MéTODO Y DISPOSITIVO PARA LA DETECCIóN DE MATERIAL GENéTICO MEDIANTE REACCIóN EN CADENA DE POLIMERASA

D E S C R I P C I ó N

OBJETO DE LA INVENCIóN

La presente invención se refiere a un método y a un dispositivo portátil o microdispositivo para detectar específicamente material genético en una muestra biológica utilizando Ia técnica conocida como PCR (Reacción en

Cadena de Polimerasa).

El microdispositivo, tiene por objeto aumentar Ia eficiencia, sencillez de uso y Ia portabilidad de Ia PCR en comparación con el análisis a escala laboratorio. El micro dispositivo permite diagnosticar rápidamente Ia presencia de una determinada secuencia de oligonucleótidos (ADN y ARN), mediante Ia técnica de PCR a tiempo real en un volumen final por ejemplo de 10 microlitros y en menos de 30 minutos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

La técnica conocida como PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) reproduce el sistema natural de replicación del ADN para un fragmento determinado del genoma, permitiendo obtener muchas copias de una secuencia determinada de ADN, siempre y cuando en Ia muestra biológica se encuentre Ia secuencia diana que se desea amplificar. Estos métodos comprenden, por tanto, una primera fase de concentración en Ia muestra, de Ia fracción conteniendo Ia secuencia específica a identificar, seguida de una segunda fase, en el caso que sea necesario, de ruptura o lisis para permitir Ia accesibilidad de dicha secuencia para finalmente ser sometida al tratamiento de PCR que permite su identificación específica. El tratamiento

PCR requiere de fases de calentamiento. La fase de detección del producto amplificado, se realiza generalmente por medios ópticos.

La detección del material genético se basa por Io tanto en su amplificación, ya que en Ia muestra inicial se encuentra en cantidades muy pequeñas que no pueden detectarse, mientras que, a través de Ia reacción de PCR, el material genético comienza su amplificación hasta que puede ser detectado (si no está presente en Ia muestra, obviamente no se produce Ia detección).

Habitualmente, Ia reacción de PCR en un microdispositivo se realiza en una microcámara (dentro de un chip o soporte plástico) que cuenta con un pequeño orificio de entrada para Ia muestra y un segundo orificio para Ia salida de Ia misma. Generalmente, los dispositivos utilizados son muy complejos ya que comprenden varias cámaras a través de las cuales se hace pasar a Ia muestra para realizar Ia concentración del analito diana, reacción de PCR y detección, Io cual ralentiza el proceso. Los medios de calentamiento habitualmente son externos a Ia cámara o soporte plástico en Ia que se produce Ia reacción de PCR, y no proporcionan un adecuado y rápido calentamiento en todas las partes de Ia cámara donde se produce Ia reacción.

Asimismo, son conocidos diversos métodos que permiten conseguir una preconcentración en Ia muestra biológica de Ia fracción que contiene Ia secuencia especifica para Ia reacción de PCR. En este sentido, también son conocidas unas partículas super-paramagnéticas, recubiertas por un anticuerpo específico que permiten Ia concentración de Ia muestra biológica. Estas partículas tienen una parte magnética, por Io que pueden ser detectadas o separadas mediante un campo magnético. Las partículas magnéticas se utilizan, por ejemplo, en las Patentes US 881541 , US 2004/108253, US 5.795.470, US 2005/208464 o US 6.159.378.

También son conocidos diversos procedimientos de detección óptica, por ejemplo por fluorescencia (Patentes EP 1 550 858, WO 2005/023427 o US 6.814.934).

Los medios de calentamiento son muy diversos, pero siempre externos al soporte plástico o chip que incorporan Ia cámara en Ia que se produce Ia reacción de PCR.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

La presente invención realiza Ia concentración de Ia muestra mediante partículas superparamagnéticas, Ia identificación específica por Ia reacción de PCR a tiempo real y Ia detección por fluorescencia. Una de las principales características de Ia invención es que Ia concentración, Ia lisis, cuando sea necesaria, el calentamiento, Ia reacción de PCR, y Ia detección por fluorescencia, se realizan en Ia misma micro cámara, es decir, sin que el material genético salga de esta micro cámara.

En concreto, se mezclan las partículas superparamagnéticas con Ia muestra a analizar, Io que permite el enriquecimiento en Ia fracción que contiene Ia secuencia diana. Se introduce Ia muestra, con las partículas superparamagnéticas, en el interior de una micro cámara. Se aplican unos imanes en las caras opuestas de Ia micro cámara, a una distancia muy pequeña, para que el campo magnético generado retenga las partículas superparamagnéticas (mientras el resto de Ia muestra sale de Ia micro cámara). Se introducen en Ia micro cámara los reactivos que producirán Ia reacción de PCR y los marcadores de fluorescencia, se retiran los imanes, se tapona Ia entrada/salida y se aplica a continuación un perfil de calentamiento a través de un dispositivo de calentamiento situado próximo a Ia cámara, produciéndose Ia amplificación del material genético en Ia misma micro cámara.

A continuación, se lleva el dispositivo a unos medios ópticos que permiten captar Ia fluorescencia y así detectar Ia presencia del material genético buscado, sin que este material ni las partículas superparamagnéticas abandonen Ia micro cámara.

Otro de los aspectos de Ia invención se refiere a los dispositivos en los que se lleva a cabo el procedimiento de detección. El dispositivo, además de contener Ia micro cámara en Ia que se produce Ia reacción de PCR, recibe el calor generado por los medios de calentamiento que están compuestos por una serie de electrodos de titanio/platino, así como los medios necesarios para poder realizar todas las fases del proceso de detección en Ia misma micro cámara de reacción.

De manera más concreta, uno de los aspectos de Ia invención se refiere a un dispositivo para Ia detección de material genético mediante reacción en cadena de polimerasa, que comprende un substrato en el que están formados una cámara de reacción así como un micro-conducto de entrada y un micro-conducto de salida, respectivamente para Ia entrada y salida de una muestra a analizar de dicha cámara. El dispositivo incorpora medios de calentamiento dispuestos adecuadamente para calentar uniformemente dicha cámara.

Para Ia introducción de Ia muestra y de los reactivos de Ia PCR en Ia micro cámara, dicho substrato (chip o soporte plástico) está retenido con carácter desmontable en un encapsulado formado por una base superior y una base inferior situándose Ia micro cámara entre dichas bases superior e inferior. Los medios de calentamiento pueden estar integrados en una de estas bases para calentar dicha cámara, o bien pueden estar integrados en el propio substrato en el que está formada Ia cámara de reacción.

La cámara es accesible a través de las bases superior e inferior mediante

correspondientes aberturas existentes en dichas bases, con objeto de realizar diversas fases del proceso sobre Ia cámara, por ejemplo Ia aplicación de un campo magnético mediante unos imanes y Ia detección óptica.

El dispositivo puede disponer de un sensor de temperatura para medir Ia temperatura en Ia cámara de reacción, así como contactos eléctricos para alimentar eléctricamente los medios de calentamiento y proporcionar una conexión con el sensor de temperatura.

Dichos medios de calentamiento comprenden una pluralidad de hilos conductores conectados entre dos terminales.

El dispositivo dispone de medios que permiten obtener una distribución de corriente uniforme en dichos hilos conductores, de modo que cada unos de dichos hilos genera una cantidad muy similar de calor. De esta manera y debido además a Ia distribución uniforme de los hilos bajo toda Ia superficie de Ia cámara de reacción, se proporciona una calentamiento uniforme en toda Ia cámara de reacción.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a un equipo para Ia detección de material genético mediante una reacción en cadena de polimerasa, que incorpora el dispositivo anteriormente descrito, y se complementa con medios electrónicos externos a dicho dispositivo para controlar Ia temperatura que producen los medios de calentamiento de Ia cámara de reacción, así como un sistema de medición de fluorescencia.

Otro aspecto de Ia invención está relacionado con un soporte plástico para

Ia detección específica de material genético mediante reacción en cadena de polimerasa, que comprende una cara superior y un cara inferior, y se caracterizada porque entre dichas caras superior e inferior incorpora una

cámara de reacción y de un micro-conducto de entrada y un micro-conducto de salida comunicados con dicha cámara. La cámara de reacción y los micro-conductos de entrada y salida, son accesibles al menos desde una de dicha caras para poder realizar el proceso de detección sobre Ia cámara.

Es también objeto de Ia invención un método para Ia detección específica de material genético mediante reacción en cadena de polimerasa, que se caracteriza porque las principales fases del método se llevan a cabo en Ia misma cámara de reacción.

De manera más detallada, el método comprende introducir en una cámara de reacción una muestra a analizar que contiene partículas magnéticas, de modo que posteriormente se aplica un campo magnético en dicha cámara de reacción, para retener las partículas magnéticas dentro de dicha cámara, fluyendo fuera de Ia cámara el resto de Ia muestra, donde posteriormente se produce una reacción de PCR controlando Ia temperatura mediante medios de calentamiento asociados a dicha cámara. Finalmente Ia muestra retenida en Ia cámara de reacción se detecta ópticamente.

El método se puede aplicar por ejemplo a muestras microbiológicas, clínicas, alimentarias etc.

La invención proporciona un dispositivo de detección portátil y autónomo que permite Ia identificación específica de marcadores genéticos mediante Ia técnica de PCR a tiempo real, automáticamente, incluyendo en Ia misma cámara Ia concentración y preparación de Ia muestra, Ia amplificación y Ia detección óptica. El sistema miniaturizado aumenta Ia eficiencia, sencillez de uso y portabilidad de Ia PCR en comparación con el análisis a escala laboratorio. El micro dispositivo permite diagnosticar rápidamente Ia presencia de una determinada secuencia de oligonucleótidos (ADN y ARN), mediante Ia técnica de PCR a tiempo real en un volumen final menor de 10

microlitros y en menos de 30 minutos.

Las temperaturas necesarias para llevar a cabo Ia PCR a tiempo real se logran mediante un sistema original de calentamiento integrado y próximo a Ia cámara de reacción, que mantiene Ia temperatura homogéneamente a Io largo del chip durante los distintos ciclos de los que consta Ia PCR. Dicha temperatura preferentemente oscila en el rango de temperatura ambiente y 95 ⁰ C.

DESCRIPCIóN DE LOS DIBUJOS

Para complementar Ia descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del invento, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado Io siguiente:

Figura 1.- muestra una vista en explosión de los elementos que forman el encapsulado del dispositivo PCR.

Figura 2.- Ia figura (a) es una representación esquemática y en sección del dispositivo microPCR encapsulado, y Ia figura (b) es una representación similar a Ia figura (a) pero en una fase previa al encapsulado.

Figura 3.- muestra dos vistas en perspectiva del dispositivo PCR, en las que se ilustra Ia posibilidad de colocar y retirar los imanes durante el proceso. La figura (a) muestra el imán superior colocado en las aberturas de Ia base superior, mientras que Ia figura (b) muestra los imanes fuera del dispositivo.

Figura 4.- Ia figura (a) es una representación esquemática de una vista en planta de Ia cámara sellada del chip PCR donde se aprecian los medios de

calentamiento, los contactos eléctricos y el contorno romboidal de Ia cámara. La figura (b) es una representación del electrodo de calentamiento y el sensor de temperatura.

Figura 5.- es una representación esquemática y en sección de Ia cámara sellada.

Figura 6.- es un esquema del sensor de resistencia de 4 hilos utilizado para medir Ia temperatura en el centro de Ia cámara.

Figura 7.- muestra un esquema correspondiente al circuito microfluidico y Ia cámara de microPCR.

Figura 8.- es una representación esquemática de una vista en planta de uno de los calentadores en forma de placa alargada.

Figura 9.- representa una simulación (ANSYS) de Ia distribución de corriente sobre Ia placa calentadora de Ia figura 8. Las formas irregulares en los extremos, indican Ia distribución de corriente por Ia superficie.

Figura 10.- es una representación en perspectiva del proceso de inyección de una muestra a analizar en el microdispositivo PCR.

Figura 11.- es una vista en planta superior del dispositivo, donde se aprecian las cápsulas o bases superior e inferior que se emplean para conectar el dispositivo fluidica y eléctricamente.

Figura 12.- representa un esquema del proceso de fabricación de los microelectrodos de Ti/Pt sobre un substrato de Pirex.

Figura 13.- representa un esquema del proceso de fabricación de Ia capa

semilla de SU-8-5 sobre el substrato de pirex con electrodos de Ti/Pt.

Figura 14.- representa un esquema del proceso de fabricación de las cavidades de las cámaras de microPCR sobre el substrato de pirex con electrodos de Ti/Pt y Ia capa semilla/aislante de SU-8-5.

Figura 15.- representa un esquema del proceso de fabricación de las tapas de las cámaras de PCR sobre un film de Kapton.

Figura 16.- representa un esquema del proceso de pegado de los dos substratos.

Figura 17.- muestra una gráfica del resultado de una muestra concentrada, lisada y termociclada dentro de un chip.

Figura 18.- muestra Ia comprobación a través de correr Ia muestra extraída del chip en un gel de electroforeis.

Figura 19.- muestra una sección en perspectiva del dispositivo PCR.

Figura 20.- muestra otra realización preferente de Ia invención donde el encapsulado es una caja portátil y Ia cámara de reacción se dispone en soporte plástico. Las figuras (a,b y c) son tres vistas en perspectiva de Ia caja en posición abierta.

Figura 21.- muestra una vista en explosión de las láminas que forman el soporte plástico portador del chip PCR.

REALIZACIóN PREFERENTE DE LA INVENCIóN

El dispositivo objeto de Ia invención comprende una cámara de reacción (1 )

comunicada con dos micro-conductos. Un micro-conducto de entrada (2) por el que se introduce Ia muestra a analizar y un micro-conducto de salida (3), que permite el flujo hacia el exterior.

En una realización preferente de Ia invención, esta cámara tiene unas dimensiones de 12 x 3 mm según se indica en Ia figura 7, y es alargada con una porción central con planta rectangular y porciones extremas triangulares en correspondencia con Ia entrada y Ia salida para facilitar Ia inyección/extracción de Ia mezcla de PCR. Los microconductos (2,3) conectados con Ia cámara (1 ) tienen aproximadamente 2.5 mm de longitud, y una anchura de 70 μm y terminan en una conexión al exterior que permite introducir y evacuar el líquido dentro de circuito fluídico tal y como se observa en Ia figura 2.

El dispositivo incorpora, en esta realización preferente, elementos de calentamiento integrados de forma solidaria a Ia cámara de reacción (1 ) dispuestos de manera que se puede calentar dicha cámara de forma uniforme y controlada por medios externos.

El circuito microfluídico formado por Ia cámara de reacción y los dos microconductos, está formado preferentemente sobre un substrato de 4.5 μm de SU-8-5 que sirve para aislar eléctricamente del líquido los terminales (4) para Ia alimentación eléctrica de los medios de calentamiento. La altura de estas cámaras puede variar dependiendo del volumen de muestra que se va a termociclar (desde 120 μm hasta 400 μm). Este circuito microfluídico está obtenido de una resina epoxy fotodefinible y llamada SU-8-50 que se deposita sobre un sustrato (5) de Pirex, tal y como se muestra en Ia figura 5.

Alternativamente, el substrato puede estar obtenido mediante otro substrato polimérico (PMMA, SU-8, COC).

Los medios de calentamiento comprenden una pluralidad de hilos conductores (6) conectados entre dos terminales (4), y preferentemente están obtenidos mediante una lámina de titanio (Ti) superpuesta a una lámina de platino (Pt).

Los hilos (6) son paralelos en toda su longitud, y están dispuestos de forma equidistante entre sí.

Los hilos de calentamiento (6) están formados en una placa de calentamiento (7) de material conductor y con forma alargada, que dispone de una superficie de conexión (8) en cada uno de sus extremos, y en las que se conecta respectivamente un primer y un segundo terminal de conexión. Los referidos hilos conductores (6) son rectos y están conectados entre dichas superficies de conexión (8), tal y como se observa en Ia figura 8.

Dichas superficies de conexión (8) disponen de cortes transversales (9) en forma de línea recta que definen unos caminos conductores de corriente para obtener una distribución de corriente uniforme en los hilos conductores (6), tal y como se muestra en Ia simulación de Ia figura 9.

Como se aprecia en Ia figura 8, dichos caminos conductores están definidos por al menos dos grupos paralelos de cortes (9) alineados. Estos cortes (9) logran que Ia distribución de Ia corriente sea uniforme independientemente de Ia posición en Ia que se encuentren las puntas eléctricas flexibles (17) con las que se alimenta cada terminal de los medios de calentamiento, tal y como se aprecia en Ia figura 2(b).

La Figura 9 muestra las simulaciones realizadas en ANSYS que demuestran que Ia máxima variación de Ia corriente entre dos calentadores de este tipo no supera los 0.04 μA.

El diseño de los elementos calefactores incorpora dos estructuras de compensación con el mismo propósito, pero para resolver dos problemas distintos:

Compensación de Ia geometría. La corriente eléctrica siempre trata de ir por el camino que presenta menor resistencia eléctrica. Debido a Ia geometría simétrica del calefactor, todas las resistencias, que se encuentran ubicadas en una configuración en paralelo, poseen Ia misma resistencia. Sin embargo, aunque Ia zona del contacto eléctrico externo se ha hecho muy grande con el fin de que no exista una dirección predominante, al estar realizado con el mismo material que Ia resistencia, presenta una cierta resistencia eléctrica. Esto hace que exista un camino preferente, el central (si el contacto está centrado). Debido al nivel de exigencia en uniformidad de temperaturas debido a Ia aplicación, esa pequeña desuniformidad no es aceptable, por Io que se han diseñado y simulado estructuras de equilibrado de corrientes entre las distintas ramas. Estas estructuras tienen como función igualar el camino total en todas las resistencias, de forma que no exista uno más favorable que los demás. Estas estructuras son en forma de "T". La zona central de Ia "T" tiene como objetivo cortar un camnio corto y desviar Ia corriente por los laterales. Se han añadido 4 niveles, dependiendo este número del grado de uniformidad requerido. Ha medida que se sube un nivel, Ia "T" es de mayor tamaño (25%), cubriendo mayor superficie. Cada brazo de Ia "T", equivale a Ia distancia entre ésta y Ia anterior "T".

Compensación del contacto. Si el contacto eléctrico al calefactor no se realiza de forma centrada, se presenta una desuniformidad y se favorece un camino más cómodo. Para minimizar este efecto, se introducen unos cortes laterales que obligan a Ia corriente a ir hacia Ia zona central del calefactor. La abertura debe ser un tercio de Ia abertura que se ve en Ia última línea de "T" (Ia más cercana al contacto eléctrico). La separación

entre esta abertura y Ia línea más cercana de "T" debe ser tal que el ángulo que se abre sea de 25°.

En una realización preferente, el dispositivo PCR dispone de seis placas calentadoras (7) colocados en paralelo tal y como se muestra en Ia figura

4(b), y preferentemente de forma transversal a Ia cámara de reacción (1 ). Cada placa calentadora (7) dispone de 32 pistas de hilos (6) de Pt de 20 μm de anchura y 5 mm de largo, separados 50 μm entre sí, que acaban en dos contactos eléctricos (uno a cada lado del chip), a través de los cuales se les alimenta a 4.5 V mediante una fuente de alimentación externa. Se dispone de hilos conductores (6) debajo de todo el área de Ia cámara de reacción (1 ) tal y como se aprecia en Ia figura 4, de modo que se calienta de forma uniforme todas las zonas de Ia cámara.

Además de estos seis calentadores, el dispositivo de PCR contiene un sensor de temperatura, en concreto un sensor de resistencia (10) de cuatro hilos, colocado en el centro de Ia cámara de reacción (1 ) tal y como se muestra en Ia figura 4. De esta forma, de los 16 contactos eléctricos que se pueden ver en Ia Figura 4, los contactos (A ₁ B ₁ C, D) son los pertenecientes al sensor de temperatura. Este sensor de resistencia (10), mostrado en Ia

Figura 6, se basa en el principio de que Ia resistencia eléctrica del platino depende de Ia temperatura y varía de modo lineal con ésta. Al alimentar el sensor con un voltaje de 4.5 V a través de los contactos (A) y (B) y medir Ia corriente a través de los contactos (C) y (D), se puede calcular Ia resistencia y por tanto Ia temperatura que hay en el centro de Ia cámara de PCR.

Los hilos de calentamiento (6) están inmersos en una de las paredes que forman Ia cámara de reacción (1 ). Los hilos pueden ir sobre el pirex o sobre Ia SU-8. En una configuración preferente los hilos van sobre el pirex y recubiertos de una capa de SU-8-5.

Para la utilización del dispositivo es necesario llenar Ia cámara con una mezcla de PCR, y cerrar a continuación los micro conductos de entrada y salida (2,3) de Ia cámara (1 ) mediante Ia utilización de un encapsulado con juntas de Silicona que cierran los orificios de entrada y salida.

Tal y como se ve representado esquemáticamente en Ia Figura 2, el encapsulado se basa en dos cápsulas o bases presionadas entre sí con unos tornillos (11 ) que deja Ia cámara de reacción (1 ) en medio.

La cápsula inferior (12) actúa como soporte de Ia cámara de reacción (1 ) formada sobre el substrato (5), mientras que Ia cápsula superior (13) actúa de soporte para una PCB (placa de circuito impreso) (14) y contiene una junta tórica (15) por cada entrada/salida de Ia cámara (1 ), así como dos orificios (16) que ponen en contacto Ia entrada/salida de tamaño micro del dispositivo con conectores de mayor tamaño al que se Ie puede acolar un tubo o una jeringa según se muestra en Ia figura 10.

Además Ia cápsula superior (13) pone en contacto a través de unas puntas eléctricas retráctiles (17) en su interior, los contactos de Ia PCB (14) con los electrodos del dispositivo de PCR, de modo que a través de unos contactos eléctricos (21 ) existentes en Ia PCB (14) se puede alimentar los medios de calentamiento mediante una fuente de alimentación externa.

Al alinear a mano todas las piezas y apretar a través de los tornillos (11 ), el chip PCR queda encapsulado fluídica y eléctricamente sin necesidad de adhesivos, de forma que se puede reemplazar y conectar fácilmente el dispositivo de PCR, pudiéndose usar fácilmente el mismo encapsulado para distintos chips. Por otro lado, tanto Ia cápsula inferior como Ia superior tienen respectivamente una abertura superior (18) y una abertura inferior (19), ambas del tamaño de Ia cámara (1 ) para poder por un lado, colocar unos imanes (20) sobre Ia superficie del chip y por el otro tener un acceso

visual al interior de Ia cámara (1 ) cuando se haga Ia medición de fluorescencia.

En Ia figura 1 se observa el proceso para encapsular el dispositivo, fluídica y electrónicamente. En esta figura se puede observar Ia cápsula o base superior (13) y Ia cápsula o base inferior (12), realizadas en PMMA, con tornillos (11) y pasadores para facilitar el alineamiento. También se observa Ia PCB (14) con diversos componentes electrónicos para alimentar los medios de calentamiento y el conector eléctrico en Ia parte inferior.

Mediante juntas tóricas (15) se consigue una inyección de líquidos sin fugas, que pasa por Ia cápsula o base superior (13) a Ia cámara de reacción (1 ) mediante conductos internos (28,29) de dicha cápsula.

El dispositivo encapsulado se monta sobre un soporte (22) que dispone de una abertura central (23), de modo que un ventilador (24) se acopla inferiormente para poder refrigerar más rápidamente Ia cámara de reacción. Se puede observar como ambas cápsulas tienen ranuras (25) que favorecen el paso de aire impulsado por el ventilador para facilitar Ia refrigeración por convención forzada.

La cápsula o base superior (13) dispone de un conducto de entrada (26) y un conducto de salida (27), que comunican respectivamente con dichos micro-conductos de entrada y salida (2,3) de Ia cámara de reacción (1 ), a través de los conductos internos (28,29) tal y como se observa en Ia figura

19.

Una vez encapsulado el dispositivo y a Ia hora de realizar el proceso de detección, se introduce Ia muestra en Ia cámara de reacción (1 ) por ejemplo mediante una jeringuilla según se ha representado en Ia figura 10.

En Ia invención se ha previsto que el encapsulado debe permitir Ia colocación de los imanes (20) muy cerca del chip, es decir de Ia cámara de reacción (1 ), además de no obstaculizar su refrigeración ni el haz de luz. Para ello, las aberturas (18) y (19) de las cápsulas superior e inferior, permiten colocar en su interior los imanes (20) de forma que se pueden extraer posteriormente.

Para Ia preparativa de Ia muestra se utiliza un sistema de concentración universal que permite Ia captura y concentración de muestras biológicas (microbiológicas, clínicas, alimentarias, medio ambientales etc). Este sistema puede utilizar partículas superparamagnéticas cubiertas por anticuerpos específicos o partículas superparamagnéticas que atrapan específicamente ácidos nucleicos. Al poner en contacto Ia muestra problema en estado líquido con las partículas magnéticas se consigue una preconcentración de Ia fracción que contiene Ia secuencia especifica para Ia reacción de PCR.

Un volumen de Ia muestra susceptible de ser analizada (1-3 mi), se hace pasar a través de Ia microcámara (1 ) al mismo tiempo que se aplica un campo magnético sobre Ia misma. En un ejemplo de realización, el volumen de Ia muestra puede estar comprendido entre 1-10 mi.

Una vez que Ia muestra se ha introducido en Ia cámara por el orificio de entrada, se desplaza, mediante el movimiento del émbolo de Ia jeringa, a Io largo de Ia cámara hasta el orificio de salida por donde se elimina al exterior del encapsulado manteniendo el campo magnético. La muestra sale de Ia cámara (1 ) por el microconducto (3) que comunica con el conducto de salida (27) a través del conducto interno (29). La junta de estanqueidad (15) evita cualquier fuga en el paso de líquido entre el microconducto (3) y el conducto interno (29).

El campo magnético se aplica al colocar los dos imanes (20) sobre Ia cámara de reacción (1 ), uno en Ia parte superior y otro en Ia inferior, según se muestra en Ia figura 3. Para ello, el encapsulado permite colocar los imanes muy cerca de Ia microcámara. En este caso, el imán superior se encuentra en contacto con Ia tapa de Ia microcámara, que tiene un grosor aproximado entre 70 μm y 100 μm, por Io que permite realizar una captura magnética extremadamente eficiente debido a Ia proximidad del imán. El imán inferior está en contacto con el sustrato (5) de pirex, que tiene un espesor entre 750 μm y 750 μm.

En otras realizaciones preferentes, es posible eliminar este sustrato, utilizando el proceso descrito en Ia patente ES-2.263.400, Io cual permitiría una proximidad inferior a 200 mieras entre el imán y Ia cámara de reacción.

De este modo, conforme se hace pasar Ia muestra por Ia cámara (1 ), quedan retenidas en Ia misma únicamente las partículas magnéticas y el complejo partículas magnéticas-analito diana, si Io hubiera. Una vez capturado Ia diana en el interior de Ia cámara (1 ) del chip y asegurado Ia ausencia total de líquido en el interior de Ia cámara (1 ), se introduce a continuación en Ia misma cámara de reacción (1 ) Ia mezcla de PCR, se retiran los imanes (20) para proceder á Ia reacción de amplificación.

Para Ia preparativa de muestra se pueden utilizar los siguientes sistemas de concentración universal que permiten Ia captura y concentración de material genético: partículas superparamagnéticas (DYNAL _© ) que atrapan específicamente ácidos nucleicos y partículas superparamagnéticas cubiertas, mediante unión covalente, por anticuerpos específicos frente a un analito diana. Al poner en contacto Ia muestra problema con las partículas magnéticas, estas se une específicamente a su diana en el caso de que esta se encontrase en Ia muestra, de manera que se forma el complejo partículas magnéticas-analito diana. La muestra, con este complejo, se

introduce por el orificio de entrada del encapsulado y se hace pasar a través de Ia cámara de reacción (1 ) donde, cuando sea necesario, se realiza Ia extracción de las biomoléculas (ADN y ARN) y Ia reacción de PCR y, al mismo tiempo, se aplica un campo magnético que retiene las partículas magnéticas dentro de Ia microcámara. De este modo tras el paso de Ia solución, únicamente queda retenido en Ia cámara el complejo partícula magnética-analito diana que incluye Ia secuencia específica, que sirve como molde para Ia reacción de PCR.

Una vez capturado el analito diana en el interior de Ia cámara del chip, se introduce en Ia misma Ia mezcla de PCR. El chip, encapsulado y perfectamente cerrado, se coloca bajo un microscopio epifluorescente o una cámara CCD o un fotomultiplicador con los filtros ópticos respectivos que permiten Ia medición de Ia fluorescencia.

Al aplicar el protocolo de amplificación, en el caso de que para Ia concentración se utilicen partículas magnéticas con anticuerpo, el tiempo de pre-activación necesario para Ia enzima Polimerasa es suficiente para provocar Ia lisis del analito diana, contenido en Ia cámara en Ia forma de complejo partícula magnética-anticuerpo-analito y dejar accesible el ácido nucleico (ADN y ARN) para su posterior detección por amplificación.

El programa de amplificación contiene los ciclos de temperatura correspondientes a pre-activación de Ia enzima, y amplificación (desnaturalización, hibridación y extensión), en un rango entre temperatura ambiente y 95° C.

La formación del producto de amplificación mediante PCR a tiempo real se observa en el chip, a través de Ia cubierta transparente de SU-8, y es posible al utilizar sondas moleculares específicas para el producto amplificado y marcadas en el extremo 5' con fluoróforo, por ejemplo Cy5, en

el extremo 3' con BHQ-2. (Cy5 es una marca registrada de GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, United Kingdom. BHQ-2 es una marca registrada de Biosearch Technologies, Inc., Novato, CV).

La fluorescencia se mide durante Ia reacción de amplificación utilizando unidades de voltaje. Cuando Ia muestra es positiva se observa un aumento exponencial de Ia fluorescencia hasta alcanzar un máximo. El comienzo de este aumento de fluorescencia se produce a partir de un determinado ciclo de amplificación, que depende de Ia cantidad de ácido nucleico inicial. El protocolo completo de amplificación no dura más de 30 minutos.

Mediante las aberturas (18) y (19) del encapsulado, Ia cámara de reacción (1 ) de PCR queda en contacto con el aire, por tres motivos principales: (i) Para poder colocar los imanes en contacto con el chip; (ii) Para que el enfriamiento sea más rápido y (iii) Para poder realizar Ia detección óptica.

Los imanes (20) se colocan uno debajo y el otro encima de Ia cámara, a mano, de forma que caben por las aberturas (18) y (19) de Ia cápsula por Io que es muy fácil ponerlos para proceder a concentrar Ia muestra y extraer el ácido nucleico y quitarlos posteriormente para amplificar el ácido nucleico y poder realizar Ia detección óptica.

Por otro lado, el equipo electrónico externo para el calentamiento de los medios de calentamiento consiste en: (i) una fuente de tensión que alimenta los hilos calentadores (6)

(ii) una fuente de tensión que alimenta el ventilador (24) (iii) un sistema de adquisición de datos que mide Ia resistencia del sensor (10)

(iv) un software para controlar Ia temperatura.

El sistema de calentamiento funciona de Ia siguiente forma: en primer lugar,

el sensor del chip mide Ia resistencia (y con ello Ia temperatura de Ia cámara) y según Ia temperatura que se necesita en cada momento, se decide si se alimentan los calentadores o el ventilador. Si Ia temperatura medida es menor que el que se necesita es ese momento, Ia fuente de tensión que alienta los calentadores se enciende y calienta Ia cámara hasta alcanzar Ia temperatura deseada. Pero si por el contrario Ia temperatura medida por el sensor es mayor que el que se necesita en ese momento Ia fuente de tensión que alimenta el ventilador se enciende para enfriar Ia cámara de PCR. Todo ello, se controla mediante un software conectado al sistema de adquisición de datos.

El equipo de adquisición de datos se basa en un microscopio y contiene: (i) una fuente de luz que consiste en una lámpara de mercurio de

100 W (ii) un filtro de excitación que filtra todas las longitudes de onda, excepto Ia de 640 mm (longitud de onda que excita al fluorocromo Cy5) (iii) un espejo dicroico que envía Ia luz emitida por Ia muestra hacia el filtro de emisión (iv) un filtro de emisión que filtra todas las longitudes de onda, excepto

Ia de 670 mm (longitud de onda que emite el fluorocromo Cy5) (v) un fotomultiplicador o una cámara CCD que recoge Ia luz que pasa por el filtro de emisión

La visualización del ácido nucleico amplificado es posible gracias a Ia acumulación por cada ciclo de amplificación del fluorocromo Cy5, que se excita a 640 mm y emite a 670 mm.

La luz que emite Ia lámpara de mercurio pasa por el filtro de excitación. Esta deja pasar únicamente Ia luz de 640 mm que llega hasta Ia muestra. Por consecuencia, el fluorocromo se excita y emite una luz roja de 670 mm que

es desviada hacia el filtro de emisión, gracias al espejo dicroico. Finalmente, esta luz de emisión llega hasta el fotomultiplicador, que está conectado a un sistema de adquisición de datos.

Tal y como se ha explicado antes, Ia cápsula o base superior (13) dispone de un orificio (18) situado encima de Ia cámara (1 ), de forma que permite este tipo de detección óptica, ya que Ia tapa de Ia microcámara es transparente. Además, es importante destacar que Ia SU-8, a diferencia de otros materiales poliméricos, tiene muy baja autofluorescencia a esta longitud de onda, de forma que permite detectar Ia señal de fluorescencia de

Ia muestra marcada con Cy5.

Los imanes (20) utilizados para Ia preparación de Ia muestra son de Neodimio-Hierro-Bro (NdFeB) y tienen forma de disco, según se observa en Ia figura 3b, con un diámetro de 10 mm y una altura de 4 mm de altura. La orientación de Ia imanación es axial con un (B-H) _max de 30 MGO _e .

En Ia figura 20 se ha representado otra realización preferente de Ia invención, en Ia que Ia base superior (13) y Ia base inferior (12) del encapsulado, están unidas de forma abisagrada o articulada en uno de sus laterales, formando un dispositivo portátil de pequeñas dimensiones. El chip PCR (30), que incluye Ia cámara de reacción (1 ), los micro-conductos (2,3) y los medios de calentamiento, está embebido en un soporte plástico (31 ) el cual dispone de una ventanas (32,32 ^' ) respectivamente en sus caras superior e inferior, que dan acceso al chip (30) según se muestra en Ia figura

21.

En una de las caras del soporte plástico (31 ) se disponen dos orificios (33) comunicados en el interior del soporte plástico con los micro-conductos (2,3). El soporte plástico también dispone en una de sus caras de unos orificios (34) que dan acceso a unos terminales eléctricos (38) conectados

con los medios de calentamiento y el sensor de temperatura del chip (30).

El soporte plástico (31 ) está formado por diversas láminas tal y como se aprecia en Ia figura 21. En concreto dispone de una lámina superior (35) y una lámina inferior (36), entre las que se dispone en una estructura tipo sandwich, el chip (30).

Entre las bases superior o inferior (13) y (12) se define un espacio adecuado para recibir al soporte plástico (31 ). Una vez introducido el soporte plástico se cierran las bases o encapsulado, de modo que los conductos (26,27) dispuestos en una de las bases, quedan comunicados con los orificios (33) del soporte plástico (31 ). De modo similar unos contactos eléctricos (39), están situados en el interior de una de las bases para contactar con los terminales (38) al cerrar el encapsulado.

Para Ia colocación de los imanes se dispone igualmente de aberturas (19) y (18), en las bases superior o inferior (13) y (12).

Un ventilador puede situarse en una de las bases, para impulsar aire con objeto de reducir Ia temperatura de Ia cámara de reacción cuando sea necesario.

1.- Proceso de fabricación del dispositivo

En una realización preferente de Ia invención, los dispositivos de PCR se fabrican sobre sustratos de pirex. Sin embargo, es posible fabricarlos sobre sustratos poliméricos como por ejemplo el PMMA tal y como se describe en Ia patente ES-2.255.463 y sin ningún sustrato aparte de Ia SU-8 en Ia patente ES-2.263.400, de forma que su coste de fabricación se reduce considerablemente.

Para fabricar los dispositivos de PCR sobre sustratos de pirex, es necesario llevar a cabo tres pasos fundamentales: (i) Fabricación de electrodos sobre sustratos de pirex, (ii)Fabricación de Ia capa semilla de SU-8-5 y (iii) Fabricación de microcámaras selladas. En los siguientes apartados se explica más en detalle cada uno de estos pasos.

1.1. Fabricación de electrodos

Se parte de un sustrato de pirex en el que se lleva a cabo un proceso de fotolitografía con Ia fotorresina positiva S1818, utilizando Ia máscara apropiada. Para ello, se deposita primero un promotor de adherencia y después Ia resina a 4000 rpm durante 30 segundos, se somete al sustrato a un tratamiento térmico de 90° C durante 20 minutos, se expone a Ia luz UV con una dosis de 300 mJ/cm ² y se releva.

A continuación se depositan 15 nm de titanio (3 minutos a 100 W) y 140 nm de platino (6 minutos a 190 W) por el método de pulverización catódica en todo el sustrato de pirex. Finalmente, se introduce el sustrato en un baño de ultrasonidos de acetona y al disolverse Ia fotorresina S1818, queda el metal solo donde no había resina, obteniendo así los microelectrodos.

Esta parte de Ia fabricación se muestra en Ia figura 12, y se compone de las siguientes fases:

a.- depósito del promotor de adherencia de Ia S1818 por centrifugado. b.- depósito de Ia S1818 por centrifugado c- polimeración de Ia S1818 (20 minutos a 9O ⁰ C) d.- exposición de 300 mJ de luz UV para degradar Ia S1818 e.- revelado de Ia S 1818 degradada f.- depósito de 15 nm de Ti y 140 nm de Pt por pulverización catódica g.- disolución de Ia S1818 en acetona.

1.2. Fabricación de cámaras selladas

Se parte de dos sustratos diferentes: el sustrato de abajo que es el mismo sustrato de pirex donde se han fabricado antes los electrodos y el sustrato de arriba, que es un film de Kapton pegado a un sustrato de pirex.

1.2.1. Fabricación del sustrato inferior

Se parte del sustrato de pirex con los electrodos de Ti/Pt obtenido tras el proceso descrito en el apartado 1.1. Se limpia cuidadosamente en baños de ultrasonidos de acetona, metanol y agua respectivamente, para asegurarnos de que se ha limpiado toda Ia fotorresina S1818. A continuación se fabrica Ia capa semilla de SU-8-5 sobre este sustrato con dos objetivos: (i) para aislar eléctricamente los electrodos y (ii) para mejorar Ia adherencia entre el sustrato de pirex y las cámaras fabricadas en SU-8-

50.

La SU-8-5 y Ia SU-8-50 son químicamente similares, Ia única diferencia que existe entre estos dos productos comerciales es Ia viscosidad, que depende de Ia cantidad de disolvente que llevan. La viscosidad del SU-8-5

(aproximadamente 290 cSt) es mucho menor que Ia del SU-8-50 (aproximadamente 2250 cSt). Por Io tanto, el grosor de Ia capa de SU-8-5 es mucho menor tras ser depositado por centrifugado sobre el sustrato de pirex. La adherencia de esta capa fina es mejor que Ia adherencia de una capa más gruesa del mismo material. Además, hay que tener en cuenta el grado de polimerización. Cuanto mayor sea este grado, mejor es Ia adherencia entre el sustrato y esta capa de polímero. Por Io tanto, al fabricar Ia capa semilla, se deposita una capa fina de SU-8-5 (4,5 μm de espesor) y se polimeriza considerablemente.

Para ello, se vierten 2 mi de fotorresina encima del sustrato y se gira a 3000

rpm durante 30 segundos. La resina se esparce por todo el sustrato y se obtiene una capa continua de SU-8-5 de 4.5 μm de espesor. A continuación, se somete al sustrato a un tratamiento térmico de 95° C durante 5 minutos para evaporar todo el disolvente. De esta forma queda solo el prepolímero listo para polimerizarse. Para ello, se lleva a cabo el paso de Ia fotolitografía irradiando Ia SU-8 con Ia luz UV utilizando Ia máscara apropiada, con una dosis de 160 mJ/cm ² . De esta forma se crean los radicales libres únicamente en las partes coincidentes con las zonas claras de Ia máscara. Es aquí donde comienza Ia polimerización y se propaga durante el siguiente tratamiento térmico, al mantener Ia capa de SU-8-5 a 95° C durante 5 minutos.

Finalmente, se sumerge el sustrato en un baño de PGMEA con agitación durante 2 minutos y se aclara con IPA. En este último paso se disuelve Ia fotorresina que no ha sido polimerizada quedando sobre el sustrato de pirex

Ia capa semilla de SU-8-5. No obstante, Ia adherencia se mejora a medida que aumenta el grado de polimerización de Ia fotorresina. Por Io tanto, se somete al sustrato a un último tratamiento térmico (30 minutos a 170 ° C) en el que este grado de polimerización aumenta considerablemente.

Esta parte de Ia fabricación se muestra en Ia figura 13, y se compone de las siguientes fases: a.- depósito de Ia SU-8-5 por centrifugado b.- evaporación del disolvente a 95 ⁰ C durante 5 minutos c- exposición de 160 mJ de luz UV para iniciar Ia polimerización d,.- propagación de Ia polimerización a 95 ⁰ C durante 5 min. e.- revelado de Ia SU-8-5 no polimerizada en PGMA f.- alta polimeración a 17O ⁰ C durante 30 minutos

Una vez polimerizada esta capa semilla, se pueden fabricar las cavidades de las cámaras de PCR con sus microcanales sobre ella, mediante otro

proceso de fotolitografía. Pero esta vez se utiliza una capa más gruesa de SU-8-50, que puede variar entre 20 y 200 μm de espesor, según Ia altura de cámara deseada. Aunque cambien algunos parámetros del proceso, el procedimiento a seguir es parecido. En primer lugar se depositan 2 mi de resina y se gira el sustrato durante unos segundos para obtener una capa uniforme. A continuación se evapora el disolvente con un tratamiento térmico a 90° C. Después Ia resina polimehza mediante una exposición a Ia luz UV y un tratamiento térmico a 90° C. Finalmente, se revela Ia resina no polimerizada para obtener las estructuras deseadas. En este caso, el grado de polimerización es relativamente bajo para que pueda seguir polimerizando después durante el proceso de pegado, en contacto con otra capa de SU-8.

Esta parte de Ia fabricación se muestra en Ia figura 14, y se compone de las siguientes fases: a.- depósito de SU-8-50 por centrifugado (20, 37 o 80 μm de altura) b.- evaporación del disolvente a 9O ⁰ C durante 8, 15 o 30 minutos dependiendo de Ia altura c- depósito de 20 μm de SU-8-50 por centrifugado d.- evaporación del disolvente a 9O ⁰ C durante 8 minutos e.- exposición de 190 mJ de luz UV para iniciar Ia polimerización f.- propagación de Ia polimerización a 9O ⁰ C durante 4 minutos g.- revelado de Ia SU-8-50 no polimerizada en PGMEA

Tal y como se ha explicado en el párrafo anterior, se pueden obtener espesores de SU-8 entre 20 y 200 μm mediante Ia combinación de diferentes capas de 20, 37 y 80 μm de altura. Para ello, se ha optimizado el depósito de capas de estas tres diferentes alturas de forma que se obtienen capas con muy buena uniformidad en el espesor, Io cual es un parámetro crítico para un buen pegado posterior.

En el caso de 20 μm, se depositan 2 mi de resina y se gira el sustrato a 6000 rpm durante 60 segundos. A continuación se evapora el disolvente sometiendo al sustrato a un tratamiento térmico de 90° C durante 8 minutos.

En el caso de 37 μm, se depositan 2 mi de resina y se gira el sustrato a

3000 rpm durante 60 segundos. A continuación se evapora el disolvente sometiendo al sustrato a un tratamiento térmico de 90° C durante 15 minutos.

Finalmente, en el caso de 80 μm, se depositan 2 mi de resina y se gira el sustrato a 1500 rpm durante 60 segundos. A continuación se evapora el disolvente sometiendo al sustrato a un tratamiento térmico de 90° C durante 3 minutos.

Se pueden hacer combinaciones diferentes entre estas tres capas para obtener Ia altura de cámara deseada. Por ejemplo, para una cámara de 100 μm de altura, se depositan 80 μm, se evapora el disolvente a 90° C durante 30 min y se vuelven a depositar 20 μm, evaporando el disolvente a 90° C durante 8 minutos.

No obstante, es importante que Ia última capa depositada sobre el sustrato sea siempre de 20 μm de altura, ya que el proceso de pegado posterior está optimizado para estas caspas de SU-8.

1.2.2. Fabricación del sustrato superior

Se parte de un sustrato de pirex en el que se pega un film de kapton de 125 μm. Estos films son muy flexibles y es imposible realizar una correcta fotolitografía sobre ellas. Es necesario pegarlos previamente a un sustrato rígido de pirex. Para ello, se depositan 4 mi de Ia resina S1818 sobre el pirex y se gira a 3000 rpm durante 30 segundos. A continuación, se pone en

contacto con el film de kapton y se introducen en el Substrate Bonder a vacío (0.1 Pa). Se calienta a 90° C durante 20 minutos y el film queda reversiblemente pegado al sustrato de pirex. De esta forma se obtiene un sustrato de kapton Io suficientemente rígido como para llevar a cabo Ia fotolitografía de SU-8

La fotolitografía sobre el kapton, se lleva a cabo exactamente igual que Ia fotolitografía de las cavidades, pero con Ia máscara apropiada.

Esta parte de Ia fabricación se muestra en Ia figura 15, y se compone de las siguientes fases: a.- depósito de S1818 por centrifugado b.- pegado de Kapton a 0.1 Pa y 9O ⁰ C durante 20 min c- depósito de 80 μm de SU-8-50 por centrifugado d.- evaporación del disolvente a 9O ⁰ C durante 30 minutos e.- depósito de 20 μm de SU-8-50 por centrifugado f.- evaporación del disolvente a 9O ⁰ C durante 8 minutos g.- exposición de 140 mJ de luz UV para iniciar Ia polimerización h.- propagación de Ia polimerización a 9O ⁰ C durante 4 minutos i.- revelado de Ia SU-8-50 no polimerizada en PGMEA

En este caso, se fabrica una capa de SU-8-50 de 100 μm de espesor para que Ia tapa de Ia cámara de PCR sea Io suficientemente rígida como para que soporte Ia presión generada durante el termociclado. Para ello, tal y como se ha explicado en el apartado 1.2.1 se deposita primero una capa de

80 μm se evapora su disolvente a 9O ⁰ C durante 30 minutos. A continuación, se vuelve a depositar una capa de SU-8-50 a 20 μm y se evapora su disolvente a 90° C durante 8 minutos. Después de somete al sustrato de pirex-kapton a 140 mJ de luz UV con Ia máscara apropiada y finalmente se polimeriza Ia capa a 90° C durante 4 minutos.

Todos los tratamientos térmicos realizados en estos procesos de fotolitografía se llevan a cabo en rampas, ya que los cambios bruscos de temperatura hacen que aparezcan grietas en Ia SU-8 debido a tensiones internas. Además, estos procesos de fotolitografía han sido optimizados mediante técnicas de Taguchi para obtener capas de SU-8 uniformes y con buenas propiedades adhesivas. Por ello, es posible pegar estas capas entre sí, tal y como se explica en el apartado 1.2.3.

12.3. Pegado de capas estructuradas de SU-8

Se parte de los dos sustratos fotolitografiados en los apartados 1.2.1 y 1.2.2. Al tener cavidades en el sustrato de abajo y tapas en el sustrato de arriba, tras el pegado se obtienen cámaras de PCR selladas. Para ello, es necesario alinear las dos capas estructuradas antes de pegarlas. El film de kapton utilizado en este trabajo es de 125 μm de espesor y permite llevar a cabo este alineamiento. Cuanto más grueso sea este film es menos transparente y es por ello que se han elegido los films de 125 μm.

La figura 16 muestra un esquema de este proceso de fabricación, que se compone de las siguientes fases operativas: a.- alineamiento de los dos sustratos b.- pegado de los dos sustratos a 300 KPa y 100 ⁰ C c- liberación del pirex-kapton

Tal y como se explica en el esquema de Ia Figura 16, tras el alineamiento se introducen los dos sustratos en Ia cámara de vacío del substrate bonder a 0.1 Pa, y tras ponerlos en contacto, se aplica una fuerza de 300 KPa mientras se eleva Ia temperatura a 100° C durante 20 minutos. Las dos capas de SU-8 se pegan irreversiblemente.

La adherencia entre el film de kapton y Ia SU-8 es muy pobre. Debido a ello,

se puede liberar el sustrato de arriba tras el proceso de pegado. Para ello se introducen los dos sustratos pegados en un baño de ultrasonidos de IPA durante 10 minutos y se despega el sustrato de pirex con Ia ayuda de una cuchilla.

1.2.4. Corte

Tras esta liberación del kapton, se obtienen las dos capas de SU-8 pegadas entre sí sobre el sustrato de pirex formando las cámaras de PCR selladas, con electrodos de platino integrados. Es decir, se consigue un sustrato de pirex que contiene 16 dispositivos de PCR. Por Io tanto, al cortar este sustrato en Ia cortadora da lugar a 16 dispositivos.