本发明涉及一种构建三维微环境的方法及装置 ，特别涉及一种与传统两维细胞培养 技术同样简易方便操作的方法 （easy as 2D) 实现包括可溶性因子、 生物材料和细胞的 三维细胞微环境的构建的方法和装置， 属于生物医学工程领域。

背景技术

两维细胞培养 （基于商业化的培养皿或多孔板） 技术发展已有百余年的历史， 在生 命科学基础研究、 制药产业、 医学研究等领域具有广泛应用。 但在很多情况下， 两维细 胞培养环境与细胞在体内生长的真实环境相距 甚远。 因此这种简化的两维微环境不能很 好的模拟和重现体内的三维微环境。 而依赖于动物体内实验的研究过程复杂且与人 体反 应具有差异性。 因此,三维细胞培养技术在近年来得到了大幅� �的发展。

三维细胞培养技术是指将不同种类的细胞种植 到具有三维结构的材料载体中， 使细 胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、 生长、 行使功能。 该技术的目的是模拟体内 细胞生长环境， 其核心因素是细胞与三维微环境之间的相互作 用， 即细胞与分子、 细胞 与细胞外基质（Extracellular matrix, ECM) 以及细胞与细胞的相互作用。 三维细胞微环 境较真实地在体外模拟和重现体内细胞生长环 境与状态 （生长、 分化、 极化、 细胞间相 互作用等） ， 细胞在基因表达、 基质分泌及细胞功能活动等方面与两维培养均 有明显差 异， 作为生理模型研究细胞对于药物反应有较准确 的预测性， 同样作为病理模型具有很 高的仿生性。 因此在体外构建三维细胞微环境实现分子、 材料和细胞在三维水平上相互 作用的研究对于加速生物、 医学和药物开发等领域的发展具有重要意义。

目前，细胞三维培养方式主要有两种：水凝胶 （hydrogel)培养方式和支架（scaffold) 培养方式。 水凝胶培养方式是将细胞和材料的悬浮液在一 定条件下交联成水凝胶， 细胞 在水凝胶的交联网络体系内实现三维培养。常 用的成胶（gelling)方式有： 温度转变（如 collagen、 matrigel) 、 H转变 （如 chitosan) 、 添加离子 （如 alginate) 、 光暴露 （如 hyaluronic acid or dextran-containing vinyl groups)等等。支架培养方式是指将细胞或细胞 -材料的悬浮液种植到已经成型的三维支架材� �中实现三维培养。目前种植的方法分为两 大类：静态种植和动态种植。静态种植一般将 细胞或细胞-材料的悬浮液直接滴加在支架 上； 动态种植借助外部动力 （如旋转种植、 表面超声波种植、 离心种植、 磁场种植等） 使细胞较高效、 均匀地渗入支架内部。 与传统两维细胞培养方式相比， 水凝胶培养体系 中， 细胞在成胶过程中需要同预聚物一起经历交联 过程， 不可避免受到伤害； 且水凝胶 体系中约 90%成分为水， 机械性能较差， 不适合长期换液增殖培养及定量检测。 但水凝 胶具有良好的光学性能， 可以像两维培养方式一样在普通白光显微镜下 对细胞生长状态 进行实时无标记观测，在血管新生、肿瘤发生 学等领域具有广泛应用。支架培养方式中， 静态种植法简便、 使用广泛， 但也最低效， 动态种植法具有外部机械力损伤细胞的潜在 危险， 且支架培养体系光学性能较差， 细胞在支架体系内的分布、 生长、 迁移等变化无 法实时观测， 必须借助荧光标记、 固定染色等手段， 无疑增大了实验的复杂性和技术难 度。 但支架具有良好的机械性能， 可以像两维培养方式一样对细胞进行长期换液 增殖培 养， 在组织工程、 临床检测等领域具有广泛应用。

近期， 三维细胞培养技术发展迅速， 市场上逐渐推出十余种三维细胞培养产品 （如 Alvetex、 AlgiMatrix GEM、 Microtissues、 RAFT、 n3D 等） ， 均产自美国、 英国、 瑞 士等地。产品主要分为两种类型： 水凝胶型和支架型。例如 qgelbio公司推出的 QGel™, 是一种 PEG粉末， 将其与细胞悬浮液和 QGel ^TM buffer混合， 以 QGel™Disc Caster为模 具， 制备载有细胞的三维水凝胶薄片； 而 3Dbioteck公司推出的 3D Insert™-PS和 3D Insert™-PCL, 是一种基于多孔板的内嵌式多孔支架， 细胞悬浮液直接滴加在内部连通 的多孔支架上达到三维培养的目的。 两种类型产品相比较， 水凝胶型三维细胞培养方式 前期制备过程较复杂， 需要多步操作， 细胞和预聚物一起交联成胶有损伤风险， 且需要 配套模具， 价格较高， 但由于水凝胶光学性能较好， 后续实验中可用显微镜在白光下观 察细胞状态； 而多孔支架型三维细胞培养方式操作过程简便 ， 技术难度低， 但由于多孔 支架光学性能差， 无法在普通白光显微镜下直接观察细胞状态， 实验中需要对细胞进行 荧光标记和荧光成像。 根据 DDW (Drug Discovery World) 调查统计， 目前仅有 7%科 研人员逐渐将两维细胞培养方式转向三维培养 方式， 7%人员持期望和积极态度，而 86% 人员拒绝使用， 主要原因是他们要求三维细胞研究手段要和传 统的两维细胞研究手段在 整套实验体系中保持一致： 培养方式上无需特殊工具和技巧， 检测方式上可依赖于常规 设备 （off-the-shelf instruments ) 和方法进行实时检测。

建立三维细胞培养系统需要考虑实际研究中的 多重因素。 如材料基质的来源 （天然 或合成材料） 、 材料基质的物化性能（化学相容性、 机械性能、 降解性、 结构特性等） 、 材料基质的生物活性（粘附位点、 诱导信号等）， 三维培养技术所需的设备、使用条件、 适用范围， 细胞的封装方式、 培养方式、 检测方式等等。 理想的三维细胞培养系统能够 实现在细胞种植、 培养、 增殖、 传代过程中以及后续的成像与定性， 同传统两维细胞培 养方式同样简便易行 （easy as 2D) 。

再者， 现代生物学、 药学、 医学的系统研究需要涉及大量信息的获取和分 析， 为了 降低研究成本， 理想三维细胞培养系统还能满足微尺度 （microscale ) 、 高通量 (high-throughput) 的研究要求。 此外， 为满足生物学、 再生医学、 组织工程、 病理学 等领域不同的研究目的， 理想三维细胞培养系统还应具备可图案化 （patterning) 、 微观 结构 （microstructure)可控性， 易于监测 （monitoring)等特点， 实现具有更为复杂精细 结构的仿生体外模型的建立。

随着生物医学、 材料学、 机械学、 工程学等交叉学科的快速发展， 越来越多的技术 用于在空间上精确控制三维细胞培养微环境。 例如诞生于半导体工业的微米尺度加工技 术 （如 3D打印机、 激光雕刻机） 被越来越广泛的应用于生物医学研究中以实现 对于分 子、 材料和细胞在空间上的精确控制和高通量排列 ， 其在建造图案化、 高通量的三维微 环境领域具有强大功能。利用此技术可重建体 外仿生模型（如模拟血管的多层生理结构， 以及肝小叶精细的生理结构） ， 以及构建三维的分子、 材料和细胞阵列芯片。 再有， 目 前常用的高通量平台技术基于微孔板 （如 96、 384孔板） 或芯片 （如基因、 蛋白、 材料 和细胞芯片） 形式， 用自动化操作系统 （如机械手、 排枪、 芯片点样系统、 个人点样仪 等） 执行实验过程， 降低了所需试剂 （如抗体、 药物） 、 材料 （如 matrigel、 collagen) 和细胞 （如干细胞、 肝细胞） 的用量来实现微量样本研究。 但是， 这些技术的应用仅仅 局限于具有拥有昂贵仪器并且有交叉学科 （生物材料、 工程制造、 生物医学等） 背景的 实验室，其在传统生物学、药学和医学实验室 的广泛应用尚存在技术上、资金上的瓶颈。 因此能在常规生物学、 医学或药学实验室实现的高通量图案化三维细 胞微环境的建立将 对于其广泛应用具有很重要的价值。

综上所述三维细胞微环境构建的复杂性、 目前已经商品化三维细胞培养产品的优缺 点以及各领域研究需要，亟需一种能够和两维 细胞培养方法一样简易，方便操作（easy as 2D) 的三维细胞培养方法， 并同时满足图案化、 高通量、 实时无标记监测等研究目的。 发明公开

本发明的目的是提供一种构建三维细胞微环境 的方法及装置。

本发明所提供的构建三维微环境的装置是基于 三维透明海绵支架的装置。所述海绵 支架为透明的海绵支架， 所述透明的海绵支架为透明度达到 50%以上的所述海绵支架。

所述海绵支架用生物材料制成， 具有若干小孔； 所述小孔的孔径为 lnm -999μηι, 孔间距为 1μηι-999μηι，所述小孔在所述海绵支架上所� ��成的孔隙率（多孔物体的孔隙体 积和物体的总体积之比） 为 70%-99.9%； 所述海绵支架的体积为 0.^m ³ -1000cm ³ 。

在本发明中， 所述小孔的孔径具体可为 1μηι -150μηι、 1μηι -85μηι 10μηι -150μηι或 ΙΟμηι -125μηΐ; 所述孔隙率具体可为 82.4%-94.2%、 82.4%-93.3%或 93.3%-94.2% (如 82.4% 93.3%或 94.2% ) ； 所述海绵支架的体积具体可为 0.2355mm ³ -37.56mm ³ 、 0.2355mm ³ -4.82 mm ³ 、 6.26mm ³ -37.56mm ³ 、 0.603 mm ³ -4.82 mm ³ 或 0.2355mm ³ -0.603 mm ³ (具体如 0.2355mm ³ 、 0.603 mm ³ 、 1.204 mm ³ 、 1.809 mm ³ 、 2.415 mm ³ 、 3.026 mm ³ 、 3.620 mm ³ 、 4.22 mm ³ 、 4.82 mm ³ 、 6.26mm ³ 12.52 mm ³ 、 25.04mm ³ 或 37.56mm ³ ) 。 在本发 明中， 所述海绵支架的吸水量为理论体积的 1-15倍、 10-15倍、 3.5-5倍或 1-2倍。

所述生物材料为可交联的人工合成的生物材料 和 /或可交联的天然生物材料;所述人 工合成的生物材料为下述至少一种： 聚乙二醇、 聚乙二醇衍生物、 聚丙烯、 聚苯乙烯、 聚丙烯酰胺、 聚乳酸、 聚羟基酸、 聚乳酸醇酸共聚物、 聚二甲基硅氧烷、 聚酸酐、 聚酸 酯、 聚酰胺、 聚氨基酸、 聚縮醛、 聚氰基丙烯酸酯、 聚氨基甲酸酯、 聚吡咯、 聚酯、 聚 甲基丙烯酸酯、 聚乙烯、 聚碳酸酯和聚氧化乙烯； 所述天然生物材料为下述至少一种： 明胶、 明胶衍生物、 藻酸盐、 藻酸盐衍生物、 琼脂、 基质胶、 胶原、 蛋白多糖、 糖蛋白、 透明质酸、 层连接蛋白和纤维连接蛋白。

本发明所提供的构建三维微环境的装置， 包括下述 A1 ) 和 A2) 的两个器件： A1 ) 所述透明的海绵支架或由两个以上所述透明的 海绵支架组成的海绵支架阵列； A2)用于 装载样品液的基底 A;

所述装载样品液的基底 A为亲水性基底或疏水性基底；所述亲水性基� �或疏水性基 底由各种改性方法制备， 包括化学修饰法、 物理改性法以及将其结合使用。 所述基底的 亲水性或疏水性使样品液在所述基底的表面形 成液体薄层；所述液体薄层的厚度通常为 1μηι -200μηι, 既可形成细胞薄层， 又不会在重力作用下形成聚集， 导致分布不均。 所述 亲水性或疏水性基底的微加工技术为下述至少 一种： 影印石版术 （photolithography) 、 微接触打印技术 （microcontact printing) 、 微流体图案技术 (microfluidic patterning) 层 流图案技术 (laminar flow patterning) 模版图案技术 (stencil patterning) 压印光刻技术 (Imprint lithography)、 流体光刻技术 (flow lithography)等。 在本发明中， 所述液体薄层的 厚度具体可为 ΙΟμηι -ΙΟΟμηι或 10μηι-50μηι， 如 ΙΟμηι或 50μηι。

所述生物材料的交联方法为下述至少一种： 光交联法、 化学交联法、 物理交联法、 辐射交联法、 酶催化交联法、 活化微珠交联法等。

所述小孔的制孔技术为下述至少一种： 致孔剂（porogen)滤除法、 相分离法、 乳液 冷冻干燥法、 溶剂蒸发法、 气体泡沫法、 纤维粘合法等。

在制备所述透明的海绵支架的过程中， 需要使用透明剂， 改变所述生物材料的光学 性能， 以达到透明的效果。 同时还可以通过使用微加工技术， 实现所述海绵支架的图案 化，和 /或实现所述海绵支架阵列的高通量。所述三� �微环境的微加工技术为下述至少一 禾中： 影印石版术 (photolithography) 、 微接触打印技术 ( microcontact printing) 、 微流 体图案技术 (microfluidic patterning)、 层流图案技术 (laminar flow patterning)、模板图案技 术 (stencil patterning) 压印光亥 [J技术 (Imprint lithography) 流体光亥 [J技术 (flow lithography) 等。 在本发明中， 具体通过使用光掩膜， 根据需要设计透光部分的图案， 进而通过光交 联得到图案化的三维海棉支架以及高通量的三 维海绵支架阵列。

所述海绵支架阵列由三个以上的所述海绵支架 组成，形成所述高通量的三维海绵支 架阵列。 在本发明中， 组成所述海绵支架阵列的所述海绵支架具体可 为 16-192个， 如 16、 24、 64、 192个。

本发明中， 所述透明的海绵支架的制备有光交联法和化学 交联法。

在本发明的一个实施例中，采用光交联法制备 所述透明的海绵支架，包括如下步骤: bl )将聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯和光引发� � 2-羟基 -4-(2-羟乙氧基) -2-甲基苯 丙酮溶解在所述透明剂与水的混合溶液中， 得到可光交联的预聚物溶液 A;

b2)利用紫外光源照射步骤 bl )获得的可光交联的预聚物溶液 A， 使所述可光交联 的预聚物溶液 A发生交联反应， 得到水凝胶；

b3 )将步骤 b2)获得的所述水凝胶浸于超纯水中除去未交联 的所述聚合物单体聚乙 二醇二丙烯酸酯、 所述透明剂和杂质。

在上述方法中，所述聚合物单体聚乙二醇二丙 烯酸酯在所述可光交联的预聚物溶液 A中的含量为每 100ml所述可光交联的预聚物溶液 A中含有 l-50g所述聚合物单体聚乙 二醇二丙烯酸酯； 所述光引发剂 2-羟基 -4-(2-羟乙氧基) -2-甲基苯丙酮在所述可光交联的 预聚物溶液 A中的含量为每 100ml所述可光交联的预聚物溶液 A中含有 0.1-10g所述 2-羟基 -4-(2-羟乙氧基) -2-甲基苯丙酮； 所述透明剂在所述透明剂与水的混合溶液中的 体 积百分含量需大于等于 0.01%， 同时小于 100%。

所述透明剂可为 1,2,4-丁三醇、 乙二醇， 1,3-丁二醇， 丙三醇， 1,2-丙二醇， 1,3-丙 二醇， 季戊四醇， 顺 -1,2-环戊二醇， 丁四醇和戊五醇等多元醇中的至少一种。

在本发明的一个实施例中，所述聚合物单体聚 乙二醇二丙烯酸酯在所述可光交联的 预聚物溶液 A中的含量为每 100ml所述可光交联的预聚物溶液 A中含有 10g所述聚合 物单体聚乙二醇二丙烯酸酯； 所述光引发剂 2-羟基 -4-(2-羟乙氧基) -2-甲基苯丙酮在所述 可光交联的预聚物溶液 A中的含量为每 100ml所述可光交联的预聚物溶液 A中含有 0.5g 所述 2-羟基 -4-(2-羟乙氧基) -2-甲基苯丙酮； 所述透明剂具体为 1,2,4-丁三醇， 所述 1,2,4- 丁三醇在所述透明剂与水的混合溶液中的体积 百分含量具体为 60% (即所述 1,2,4-丁三 醇与所述水的体积比为 3: 2) 。

在本发明的另一个实施例中， 采用化学交联法制备所述透明的海绵支架， 包括如下 步骤：

cl )将聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯溶解在所� �透明剂与水的混合溶液中， 再加 入过硫酸铵和 Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基二乙胺， 得到预聚物溶液 Β;

c2) 在步骤 cl ) 得到预聚物溶液 B后， 将其加到制备海绵支架的模具中， 使所述 预聚物溶液 B发生化学交联反应 （室温下进行） ， 得到水凝胶；

c3)将步骤 c2)获得的所述水凝胶浸于超纯水中除去未交联 的所述聚合物单体聚乙 二醇二丙烯酸酯、 所述透明剂和杂质。

在上述方法中，所述聚合物单体聚乙二醇二丙 烯酸酯在所述预聚物溶液 B中的含量 可为每 100ml所述预聚物溶液 B中含有 l-50g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯酸酯；所 述过硫酸铵在所述预聚物溶液 B 中的含量可为每 100ml 所述预聚物溶液 B 中含有 0.01-lg所述过硫酸铵；所述 Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基二乙胺在所述预聚物溶液 B中的含量可为 每 100ml所述预聚物溶液 B中含有 0.01-lg所述 Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基二乙胺； 所述透明剂 在所述透明剂与水的混合溶液中的体积百分含 量需大于等于 0.01%， 同时小于 100%。

所述透明剂可为 1,2,4-丁三醇、 乙二醇， 1,3-丁二醇， 丙三醇， 1,2-丙二醇， 1,3-丙 二醇， 季戊四醇， 顺 -1,2-环戊二醇， 丁四醇和戊五醇等多元醇中的至少一种。

在本发明的一个实施例中，所述聚合物单体聚 乙二醇二丙烯酸酯在所述预聚物溶液

Β中的含量可为每 100ml所述预聚物溶液 Β中含有 10g所述聚合物单体聚乙二醇二丙烯 酸酯； 所述过硫酸铵在所述预聚物溶液 B中的含量可为每 100ml所述预聚物溶液 B中 含有 0.05g所述过硫酸铵； 所述 Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基二乙胺在所述预聚物溶液 Β中的含量 可为每 100ml所述预聚物溶液 B中含有 0.5g所述 Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基二乙胺。所述透明剂 具体为 1,2,4-丁三醇，所述 1,2,4-丁三醇在所述透明剂与水的混合溶液中的 体积百分含量 为 60% (即所述 1,2,4-丁三醇与所述水的体积比为 3: 2) 。

在上述化学交联方法中， 所述制备海绵支架的模具具体可用生物材料制 成， 所述生 物材料为人工合成的生物材料和 /或天然生物材料;所述人工合成的生物材料为� ��述至少 一种： 聚甲基丙烯酸酯、 聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙 烯、聚丙烯酰胺、 聚乳酸、 聚羟基酸、 聚乳酸醇酸共聚物、 聚二甲基硅氧烷、 聚酸酐、 聚酸酯、 聚酰胺、 聚氨基酸、 聚縮醛、 聚氰基丙烯酸酯、 聚氨基甲酸酯、 聚吡咯、 聚酯、 聚乙烯、 聚碳酸 酯和聚氧化乙烯； 所述天然生物材料为下述至少一种： 明胶、 明胶衍生物、 藻酸盐、 藻 酸盐衍生物、 琼脂、 基质胶、 胶原、 蛋白多糖、 糖蛋白、 透明质酸、 层连接蛋白和纤维 连接蛋白。

在上述光交联法和化学交联法制备所述透明的 海绵支架的步骤中， 在步骤 b3 ) 和 c3) 中所述除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇 二丙烯酸酯、 所述透明剂和杂质后， 还包括将所述水凝胶在 -200°C~0°C条件下冷冻 l-72h， 再干燥 l-72h， 得到所述海绵支架 或所述海绵支架阵列。 在本发明的实施例中， 在除去未交联的所述聚合物单体聚乙二醇二丙 烯酸酯、 所述 透明剂和杂质后， 将所述水凝胶在 -20°C条件下冷冻 4-5h， 再在 -50°C， 20pa条件下， 干 燥 12小时， 得到所述海绵支架或所述海绵支架阵列。

根据实际需要， 本发明所提供的用于构建三维微环境的装置， 还包括镶嵌在所述基 底 A上的边框。

所述边框用生物材料制成， 所述生物材料为人工合成的生物材料和 /或天然生物材 料； 所述人工合成的生物材料为下述至少一种： 聚乙二醇、 聚乙二醇衍生物、 聚丙烯、 聚苯乙烯、 聚丙烯酰胺、 聚乳酸、 聚羟基酸、 聚乳酸醇酸共聚物、 聚二甲基硅氧烷、 聚 酸酐、 聚酸酯、 聚酰胺、 聚氨基酸、 聚縮醛、 聚氰基丙烯酸酯、 聚氨基甲酸酯、 聚吡咯、 聚酯、 聚甲基丙烯酸酯、 聚乙烯、 聚碳酸酯和聚氧化乙烯； 所述天然生物材料为下述至 少一种： 明胶、 明胶衍生物、 藻酸盐、 藻酸盐衍生物、 琼脂、 基质胶、 胶原、 蛋白多糖、 糖蛋白、 透明质酸、 层连接蛋白和纤维连接蛋白。

在本发明的一个实施例中， 所述基底 A具体为亲水性基底； 所述基底 A上的边框 具体为用聚甲基丙烯酸甲酯制成的。

实际操作中， 根据需要， 所述装置还包括支撑所述海绵支架或所述海绵 支架阵列的 基底 B。在本发明的一个实施例中， 所述基底 B为固定所述海绵支架或所述海绵支架阵 列的载玻片。

所述海绵支架或所述装置在构建三维微环境中 的应用也属于本发明的保护范围。 本发明所提供的构建三维微环境的方法是基于 所述海绵支架（三维透明海绵支架）， 采用与传统两维细胞培养方法一样简便易行的 方法， 可实现包含可溶性因子、 生物材料 和细胞的三维细胞微环境的构建， 并同时满足图案化、 高通量、 无标记实时监测等研究 目的。 （图 1 )

本发明所述的与传统两维细胞培养方法一样简 单易行的种植方法基于传统滴加法 和液体薄层法。 传统滴加方法是指将样品液体直接滴加在支架 表面或旁侧， 样品液自动 被吸入支架内部。 液体薄层法是指将三维海绵支架接触覆盖在分 子、 材料和细胞的液体 薄层上， 利用海绵支架的自动吸附作用， 使得分子、 材料和细胞自动分散进入到所述海 绵支架中， 以实现高通量同步装载， 完成分子、 材料和细胞三维微环境的构建。

所述构建三维微环境的液体薄层法具体为用所 述装置构建三维微环境，可包括如下 步骤：

al ) 将样品液置于所述装置的基底 A上， 形成液体薄层；

a2) 将步骤 al ) 中形成所述液体薄层的所述基底 A覆盖在所述装置的海绵支架或 海绵支架阵列上， 或者将所述海绵支架或所述海绵支架阵列覆盖 在步骤 al )中形成所述 液体薄层的所述基底 A上，待所述样品液分散进入到所述海绵支架� �所述海绵支架阵列 后， 实现所述样品液的三维尺度装载， 完成所述三维微环境的构建；

所述液体薄层的厚度为 Ιμηι -200μηι, 既可形成细胞薄层， 又不会在重力作用下形 成聚集， 导致分布不均。 在本发明中， 所述液体薄层的厚度具体可为 ΙΟμηι -ΙΟΟμηι或 10μιη-50μιη, 如 ΙΟμιη或 50μιη。

在上述方法中， 所述样品液具体可包括下述 a) -d) 中任一所述的物质： a)各种分 子物质 （如小分子化合物、 药物、 核酸、 蛋白等） 中的任一种或任几种的混合物； b ) 各种天然与合成材料（如细胞外基质， 高分子材料、 微珠等） 中的任一种或任几种的混 合物； c )各种细胞和微生物 （如真核 /原核细胞、 病毒、 微生物等） 中的任一种或任几 种的混合物； d) a) -c ) 中任几种的混合物。

在本发明中， 上述所有三维微环境均为包括下述 a) -d) 中任一所述的三维微环境： a) 各种分子物质 （如小分子化合物、 药物、 核酸、 蛋白等） 中的任一种或任几种的混 合物； b ) 各种天然与合成材料 （如细胞外基质， 高分子材料、 微珠等） 中的任一种或 任几种的混合物； c )各种细胞和微生物 （如真核 /原核细胞、 病毒、 微生物等） 中的任 一种或任几种的混合物； d) a) -c ) 中任几种的混合物。

上述三维细胞微环境研究应用领域广泛， 包括但不限于： 分子 /材料 /细胞的芯片用 于研究分子 /细胞、 材料 /细胞、 细胞 /细胞相互作用； 药物筛选； 体外模型构建； 组织 工程； 再生医学； 病理研究等等。

附图说明

图 1为方法设计总图。 其中， A-1至 A-3为两维细胞培养技术， 具体的， A-1为细 胞滴加平铺在培养皿中， A-2为显微镜观察培养皿上细胞状态， A-3为传代培养，继 A-3 之后， 可根据需要进行各种细胞研究。 B-1 至 B-5 为三维细胞培养技术， 具体的， B-1 为细胞自动吸附进入透明多孔海绵支架， B-2为显微镜观察透明海绵支架内部细胞状态， B-3为传代培养， B-4为液体薄层法高通量自动装载 （1-液体薄层； 2-海绵支架阵列； 3- 疏水性边框） ， B-5为微加工技术实现微尺度、 图案化设计 （1-TMP修饰玻片； 2-盖玻 片； 3-OTS修饰玻片； 4-紫外光； 5-图案化光掩膜； 6-预聚物） ， 继 B-5之后， 可根据 需要进行各种细胞研究。

图 2为透明海绵支架制备及表征。 A为化学交联法制备海绵支架模具。 B为化学交 联法制备海绵支架实物图（正面图和侧面图） 及其电镜图。 C和 D为光交联法制备海绵 支架实物图 （圆柱形和圆环形） 及其电镜图 （C大孔径， D小孔径） 。 E和 F为光交联 法制备海绵支架孔径分布图 （E大孔径， F小孔径） 。

图 3 为透明海绵支架自动装载分子、 材料、 细胞。 A和 B为圆柱形海绵支架阵列 自动装载分子 （酚红溶液） ， A为装载前， B为装载后。 C和 D为正六边形海绵支架阵 列自动装载材料 （明胶） ， C为装载前， D为装载后。 E为正六边形和长方形海绵支架 阵列自动装载细胞 （HeLa) 。 F-1至 F-9为海绵支架自动装载荧光微球动态图 （荧光微 球直径 ΙΟμηι) 。

图 4 为透明海绵支架光学性能测试。 Α 为透过化学交联法制备的透明海绵支架 ( 0.5mm)观察文字（左侧两个样品为 0%1,2,4-丁三醇， 右侧两个样品为 60%1,2,4-丁三 醇） 。 B为化学交联法制备不同高度的透明海绵支架� � C为透过光交联法制备海绵支架 观察文字（0%1,2,4-丁三醇）。 D为透过光交联法制备透明海绵支架观察文字� �60%1,2,4- 丁三醇） 。 E 为不同体积比的透明剂 1,2,4-丁三醇对透明海绵支架透明度的定量图。 F 为不同高度对透明海绵支架 （60%透明剂 1,2,4-丁三醇） 透明度的定量图。

图 5为 HeLa细胞在透明海绵支架中生长形成肿瘤微球� � A-1至 A-5: 显微镜观察 HeLa细胞随时间在透明海绵支架中生长形成肿� �微球。 B为显微镜观察 HeLa肿瘤微球 的荧光图片。 C为 HeLa肿瘤微球的电镜图。 D为激光共聚焦显微镜观察 HeLa肿瘤微 球的三维荧光图片。

图 6为 HeLa肿瘤微球传代培养保持高存活率。 A为 HeLa肿瘤微球在透明支架中 的显微镜图片。 B为 HeLa肿瘤微球被消化洗涤出支架。 C和 D为肿瘤微球死 /活染色荧 光图片， C为低倍镜 2x， D为高倍镜 10x。

图 7为液体薄层法自动装载分子、 材料进入高通量、 图案化海绵支架。 A-1和 A-2 为等离子清洗法形成亲水性基底， A-1为清洗前水的接触角， A-2为清洗后水的接触角。 B为微加工技术 （影印石版术） 制备高通量海绵支架阵列。 C为等离子清洗法和微接触 打印法形成不同染料液体薄层。 D为液体薄层法高通量自动装载不同染料液体� �入海绵 支架阵列。 E为液体薄层法自动装载 Doxorubicin药物和荧光微球进入微加工技术 （影 印石版术） 制备的图案化海绵支架 （清华大学百年校庆图标） 。

图 8为液体薄层法自动装载 HeLa细胞进入海绵支架阵列。 A为液体薄层法自动装 载 HeLa细胞进入圆环形海绵支架阵列。 B-1至 B-3为不同细胞浓度液体薄层自动装载 效果图。 C为不同细胞浓度液体薄层自动装载进入海绵� �架内部的激光共聚焦显微镜三 维扫描图。 D为 Cell Titer-Blue测试液体薄层法自动装载不同浓度 HeLa细胞进入海绵支 架的细胞量与液体薄层残余细胞量。 E为 Cell Titer-Blue定量荧光强度-活细胞数量标准 曲线。 F为根据标准曲线 E图， 定量液体薄层法自动装载不同浓度 HeLa细胞进入海绵 支架的比率。

实施发明的最佳方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的孔隙率均指多孔物体的 孔隙体积和物体的总体积之比。 实施例 1、 分别采用化学交联法和光交联法制备图案化透 明三维海绵支架 本实施例所提供的制备透明海绵支架的生物材 料为聚乙二醇二丙烯酸酯 (PEGDA4000) 。 聚乙二醇二丙烯酸酯具有良好的生物相容性、 机械性能、 不可降解 性以及适用多种交联方法等优点， 适合作为本实施例制备透明海绵支架的生物材 料。 聚 乙二醇二丙烯酸酯合成方法： 在氮气条件下， 将 5g聚乙二醇 (PEG4000)粉末搅拌溶解于 50ml二氯甲烷溶液中， 缓慢逐滴加入 0.76ml的三乙胺溶液和 0.47ml的丙烯酰氯溶液， 室温下搅拌反应 24h。 之后， 加入 100ml 2M的碳酸钾溶液洗涤， 并静置分层， 收集下 层二氯甲烷混合液。将二氯甲烷混合液滴加入 500ml无水乙醚溶剂中沉淀， 过滤收集白 色粉末， 并室温干燥， 最终得到白色 PEGDA固体粉末。

(一） 化学交联法制备透明海绵支架

1. 激光切割法制备支架模具

采用 Rayjet激光雕刻机切割厚度分别为 0.5mm、 lmm、 2mm、 3mm的聚甲基丙烯 酸甲酯 （PMMA) 平板形成模具。 模板设计由软件 AutoCAD完成： 模板长 75mm， 宽 25mm, 均匀分布 3 X 14个直径为 4mm的微孔作为支架模型， 每个微孔的中心距离为 1000 m。 激光雕刻机的主要加工参数为： 切割能量 100%， 切割次数 2， 切割线速度 10%。 见图 2-Α。 2. 化学交联法制备水凝胶

本发明化学交联法制备水凝胶所配制的预聚物 溶液 B 的一大特点就是透明剂的添 力口， 从而满足生物学、 药学、 医学等领域对三维微环境实施无标记成像研究 的要求。 可 用的透明剂主要为多元醇类， 如乙二醇， 1,3-丁二醇， 1,2,4-丁三醇， 丙三醇， 1,2-丙二 醇， 1,3-丙二醇， 季戊四醇， 顺 -1,2-环戊二醇， 丁四醇， 戊五醇等。 所述透明剂多元醇 在最终的预聚物溶液 B中的体积百分比为 0.01%-100%。下述将以 1,2,4-丁三醇作为透明 剂， 阐述所述预聚物溶液 B的配制及水凝胶的制备方法： 将 10% (w/v) 聚乙二醇二丙 烯酸酯于 60°C条件下溶解于 1,2,4-丁三醇与水 （体积比 60/40 ) 的混合溶液中。 在冰盒 上操作， 加入 0.05% (w/v) 过硫酸铵的和 0.5% (w/v) Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基二乙胺得到预 聚物溶液 Β (上述各物质的浓度均为在预聚物溶液 Β中的终浓度） 。 将此预聚物溶液 Β 滴加到 ΡΜΜΑ模具的微孔中， 在室温条件下溶液逐渐化学交联为透明的水凝 胶。 实验 中， 同时设置不加入透明剂 1,2,4-丁三醇的对照。

3. 海绵支架的制备

采用冷冻干燥法将上述水凝胶制备成多孔支架 。 具体过程如下： 将上述载有水凝胶 的模具浸于超纯水中除去未交联的单体、 1,2,4-丁三醇等杂质， 换 4-5次水。 之后， 将其 在 -20°C条件下冷冻 4-5h， 再转入冷冻干燥机（-50°C， 20pa)干燥 12小时， 得到白色多 孔海绵支架。 按照上述方法， 制备得到海绵支架， 其实物图和电镜图见图 2-B。 所得海 绵支架的体积大小为 6.26mm ³ 、 12.52 mm ³ 、 25.04mm ³ 、 37.56mm ³ ;孔径大小 ΙΟμηι -150μηΐ; 孔间距 Ιμηι -999 μ m; 孔隙率为 94.2%， 连通性良好； 吸水量为理论体积的 10-15倍。

(二） 光交联法制备图案化透明海绵支架

1. 光掩模的设计与打印

采用 AutoCAD绘图软件设计光掩模。 设计尺寸： 光掩模大小为 76.2mmx25.4mm， 根据需求自由设计图案。例如，图 2中 C设计尺寸：透光孔径 D=lmm，孔间距 W=2mm。 图 2中 D设计尺寸： 透光环内径 D _ή =1200μηι, 外径 D外 =2000、 2560、 3020、 3420、 3780、 4100、 4400、 4680μηι, 环间距 ¥=6000μηι。 在印刷厂 （清华大学印刷厂） 打印 胶片光掩模。

2. 可光交联的预聚物溶液 Α的配制

本发明配制可光交联的预聚物溶液 A的一大特点就是透明剂的添加，从而满足生� � 学、 药学、 医学等领域对三维微环境实施无标记成像研究 的要求。 可用的透明剂主要为 多元醇类， 如乙二醇， 1,3-丁二醇， 1,2,4-丁三醇， 丙三醇， 1,2-丙二醇， 1,3-丙二醇， 季 戊四醇， 顺 -1,2-环戊二醇， 丁四醇， 戊五醇等。 所述透明剂多元醇在最终的可光交联的 预聚物溶液 A中的体积百分比为 0.01%-100%。 下述将以 1,2,4-丁三醇作为透明剂， 阐 述所述可光交联的预聚物溶液 A的配制方法：将 10% (w/v)聚乙二醇二丙烯酸酯和 0.5% (w/v) 2-羟基 -4-(2-羟乙氧基) -2-甲基苯丙酮于 60°C条件下溶解于 1,2,4-丁三醇与水（体 积比 60/40) 的混合溶液中， 冷却后得到可光交联的预聚物溶液 A (上述各物质的浓度 均为在可光交联的预聚物溶液 A中的终浓度） 。 混匀贮存于 4°C环境中备用。 实验中， 同时设置不加入透明剂 1,2,4-丁三醇的对照。

3. 载玻片的包被 采用化学修饰法分别将载玻片包被上十八烷基 三氯硅烷 （OTS ) (百灵威科技有限 公司）和甲基丙烯酸 3- (三甲氧基硅烷)丙酯 （TMP) ， OTS暴露端十八烷基将载玻片改 性为疏水性， 可以使液体聚集成一定高度， TMP暴露端双键可以与聚乙二醇二丙烯酸 酯的双键反应使聚合物固定在载玻片上。 具体包被方法如下： 1) 将载玻片放到染色架 上， 浸泡于洗洁精水溶液中， 超声 20分钟； 2) 将载玻片染色架浸于 10%的氢氧化钠 溶液 60分钟； 3) 再浸于超纯水中 30分钟， 烘干； 4) 室温下， 将载玻片染色架浸于 含有 5% (V/V) OTS的正己烷溶液中 30分钟， 或含有 1% (V/V) TMP的乙醇 （含 3% 乙酸） 中 3分钟； 5) 将包被上 OTS的载玻片在甲苯中浸泡 10分钟， 将包被上 TMP 的载玻片在无水乙醇中浸泡 10分钟； 6) 最后将载玻片烘干， 储存于 4°C冰箱中备用。

4. 紫外光交联过程

按照图 1-B-5 (影印石版术示意图） 所示构造图， 将上述步骤 1、 2、 3制备好的光 掩模、 可光交联的预聚物溶液 、 包被好的载玻片， 以及盖玻片组合起来， 将其暴露在 紫外光下形成图案状水凝胶， 支架高度为 2 个盖玻片， 300μηι。 紫外光源为加拿大 Omnicure S2000紫外交联仪； 具体紫外交联参数为： 紫外光强度 20mW/cm ² ， 光照时间 8.5s。

5、 图案化海绵支架的制备

采用冷冻干燥法将水凝胶制备成多孔支架。 具体过程如下： 将上述步骤 4交联后的 组合轻轻拆卸， 取固定有水凝胶的载玻片（即支撑所述海绵支 架或所述海绵支架阵列的 基底 B )浸于超纯水中除去未交联的单体、 1,2,4-丁三醇和杂质， 换 4-5次水。 之后， 将 其在 -20°C条件下冷冻 4-5h， 再转入冷冻干燥机（-50°C， 20pa)干燥 12小时， 得到白色 三维图案化海绵支架。 按照上述方法， 制备得到不同大小的海绵支架， 其实物图和电镜 图见图 2中 C和 D。 其中， 图 2中 C的海绵支架体积大小均为 0. 2355μ1。 图 2中 D的 海绵支架体积大小分别为 0.603μ1、 1.204μ1、 1.809μ1、 2.415μ1、 3.026μ1、 3.620μ1、 4.22μ1、 4.82μ1。 图 2中 C所示的海绵支架的孔径大小均在 10μηι-125μηι; 孔间距 Ιμηι -999μηι, 孔径分布百分比率均为 （见图 2中 Ε) ： 10μηι-30μηι的小孔占 17.74%， 30μηι-50μηι的 小孔占 43.55%， 50μηι-80μηι的小孔占 32.56%， 孔径大小 80μηι-125μηι的小孔占 6.45%; 孔隙率为 93.3%， 连通性良好； 吸水量为理论体积的 3.5-5倍。 图 2中 D所示的海绵支 架的孔径大小均在 1μηι-85μηι _; 孔间距 Ιμηι -999μηι, 孔径分布百分比率均为 （见图 2 中 F) ： 1μηι-10μηι的小孔占 5.33%， 10μηι-20μηι的小孔占 27.83%， 20μηι-30μηι的小孔 占 35.00%， 孔径大小 30μηι-40μηι的小孔占 20.50%， 孔径大小 40μηι-85μηι的小孔占 11.33%； 孔隙率为 82.4%， 连通性良好； 吸水量为理论体积的 1-2倍。

实施例 2、 海绵支架自动装载分子、 材料、 细胞

本案例实现分子、 材料和细胞的自动装载方法为传统滴加方法 （图 1中 B-1 ) 。 传 统滴加方法是指将样品液体直接滴加在支架表 面或旁侧， 样品液自动被吸入支架内部。 所述样品液可为小分子化合物、 药物、 核酸、 蛋白、 细胞外基质成分、 高分子材料、 微 珠、 真核细胞、 原核细胞、 病毒、 微生物中的任一种或任几种的混合物。

本实施例选用 ρΗ指示剂酚红作为样品液中分子样品的示例� �图 3中 Α和 B)、 lmg/ml 的明胶作为样品液中材料样品的示例（图 3中 C和 D) 、 5 X 10 ⁶ 个 /ml的 HeLa细胞（中 国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中 心， 3111C0001CCC000011 )作为细胞样 品 （图 3中 E) 自动装载进入实施例 1光交联制备好的三维图案化 "海绵支架" 中。 其 中， 图 3中 A的圆柱形海绵支架是按照实施例 1所述光交联法制备而来的， 圆柱的直径 为 ΙΟΟΟμηι; 海绵支架的高度为 300μηι _; 其海绵支架的孔径大小 1μηι-85μηι _; 孔间距 1μηι-999μηΐ; 孔隙率为 82.4%， 连通性良好； 吸水量为理论体积的 1-2倍； 该海绵支架 阵列共由 64个海绵支架组成。 图 3-C和 3-Ε中的正六边形和长方形海绵支架是按照实 施例 1所述光交联法制备而来的， 正六边形的边长为 500μηι， 长方形的长为 ΙΟΟΟμηι, 宽为 500μηι _; 海绵支架的高度为 300μηι _; 海绵支架的孔径大小 10μηι-125μηι _; 孔间距 1μηι-999μηΐ; 孔隙率为 93.3%， 连通性良好； 吸水量为理论体积的 3.5-5倍； 这两海绵 支架阵列均共由 16个海绵支架组成。 用荧光显微镜拍摄记录海绵支架自动装载 5χ10 ⁶ 个 /ml的荧光微球 （直径 ΙΟμηι) 液体的动态过程 （图 3中 F) 。 其中， F-1为 1.5秒， F-2为 2.5秒， F-3为 3.5秒， F-4为 4.5秒， F-5为 5.5秒， F-6为 7秒， F-7为 8.5秒， F-8为 11秒， F-9为 13秒。 吸水量为 5μ1的海绵支架完成自动装载过程耗时 13秒。

实施例 3、 海绵支架透明光学性能测试

本实施例选用文字观察和透明度测量来检测海 绵支架的透明光学性能。

将按照实施例 1中化学交联法和光交联法制备的海绵支架 （图 2中 Β， 图 3中 C) 浸入水中， 置于 37 °C培养箱中 2-3天， 除去支架内部气泡。 将其分别置于载玻片上， 透 过支架观察文字 （图 4中 A， C和 D ) 。 通过对比观察， 本发明方法制备的海绵支架再 次吸水后光学性能良好， 可以清晰看到载玻片下的文字。 没有加入透明剂的样品光学性 能较差， 无法清晰看到载玻片下文字。 将不同体积比 （0%， 10% , 30% , 60% ) 透明剂 1 ,2,4-丁三醇和不同高度的体积比为 60%透明剂 1 ,2,4-丁三醇的样品分别放在载玻片上， 用酶标仪检测其透光度（同时以 1cm玻璃作为对照）， 得到透明海绵支架的透明光学性 能定量图（图 4中 E和 F)。根据此定量图，可知：透明海绵支架的透� ��度随透明剂 1,2,4- 丁三醇的体积比的增大而增大， 随透明海绵支架的高度的增大而减小。

实施例 4、 观察记录细胞在透明海绵支架中生长

本实施例选用 HeLa细胞作为案例观察记录其在透明海绵支架� �的生长。 将 5 X 10 ⁶ 个 /ml的 HeLa细胞悬浮液滴加在海绵支架上， 并培养于 37 °C、 5%C0 ₂ 、 饱和湿度培养 箱中， 培养液为添加 10% ( v/v) FBS禾 B 1% ( v/v)双抗（青链霉素、 链霉素） 的 DMEM 培养液， 每两天换液一次。 普通白光显微镜观察记录 HeLa细胞随时间在透明海绵支架 (实施例 1中化学交联法制备得到的海绵支架） 中逐渐生长形成肿瘤微球 （图 5中 A-1 至 A-5 ) 。 其中， A-1至 A-5分别为细胞种植 0h、 4h、 26h、 50h、 lOOh后的记录图片。 通过观察比较， 可清晰观察到 HeLa细胞逐渐生长形成肿瘤微球， 且肿瘤微球随时间逐 渐增大。 （见箭头标记） 。 换液培养六天后， 进行 PBS洗涤、 4%多聚甲醛固定 lOmiiu PBS洗漆、 0.5% ( v/v) triton通透 5min、 PBS洗涤、 100nM罗丹明 （Rhodamine) 室温 染色 30min、 PBS洗涤、 100nM DAPI 37 °C染色 10min、 PBS洗涤、 覆盖抗荧光猝灭剂 等一系列步骤将支架内的肿瘤微球实现荧光染 色。图 5中 B为荧光显微镜观察肿瘤微球 图片， 图 5中 C为扫描电镜观察肿瘤微球， 图 5中 D为激光共聚焦显微镜观察肿瘤微 球图片 （细胞核： 蓝色 -DAPI, 细胞骨架： 红色 -rhodamine ) ， 进一步证明 HeLa细胞在 三维环境中的生长状态为三维立体生长， 不同于传统两维环境中单细胞层生长。

实施例 5、 海绵支架中细胞的传代培养

本实施例选用 HeLa细胞作为案例进行传代培养。 将实施例 4透明支架中的 HeLa 肿瘤微球 （图 6中 A) 经过 0.25%胰酶消化 2min、 培养液洗涤 3-4次， 得到 HeLa细胞 悬浮液 （图 6中 B) 。 经过 0.2% (w/v) Calcein-AM ( sigma, C1359, 染色操作参见说 明书）和 0.3% (w/v) PI染液（死细胞： 红色 -PI， 活细胞： 绿色 -Calcein-AM)染色 15min 后， 荧光显微镜观察细胞保持接近 100%的存活率 （图 6中 C-1和 C-2) 。 其中 C-1为 低倍镜 2X观察图片， C-2为高倍镜 10 X观察图片。

实施例 6、 液体薄层法将药物分子、 材料自动装载于高通量、 图案化海绵支架阵列 本案例实现分子、材料的高通量、图案化自动 装载方法为液体薄层法（图 1中 B-4)。 液体薄层法是指将图案化海绵支架阵列覆盖在 液体薄层上或将液体薄层覆盖在图案化 海绵支架阵列上， 利用海绵 的吸附作用和液体薄层的易流动分离性， 自动将液体吸进 海绵支架内， 从而实现样品液的三维微尺度装载。 下述内容涉及用于构建三维微环境的 装置的基底 A的制作、 所述基底 A上疏水边框的制作， 以及利用液体薄层法实现分子、 材料的高通量、 图案化自动装载的操作步骤。 具体如下：

1. 等离子清洗法修饰亲水性基底载玻片

采用 HPDC 基础型等离子清洗系统将载玻片改性为亲水性 基底， 即制作用于构建 三维微环境的装置的基底 A。 具体过程如下： 1 ) 将载玻片放置入清洗机的舱内， 打开 等离子清洗系统中的真空油泵， 抽真空 5分钟； 2)待舱内产生紫色辉光时， 计时清洗 1 分钟；改性效果见图 7中 A-1和 A-2 (A-1清洗前水的接触角， A-2清洗后水的接触角）。 液体可在基底上形成薄层。

2. 化学法修饰疏水性边框

1 ) 按照高通量海绵支架阵列载玻片 （图 7中 B的多边形的海绵支架阵列是按照实 施例 1所述光交联法制备而来的，多边形的外直径� � ΙΟΟΟμηι;海绵支架的高度为 300μηι _; 其海绵支架的孔径大小 1μηι-85μηι _; 孔间距 1μηι-999μηι _; 孔隙率为 82.4%， 连通性良好； 吸水量为理论体积的 1-2倍； 该海绵支架阵列共由 192个海绵支架组成。 ） 的设计， 用 激光雕刻机（Rajet)切割厚度为 0.5mm的 PMMA平板， 得到与海绵支架阵列区域划分

(2X 6) 重合的 PMMA边界模具； 2) 沿 PMMA模具的边界均匀涂抹 50μ1 1% (ν/ν) OTS/正己烷混合溶液， 并放在匀胶机 （Mycro) 上以 3000r/min的速度旋匀 30s; 3) 将 修饰后的 PMMA模具对齐按压在经上述等离子清洗法处理� �的亲水性载玻片（基底 A) 上 4s; 4)在步骤 3载玻片（基底 A)上一一对应海绵支架阵列区域滴加 1C L不同颜色 的染料溶液 （葡萄紫， 亮蓝， 果绿， 胭脂红， 日落黄， 苋菜红） ， 染料溶液在每个区域 自动分散成均匀液体薄层 （图 7中 C) _;

3. 液体薄层法自动装载分子、 材料进入高通量、 图案化海绵支架

将高通量的海绵支架阵列载玻片（基底 B及固定其上的海绵支架阵列） （图 7中 B 所示海绵支架阵列）按照区域划分平行正对轻 轻覆盖在上述载有不同颜色染料液体薄层 (液体薄层厚度为 10微米） 的载玻片 （基底 A) 上， 使海绵支架每个阵列区域 （2X 6) 同时接触区域液体薄层， 区域液体自动被海绵支架吸收， 从而达到高通量并行自动装载 的目的 （图 7中 D) 。

按照上述三个步骤采用液体薄层法将 Doxorubicin药物（红色荧光）和荧光微球（绿 色， 直径 ΙΟμηι) 同时自动装载进入图案化海绵支架中 （图 7中 Ε) 。 实现多种液体的 简易同步装载。图 7中 Ε中的清华百年校庆图标状海绵支架是按照实� ��例 1所述光交联 法制备而来的， 海绵支架的高度为 300μηι _; 海绵支架的孔径大小 10μηι-125μηι _; 孔间距 1μηι-999μηΐ; 孔隙率为 93.3%， 连通性良好； 吸水量为理论体积的 3.5-5倍。

实施例 7、 液体薄层法自动装载 HeLa细胞种植入高通量海绵支架阵列

本实施例先采用 Calcein-AM试剂 （sigma, C1359) 检测高通量海绵支架阵列能否 实现对 HeLa细胞的自动装载， 接着选用 Cell Titer-Blue试剂 （Promega, G8080) 研究 液体薄层法高通量自动装载 HeLa细胞的效率。

首先， 将 HeLa细胞悬浮液轻轻吹打均匀， 并用 Calcein-AM (其使用方法参照试剂 说明书） 处理细胞， 取 200μ1不同浓度的悬浮液分别均匀平铺在不同的 亲水性载玻片基 底（基底 Α)上， 轻轻将高通量海绵支架陈列载玻片 （基底 Β及固定其上的海绵支架阵 列， 图 8中 Α的圆环形海绵支架是按照实施例 1所述光交联法制备而来的， 圆环的内径 为 2400μηι， 外径为 3400μηι _; 海绵支架的高度为 300μηι _; 海绵支架的孔径大小 10μηι-125μηΐ; 孔间距 1μηι-999μηι; 孔隙率为 93.3%， 连通性良好； 吸水量为理论体积 的 3.5-5倍； 该海绵支架阵列共由 24个海绵支架组成。 ）覆盖在细胞液体薄层 （液体薄 层厚度为 50微米） 上， 待细胞溶液分散进入海绵支架内部后， 轻轻移去支架阵列载玻 片， 实现 HeLa细胞的高通量三维装载 （图 8中 A， HeLa细胞： 绿色 -Calcein-AM) 。 不同细胞浓度液体薄层装载后的效果图见图 8中 B-1至 B-3 (B-1 : 2X 10 ⁶ 个 /ml， B-2: 4X 10 ⁵ 个 /ml， B-3: 8 X 10 ⁴ 个 /ml) 。 采用激光共聚焦显微镜扫描海绵支架内部的细 胞分 布， 见图 8中 C-1至 C-3 (C-l : 2X 10 ⁶ 个 /ml， C-2: 4X 10 ⁵ 个 /ml， C-3: 8 X 10 ⁴ 个 /ml) 。 结果表明， 随着细胞浓度的提高， 自动装载进入海绵支架的细胞越多， 绿色荧光强度越 强， 细胞三维分布越密集， 特别是图 8中 B-1和 C-l。 这说明上述高通量海绵支架陈列 能够通过液体薄层法实现对 HeLa细胞的自动装载。

接着， 采用 Cell Titer-Blue试剂定量液体薄层法自动装载细胞的� �率。

1、 建立活细胞数量-荧光强度标准曲线；

在 96孔板中分别种植 4X 10 ⁴ 个 /孔、 8 X 10 ³ 个 /孔、 1.6 X 10 ³ 个 /孔、 320个 /孔的一 系列浓度的 HeLa细胞， 每个浓度重复 3个样本， 每个孔中加入 ΙΟΟμΙ培养液和 20μ1的 Cell Titer-Blue试剂， 在 37°C、 5 C0 ₂ 饱和湿度培养箱中孵育 lh。 用酶标仪测定荧光 强度， 建立标准曲线 （图 8中 E) 。

2、 Cell Titer-Blue试剂定量液体薄层法自动装载细胞的� �率；

按上述液体薄层法分别将不同细胞浓度的悬浮 液自动装载到高通量海绵支架阵列 (基底 B及固定其上的海绵支架阵列， 图 8中 A所示的圆环形海绵支架） 中。 在每个 液体薄层载玻片（基底 A)和海绵支架载玻片（基底 B及固定其上的海绵支架阵列）上 分别加入 ΙΟΟΟμΙ培养液和 200μ1的 Cell Titer-Blue试剂混合液， 在 37°C、 5 C0 ₂ 饱和 湿度培养箱中孵育 lh (图 8， D-l : 5 X 10 ⁶ 个 /ml， D-2: 1 X 10 ⁶ 个 /ml, D-3: 2X 10 ⁵ 个 /ml)。 从每个混合液中取 30μ1到 384孔板，用酶标仪测定荧光强度，根据标准曲 线（图 8中 Ε)， 定量液体薄层法自动高通量装载不同浓度 HeLa细胞进入海绵支架的效率，见图 8中 F。 结果表明， 随着细胞浓度的提高， 海绵支架内的细胞与 Cell Titer-Blue试剂反应， 导致 其颜色越偏红， 说明自动装载进入海绵支架的细胞越多， 液体薄层法实现自动装载的效 率越高。

工业应用

本发明提出了一种基于透明海绵支架材料实现 能够和两维细胞培养方法一样简易， 方便操作 （easy as 2D) 的构建三维细胞微环境的方法， 并同时满足图案化、 高通量、 实时无标记监测等研究目的。 1 ) 利用三维海绵支架材料的多孔性实现了自动简 易的细 胞或细胞-材料的装载。 采用传统滴加方法， 细胞或细胞-材料悬浮液便能自动吸附进入 多孔海绵支架内部， 形成三维微环境体系； 2) 种植细胞在三维微环境中可是实现自由 三维生长， 增殖， 并且易于传代； 3 ) 利用透明海绵支架材料的优良光学性能， 实现应 用常规设备 （如普通光学显微镜） 对细胞进行无标记观测； 4) 透明海绵支架材料可有 效结合三维微加工技术， 实现三维微环境的微量化、 图案化以形成高通量三维微环境阵 列； 5 ) 我们还发明了一种简易、 可广泛应用的液体薄层法， 可以快速、 无损地实现分 子、 材料和细胞以及其混合物的三维微环境的高通 量同步装载。

本发明与现有研究相比具有如下优点： 1、 本发明方法结合工程学、 化学、 物理学、 材料学等学科知识， 制备三维透明海绵多孔支架， 利用支架的多孔性、 光学透明性、 机 械弹性、 交联可控性等特征， 为生物学、 药学、 医学等领域对于精确可控和高通量的三 维细胞微环境的研究提供一个简单易行、 应用广泛的平台； 2、 本发明提出的三维微环 境构建方法与传统两维细胞培养手段一样简单 易行 （easy as 2D ) ， 使用常规设备 ( off-the-shelf instruments )满足细胞在三维体系中快速种植、 自由生长、 长期增殖、 易 于传代、 实时监测等基本培养要求； 3、 本发明提出的透明海绵支架概念填补了材料性 能领域的空白。本发明提供的制备透明海绵支 架的方法有效地改善了传统三维支架光学 性能差的问题， 可满足生物学、 药学、 医学等领域对三维微环境进行实时无标记成像 研 究的要求， 极大地降低了对研究手段、 方法、 设备等方面的要求； 4、 本发明提出的液 体薄层装载方法，无需特别的专业技术和手段 以及昂贵的设备就可以实现三维细胞微环 境的高通量同步构建， 大大降低了操作过程中对于人员技能、 环境空间等各方面的使用 要求， 具有广泛的应用前景， 且简易的操作步骤降低了对活细胞的损伤； 5、 本发明方 法可与各种现有研究技术（如三维微加工技术 、细胞动态种植技术、 自动化操作系统等） 结合使用， 以实现图案化 （patterning) 、 微观结构 （microstructure) 可控性， 实时监测 (monitoring)等目的， 来满足不同研究领域、 不同研究目的的多重需求； 6、 本发明最 终可应用于开发各种三维细胞应用产品， 为三维细胞微环境研究提供现成的 ( off-the-shelf)平台， 以实现三维细胞产品在传统生物学、 药学和医学领域的无障碍广 泛应用。

此发明方法对于熟悉传统两维细胞培养、研究 的人员来说操作简单， 无需其他的专 业技术和手段（如微加工技术和特殊合成材料 ） 以及昂贵的设备 （如自动化、 微加工设 备） 。 最终以实现在传统生物学、 药学和医学领域的无障碍广泛应用。