a) und b) oder die Verfahrensschritte a), b) und c) ausgeführt werden.

Die genannten Schritte betreffen die Erkennung der geometrischen Verhältnisse der Zelle im Einzelbild des Videosignals, deren Verän- derung in der Abfolge der Einzelbilder untersucht wird. So erlaubt die Detektion der Zellwand gleichzeitig auch die Ermittlung von Zellausläufern und die Berechnung eines geeignet berechneten Zellausläufer-Indexes, insbesondere in Relation zur Oberfläche der Zelle. Aus den gewonnenen geometrischen Daten der Zelle und des

Zellkerns sowie der Zellorganellen lassen sich wesentliche Eigenschaften ableiten.

Zur Detektion der Zellwand bzw. des Zellkerns gehört insbesondere auch die Detektion des Ortes, an dem sich die Zelle bzw. der Zellkern befindet, so dass auch eine Absolutbewegung der gesamten Zelle oder des Zellkerns von einer Einzelaufnahme zur nächsten nachverfolgt werden kann. Vorzugsweise ist eine erfasste Eigenschaft eine Zeit, eine Zeitspanne, eine Frequenz oder eine Häufigkeit, in der oder mit der sich eine erfasste Eigenschaft ändert. Damit wird die Dynamik der Änderungen besonders gut erkennbar. Die Dynamik der Änderungen der er- fassten Eigenschaften bildet einen wichtigen Bestandteil des erfin- dungsgemäßen Verfahrens.

Vorzugsweise sind die Vergleichs werte Momentaufnahmen von er- fassten Eigenschaften oder zeitliche Entwicklungen von erfassten Eigenschaften aufgrund bekannter Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustände und/oder deren Änderungen. So kann untersucht werden, ob das Ausmaß und/oder Schnelligkeit einer gemessenen Änderung von erfassten Eigenschaften einem bekannten Schädigungszustand entspricht, oder ob sich die Änderung innerhalb der normalen Bandbreite von vitalen bzw. gesunden Zellen be- findet. Dabei wird die Variabilität der Eigenschaften bei gesunden oder bei geschädigten Zellen berücksichtigt. Bevorzugterweise wird die Erfassung von Eigenschaften und deren Vergleich mit Vergleichswerten für mehrere, insbesondere einen Zellverband bildende, individualisierte Zellen vorgenommen, wobei vorzugsweise zwischen 5 und 500 Zellen, besonders bevorzugt zwi- sehen 10 und 100 Zellen untersucht werden. Die Untersuchung erfolgt insbesondere Stichprobenhaft. Die Untersuchung einer Vielzahl von Zellen erlaubt eine Verbesserung der statistischen Datenbasis und daher eine Verbesserung der Aussagekraft der Untersuchung. Insbesondere zusätzlich zur Untersuchung von Monokulturen kann auch die Untersuchung von Kulturgemischen mit verschiedenen Zellarten erfolgen, wobei die hohe Ortsauflösung bzgl. des Zelltyps und der Interaktionen der einzelnen verschiedenen Zellen besonders vorteilhaft ist. Dazu ist vorzugsweise die Zellprobe oder ZeII- kultur eine Mischkultur aus wenigstens zwei unterschiedlichen Zelltypen oder Zellarten. Auch drei bis fünf verschiedene Zellarten können auf diese Weise untersucht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei nach oben theoretisch nicht begrenzt. Die Leistungsfähigkeit der verwendeten videomikroskopischen Vorrichtung und die Rechenkapazität der zur Analyse eingesetzten Datenverarbeitungsanlagen setzen der Anzahl verschiedener gleichzeitig zu untersuchender Zellen und insbesondere Zelltypen allerdings eine obere Grenze. Eine Untersuchung anhand von Kulturgemischen kann in der Praxis etwa auch auf eine Untersuchung von zunächst nur einem Zelltyp folgen.

Vorzugsweise findet die videomikroskopische Erfassung statt, während die Zellkultur inkubiert wird, insbesondere mit einer chemischen oder pharmakologischen Substanz und/oder unter Einwirkung eines oder mehrerer physikalischer Reize.

Vorzugsweise stammt der Vergleichswert von einer Zelle desselben Zelltyps, dessen Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustand bekannt ist. Alternativ oder zusätzlich dazu stammt der Vergleichswert von derselben Zelle oder einer Zelle desselben Zelltyps aus dem erfassten Ausschnitt zu einem früheren Zeitpunkt innerhalb des Messzeitraums. Die beiden Alternativen können bei mehreren erfassten Eigenschaften auch gemischt werden. Die zunächst genannte Alternative ist besonders bei bekannten Zelltypen vorteilhaft, für die Referenzwerte bekannt sind. Die letztgenannte Alternative ist vorteilhaft, da so auch relative Veränderungen bei der Beobachtung von Zellen während der Inkubation mit bisher unbekannten Wirkstoffen erfasst werden können, die für Aussagen zur Beurteilung der Wirkung von eingebrachten Stoffen unter Umständen ausreichen. Außerdem kann so die Dynamik bei bisher unbekannten Zellen untersucht werden, etwa bei der Beschreibung des Wachstums von Tumorzellen eines Patienten und Charakterisierung der Auswirkungen verschiedener Medikamente auf diese Zellen. Da es sich um patientenspezifische Tumorzellen handelt, sind in der Regel keine Vergleichsdaten für diese spezielle Zellreihe vorhanden, die Auswirkungen von Stoffen auf diese Zellen, sind jedoch von Bedeutung.

Ferner vorzugsweise werden Positiv- und/oder Negativ-Kontrollen der Zellprobe oder Zellkultur, insbesondere gleichzeitig, inkubiert und videomikroskopisch erfasst und wird die wenigstens eine er- fasste Eigenschaft auch für wenigstens eine individualisierte Zelle der Kontrolle erfasst und als Vergleichswert verwendet. Damit ist ein direkter Vergleich zwischen den erfassten Werten und Vergleichswerten möglich, da die Vergleichswerte bezüglich desselben Zelltyps oder derselben Zellkulturmischung unter denselben Rahmenbedingungen gewonnen werden, wie die erfassten Werte der schad- oder wirkstoffstoffbelasteten Zellkulturen.

In einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfah- rens wird das Verfahren unter Standardkulturbedingungen durchgeführt. Dabei werden insbesondere Umgebungsfaktoren, insbesondere Temperatur, Kohlendioxidgehalt oder Licht verändert. Die technische Umsetzung des neuen Messverfahrens erfolgt durch videomikroskopische Aufzeichnung des Zellwachstums und der Zellbewegung unter Zellkulturbedingungen. Die zu untersuchenden Zellen werden mit der Testsubstanz inkubiert und über einen Zeitraum von meist vier bis zwölf Stunden beobachtet. Der Zeitraum kann auch kürzer oder länger sein. Die Zellveränderungen werden in einem, insbesondere digitalen, Videofilm bzw. Videosignal aus einer Abfolge von Einzelbildern aufgezeichnet. Diese Abfolge von Einzelbildern aus dem Videosignal stellt die Datenbasis für die folgende Datenanalyse dar. Vorzugsweise wird die videomikroskopi- sehe Erfassung mit einer Bildwiederholungsrate von 0,01 Hz bis 1

Hz ₁ insbesondere zwischen 0,05 Hz bis 0,2 Hz, insbesondere von 0,1 Hz, vorgenommen. Dies entspricht einem Abstand zwischen den Einzelbildern von 1 bis 100 s, insbesondere 5 bis 20 s, insbesondere 10 s. Diese Intervalle sind an die typischen Geschwindig- keiten und Änderungszeiten der untersuchten Zellkulturen bzw.

Zellproben anzupassen, die je nach Zelltyp unterschiedlich ausfallen können. In wenigen Fällen ist eine Bildwiederholungsrate von mehr als 1 Hz notwendig. Die Bildwiederholungsrate kann vorzugsweise auch variabel sein, wodurch beispielsweise nach der Zugabe eines Wirkstoffs zunächst mit einer vergleichsweise hohen Bildwiederholungsrate aufgenommen wird, um die unmittelbare Reaktion detailscharf aufzunehmen, während im Laufe des Untersuchungszeitraums die Abstände zwi- sehen Einzelbildern größer werden, wenn die Aktivität der untersuchten Zellen nachlässt. Hiermit ist eine Reduktion der zu verarbeitenden Datenmengen erreichbar, ohne die Genauigkeit der Ana- lyse zu verschlechtern.

Bei der Datenanalyse wird auf eine umfangreiche Datenbank mit Zellbewegungsdaten zurückgegriffen, in denen Vergleichsdaten bzw. Referenzdaten gespeichert sind, die bei Untersuchungen unter fest definierten Umgebungsbedingungen mit bekannten toxischen Agenzien erlangt wurden. Diese Datenbank enthält neben Bewegungsdaten von Einzelzellen auch Daten zu Zell-Zell-Interaktionen und zu Wechselwirkungen mit physikalischen Strukturen oder Rei- zen in Kombination mit bekannten Wirkstoffen. Daten für Zellkulturen mit einem bis zu drei Zelltypen oder auch mehr Zelltypen sind in der Datenbank hinterlegt. Durch einen computergestützten Vergleich der neu gewonnenen Daten mit den Ergebnissen aus der Datenbank und/oder einer Positiv- oder Negativprobe sind Aussagen in Bezug auf die Wirkung und Toxizität verschiedener Wirkstoffe möglich. Die Datenbank enthält in der Regel keine videomikroskopischen Einzelbilder oder Bildsequenzen, sondern nur die Parametri- sierungen der oben genannten Eigenschaften. Dies führt zu einer sehr effizienten Datenreduktion.

Das erfindungsgemäße Verfahren kommt ohne zusätzliche Reagenzien aus, die eine Verfälschung der Testumgebung bewirken würden und die Interpretation der Messwerte erschweren können. Das Testsystem weist durch die Beobachtung von Einzelzellen, auch einer Mehrzahl von Einzelzellen, eine hohe Ortsauflösung auf. Schädigungsmuster können einzelnen Zellen und Zeilsubpopulationen zugeordnet werden und lassen damit eine höhere Spezifität bei der Interpretation der Untersuchungsergebnisse zu. Auch Untersuchungen mit mehr als zwei oder drei Zellpopulationen sind möglich. ZeII- Schädigungen im Zusammenhang mit strukturellen Besonderheiten sind möglich, spezifische Reaktionen auf mechanische Zellschädigungen lassen sich sensitiver als bisher nachweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren reagiert bereits frühzeitig auf Veränderungen des Zellverhaltens und ist damit sensibler als vergleichbare mikroskopische Untersuchungsverfahren. Breit angelegte Screening-Untersuchungen, z.B. in der pharmakologischen Wirkstoffforschung, sind damit mit einem auch deutlich niedrigeren Zeitfaktor möglich. Durch das Fehlen chemischer Reagenzien werden die laufenden Kosten bei den Untersuchungen minimiert. Langzeitbeobachtungen sind ohne Probleme möglich, der Aufwand für die vorzuhaltenden Zellmengen wird minimiert.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur Zellkulturen mit vereinzelten Zellen untersucht werden, sondern auch mit Zellen, die in Zellteppichen bzw. Zellrasen vorhanden sind. Auch in Zellrasen herrscht eine rege Bewegung, da einzelne, bewegliche

Zellen die benachbarten Zellen durchdringen können, d.h. sich zwischen zwei benachbarten Zellen hindurchzwängen können. Auch in dieser Umgebung ist eine Individualisierung und Verfolgung der einzelnen Zellen von Einzelbild zu Einzelbild des Videosignals möglich.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auch gelöst durch ein Computerprogrammprodukt mit Programmcodemitteln, bei deren Ausführung in einer Datenverarbeitungsanlage die Schritte eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens ausge- führt werden oder ausführbar sind. Ebenfalls wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch einen Datenträger mit einem darauf gespeicherten oder geschriebenen erfindungsgemäßen Computerprogrammprodukt. Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auch durch eine

Vorrichtung zur Zeilprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur gelöst, die eine Videomikroskopievorrichtung umfasst , die ausgebildet ist, um eine, insbesondere digitale, Videoaufnahme der inkubierten Zellprobe oder Zellkultur zu machen, wobei die Auflösung der Videomikroskopievorrichtung ausreicht, um einzelne Zellen der Zellprobe oder Zellkultur zu individualisieren, wobei die Vorrich- tung eine Auswertevorrichtung umfasst, die ausgebildet ist, aus der

Videoaufnahme wenigstens eine Zelle zu individualisieren, wenigstens eine Eigenschaft der individualisierten Zelle sowie deren zeitliche Änderung zu erfassen und mit einem Vergleichswert zu vergleichen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise eingerichtet, das erfindungsgemäße Verfahren wie oben beschrieben durchzuführen. Vorzugsweise hat die Auswertevorrichtung Zugriff auf eine Datenbank mit Vergleichswerten, in der Vergleichsdaten bezüglich der erfassten Eigenschaften für eine oder mehrere Zelltypen oder Zellarten mit bekanntem Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustand hinterlegt sind. Außerdem ist vorzugsweise in der Daten- bank zusätzlich hinterlegt, durch welche Stoffe oder physikalischen

Reize der Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustand verursacht wurde, dem die Vergleichsdaten entsprechen. Vorzugsweise wird die Datenbank durch die Auswertevorrichtung um die neu gewonnenen Daten ergänzt.

Damit ist auch eine Vorrichtung geschaffen, mit der erfindungsgemäß besser als mit derzeit gebräuchlichen Untersuchungsmethoden und -Vorrichtungen die Beurteilung von Zellfunktionen, Zellvitalität und Schädigungszuständen möglich ist. Durch die Beobachtung von Zellbewegungen und Formveränderungen über die Zeit umgeht das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung die Unzulänglichkeiten der bekannten Verfahren und Vorrich- tungen. Insbesondere können Zellen mit Hilfe der videomikroskopischen Beobachtung über variable Zeiträume beobachtet werden und Bewegungen oder Formveränderungen der Zellen aufgezeichnet werden. Einzelne Umgebungsfaktoren wie Temperatur, Kohlendio- xidgehalt oder Licht und beliebige weitere physikalische Umweltgrößen sind dabei kontrolliert veränderbar. Unter konstanten physikalischen Umweltfaktoren können die Auswirkungen von zu untersuchenden chemischen Wirkstoffen oder speziellen physikalischen Reizen aufgezeichnet und untersucht werden.

Die Untersuchungen werden an der vitalen Zellkultur durchgeführt und es werden keine zusätzlichen Testreagenzien verwendet, die die Ergebnisse durch ihre Eigenwirkung bzw. Nebenwirkungen verfälschen könnten. Die erfassten Daten können sowohl für einzelne Zellen als auch für Zellverbände erhoben und ausgewertet werden als auch bei der Untersuchung von Zellverbänden Formveränderungen als Reaktion auf Nachbarzellen und deren Bewegungsverhalten analysiert werden. Da auch die Kollektivanalysen immer auf dem Niveau der einzelnen Zelle erfolgen, ist eine besonders hohe Orts- auflösung auch bei den Kollektivanalysen gegeben. Dies gilt auch für die Untersuchung von Mischkulturen.

Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, wobei bezüglich aller im Text nicht näher erläuterten erfindungsgemäßen Einzelheiten ausdrücklich auf die Zeichnungen verwiesen wird. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Zelle,

Fig. 2 ein schematisches Diagramm der zeitlichen Entwicklung erfasster Eigenschaften mit herkömmlichen bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren und

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

In den folgenden Figuren sind jeweils gleiche oder gleichartige Elemente bzw. entsprechende Teile mit denselben Bezugsziffern versehen, so dass von einer entsprechenden erneuten Vorstellung abgesehen wird.

In Fig. 1 ist eine Zelle 1 , die in dem erfindungsgemäßen Verfahren individualisiert worden ist, schematisch dargestellt. Die Zelle 1 weist eine Zellwand 2 und einen Zellkern mit einer Zellkerngrenze 4 auf, sowie Organellen 5 und Einschlüsse 6. Diese Bestandteile der Zelle 1 sind videomikroskopisch erkennbar, und zwar insbesondere über

Grauwertanalysen oder über Farbnuancen. Auch in der Licht-, Pha- senkontrast-Fluorenszenzmikroskopie oder Laser-Rastermikroskopie sind diese Bestandteile erkennbar und können für die erfindungsgemäße Analyse verwendet werden. Verfahren zur automati- sehen Erkennung dieser Zellgrenzen und Zellbestandteile im Einzelbild sind bekannt.

In Fig. 1 ist ein erster Schritt einer beispielhaften weiteren Analyse bereits dargestellt. Es sind Verbindungslinien 7, 8 zwischen der Zellkerngrenze 4 und der Zellwand 2 dargestellt, die in Punkten 7',

7" bzw. 8', 8"die Zellwand 2 bzw. den Zellkern 3 berühren. Diese Verbindungslinien 7, 8 stellen solche Verbindungslinien dar, bei denen aus der Schar möglicher Verbindunglinien ein lokales Maximum bzw. ein lokales Minimum der Länge der Verbindungslinien vorliegt. Dabei sind in Fig. 1 diejenigen Verbindungslinien mit einer lokal maximalen Länge durchgezogen bzw. solide gezeichnet, während die Verbindungslinien mit lokal minimaler Länge gestrichelt darge- stellt sind. Die längsten dieser Verbindungslinien markieren Zellausläufer 9.

Für die Erkennung, welche Verbindungslinien eine lokale maximale oder minimale Länge aufweisen, sind mehrere verschiedene Verfahren anwendbar, die zu im Einzelnen leicht verschiedenen Ergebnissen kommen können. In der zeitlichen Verfolgung sind sie aber im Wesentlichen gleichwertig und kommt es vor allem darauf an, dass jeweils konsistent angewendet werden. So können die Linien vom Mittelpunkt des Zellkerns 3 ausgehen, sie können von der unregelmäßigen Zellkerngrenze 4 ausgehen, von einem Kreis um den Mittelpunkt des Zellkerns 3, oder es wird von der Zellwand 2 auf die Zellkerngrenze 4 zurückgerechnet und jeweils mit geeigneten Algorithmen optimiert.

Die in Fig. 1 eingezeichneten Verbindungslinien lassen bereits einen Rückschluss auf die Zahl und das Ausmaß von Zellausläufern 9 zu. Eine zur dargestellten Methode alternative Methode besteht etwa in der Fourier-Analyse der Zellwand 2 und insbesondere der Zellkerngrenze 4. Auch andere geeignete geometrische Analysenmethoden sind hierfür anwendbar. Um den Aufwand der notwendigen Analyse zu begrenzen, kann vorgesehen sein, dass nur eine Anzahl der signifikantesten Ausläufer 9 auf die beschriebene Weise bestimmt wird und über die Abfolge von Einzelaufnahmen hinweg verfolgt wird. Dadurch ist die Entwicklung der Ausläufer, ihr Ausstülpen und Wiedereinziehen, nachvollziebar. Auch die Verteilung der Positionen und/oder Signifikanzen der Ausläufer können erfasst werden. Es kann auch erfasst werden, in welchen Bereichen sich die Zelle 1 am schnellsten verändert, d.h. in welchen Bereichen Ausläufer sich besonders schnell bilden oder zurückziehen.

In Fig. 1 kann auch analysiert werden, wo sich die Organellen 5 und 5 Einschlüsse 6 befinden, wo sie sich im Verhältnis zum Zellkern 3 befinden und, anhand der aufeinanderfolgenden Einzelbilder, wie sie sich bewegen.

Eine entsprechende Analyse kann für eine Vielzahl von individuali-o sierten Zellen 1 ablaufen, die auch unterschiedlichen Zelltyps sein können. Typischerweise beinhaltet ein untersuchter Ausschnitt beispielsweise mehrere hundert Zellen, die entweder alle untersucht werden oder aus denen eine Stichprobe gebildet wird, die dann über die Dauer des Videosignals von Einzelbild und Einzelbild nachver-5 folgt werden.

Bei den meisten Zelltypen ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich in dem untersuchten Ausschnitt Zellen befinden, die über die Beobachtungsdauer hinweg im beobachteten Ausschnitt verbleiben, rela-o tiv groß. Es ist möglich, solche Zellen auszuwählen, die im Ausschnitt verbleiben, oder die Analyse so anzupassen, dass berücksichtigt wird, dass einige untersuchte Zellen sich aus dem Ausschnitt herausbewegen und andere Zellen an deren Stelle neu in die Untersuchung aufgenommen werden.

5

In Fig. 2 ist der zeitliche Verlauf einer herkömmlichen Untersuchungsgröße sowie dreier nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelter Indizes über einen Zeitraum von 260 Minuten dargestellt. Die Untersuchung betrifft eine Zellkultur, die in einer toxischen Dia-o lyselösung inkubiert sind. Dialyselösungen zur Bauchfelldialyse, die gegebenenfalls mit Lactat als einzigem Puffer versehen sind, weisen in der Regel einen pH-Wert auf, der nicht an den pH-Wert an- gepasst ist, indem sich menschliche Körperzellen gut entwickeln. Die verwendete toxische Dialyselösung ist sauer und hyperosmolar.

Auf der vertikalen Achse sind zwei verschiedene Einheiten darge- stellt. Zum einen handelt es sich um einen Index, der für die drei erfindungsgemäß erfassten und ermittelten Eigenschaften 21 bis 23 charakteristisch ist. Diese Indizes entsprechen willkürlichen Einheiten. Bei der mit 20 bezeichneten Kurve handelt es sich um den zeitlichen Verlauf der Konzentration des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH), das in der Einheit IU/I gemessen wird, also in internationalen Einheiten pro Liter. Lactatdehydrogenase ist ein in allen Zellen vorkommendes Enzym, das bei Zellschädigung, insbesondere einer Schädigung der Zellwand, freigesetzt wird und ist ein Standardtest zur Untersuchung von Zellschädigungen. Die Höhe des LDH- Messwertes korreliert mit der Anzahl der geschädigten Zellen und der Intensität der Zellschädigung. Die Freisetzung führt zu einer erhöhten Konzentration von Lactatdehydrogenase im Medium.

Aus der mit Rauten markierten LDH-Kurve 20 ist erkennbar, dass es mit zunehmender Zeit bei der Inkubation der Zellen in der toxischen Dialyselösung zu einer massiven Zellschädigung kommt, und damit, als messbarem Zeichen hierfür, zu einem Anstieg der LDH-Werte. Dieser Anstieg beginnt signifikant nach etwa zwei Stunden und erfährt eine Beinahe-Sättigung nach ca. drei Stunden, wonach nur noch ein leichter weiterer Anstieg des LDH-Werts 20 feststellbar ist. Dies ist dadurch erklärlich, dass ein Großteil der Zellschädigungen nach ca. drei Stunden bereits eingetreten ist.

Die mit den Bezugszeichen 21 , 22 und 23 versehenen Indexverläufe sind aus jeweils mehreren Einzelgrößen berechnet. Die mit dem Be- zugszeichen 21 gekennzeichnete Linie bezieht sich auf Veränderungen der Zellform und Zellgesamtfläche, d.h. den Flächeninhalt, den Umfang und die Ausläuferanzahl der Zellen. Der mit dem Bezugszeichen 22 versehene Index errechnet sich aus mehreren Eigenschaften, die Bewegungen der Zelle als Ganzes betreffen, nämlich Veränderungen des Ortes von Zellen, ihre Geschwindigkeit und die Gerichtetheit und Richtung ihrer Bewegungen. Der mit dem Bezugszeichen 23 gekennzeichnete Index errechnet sich aus Bewegungen der Zelle an ihrem Platz, nämlich Veränderungen der Zelloberfläche, der Dynamik der Ausbildung von Ausläufern und der Bewegung von Zellorganellen. Deutlich erkennbar ist, dass bereits zu Beginn der Messung der Index 23 betreffend Dynamik der Bewegung der Zelle am Ort, d.h. die Veränderungen der Zelloberfläche, die Dynamik der Ausbildung von Ausläufern und die Bewegung von Zellorganellen signifikant abnimmt. Nach einer ersten steilen Abnahme dieses Indexes in den ersten 30 Minuten der Messung fällt dieser weiter, allerdings nicht mehr so steil.

Der mit dem Bezugszeichen 22 gekennzeichnete Index, der die Bewegung der Zelle als Ganzes anzeigt, ist zunächst flach, während er nach etwa einer Stunde ebenfalls signifikant abnimmt. Nach 1 Stunde in der toxischen Dialyselösung verlieren die Zellen somit ihre Beweglichkeit im Medium, d.h. die Veränderung des Ortes, Geschwindigkeit und die Gerichtetheit der Bewegung. Nach etwa 2 Vz Stunden fällt der Index 22 nur noch wenig ab. Allerdings bewegt sich dieser Index 22 nach 2 ^Λ A Stunden auf einem Bruchteil des Niveaus zu Anfang der Messung. Die Zellbewegung ist somit im Wesentlichen zum Stillstand gekommen. Der dritte Index, Bezugszeichen 21 , hat einen flacheren Verlauf. Eine erste relativ signifikante Veränderung betrifft eine Abnahme nach ungefähr 2 Stunden, wonach die Zellform, die Zellgesamtflä- che und auch die Ausläuferanzahl, abnehmen. Diese Abnahme setzt sich im weiteren Verlauf der Messung fort.

Aus Fig. 2 ist somit zu entnehmen, dass anhand der Indizes 21 , 22, 23 aus dem erfindungsgemäßen Verfahren bereits sehr viel früher als mit der bekannten Methode der Messung der Lactatdehydro- genase-Werte in der Lösung eine Veränderung von Eigenschaften der Zellen in der toxischen Dialyselösung erkennbar ist. Es lässt sich auch sehr viel genauer als bislang möglich erkennen, welche Art von Veränderungen sich in den entsprechenden individualisier- ten und untersuchten Zellen ergibt.

In Fig. 3 ist beispielhaft in schematischer Darstellung eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 40 gezeigt. Diese Vorrichtung 40 zur Zeilprobendiagnostik umfasst einen Zellproben- behälter 41 mit einer Zellprobe oder Zellkultur, der in einem Inkubator 42 zusammen mit einem Videomikroskop 43 angeordnet ist, das auf den Zellprobenbehälter 41 gerichtet ist. Der Inkubator 42 ist über eine Steuerleitung 45 und eine Signal- und Steuerleitung 46 mit einer Datenverarbeitungsanlage 44 verbunden. Die Datenverar- beitungsanlage 44 umfasst eine Auswertevorrichtung 47, die über die Signal- und Steuerleitung 46 sowie Signal- und Steuerwege 51 , 52 Signale von dem Videomikroskop 43 empfängt und auswertet. Dazu greift die Auswertevorrichtung 47 auf eine Datenbank 48 zurück, gekennzeichnet durch einen Doppelpfeil, die Vergleichsdaten über erfasste Eigenschaften eines oder mehrerer untersuchter Zelltypen enthält oder umfasst. Die Datenverarbeitungsanlage 44 umfasst außerdem eine Steuervorrichtung 49, mit der der Inkubator 42 und das Videomikroskop gesteuert werden können. So sind beispielsweise die Umweltbedingungen des Inkubators 42 durch die Steuervorrichtung 49 veränder- bar sowie die Aufnahme durch das Videomikroskop 43 steuerbar.

Die Auswertevorrichtung 47 und die Steuervorrichtung 49 können auch miteinander in Kontakt stehen, so dass die Steuervorrichtung 49 beispielsweise der Auswertevorrichtung 47 mitteilen kann, dass die Umweltbedingungen im Inkubator 42 geändert werden oder dass die Bildwiederholfrequenz des Videosignals geändert wird.

Weiterhin ist dargestellt, dass über ein Signal- und Steuerweg 53 und eine Daten- und Steuerleitung 54 eine Anzeige- und Bedienvorrichtung 50 außerhalb der Datenverarbeitungsanlage 44 ange- steuert wird, auf der Analysen ausgeführt werden können oder auf der Videodaten, Analysezwischendaten, Analyseenddaten usw. angezeigt werden können.

Es ist auch dargestellt, dass die Auswertevorrichtung 47 Daten oder Steuerbefehle an die Datenbank 48 senden kann. Damit kann die

Datenbank 48 um erkannte Vergleichsdaten erweitert werden oder es kann ein Steuerbefehl folgen, mit dem bestimmte Daten aus der Datenbank 48 abgerufen werden. Einige oder alle dieser genannten Vorrichtungen können auch in einer einzigen Datenverarbeitungsanlage zusammengefasst sein oder jeweils auf verschiedene Datenverarbeitungsanlagen oder andere geeignete elektronische Anlagen verteilt sein, die ein Netzwerk bilden.

Alle genannten Merkmale, auch die den Zeichnungen allein zu entnehmenden sowie auch einzelne Merkmale, die in Kombination mit anderen Merkmalen offenbart sind, werden allein und in Kombination als erfindungswesentlich angesehen. Erfindungsgemäße Ausführungsformen können durch einzelne Merkmale oder eine Kombination mehrerer Merkmale erfüllt sein.

Bezuαszeichenliste

1 Zelle

2 Zellwand

3 Zellkern

4 Zellkerngrenze

5 Organelle

6 Einschluss

7 Verbindungslinie mit lokal maximaler Länge

T Punkt auf der Zellwand

7" Punkt auf dem Zellkern

8 Verbindungslinie mit lokal minimaler Länge

8' Punkt auf der Zellwand

8" Punkt auf dem Zellkern

9 Zellausläufer

20 LDH-Konzentration

21 Index 1

22 Index 2

23 Index 3

40 Vorrichtung zur Zellprobendiagnostik

41 Zeilprobenbehälter

42 Inkubator

43 Videomikroskop

44 Datenverarbeitungsanlage

45 Steuerleitung

46 Signal- und Steuerleitung

47 Auswertevorrichtung

48 Datenbank

49 Steuervorrichtung

50 Anzeige- und Bedienvorrichtung

51 - 53 Signal- und Steuerwege

54 Daten- und Steuerleitung