Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vorrichtung zur spektral differenzierenden, Bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht der im Oberbegriff von Anspruch 22 genannten Art.

Derartige Verfahren und Vorrichtungen finden insbesondere in der modernen Biologie heute vielfach Anwendung. Insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Vielzahl spezifischer Fluoreszenzson- den entwickelt worden. Diese eignen sich beispielsweise zur spezifischen Markierung von Antikörpern, bestimmten DNA-Sequenzen oder anderen biologischen Strukturen. Sie umfassen weiter Fusionskonstrukte bestimmter Proteine mit fluoreszierenden Proteinen, wie etwa GFP (Green Fluorescent Protein) oder YFP (Yellow Fluorescent Protein) etc.

Weiter sind besondere Indikatorfarbstoffe von ihnen umfasst, dern Fluoreszenz im Hinblick auf ihre Intensität und/oder ihr Emissionsspekt- rum mit der Konzentration bestimmter Ionen, beispielsweise Calcium, korreliert ist.

Die moderne Biologie versucht, die Komplexität ihrer Messmethoden an die Komplexität der untersuchten Proben anzupassen und ist somit vielfach daran interessiert, eine möglichst große Zahl von unterschiedli-

chen Markierungen in einer Probe zu lokalisieren und räumlich gegeneinander aufzulösen.

Ein anderes, besonders aktuelles Problem ist die quantitative Erfassung von Fluorophoren, die miteinander durch fluoreszenzlose Energieüber- tragung FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in Wechsel- wirkung treten. Solche FRET-Paare, bestehend aus Donor und Akzeptor, sind im optischen Mikroskop räumlich nicht gegeneinander auflösbar.

Vielmehr wird die Überlagerung der Donor-und Akzeptor-Spektren bzw. ihr Verhältnis zueinander gemessen.

Ein weiteres, aktuelles Problem ist die Auftrennung der Fluoreszenz eines Indikatorfarbstoffs in die Anteile der gebundenen und freien Form des Fluorophors zum Zwecke der Verhältnisbildung und anschließenden Berechnung der Aktivität eines Liganden.

Ein weiteres Problem, das bei nahezu allen bildgebenden Fluoreszenz- verfahren in der Biologie zum Tragen kommt, ist die Berücksichtigung der sog. Autofluoreszenz, d. h. der unspezifischen Hintergrundfluores- zenz, die viele Strukturen, wie etwa Zellen und Substratträger zeigen.

Eine wesentliche, prinzipielle Einschränkung dieser Verfahren liegt darin, dass die in der Regel verwendeten organischen Fluorophore relativ breite Exitations-und Emissionsspektren aufweisen, was auf die Vielzahl der in diesen organischen Molekülen beteiligten phononischen Subni- veaus zurückzuführen ist. Damit wird es vergleichsweise schwer, einzelne, in der Probe enthaltene Spezies von Fluorophoren spezifisch anzuregen oder spezifisch zu detektieren. Vielmehr erhält man in der Regel als Signal eine komplexe Zusammensetzung von Beiträgen der unterschiedlichen Spezies.

Konventionell behilft man sich damit, möglichst weit auseinander liegende Anregungskanäle und möglichst enge Detekttonskanäle zu verwenden. Der Begriff des Anregungskanals ist in diesem Zusammen- hang als die Summe der Eigenschaften des die Fluoreszenz anregenden

Lichtes zu verstehen. Dies umfasst insbesondere die spektralen Eigenschaften, zu denen im Rahmen dieser Beschreibung auch die Intensität der jeweiligen spektralen Komponenten gerechnet wird.

Allerdings können auch andere Eigenschaften, wie etwa der Anregungs- zeitpunkt und/oder die Anregungsdauer, zusammengefasst als Anre- gungszeit, mit zur Definition eines Anregungskanals verwendet werden.

In analoger Weise wird hier der Begriff des Detektionskanals als die Summe der Eigenschaften der das von der Probe emittierte Fluoreszenz- licht leitenden, filternden und detektierenden Elemente verstanden. Dies umfasst wiederum einerseits die spektralen Eigenschaften, einschl. der jeweiligen Empfindlichkeiten für einzelne spektrale Komponenten, sowie andererseits die Detektionszeit, die Detektionszeitpunkt und Detektions- dauer umfassen kann. Spezielle Kombinationen von je einem Anregungs- kanal und einem Detektionskanal werden im Folgenden zusammenfassend als Messkanäle bezeichnet.

In der gängigen Praxis sind verschiedene Methoden bekannt, die auf die optimale spektrale Auflösung der unterschiedlichen Fluophorenarten gegeneinander abzielt und von den Eigenschaften der Fluorophore und ihrer Kombination abhängen. So ist es beispielsweise möglich, bei einem gegebenen Detektionskanal mehrere Aufnahmen nacheinander mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen durchzuführen, wobei die Anregungswellenlängen jeweils so gewählt sind, dass das Absorptions- maximum jeweils einer Fluorophorenspezies möglichst genau getroffen wird. In diesem Fall wird je Messung ein Messkanal benutzt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Probe bei einer Exitationswellenlänge anzuregen, die im Bereich der Anregungsspektren mehrerer Fluoropho- renspezies liegt, und das Emissionslicht durch Filtersätze oder Kaskaden von Strahlteilern in spektrale Bereiche aufzuteilen und diese Teile getrennten Photosensoren zuzuführen. Bei diesem Verfahren werden also mehrere Messkanäle gleichzeitig benutzt. Sind die Emissions-bzw.

Exitationsbanden der interessierenden Fluorophore genügend weit voneinander getrennt, lassen sich die Frequenzbereiche der einzelnen Messkanäle so wählen, dass jeder Kanal einem Fluorophor entspricht.

Nachteilig bei diesen Techniken ist, dass meist ein gewisses Überspre- chen zwischen den Kanälen nicht vermeidbar ist. Dies trifft insbesondere zu, wenn eine Vielzahl unterschiedlicher Fluorophore in einer Probe verwendet wird, wobei sich deren Spektren aufgrund der begrenzten Bandbreite der nutzbaren Wellenlängen überlappen. Dem kann zwar dadurch entgegengewirkt werden, dass die spektralen Begrenzungen der einzelnen Detektionskanäle, beispielsweise durch enge Bandpassfilter, scharf begrenzt werden. Dies hat allerdings zur Folge, dass ein großer Teil der emittierten Fluoreszenzphotonen nicht zur Signalgebung beiträgt, was sich negativ auf die Qualität des detektierten Signals auswirkt. Insbesondere ist dies unerwünscht, da wegen Bleichprozessen der Fluorophore in der Probe die Gesamtzahl der von einem gegebenen Präparat emittierbaren Photonen begrenzt ist, andererseits aber aufgrund des Photonenrauschens die Qualität und Auflösung einer Messung umso besser ist, je mehr Photonen zur Messung beitragen. Nahezu alle Fluoreszenzphotonen können zwar dadurch nutzbar gemacht werden, dass das emittierte Fluoreszenzlicht spektral zerlegt und das Spektrum mittels einer großen Vielzahl spektraler Kanäle weiterbehandelt wird. Das relative Rauschen in jedem einzelnen, extrem engen Kanal wächst dabei jedoch erheblich an, da für jeden einzelnen Kanal nur vergleichsweise wenige Photonen zur Verfügung stehen, so dass sich dieses Verfahren nur in besonders lichtstarken Anwendungsfällen eignet.

Die angesprochenen Probleme lassen sich stark reduzieren, wenn breite Messkanäle gewählt werden, deren Übersprechen bewusst in Kauf genommen wird, und die aufgenommenen Daten einer erheblichen, rechnerischen Nachbearbeitung bzw. Auswertung unterzogen werden.

Hierzu werden die aufgenommenen Signale in den Detektoren oder nachgeschalteten Umwandlungseinheiten in digitale Daten konvertiert und in einer Speichereinheit einer digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert. Bei vielen Anwendungen, wie z. B. der Laser-Scanning- Mikroskopie (LSM) ist die Digitalisierung und Nachbearbeitung der Daten sogar ein wesentlicher Bestandteil der Technik.

Die zuvor angesprochene Auswertung der Daten geschieht üblicherweise vermittels einer Verrechnungseinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage. Besonders gute Ergebnisse hat man mit der Methode des sog."Linear Unmixing"erzielt. Diese Methode beruht auf der Aufstellung und Lösung eines inhomogenen, linearen Gleichungssystems, das über die bekannten Eigenschaften der Messkanäle einen Zusammenhang herstellt zwischen dem gemessenen Signal und der Fluorophorenzusammensetzung in der Probe. Dieses Gleichungssystem lässt sich mathematisch in Matrixschreibweise darstellen als y=AB+l b oder in Komponentenschreibweise Diese Formeln sind folgendermaßen zu verstehen : Der Vektor B repräsentiert die unterschiedlichen Spezies von Fluorophoren in ihrer relativen Konzentration in einem gegebenen Bildpunkt. Die Anzahl der unterschiedlichen Fluorophorenspezies sei p. Damit weist der Vektor B p Komponenten BS, auf. Der Vektor y repräsentiert das in jedem Messkanal detektierte Signal. Die Anzahl der Messkanäle sei q. Damit weist der Vektor y g Komponenten y, auf. Wurden für die Messung beispielweise vier unterschiedliche Anregungswellenlängen und vier unterschiedliche spektrale Detektionsfenster verwendet, ist die Anzahl der Messkanäle q = 16. Der Vektor I stellt die für jeden Messkanal verwendete Anregungsintensität dar und weist somit q Komponenten I, auf. Die Matrix A ist die Koeffizientenmatrix die die chemische Komposition B von Fluorophoren über die Anregungsintensitäten Ir der Anregungskanäle und die übrigen Eigenschaften aµr der Messkanäle mit dem Ergebnissignal y verknüpft. Die Matrix A hat also pq Elemente I"a". Der Vektor b mit q Komponenten br schließlich ist eine Korrek- turgröße, die das Streulicht oder ein anderes Hintergrundlicht in jedem

Messkanal wiedergibt. Die Größen B, sind in der Regel als ortsabhängig aufzufassen, während die übrigen Größen auf der jeweils rechten Seite der Gleichungen (1) und (2) Parameter darstellen, die für normalerweise für alle Pixel gleich sind. Autofluoreszenz des Messobjektes kann entweder als Fluoreszenz eines zusätzlichen Fluorophors 5 oder aber als Hintergrundlicht b, (falls ortsunabhängig) behandelt werden. Bei Vorliegen von FRET kann ein FRET-Paar als eigenständiger Chromophor aufgefasst werden, dessen Konzentration durch eine der Größen Bl. gegeben ist.

Ziel des"Linear Unmixing"ist es, die Lösung B des vorstehenden linearen Gleichungssystems zu finden, was mathematisch durch einfache Inversion der Koeffizientenmatrix A möglich ist, sofern die Zahl der Gleichungen q größer oder gleich der Anzahl der unterschiedlichen Fluorophorenspezies p ist. Für die algorithmische Umsetzung dieser mathematischen Operation sind dem Fachmann eine Reihe numerischer Verfahren bekannt. Eine Erläuterung dieser Technik ist in Farkas et al..

"Non-invasive image acquisition and advanced processing in optical bio-imaging", Computerized Medical Imaging and Graphics, 22 (1998), S. 89-102 oder Dickinson et al.."Multi-spectral imaging and linear unmixing at whole new dimension to laser scanning fluorescent microscopy", BioTechnics, 31, Nr. 6 (2001), S. 1272-1278 sowie <BR> <BR> <BR> Boardman :"Inversion of imaging spectroscopy data using singular value decomposition", Proc. IGARSS, 89, Nr. 4 (1989), S. 2069-2072 offenbart. Eine Implementierung dieses Auswerteverfahrens in einer LSM-Vorrichtung wurde von der Firma Carl Zeiß, Jena, Deutschland, in deren Laser-Scanning-Mikroskop LSM 510 meta realisiert.

Wie erläutet, bietet das Verfahren des"Linear Unmixing"ein probates Mittel der Datenauswertung bei Kenntnis der Eigenschaften der verwendeten Messkanäle. Nachteilig ist jedoch, dass die Auswahl der geeigneten Messkanäle, d. h. die Einstellung sämtlicher Parameter wie Anregungswellenlänge,-intensität,-zeit und Detektionswellenlängen und -zeit, nach wie vor der Intuition des Benutzers unterworfen ist. Da sich

die Intuition jedoch nach anschaulichen Regeln richtet, die es dem Benutzer nahe legen, nach wie vor möglichst je einen Messkanal einer Fluorophorenspezies zuzuordnen, werden die Möglichkeiten, die die komplexe Datenanalyse bietet, in der Regel nicht ausgenutzt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein gattungsgemäßes Verfahren derart weiterzubilden, dass auf einfache Weise die Qualität der erhaltenen Daten verbessert wird.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine gattungsgemäße Vorrichtung derart weiterzubilden, dass die damit erhaltenen Ergebnisse auf einfache Weise verbessert werden.

Diese Aufgaben werden gelöst durch ein Verfahren bzw. eine Vorrich- tung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche.

Vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.

Die Erfindung baut auf einem gattungsgemäßen Verfahren dadurch auf, dass die Eigenschaften mehrerer Messkanäle vor der Durchführung der Messung automatisch eingestellt werden oder dem Benutzer entsprechen- de Anweisungen zur manuellen Einstellung gegeben werden. Die automatischen Einstellungen oder Anweisungen erfolgen gemäß dem Ergebnis eines von einer Berechnungseinheit der digitalen Datenverar- beitungsanlage durchgeführten, mathematischen Optimierungsverfahrens.

Dabei werden die Fluoreszenzcharakteristiken wenigstens einiger der in der Probe enthaltenen Fluorophore berücksichtigt. Ein solches mathema- tisches Optimierungsverfahren ist streng zu trennen von der automati- schen Ansteuerung bestimmter Standardeinstellungen, die ab Werk programmiert sein können oder sich an einer vom Benutzer selbst eingerichteten Einstellungsbibliothek orientieren. Vielmehr gibt der Benutzer der Datenverarbeitungsanlage ein, welche Fluorophore er in der Probe vermutet bzw. deren Charakteristiken. Diese Angaben werden dann dem mathematischen Optimierungsverfahren zugrunde gelegt, das die für

die speziellen Belange des Benutzers optimalen Einstellungen der Messkanäle errechnet. Damit kann insbesondere eine sich der Intuition weitgehend widersetzende, im Hinblick auf eine mathematische Auswertung der aufgenommenen Daten aber besonders günstige Segmentierung des gesamten Fluoreszenzspektrums vorgenommen werden anstatt mit Filtern enge Bänder auszuschneiden und die Anzahl der zum Signal beitragenden Photonen und damit die Signalqualität unnötig zu reduzieren.

Vorteilhafterweise sind die Charakteristiken einer Vielzahl von Fluorophoren in einer oder mehreren Bibliotheken in einer Speicherein- heit der digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert, so dass es genügt, wenn der Benutzer die von ihm in der Probe vermuteten Fluorophore identifiziert, ohne deren vollständige Charakteristiken eingeben zu müssen.

Besonders günstig ist es, wenn im Rahmen des mathematischen Optimierungsverfahrens ein lineares Gleichungssystem aufgestellt wird, das den Zusammenhang zwischen einer vom Benutzer vermuteten, chemischen Zusammensetzung der Probe und dem aufgrund der zu optimierenden Eigenschaften der Messkanäle resultierenden Signal beschreibt. Dieses Merkmal greift die mathematische Grundlage des "Linear Unmixing"auf. Allerdings wendet es diese Grundidee in genau entgegengesetzter Weise als beim Stand der Technik an. Während nämlich beim"Linear Unmixing"bei bekannten Komponenten y, und bekannten, die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten aur die relativen Konzentrationen Bz, der einzelnen Fluorophorenspezies gesucht sind, zielt das erfindungsgemäße Verfahren vielmehr darauf ab, durch Variation der die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten aF, r eine Optimierung des Systems in dem Sinne herbeizuführen, dass die Lösung des Gleichungssystems möglichst eindeutig erfolgen kann. Die Optimie- rung ist also auf die Lösbarkeit des Gleichungssystems ausgerichtet, insbesondere auf deren Eindeutigkeit. Auf diese Weise kann sicherge- stellt werden, dass ein sich an die Messung anschließendes Auswertever-

fahren, das auf der Methode des"Linear Unmixing"basiert, nicht etwa deshalb scheitert, weil die die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten im speziellen Fall so gewählt waren, dass die Zahl der linear unabhängi- gen Gleichungen des Systems die Zahl der vorhandenen Fluoropho- renspezies unterschreitet und das Gleichungssystem somit nicht mehr eindeutig lösbar ist.

Vorteilhafterweise ist das Optimierungsverfahren jedoch so flexibel gestaltet, dass nicht ausschließlich auf die Lösbarkeit bzw. Eindeutigkeit der Lösung des Gleichungssystems hin optimiert wird, sondern zusätz- lich vom Benutzer gewählte Nebenbedingungen berücksichtigt werden.

Beispiele für derartige Nebenbedingungen sollen weiter unten erläutert werden.

Vorteilhafterweise umfasst das Optimierungsverfahren die Optimierung einer Konditionszahl eines Matrixausdrucks, der diejenige Matrix enthält, die von den Koeffizienten des vorgenannten linearen Glei- chungssystems gebildet wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist dies so zu verstehen, dass sich die algorithmische Implementierung des erfindungsgemäßen Verfahrens mathematisch als Optimierung einer Konditionszahl des genannten Matrixausdrucks darstellen lässt. Je nach konkreter Umsetzung kann es möglich sein, auf die explizite Definition einer Matrix oder eines Arrays im Rahmen eines Computerprogramms zu verzichten.

Besonders bevorzugter Weise wird der Matrixausdruck, der der Berechnung der Konditionszahl zugrunde gelegt wird, als linksseitiges Matrixprodukt der Matrix A mit ihrer Transponierten AT, also XT2, gebildet. Dem liegt die Überlegung zugrunde, dass die Ausdrücke der Gleichungen 1 und 2 durch linksseitige Multiplikation mit AT überführt werden können in AT(#-###)=ATA# (3)

Bekanntermaßen führt die linksseitige Multiplikation mit der Transpo- nierten einer Matrix zur Symmetrisierung des sich ergebenden Matrix- ausdrucks, was einer Ausgleichsrechnung im Sinne der Gauss'schen Minimierung der Fehlerquadratsumme entspricht.

Bei expliziter Berücksichtigung des Rauschens der Messkanäle kann eine mit den vom Benutzer erwarteten Messfehlern gewichtete Matrix herangezogen werden, was als Minimierung der aus der Statistik bekannten Größe x2 (Chi Quadrat) betrachtet werden kann.

So kann beispielsweise in einer bevorzugten Ausführungsform die zu optimierende Konditionszahl im Wesentlichen der Determinante des Matrixausdrucks, insbesondere des Ausdr. ucks ATA entsprechen.

Alternativ können als Optimierungskriterium Konditionszahlen verwendet werden, die auch die Spur N des Matrixausdrucks enthalten.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als zu optimierende Konditionszahl die Größe verwendet, wobei det die Determinante, N die Spur und n die Dimension des Matrixausdrucks ist. Bei einem weiteren vorteilhaften Ausführungs- beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Konditionszahl das Verhältnis des kleinsten zum größten Eigenwert des Matrixausdrucks benutzt. Es hat sich gezeigt, dass die Optimierung jeder dieser Konditi- onszahlen durch Variation der Matrixelemente Iras, zu einer Wahl von Messkanaleigenschaften führen, die sich zwar der Intuition in vielen Fällen stark widersetzen, jedoch im Hinblick auf eine der Messung nachgeschaltete Datenauswertung, insbesondere vermittels der Methode des"Linear Unmixing"hervorragende Ergebnisse liefern.

Dabei führt die Optimierung verschiedener Konditionszahlen in verschiedenen Fallkonstellationen zu unterschiedlich guten Ergebnissen.

Es ist daher besonders vorteilhaft, das erfindungsgemäße Verfahren

dahingehend weiterzubilden, dass dem Benutzer die Möglichkeit gegeben wird, eine globale Charakteristik des erwarteten Messergebnisses, beispielsweise sehr schwache Fluoreszenz, besonders große Anzahl unterschiedlicher Fluorophore, spektral besonders nah benachbarte Fluorophore etc., anzugeben und damit oder direkt die zu optimierende Konditionszahl festzulegen.

Die Umsetzung des berechneten Optimierungsergebnisses in die Realisierung physikalischer Eigenschaften der Messkanäle kann auf vielfache Weise durchgeführt werden. So bietet sich beispielsweise eine Frequenz-oder Frequenzbandwahl im Anregungs-und/oder Detekti- onsstrahlengang durch einstellbare Filter wie etwa AOTFs (Acusto Optic Tunable Filters) oder LCTFs (Liquid Crystal Tunable Filters) an. Ebenso können feste Kanten-, Bandpassfilter und/oder Strahlteiler, die bei- spielsweise auf motorisch angetriebenen Filterschiebern oder-rädern angeordnet sind, zum Einsatz kommen. Eine weitere Möglichkeit der automatischen Beeinflussung der Messkanalcharakteristiken besteht in der Variation der Anregungsintensitäten, beispielsweise durch Einbrin- gen sog. Graukeile in den Anregungsstrahlengang. Auch die zeitlichen Charakteristika der Messkanäle lassen sich in Umsetzung des erfin- dungsgemäßen Optimierungsverfahrens variieren. Beispielsweise kann die Anregungsdauer variiert oder es können zur Trennung von Fluores- zenzkomponenten mit kurzer und langer Lebensdauer zeitliche Detekti- onsfenster definiert werden. Hierzu ist dem Fachmann eine Vielzahl von Umsetzungsmöglichkeiten bekannt.

Konditionszahlen von Matrizen, wie oben erwähnt, liefern im Wesentli- chen Abschätzungen maximaler Fehler, die jedoch in der Praxis oft weit unterschritten werden können. Dies trifft insbesondere zu, wenn bekannte Strukturen eines gegebenen Problems berücksichtigt werden. In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Möglichkeit einer weitergehenden Optimierung vorgesehen, bei der die speziellen Eigenschaften der experimentellen Störquellen bei Fluoreszenzmessungen formuliert werden. Insbesondere

ist vorteilhafterweise ein zweiter Optimierungsschritt vorgesehen, in dem durch Variation der die Eigenschaften der Messkanäle beschreiben- den Koeffizienten das Rauschen des zu erwartenden Signals optimiert wird.

Dieser erfinderischen Idee liegt die folgende Erkenntnis zugrunde. Sind die Koeffizienten der Matrix A bzw. des Matrixausdrucks ArA bestimmt, vorzugsweise durch Anwendung des oben beschriebenen, ersten Optimierungsschrittes optimiert, lautet die Lösung des linearen Gleichungssystems ###=(ATA)-1 AT(#-###) (5) Dabei bezeichnet (B) den Erwartungswert der Lösung #, womit berücksichtigt wird, dass der Vektor D-I b mit einer experimentellen Schwankung G behaftet ist. Der Vektor ü ist zu verstehen als kompo- nentenweise Quadratwurzel der Ausdrücke v2, die jeweils als Erwar- tungswerte der Varianz des Messwertes yr zu verstehen sind. Diese setzten sich aus zwei Komponenten zusammen, nämlich dem Photonen- rauschen, dessen Varianz proportional zum Signalniveau ist, und dem davon statistisch unabhängigen, konstanten Detektorrauschen, das sich aus Dunkelstrom und Ausleserauschen des jeweiligen Detektors zusammensetzt.

#r2=yrs+#0,r2 (6) Dabei ist s eine Proportionalitätskonstante (ein geeignet berechneter Einzelphotonenbeitrag) und CT2, die Summe aller konstanten Beiträge zur Varianz des Signals im Kanal r.

Nach der Methode der Gaußschen Fehlerfortpflanzung lässt sich die Schwankung Gs, 8 der Komponente BX, des Vektors B beschreiben als Da Gleichung 5 ein lineares Gleichungssystem ist und I b nicht von y, <BR> <BR> abhängt, ist ##Bµ3=cµr, wobei cµr das Element der r-ten Zeile und, u-ten<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> #y<BR> <BR> ex, Spalte der Matrix C= (ATA)'AT ist. Daher ist Dieser Ausdruck oder auch die Summe aller Abweichungsquadrate lässt sich im Raum aller Messkanalparameter minimieren. Allerdings enthalten laut Gleichung (6) die Größen C2 die Messwerte Yr, sodass für die Minimierung von SB vom Benutzer Angaben über die Größe der erwarteten Signale gemacht werden müssen.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemä- ßen Verfahrens ist es im Wesentlichen diese Größe SB, die durch Variation der die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten optimiert wird.

Dabei ist vorzugsweise vorgesehen, dass das Rauschen des zu erwarten- den Signals unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimiert wird. Eine dieser Nebenbedingungen, die auch im Rahmen des oben beschriebenen, ersten Optimierungsschritts Anwendung finden können, kann bei einer vorteilhaften Ausbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Höchstgrenze für die Bleichung eines oder mehrerer Fluorophore sein.

Da bei fortschreitender Bleichung das Signal abnimmt, während

bestimmte Anteile des Rauschens zeitunabhängig sind, kann die Optimierung unter Umständen in Bezug auf Beleuchtungsdauer bzw.

-intensität erfolgen. Als weitere mögliche Nebenbedingung kann mit Vorteil die Minimierung des Rauschens eines Signals einer bestimmten, vorzugsweise vom Benutzer vorgegebenen, Intensität genutzt werden.

Diese Nebenbedingung bietet sich insbesondere an, wenn das erwartete Signal so niedrig ist, dass das Gesamtrauschen des Messkanals durch Dunkelstrom und Ausleserauschen des Detektors dominiert wird.

Als weitere, mögliche Nebenbedingung kann in einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die maximale spektrale Auflösung verschiedener Fluorophore in einem bestimmten Bereich eines zuvor aufgenommenen Testbildes genutzt werden. Dies kommt insbesondere dort zum Tragen, wo ein oder mehrere verschiedene Fluorophore vor dem Hintergrund einer allgemeinen, unspezifischen Autofluoreszenz der Probe aufgelöst werden sollen oder falls ein bestimmter Bildbereich für den Benutzer von besonderem Interesse ist.

Bei einer weiteren, günstigen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, als Nebenbedingung die Minimierung des relativen Fehlers der Messkanäle zu nutzen. Diese Form der Nebenbe- dingung wird vorzugsweise dann eingeführt, wenn Verhältnismessungen, wie etwa bei FRET-Messungen, durchgeführt werden sollen.

Besonders günstig kann es sein, wenn der Benutzer die Möglichkeit erhält, zusätzlich zu einer oder mehreren Nebenbedingungen oder an ihrer statt Informationen zu einem vermuteten Modell des Rauschens, beispielsweise poisonbasiert, eingeben kann.

In besonders bevorzugter Weise wird das erfindungsgemäße Optimie- rungsverfahren im Rahmen eines iterativen, dialoggesteuerten Prozesses zur Definition der Nebenbedingungen durchgeführt, der es dem Benutzer erlaubt, nach Durchführung eines vorläufigen Optimierungsschrittes weitere Informationen einzugeben und einen oder mehrere erneute Optimierungsschritte anzufügen.

Um die Vorteile und Besonderheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens in besonders vorteilhafter Weise umsetzen zu können, ist erfindungsge- mäß eine Vorrichtung, wie beispielweise ein Laser-Scanning-Mikroskop, vorgesehen, dessen digitale Datenverarbeitungsanlage derart program- miert ist, dass das vorbeschriebene, erfindungsgemäße Optimierungsver- fahren durchführbar ist, und die über die weiter oben erwähnten technischen Einrichtungen zur automatischen Einstellung der Messkanal- eigenschaften verfügt.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Systems wird nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnung erläutert. Es zeigt die einzige Fig. 1 den schematischen Aufbau eines erfindungsgemäß einge- richteten Laser-Scanning-Mikroskops.

In dem in Fig. 1 gezeigten, besonders vorteilhaften Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist diese als Laser-Scanning- Mikroskop realisiert. Das System besteht im Wesentlichen aus drei Teilen, nämlich einer Datenverarbeitungsanlage 10, einer Benutzer- schnittstelle 20 sowie einem optisch/elektronischen Aufbau 30. Die Datenverarbeitungsanlage umfasst eine Berechnungseinheit 11, in der die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Optimierungsverfahrens sowie vorzugsweise die zur Auswertung der aufgenommenen Daten notwendi- gen Rechnungen durchgeführt werden. Weiter ist eine Speichereinheit 12 umfasst, in der einerseits aufgenommene Daten gespeichert oder zwischengespeichert werden können, andererseits aber auch die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Pro- grammbefehle sowie Bibliotheken gespeichert sind, in denen die für die erfindungsgemäßen Berechnungen erforderlichen Daten gespeichert sind.

Diese sind etwa Anregungs-, Fluoreszenzspektren sowie Fluoreszenzle- bensdauern einer Vielzahl von Fluorophoren, spektrale Charakteristiken einer Vielzahl von Filtern oder Farbteilern sowie die Empfindlichkeits- charakteristiken verschiedener Detektoren. Auch die spektralen und elektronischen Merkmale verschiedener Lichtquellen, insbesondere

Laser, können in der Speichereinheit 12 der Datenverarbeitungsanlage 10 gespeichert sein.

Weiter umfasst die Datenverarbeitungsanlage 10 eine Datenschnittstel- le 13, über die die aufgenommenen Messdaten sowie Benutzereingaben über die Benutzerschnittstelle 20 in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingespeist und Steuerbefehle an einstellbare Komponenten des optisch/elektronischen Aufbaus 30 der Vorrichtung sowie Informationen an die Benutzerschnittstelle 20 ausgegeben werden können.

Die genannten Elemente der Datenverarbeitungsanlage 10 können auf vielfache, dem Fachmann bekannte Weise realisiert und in ihren technischen Einzelheiten der speziellen jeweiligen Konfiguration angepasst werden.

Zur Messung einer Fluoreszenzprobe 40 wird diese unter dem Mikro- skopobjektiv 39 platziert. Über die Benutzerschnittstelle 20 kann der Benutzer verschiedene Daten in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingeben, die die vermutete chemische Fluorophorenzusammensetzung, voraussichtliche Intensitäten und/oder Optimierungsnebenbedingungen, wie beispielsweise Bleichgrenzen, eingeben. Aufgrund dieser Vorgaben berechnet die Berechnungseinheit 11 der Datenverarbeitungsanlage 10 gemäß dem erfindungsgemäßen Optimierungsverfahren diejenigen Werte, entsprechend denen der optisch/elektronische Aufbau 30 einzustellen ist.

Hierdurch werden die Messkanäle als spezifische Kombinationen spezieller Anregungs-und Detektionskanäle definiert. In dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel sind die Anregungskanäle vergleichswei- se einfach ausgeführt. Sie bestehen im Wesentlichen aus zwei Laserquel- len 31a und 31b, die über motorisch ansteuerbare Kollimatoren 32a, 32b, Umlenkspiegel 33a, 33b, 33c, ein motorisch ansteuerbares Strahlteiler- rad 34a, einen Scanningspiegel 35 und eine Scanninglinse 36 durch das Mikroskopobjektiv 39 die Probe 40 beleuchten. Die Eigenschaften des Anregungslichtes in Bezug auf Wellenlänge und Intensität sind durch Ansteuerung der Laser 31a, 31b, der Kollimatoren 32a, 32b sowie des Strahlteilerrades 34a über die Steuerleitungen 131a, 131b und 134a

einstellbar. Selbstverständlich liegt es im Bereich der Erfindung, Lichtquellen anderer Art und/oder anderer Zahl zu verwenden oder die Einstellung der Eigenschaften des Anregungslichtes durch andere oder weitere ansteuerbare Komponenten, wie etwa Neutralgrau- Filterschiebern, zu realisieren.

Die Ansteuerung des Scanningspiegels 35 über die Steuerleitung 135 geschieht auf herkömmliche Weise.

Das Fluoreszenzlicht, das in Fig. 1 schematisch als gestrichelte Linie dargestellt ist, läuft von der Probe 40 durch das Mikroskopobjektiv 39, Umlenkspiegel 33c, Scanninglinse 36 und Scanningspiegel 35 auf das motorisch ansteuerbare Strahlteilerrad 34a zu. Bei geeigneter Einstellung des Rades 34a passiert der wesentliche Anteil des Fluoreszenzlichtes den eingestellten Strahlteiler, während Licht im Bereich der Anregungswel- lenlänge reflektiert wird. Die Einstellung der Detektionskanäle erfolgt über die Einstellung dieses Strahlteilerrades 34a sowie über die Einstellungen weiterer Strahlteilerräder 34b und 34c, die über die Steuerleitungen 134b und 134c entsprechend den von dem erfindungsge- mäßen Optimierungsverfahren ermittelten Parametern eingestellt werden.

Eine weitere Kanalspezifizierung erfolgt über die Einstellung der Filterräder 36a und 36b, die über die Steuerleitungen 136a und 136b gemäß den von dem erfindungsgemäßen Optimierungsverfahren ermittelten Parametern eingestellt werden.

Das so vorselektionierte Fluoreszenzlicht fällt auf verschiedene Detektoren 37a, 37b und 37c, deren Daten über die Eingangsleitun- gen 137a, 137b und 137c in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingespeist werden. Je nach speziellem Aufbau werden die Daten bereits in den Detektoren 37a, 37b, 37c oder erst in der Datenschnittstelle 13 der Datenverarbeitungsanlage 10 digitalisiert. Die so aufgenommenen und in der Speichereinheit 12 der digitalen Verarbeitungsanlage 10 gespeicher- ten Daten werden von der Berechnungseinheit 11 von bekannten Datenauswertungsprogrammen ausgewertet, wobei vorzugsweise die Methode des"Linear Unmixing"Anwendung findet.

Die erfindungsgemäße Einstellung bzw. Definition der Messkanäle bezieht sich in dem gezeigten Ausführungsbeispiel sowohl auf die spektrale Sektionierung des Fluoreszenzlichtes als auch auf die Anzahl der verwendeten Messkanäle, d. h. die Anzahl der verwendeten Kombina- tionen von Anregungs-und Detektionskanälen. Dabei sind die Anzahl und Art der Detektoren ebenso variabel wie die der Lichtquellen.

Insbesondere können, in Fig. 1 nicht gezeigt, Detektoren verwendet werden, die beispielsweise bzgl. ihrer Detektionszeit, d. h. Detektions- dauer und/oder Detektionszeitpunkt, gemäß errechneten Optimierungspa- rametern angesteuert werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, die für den LSM-Aufbau erforderlichen Pinholes 38a-c ansteuerbar zu gestalten und ihren Durchmesser in die Reihe der Optimierungsparameter aufzunehmen.

Natürlich stellt die beschriebene und in Fig. 1 gezeigte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung lediglich eine beispielhafte Illustration einer besonders vorteilhaften Variante dar. Im Bereich der vorliegenden Erfindung sind jedoch vielfältige Variationen denkbar.

Bezugszeichenliste 10 digitale Datenverarbeitungsanlage 11 Berechnungseinheit von 10 12 Speichereinheit von 10 13 Datenschnittstelle von 10 120 Steuerleitung 131 a, b Steuerleitung 134a-c Steuerleitung 135 Steuerleitung 136a, b Steuerleitung 137a-c Steuerleitung 20 Benutzerschnittstelle 30 optisch/elektronischer Aufbau 31 a, b. Laser 32a, b Kollimator 33a-c Umlenkspiegel 34a-c Strahlteilerrad 35 Scanningspiegel 36 Scanninglinse 37a-c Detektor 38a-c Pinhole 39 Mikroskopobjektiv 40 Fluoreszenzprobe