DESCRIPCIÓN

Campo técnico de la Invención

La presente invención está dirigida a un método y a un aparato para la detección y/o identificación de la presencia de microorgansimos en muestras.

Los microorganismos han sido protagonistas de sucesos históricos tales como el declive del Imperio Romano o la conquista del Nuevo Mundo. En 1347, la peste arrasó Europa con una fuerza brutal: mató a un tercio de la población en cuatro años. Durante los 80 años posteriores, esta enfermedad continuó su ataque hasta eliminar un 75% de la población europea. El efecto de la peste fue tan grande que algunos historiadores creen que cambió la cultura europea, abriendo camino al Renacimiento.

Difícilmente puede sobreestima rse la importancia de los microorganismos. En términos de número y masa, exceden a m plia mente a cua lqu ier otro grupo de organismos del planeta, además, se encuentran en todas partes y su contribución al funcionamiento de la biosfera es enorme. La sociedad en general se beneficia de ellos, pues son necesa rios para la producción de pan, queso, antibióticos, vacu nas, vitaminas, enzimas y muchos otros productos importantes.

Desde las p ri mera s ho ra s de vida, l os seres h u m a nos so n co lo n iza dos por microorganismos, y algunos de ellos vivirán en simbiosis permanente con su huésped en la piel, tracto digestivo, vías respiratorias altas, oídos y otros muchos tejidos, constituyendo la flora microbiana normal. Algunos participan en procesos bioquímicos fundamentales para la vida de los humanos. Por lo tanto, se establece un equilibrio que se puede ver a lterado en determinadas situaciones produciéndose lo que conocemos como infección. Actualmente, disponemos de un amplio arsenal farmacoterapéutico, pero para optimizar el tratamiento, es necesario un método de diagnóstico precoz, que nos permita un inicio tempra no del tratamiento y ajustado a las sensibilidades del microorganismo causante.

Antecedentes de la Invención En la literatura científica hay multitud de publicaciones dedicadas a la detección de microorganismos. Los métodos tradicionales, que incluyen típicamente el crecimiento y el cultivo de los distintos especímenes en medios favorables, así como la posterior identificación ocular, microscópica y/o por medios de análisis químico o bioquímico de los resultados obtenidos, requiere por lo general varios días de cuidadoso trabajo de laboratorio.

En las últimas décadas se han desarrollado procedimientos alternativos de detección de microorganismos destinados a resolver el problema de la necesidad de obtener los resultados en el menor tiempo posible. Entre estos procedimientos se encuentra el uso de la microcalorimetría. El uso de medidas de microcalorimetría en la detección del crecimiento bacteriano y, en general, en el análisis bioquímico de muestras, se basa en el hecho de que los cultivos bacterianos producen un intercambio de energía derivado de sus procesos metabólicos. De esta manera, la cantidad de calor producido, detectable mediante microcalorimetría, puede considerarse como una de las medidas de su actividad metabolica. Esta relación es conocida, ver por ejemplo las publicaciones de patente US3,552,207, US3,765,237 ó US2004/0235086.

La microcalorimetría es, pues, una técnica experimental que permite determinar con alta sensibilidad la energía expuesta como consecuencia de cualquier proceso o transformación. Esta técnica despierta interés en ciencias biológicas porque el flujo de calor está fuertemente relacionado con la cinética y termodinámica de los procesos biológicos. Variaciones de calor consecuencia de las reacciones químicas que tienen lugar durante el metabolismo, pueden ser usadas para monitorizar el crecimiento bacteriano, y ver la influencia de agentes externos. Todos los seres vivos intercambian calor como consecuencia de su metabolismo. La tasa de calor es una adecuada medida de la actividad metabolica de los organismos y sus partes constituyentes, células y niveles subcelulares. El calor generado por una sola célula está en el rango de 1-80 pW. Células humanas de tejidos conectivos (fibroblastos, adipocitos, etc.) han reportado tasas metabólicas de aproximadamente 25-80 pW por célula. En contraste, los microorganismos producen pequeñas cantidades de calor, del orden de 1-3 pW por célula. A pesar de la baja cantidad de calor de las bacterias, su exponencial replicación en medios de cultivo permite su detección por microcalorimetría en pocas horas, incluso partiendo de muestras con una baja concentración de bacterias (10 UFC/ml). La microcalorimetría ha sido usada en biología, farmacología, biotecnología y ecología por su alta sensibilidad, precisión y simplicidad, sin embargo, el uso en clínica ha sido muy limitado.

Esta técnica despierta interés, porque el flujo de calor está fuertemente relacionado con la cinética y termodinámica de los procesos biológicos. En investigación microbiológica, la calorimetría es particularmente valorable porque permite ver de forma rápida cambios en el metabolismo, y la velocidad y eficacia del crecimiento en presencia de diferentes agentes. Además presenta la ventaja de que las medidas se pueden ver en tiempo real. En los últimos años este procedimiento ha cobrado un interés creciente. Así, se han publicado varios estudios en los que se sugiere la posibilidad de la identificación de distintos microorganismos por medio de microcalorimetría, entre los que cabe citar, a modo de ejemplo, los siguientes: Thomas Maskow et al.: Calorimetric real time monitoring of lambda prophage induction, Journal of Virological Methods 168 (2010) 126-132; "The heat is on": Rapid microcalorimetric detection of mycobacteria in culture, Tubercu losis 90 (2010) 57-59; Dai Chunmei et al. : Investigation of anti- microbial activity of catechin on Escherichia coli growth by microcalorímetry, Environmental Toxicology and Pharmacology 30 (2010) 284-288; Weijun Kong et al.: Screening for novel antibacterial agents based on the activities of compounds on metabolism of Escherichia coli: a microcalorimetric study; G. Buttiglieri et a l. : Microcalorímetry: A tool to investígate aerobic, anoxic and anaerobic autotrophic and heterotrophic biodegradation, Biochemical Engineering Journal 52 (2010) 25-32; F. Allenberger: Listería Monocytogenes - Microcalorimetric Investigations Regarding The Antibacterial Efficiency of Chemotherapeutics, Thermochimica Acta 119 (1987) 113- 119; Xie Chang-ü et al.: Microcalorimetric Study Of Bacterial Growth, Thermochimica Acta 123 (1988) 33-41, o bien Natividad Lago Rivero et al.: Microcalorimetric study od the growth of Enterococcus faecalis in an enriched culture médium, J Therm Anal Calorim (2011) DOI 10.1007/sl0973-011-2052-l. Asimismo, las publicaciones de patente WO2007/010379 y EP1785722 tratan de la detección de microorganismos por medio de la microcalorimetría.

En algunas de las publicaciones anteriormente citadas se pone de ma nifiesto la posibilidad de la identificación de determinados tipos de microorganismos o bacterias mediante el análisis de termogramas obtenidos por microcalorimetría y se reconoce el avance que estos procedimientos suponen con respecto a los métodos tradicionales de análisis por crecimiento y cultivo de dichos microorganismos. Sin embargo, a pesar de que la ¡dea de que, bajo determinadas condiciones, el termograma puede llegar a constituir una especie de "huella" a partir de la cual se puede llegar a identificar a cada una de las bacterias de interés, en dichas piezas del estado de la técnica se hace constar que existe una necesidad de desarrollar estos resultados a fin de abrir nuevas posibilidad es de ide ntificación rá pida de m icroorga n ismos po r med io de u n procedimiento simple, fiable y fácilmente reproducible.

Por ello, el principal objetivo de la presente invención es el proponer un método y un aparato que permitan la detección y/o identificación de la presencia de microorganismos en diversos tipos de muestras y que resuelva los problemas identificados hasta ahora por la literatura anteriormente citada. En particular, el objetivo es que el nuevo procedimiento sea capaz de realizar esta detección e identificación de manera rápida, simple, fiable y reproducible.

Otros objetivos y fines de la presente invención se deducen fácilmente de las ventajas que aportan las distintas características técnicas mediante las cuales vamos a definir la presente invención así como los ejemplos particulares de ejecución de la misma, y que se detallan a continuación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Con objeto de resolver los problemas descritos anteriormente y otros que se deducirán fácilmente de las ventajas aportadas por las distintas características y ejemplos de realización de la presente invención descritos más abajo, la presente invención presenta un método de detección y/o identificación de un microorganismo en una muestra tal y como se describe en la reivindicación 1, y un aparato para la detección y/o identificación de un microorganismo en una muestra de acuerdo con la reivindicación 9. Las reivindicaciones dependientes describen modos de realización particularmente ventajosos de la presente invención.

En particular, la presente invención presenta en un primer aspecto inventivo un método de detección y/o identificación de un microorganismo en una muestra, que incluye las siguientes etapas: obtener una base de datos que establezca una correlación entre al menos un parámetro y una pluralidad de microorganismos, entre los cuales se encuentra dicho microorganismo;*- - - · ·.-. ^; -·.. analizar dicha muestra en un calorímetro que suministre una señal eléctrica proporcional a la energía desprendida por dicha muestra; obtener una curva que relacione dicha señal eléctrica con respecto al tiempo; extraer de dicha curva al menos un parámetro indicativo del comportamiento de dicho microorganismo; y comparar dicho parámetro extraído de dicha curva con dicho parámetro contenido en dicha base de datos para establecer una conclusión sobre la presencia de dicho microorganismo en dicha muestra.

Con la secuencia de pasos del procedimiento anteriormente citado se consigue un método que es esencialmente más rápido y fiable que los métodos conocidos hasta ahora. Los autores de la presente invención han identificado una serie de parámetros característicos de cada microorganismo y que resultan del análisis matemático de los diferentes termogramas. De esta forma, realizando previamente un procedimiento de medición por microcalorimetría de todos los microorganismos de interés a diferentes concentraciones, se puede obtener una base de datos con todos los parámetros característicos, de forma que a la hora de realizar un análisis de un cultivo en principio desconocido, ya no es preciso llevar a cabo la identificación individualizada de los termogramas, como se venía haciendo hasta ahora, sino que basta con extraer de forma automatizada uno o varios de los parámetros de interés y realizar una comparación con la información contenida en la base de datos.

Ventajosamente, la etapa de obtener una base de datos puede consistir en la ejecución de los siguientes pasos: preparar una muestra de uno de los microorganismos incluido en dicha pluralidad de microorganismos; - analizar dicha muestra en un calorímetro que suministre una señal eléctrica proporcional a la energía desprendida por dicha muestra; obtener una curva que relacione dicha señal eléctrica con respecto al tiempo; extraer de dicha curva al menos un parámetro indicativo del comportamiento de dicho microorganismo; - transferir los resultados de dicho parámetro o parámetros junto con la identificación del microorganismo elegido a un sistema electrónico capaz de crear una base de datos que establezca una relación entre ambos; y repetir todos los pasos citados anteriormente con cada uno de los microorganismos incluido en dicha pluralidad de microorganismos.

De forma ventajosa, la etapa o etapas de analizar la muestra en un calorímetro puede también comprender la ejecución de los siguientes pasos: proveer un calorímetro de conducción calorífica tipo Calvet, dotado al menos de un sistema termostático y de un sistema detector formado por dos termopilas idénticas,

proveer un sistema de adquisición y tratamiento de datos;

proveer dos células, una célula experimental y una célula testigo;

introducir una porción de medio de cultivo en la célula experimental e introducir una porción de medio de cultivo más suero fisiológico, preferentemente cloruro sódico 0,9%, en la célula testigo;

introducir ambas células en los respectivos recintos internos de cada una de dichas termopilas;

inocular en la célula experimental la muestra a analizar tras un tiempo de estabilización; y

transferir los datos resultantes de la medición a dicho sistema de adquisición y tratamiento de datos.

La etapa de extraer de dicha curva al menos un parámetro indicativo del comportamiento de dicho microorganismo puede incluir la división de dicha curva en al menos dos tramos y el ajuste matemático de cada uno de dichos tramos a dos ecuaciones matemáticas diferentes, al menos uno de dichos tramos ajustado a una ecuación exponencial y/o al menos otro de dichos tramos es ajustado a una ecuación polinómica.

Dicho parámetro puede ser al menos uno de los siguientes: función matemática; parámetros de ajuste de dicha función matemática; valor o valores máximos, absolutos o relativos, de dicha señal; valor o valores mínimos, absolutos o relativos, de dicha señal; tiempos de registro o detección de dicha señal; constante de crecimiento; tiempo de generación o cantidad de calor intercambiado. Dichos microorganismos de interés, de forma general cualquier microorganismo capaz de provocar el desarrollo de una infección, puede ser uno de los siguientes: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis, Pseudomonas aeruginosa o Streptococcus pyogenes.

La presente invención provee en un segundo aspecto inventivo un aparato para la detección y/o identificación de un microorganismo en una muestra, que incluye: medios adaptados para obtener una base de datos que establezca una correlación entre al menos un parámetro y una pluralidad de microorganismos, entre los cuales se encuentra dicho microorganismo;

medios adaptados para analizar dicha muestra y para suministrar una señal eléctrica proporcional a la energía intercambiada por dicha muestra;

medios adaptados para obtener una curva que relacione dicha señal eléctrica con respecto al tiempo;

- medios adaptados para extraer de dicha curva al menos un parámetro indicativo del comportamiento de dicho microorganismo; y

medios adaptados para comparar dicho parámetro extraído de dicha curva con dicho parámetro contenido en dicha base de datos para establecer una conclusión sobre la presencia de dicho microorganismo en dicha muestra. Este aparato está adaptado para realizar el procedimiento objeto de la presente invención, descrito más arriba en el primer aspecto inventivo, y presenta las ventajas ya indicadas.

Según un modo de realización preferente de la presente invención, dichos medios adaptados para analizar la muestra comprenden al menos: a) un calorímetro de conducción calorífica tipo Calvet, dotado al menos de un sistema termostático y de un sistema detector que incluye dos termopilas idénticas;

- en el que dicho sistema detector comprende además dos células, una célula experimental y una célula testigo; dicha célula experimental adaptada para recibir una porción de dicha muestra más un medio de cultivo y dicha célula testigo adaptada para recibir otra porción de medio de cultivo más suero fisiológico, preferentemente cloruro sódico al 0,9%; y - en el que ambas células están alojadas en los respectivos recintos internos de cada una de dichas termopilas; y

b) un sistema de adquisición y tratamiento de datos adaptado para recibir los datos resultantes de la medición de dicha muestra en dicho calorímetro.

Ventajosamente, el sistema de adquisición y tratamiento de datos puede incluir al menos, un multímetro de precisión, adaptado para recoger los datos y señales suministrados por dichos medios adaptados para analizar la muestra;

- un convertidor analógico/digital; y

medios de memoria y de procesado de datos, por ejemplo un ordenador, adaptados para recibir dicha señal digital, para procesar dicha señal, para obtener una curva que relacione dicha señal eléctrica con respecto al tiempo y para extraer y almacenar en una base de datos una pluralidad de parámetros relacionados con dicha señal e indicativos del comportamiento de dicho microorganismo.

Los medios adaptados para extraer de dicha curva al menos un parámetro indicativo del comportamiento de dicho microorganismo pueden asimismo incluir medios adaptados para efectuar la división de dicha curva en al menos dos tramos y para ajustar matemáticamente cada uno de dichos tramos a dos ecuaciones matemáticas diferentes, al menos uno de dichos tramos siendo ajustado a una ecuación exponencial y/o el otro a una ecuación polinómica.

La función matemática resultante de dicho ajuste es, ventajosamente, la unión de dichos tramos ajustados a dichas ecuaciones, en el que el número de dichos tramos es mayor de dos, por ejemplo un número comprendido entre tres y diez, y en el que al menos uno de los tramos está ajustado a una ecuación exponencial y otro de los tramos está ajustado a una función polinómica.

El parámetro puede ser al menos uno de los siguientes: función matemática resultante de dicho ajuste; área bajo la curva de dicha función matemática; parámetros de ajuste de dicha función matemática; valor o valores máximos, absolutos o relativos, de dicha señal; valor o valores mínimos, absolutos o relativos, de dicha señal; tiempos de registro o detección de dicha señal; constante de crecimiento; tiempo de generación o cantidad de calor intercambiado. Las ventajas técnicas de cada uno de estos ejemplos de realización particularmente ventajosos de la presente invención están suficientemente explicadas en el siguiente texto de la presente solicitud de patente de invención, en particular en el apartado en el que se describe detalladamente un modo de realización de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Para una mejor comprensión de la invención, sus objetos y ventajas, se adjuntan a la memoria las siguientes figuras en las que se representa:

La 1 muestra un detalle del montaje diferencial de las termopilas de un microcalorímetro tipo Calvet.

La figura 2 representa la recta de regresión para el calibrado dinámico a 298,15 k con una constante de calibrado de C=23,8 J/ μν.Ιι

La figura 3 representa la recta de regresión para el calibrado químico a 309,65 k con una constante de calibrado de C=23,4 J/ μΝ/.h La figura 4 representa el montaje experimental de acuerdo con un ejemplo de realización de la presente invención.

La figura 5 representa un termograma de control

La figura 6 representa los termogramas de la bacteria Staphylococcus aureus La figura 7 representa los termogramas de la bacteria Staphylococcus epidermidis La figura 8 representa los termogramas de la bacteria Staphylococcus warneri La figura 9 representa los termogramas de la bacteria Staphylococcus hominis La figura 10 representa los termogramas de la bacteria Streptococcus pyogenes La figura 11 representa los termogramas de la bacteria Enterococcus faecalis La figura 12 representa los termogramas de la bacteria Escherichia colt ^' La figura 13 representa los termogramas de la bacteria Proteus mirabilis La figura 14 representa los termogramas de la bacteria Klebsiella pneumoniae

La figura 15 representa los termogramas de la bacteria Pseudomonas aeruginosa

La figura 16 es la representación gráfica del primer tramo del termograma de f. faecalis (10 ⁶ UFC/ml) La figura 17 es la representación gráfica del segundo tramo del termograma de E. faecalis (10 ⁶ UFC/ml)

La figura 18 es la representación gráfica del tercer tramo del termograma de f. faecalis (10 ⁵ UFC/ml)

La figura 19 es la representación gráfica del cuarto tramo del termograma de f. faecalis (10 ⁶ UFC/ml)

La figura 20 es la representación gráfica del quinto tramo del termograma de E. faecalis (10 ⁶ UFC/ml)

La figura 21 es la representación gráfica del sexto tramo del termograma de E. faecalis (10 ⁶ UFC/ml) La figura 22 es la representación gráfica del séptimo tramo del termograma de E. faecalis (10 ⁶ UFC/ml)

La figura 23 es la representación gráfica del octavo tramo del termograma de E. faecalis (10 ⁶ UFC/ml)

La figura 24 es la representación gráfica del noveno tramo del termograma de E. faecalis (10 ⁶ UFC/ml)

La figura 25 representa el termograma completo de E. faecalis (10 ⁶ UFC/ml)

REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN

La microcalorimetría es la técnica experimental que permite determinar, con a sensibilidad, la energía expuesta como consecuencia de cualquier proceso transformación. El primer calorímetro conocido, se debe al profesor de Medicina y Química de la Universidad de Glasgow, Joseph Black, quien en 1761, hizo un hueco en el centro de una barra de hielo, introdujo una sustancia sólida, de masa y temperaturas predeterminadas, y después de esperar 20 minutos para que se alcanzara el equilibrio térmico, con una esponja seca, previamente pesada, absorbía el agua fundida y volvía a pesar, con lo cual conocía la masa de hielo fundido. Así es como desarrolló los conceptos de calor específico y calor latente, definiendo este como el calor necesario para producir cambios de estado sin variaciones de temperatura. Acababa de crear el primer calorímetro isotérmico e iniciar la calorimetría como ciencia. Ya casi a finales del siglo XIX, el químico francés Pierre Eugéne Marcelin Berthelot realiza grandes avances dentro de esta nueva línea de investigación, al inventar en 1881 una bomba calorimétrica que le permitiría estudiar reacciones de combustión a volumen constante y en presencia de oxígeno a presión.

Richards, premio Nobel de Química en 1914, desarrolló la calorimetría adiabática según una idea propuesta 50 años antes por el científico francés Pearson (1849). Se trataba de eliminar las correcciones que las fugas térmicas, siempre difíciles de evaluar, obligaban a introducir en todas las experiencias calorimétricas, bien una corriente de agua caliente, una resistencia eléctrica o una reacción química, considerando de los tres posibles métodos el último de todos como el más conveniente. Sin embargo, hoy en día se sabe que obtener un adiabatismo total es prácticamente imposible aun con los avances técnicos actuales.

En esta época, la evolución de los distintos tipos de calorímetros avanza de forma vertiginosa, fruto del esfuerzo de grandes investigadores que dedicaron una cantidad prodigiosa de ingenio y paciencia a la construcción de nuevos aparatos. Hay que esperar hasta 1923 para que Albert Tian en Marsella construyese el primer microcalorímetro de conducción calorífica. Se trata de un equipo que emplea el efecto Peltier para compensar los efectos exotérmicos, en el que se suprime la agitación en el baño calorimétrico y que permite realizar micromedidas.

En 1956, Edouard Calvet, discípulo de Tian, considerando la propuesta de Joule de que todos los calorímetros debían constar de células gemelas y tomando como base la idea de conducción calorífica desarrollada por Tian, construyó el primer calorímetro de flujo de calor con termopilas, que en la actualidad todavía lleva su nombre, convirtiéndose así en el descubridor e impulsor de la microcalorimetría moderna. El conocido calorímetro de Calvet no ha sido superado aún por las numerosas versiones que, basándose en esta medida del flujo calorífico, han creado diferentes casas comerciales.

Un microcalorímetro está formado por un recinto interno o sistema detector, en el que se realizan los procesos térmicos que queremos estudiar (calorímetro propiamente dicho) y el termostato que lo rodea. Los fenómenos térmicos que tienen lugar durante un proceso tienden a hacer variar la temperatura del calorímetro, produciéndose, de este modo, intercambios energéticos entre los dos recintos a través del medio que los separa, que pueden ser detectados mediante fenómenos termoeléctricos.

Por lo tanto, llamamos recinto interno (R.l.) al calorímetro y recinto externo (R.E.) al termostato que lo rodea. Los parámetros que caracterizan un calorímetro, y de los cuales dependerá su funcionamiento y diseño, son el flujo de calor (Φ) que se establece entre los recintos interno y externo, la conductividad calorífica (Λ) del medio que los separa y las temperaturas (θ _Ιη1 ,θ _6Χ{ ) del recinto interno y externo, respectivamente. El flujo de calor (Φ) entre los dos recintos puede ser determinado a partir de la ley de Fourier:

Cuanto mayor sea la diferencia de temperaturas entre R.l. y R.E. y cuanto mayor sea la conductividad calorífica del medio que los separa, mayor será el flujo de calor entre ambos recintos.

Los calorímetros se clasifican en función del intercambio de calor que se establece entre el calorímetro propiamente dicho y su entorno, como consecuencia de la diferencia de temperatura que se establece entre ambos.

En los calorímetros adiabáticos no se produce transferencia de calor entre sus límites (Φ=0) debido a que los recintos interno y externo se encuentran separados por una pared totalmente adiabática (Λ=0), denominada escudo adiabático y, teóricamente impermeable al paso de calor.

Sin embargo, el término adiabático se emplea en un sentido impreciso, porque en la práctica, ningún calorímetro es realmente adiabático, aunque se puede conseguir reducir el intercambio de calor entre el calorímetro y su entorno minimizando las diferencias de temperatura entre ambos recintos, minimizando el coeficiente de transferencia de calor o reduciendo al mínimo el tiempo de intercambio calorífico

En este tipo de calorímetro lo que se debe medir, con la mayor precisión posible, es el aumento o disminución de la temperatura a lo largo del proceso. La denominación de calorímetro isotérmico engloba a todos aquellos calorímetros en los cuales, idealmente, durante la experiencia no se producen cambio de temperatura. El uso del término isotérmico, implica una constancia de la temperatura en cualquier parte del calorímetro con el tiempo, es decir, la temperatura tanto del recinto interno como del externo debe ser prácticamente la misma (9¡ _nt =6 _ext ), lo cual provoca que la conductividad del medio que los separa adopte valores muy elevados (Λ=°°) para conseguir mantener el flujo calorífico Φ=0.

Normalmente, estos equipos suelen emplear un cambio de fase para conseguir mantener esta temperatura constante de modo que la cantidad de sustancia que cambia de estado (sólido-líquido, en el caso del calorímetro de hielo de Bunsen, o bien líquido-vapor) sea proporcional a la energía liberada por el proceso. Sin embargo, existen otros métodos alternativos, pudiendo citar así aquellos que utilizan calentadores eléctricos (efecto Joule) para equilibrar la absorción de calor, o enfriamiento eléctrico (efecto Peltier) para compensar la liberación del mismo.

El fundamento de la calorimetría de conducción calorífica radica en el hecho de que la mayor parte del calor desarrollado en el recinto interno es llevado al externo por conducción a través de una asociación de termopares conectados en serie, de modo que la fuerza electromotriz producida en el sistema por efecto Seebeck es proporcional al flujo calorífico que atraviesa la termopila.

Si consideramos que 0 _ex t (temperatura del recinto externo) permanece constante, y que 6¡nt (temperatura del recinto interno) varía debido al proceso realizado, el flujo que se produce variará en función del tiempo, por lo que despejando en la ecuación anterior, la conductividad (Λ) del medio que separa los recintos se puede escribir como:

Λ = Φ

ext En los calorímetros de conducción calorífica se miden con precisión las fugas térmicas entre el calorímetro y el termostato.

Algunas de sus características principales son la capacidad de medir el flujo térmico que se produce entre los dos recintos (interno y externo), sin necesidad de agitación, ya que no nos basamos en medidas de temperatura sino en la medida de la fuerza electromotriz producida en las soldaduras de los termopares que rodean los recintos interno y externo (por efecto Seebeck), que es proporcional al flujo de calor, el montaje "en oposición" (diferencial) de dos termopilas idénticas, de forma que se suprime la deriva del cero experimental debida a las variaciones de temperatura, la posibilidad de realizar calorimetría a altas y bajas temperaturas, prácticamente con el mismo montaje, sin más que hacer unas pequeñas modificaciones en los termostatos, y sin limitación en el tiempo de medida y la versatilidad en el tamaño de las muestras a estudiar.

En los ejemplos de realización de la presente invención que se van a describir se ha utilizado un microcalorímetro de conducción calorífica de Calvet.

La microcalorimetría de conducción calorífica fue desarrollada por Calvet (1956), quien transformó y mejoró extraordinariamente un calorímetro de una sola termopila ideado por Tian (1923). Para asegurar la constancia de la temperatura, intentó anular el flujo calorífico entre un recinto aislado y el exterior, utilizando un método de transferencia termoeléctrica que compensaba exactamente los efectos térmicos producidos dentro del recinto i nterno. Como los medios de la época no perm itía n la suficiente automatización del calorímetro, Calvet en 1958 propuso aumentar considerablemente la conducción calorífica entre el recinto interno y su entorno, midiendo directamente el calor transferido por conducción. El sistema así creado se hace sensiblemente isotérmico. De hecho, la esta bil ización de la temperatura del recinto externo, constituido por un bloque ca lori métrico metá l ico de geometría previa mente determinada, permite obtener una estabilidad térmica muy grande, debido a sus recintos múltiples, formando un termostato que mantiene la temperatura con una precisión de ±0.05 K, con lo que permite detectar flujos de calor pequeños, del orden de 10 ^"6 W.

Para determinar el flujo de calor consecuencia del metabolismo bacteriano, a presión constante, en el ejemplo de realización de la presente invención se uti liza un microcalorímetro de tipo Calvet. Se trata de un calorímetro de conducción calorífica o flujo cuasi-isotermo que permite registrar flujos de calor muy pequeños, del orden de un microvatio, proporcionales a la fuerza electromotriz de la pila termoeléctrica.

Este método de trabajo presenta una serie de ventajas: permite realizar una medida directa del calor de mezcla sin necesidad de conocer las capacidades caloríficas de sus componentes ni de sus mezclas, el calibrado es fácil y preciso, permite trabajar en un amplio intervalo de temperaturas, la velocidad del proceso de mezcla no influye en los resultados puesto que la energía desarrollada durante el mismo y su medida son independientes del tiempo que dura la experiencia, y los resultados obtenidos son fácilmente reproducibles. La separación entre el calorímetro propiamente dicho y el montaje experimental que de forma adicional se requiere, permite realizar cambios en este último sin interferir en el propio calorímetro.

El microcalorímetro tipo Calvet utilizado en el ejemplo de realización de la presente invención, consta básicamente de un sistema termostático, un sistema detector y un sistema de adquisición y tratamiento de datos.

El termostato, de recintos múltiples, está formado por un cilindro de chapa de hierro que contiene un material aislante y que separa el sistema termostático del exterior con una gruesa capa de lana de vidrio y por un termostato aneroide, constituido por cinco cilindros concéntricos de aluminio, separados entre si por capas de amianto (aislante térmico) del mismo espesor. Tiene como objeto mantener los elementos calorimétricos a la misma temperatura, ya que por su disposición permite que cualquier efecto térmico procedente del exterior, se propague con mayor facilidad sobre las capas metálicas del recinto que a través del propio aislamiento, consiguiendo así una difusión más homogénea y posibilitando su conducción hacia las bases. En el exterior del conjunto de cilindros de aluminio (recintos múltiples), se enrolla la resistencia eléctrica calefactora, conectada a un termómetro de contacto que está controlado por un regulador electrónico de temperatura.

El sistema detector está formado por dos termopilas idénticas, dispuestas simétricamente respecto a un plano diametral y conectadas en oposición (montaje diferencial) rodeadas por dos piezas troncocónicas de aluminio (sistema repartidor equitativo de calor). El montaje diferencial permite que las perturbaciones externas lleguen por igual a ambos elementos, compensándose mutuamente y permitiendo detectar de forma directa la diferencia entre los flujos térmicos medidos. Una de las termopilas se utiliza como laboratorio "experimental", realizándose en ella el proceso que se desea estudiar, mientras que la otra, permanece siempre a la temperatura del termostato y se usa como "testigo".

Cada una de las termopilas está constituida por un recipiente cilindrico de paredes de plata pura de pequeño espesor, donde se introduce la célula cilindrica en la que tendrá lugar el fenómeno calorífico a estudiar, y que a su vez, es coaxial con otro cilindro de mayor tamaño que se ajusta en el bloque troncocónico. Ambos cilindros están unidos por termopares de cromel-constantán conectados en serie entre si, distribuidos homogéneamente de forma radial y eléctricamente aislados por una fina capa de mica, conectando térmicamente el recinto interno (pared de plata del recinto interno) con el recinto externo (pared de aluminio del recinto externo), que se supone a temperatura constante. El número y tamaño de estos termopares se calcula de modo que permitan obtener la máxima sensibilidad y precisión, así como mínima inercia térmica, transfiriéndose el calor a través de ellos, en un sentido u otro, por conducción. En cada termopila se pueden considerar dos partes semejantes entrelazadas, pero con distintas funciones: la parte detectora, que produce una fuerza electromotriz efecto Seebeck proporcional a la potencia desarrollada en el proceso experimental, y que está constitu ía por 800 termopares, y la pa rte com pensadora, formada por 200 termopares, que se puede conectar a un sistema electrónico que regula y mide una intensidad de corriente, para así compensar, por efecto Peltier, el calor absorbido o producido en la experiencia.

Esta diferencia permite trabajar en tres grados diferentes de sensibilidad de detección, que se pueden seleccionar mediante un conmutador, situado en la parte externa del calorímetro: Pequeña sensibilidad (P.S.): se usa como detector la parte compensadora de la termopila y se habilitan 200 termopares.

Mediana sensibilidad (M.S.): la detección se realiza con la parte detectora, activándose 600 termopares.

Gran sensibilidad (G.S.): actúan ambas partes de la termopila conectadas en serie, 800 termopares. Los ejemplos de realización de la presente invención que se describen a continuación y los datos asociados a los mismos se realizaron utilizando este grado de sensibilidad. Las termopilas son accesibles desde el exterior a través de dos orificios cilindricos, paralelos entre sí, que van desde la parte superior del microcalorímetro hasta el recinto interno. La gran distancia que separa los termopares de la entrada, permite minimizar los efectos de conducción calorífica hacia el exterior. En cuanto al sistema de adquisición y tratamiento de datos, la potencia calorífica desarrollada en la célula es transformada por los termopares en fuerza electromotriz (efecto Seebeck), esta es transmitida a un multímetro, que recoge los datos con una precisión del 0,01%, trabajando en un rango de 200 mV. El mismo multímetro convierte la señal analógica en señal digital y la transfiere por medio de un conector a un ordenador, que recoge la información por medio de un programa de lenguaje Qbasic. Una subrutina se encarga de almacenar los valores en un archivo y de integrar la curva que representa la señal de salida frente al tiempo.

El montaje diferencial se muestra en la figura 1, en la que podemos distinguir la célula experimental 1 así como la célula testigo 2. El objetivo del método calorimétrico diferencial radica en suprimir las variaciones accidentales de temperatura en el reciento externo, que se ocasionan cuando el aparato disponía de un solo elemento microcalorimétrico aislado, como en el calorímetro de Tian. El sistema consiste en disponer de dos elementos microcalorimétricos idénticos, en las mismas condiciones de intercambio calorífico, unidos entre sí en oposición y con un mismo recinto externo. En uno de ellos se introduce la célula "experimental" 1, donde va a tener lugar el fenómeno a estudiar, y en el otro la célula "testigo" 2, en la que se producirá un fenómeno térmico de potencia regulable y conocida.

La principal ventaja de este montaje es que no depende de la temperatura externa, asegurando así la estabilidad del cero experimental, inconveniente que sí se presenta en el microcalorímetro de un solo elemento. En este último es muy difícil alcanzar un estado de potencia nula en la célula, debido fundamentalmente a que la temperatura del recinto externo, que afecta a las soldaduras externas de los termopares, no permanece constante.

Al poner en marcha un proceso térmico en la célula experimental, se produce una energía calorífica, Q, en el recinto interno. Esto origina una diferencia de temperaturas entre ambos recintos, interno y externo del microcalorímetro, y esta variación puede ser medida a través de las termopilas. De forma general, las características, constitución, disposición de elementos, funcionamiento y medidas (en régimen permanente o en régimen variable) del microcalorímetro, son las propias y convencionales de una microcalorímetro tipo Calvet. En cuanto al calibrado del microcalorímetro, para calcular el calor intercambiado a lo largo de una experiencia, es necesario calcular el valor de la integral J2?(f)c¿f y el de la constante de calibrado, C, que va a depender tanto del microcalorímetro empleado como de la sensibilidad de trabajo, la cual a su vez es función del número de termopares implicados. Por ello, ha de realizarse un calibrado previo del aparato, que puede ser un calibrado eléctrico, midiendo el calor producido por efecto Joule en una resistencia de valor determinado, cuando se hace pasar por ella una corriente eléctrica de intensidad conocida, bien durante u n largo periodo de tiempo (calibrado estático) o bien suministrando la misma potencia durante un corto periodo de tiempo (calibrado dinámico). Alternativamente, se puede realizar un calibrado químico, mediante mezclas estándar, cuyos efectos térmicos están perfectamente determinados y verificados en distintos laboratorios internacionales de reconocido prestigio, siguiendo las normas de la IUPAC, o bien utilizar patrones radiactivos de largo periodo de semidesintegración, que suministran un flujo constante de calor independiente de la temperatura. En nuestro ejemplo particular de realización, se propone realizar un calibrado dinámico por efecto Joule, contrastándolo con el calibrado de una mezcla de hexano y ciclohexano. Las otras alternativas son igualmente válidas.

En el calibrado eléctrico por efecto Joule, y atendiendo a la duración del paso de la corriente a través de la resistencia, se diferencian dos tipos de calibrado: Calibrado estático: se basa en el desarrollo constante y continuo de una potencia en el interior de la célula, estableciéndose un régimen permanente de flujo entre la célula y el bloque calorimétrico a través de los hilos de los termopares, de tal forma que la temperatura de ambos recintos (interno y externo) se mantiene constante mientras que la potencia suministrada no varíe. Para ello, seleccionamos en el generador EJ P 30 (SETARAM, Lyon, Francia) una intensidad constante que mantenemos hasta que se alcanzan las condiciones de régimen permanente de flujo.

La constante de calibrado puede determinarse a partir de la potencia generada en la célula ( W = I ² R ) y la fuerza electromotriz máxima, E _max , midiendo mediante un multímetro digital conectado al microcalorímetro, la separación respecto al cero experimental.

Calibrado dinámico: Se realiza en régimen variable suministrando una potencia eléctrica en un tiempo corto. Para la determinación de la constante de calibrado se introduce en la termopila laboratorio una célula de calibrado conectada a una fuente de intensidad constante EJP 30 (SETARAM, Lyon, Francia). Una vez que el sistema alcance la estabilidad térmica, aproximadamente a las dos horas, se hace pasar por la resistencia laboratorio una corriente de intensidad /, durante un tiempo corto y determinado (entre 10 segundos y 2 minutos), a fin de evitar que se alcance el estado estacionario, disipándose parte de esta energía calorífica por efecto Joule. Esta energía actúa a su vez calentado el recinto interno y provocando que se genere en los termopares por efecto Seebeck una fuerza electromotriz proporcional al calor puesto en juego. Esta corriente perfectamente estabilizada y con una precisión de ±10 ^"6 amperios es suministrada por el generador. Antes de alcanzar el régimen estacionario se interrumpe al paso de corriente de manera que la señal eléctrica de salida de la termopila, una vez alcanzado el valor máximo, disminuye exponencialmente hasta alcanzar la prolongación del cero inicial (cero experimental).

En este momento el sistema de adquisición de datos nos permitirá conocer el valor de la integral dada en las ecuaciones anteriores, que se corresponde con el área bajo la curva experimental y que es proporcional al efecto calorífico registrado. Por otra parte la energía suministrada por la resistencia viene determinada por la Ley de Joule como ( Q = I ² Rt ), por lo que igualando ambas expresiones:

Por lo tanto, podremos calcular el valor de la constante C, que coincide con la pendiente de la recta resultante de ajustar por mínimos cuadrados los valores obtenidos para la integral a distintos tiempos de calentamiento.

Este es el tipo de calibrado que se ha seguido en el ejemplo de realización de la presente invención. Los resultados experimentales del calibrado dinámico por efecto Joule a 298,15 K, se muestran en la siguiente tabla:

La figura 2 muestra la recta de regresión para el calibrado dinámico a 298,15 k con una constante de calibrado de C=23,8 J/ μΝ/.h

Calibrado químico mediante mezclas estándar: Los resultados a los que se llegó con el calibrado eléctrico por efecto Joule, son verificados determinando experimentalmente las entalpias molares de exceso del sistema patrón, recomendado por la Comisión de Termodinámica y Termoquímica de la IUPAC, ciciohexano + hexano a 298,5 K y presión atmosférica.

En este ejemplo de realización de la presente invención se realiza un calibrado químico utilizando una mezcla de hexano y ciciohexano. La temperatura de trabajo es también de 309,65 k.

Los resultados del calibrado químico se muestran en la siguiente tabla:

La figura 3 muestra la recta de regresión para el calibrado químico a 309,65 k, con una constante de calibrado de C=23,4 J/ μΝ/.h

En los ejemplos de realización de la presente invención que estamos describiendo se utilizan las siguientes bacterias, nombradas solamente de manera no exhaustiva, entendiéndose que otras muchas, conocidas de cualquier lector experto en el campo técnico, están también incluidas en el objeto de la presente invención:

Staphylococcus aureus ^■ Staphylococcus epidermidis

^■ Staphylococcus warneri

^■ Staphylococcus hominis

^■ Streptococcus pyogenes ■ Enterococcus faecalis

^■ Escherichia coli

^■ Klebsiella pneumoniae

^■ Proteus mirabilis

^■ Pseudomonas aeruginosa Preparación de las muestras bacterianas

Para determinar el comportamiento microcalorimétrico de una especie bacteriana es necesario estudiar muestras de una misma cepa a diferentes concentraciones.

En todos los casos, partimos de una cepa pura de la bacteria a estudiar, la cual, es inoculada en una placa de agar sangre e incubada a 309,65 K en una estufa durante 24 horas.

A partir de la placa de agar sangre donde han crecido múltiples colonias, preparamos una suspensión de bacterias en cloruro sódico 0,9%, cuya concentración es ajustada a la correspondiente a 0.5 de la escala McFarland. Posteriormente, se hacen diluciones con cloruro sódico 0,9% hasta obtener m uestras q ue nos perm ita n obtener concentración finales de 10 ⁶ , 10 ⁵ , 10 ³ o 10 UFC/ml.

Como medio de cultivo se utiliza un caldo digerido de soja-caseína, medio no selectivo en el que la mayoría de los microorganismos patógenos presentan crecimiento.

Montaje experimental v recogida de datos

Las experiencias que se muestran en este ejemplo de realización de la presente invención se han realizado en un microcalorímetro tipo Calvet, que dispone de dos células (experimental y testigo) de aluminio y teflón con una capacidad de 10 mi. En la célula testigo se incorporan 7ml de medio de cultivo más lml de cloruro sódico 0,9%, y en la célula experimental 7ml de medio de cultivo. Ambas células se unen a unos tubos huecos de plástico, que permitirán introducir las dos celdas a través de dos orificios cilindricos, paralelos entre sí, que van desde la parte superior del microcalorímetro hasta el recinto interno de las termopilas (ver figura 4). De esta forma, la gran distancia que separa las células de la entrada, permite minimizar los efectos de conducción calorífica hacia el exterior.

En el montaje experimental de acuerdo a un ejemplo de realización de la presente invención de la figura 4 distinguimos la muestra 5, el medio de cultivo 3 y el cloruro sódico 0,9% y el medio de cultivo 4.

En el caso de la célula experimental, a través de la tapa de teflón con una aguja va conectada la jeringa que contiene el inoculo de bacterias.

Trascurrido el tiempo de estabilización, aproximadamente 2 horas, inoculamos el medio de cultivo con la muestra dispuesta en la jeringa, y utilizando para ello, una barra metálica de diámetro inferior al tubo hueco al que está unido la célula experimental.

A partir del momento de la inoculación, el sistema de adquisición de datos a través de un programa de lenguaje Qbasic, empieza a recoger datos con un intervalo de 15 segundos durante el tiempo que dura la experiencia. Todas las muestras estudiadas en el microcalorímetro son sometidas a un control de pH antes y después de cada experiencia.

Termoaramas bacterianos

La microcalorimetría es una técnica analítica de medida del calor producido o consumido por reacciones químicas o cambios físicos de estado, incluyendo el calor generado durante los complejos procesos biológicos.

Todos los organismos producen calor como consecuencia de su metabolismo. La tasa de calor es una adecuada medida de la actividad metabólica de los organismos y sus partes constituyentes, células y niveles sub-celulares.

Cuando analizamos el comportamiento microcalorimétrico de un cultivo bacteriano obtenemos una serie de registros de fuerza electromotriz que responden al intercambio energético que se produce durante el periodo de cultivo. Este intercambio energético es dependiente de la concentración del inoculo inicial y de la especie bacteriana. Este comportamiento microcalorimétrico está definido por una serie de máximos y mínimos cuyo valor y tiempo de registro configuran la curva de crecimiento de cada especie bacteriana. Representando la diferencia de potencia calorífica registrada por el sistema de adquisición de datos durante la experiencia frente al tiempo, obtenemos un termograma que representa la curva de crecimiento de cada bacteria.

En las figuras 5 a 15 podemos observar tanto el termograma de control como los termogramas asociados al ejemplo de realización de la presente invención que se está describiendo, relativos a las bacterias citadas más arriba.

Tratamiento matemático de los termogramas

Los termogramas obtenidos para cada una de las bacterias a las diferentes concentraciones estudiadas pueden ser tratados matemática mente. Estos termogramas son divididos en tramos y posteriormente se ajusta cada parte a la correspondiente ecuación matemática.

Las diferentes partes del termograma se ajustan a ecuaciones exponenciales en la fase ascendente y descendente de cada pico de F.E.M.

Y a ecuaciones polinómicas en las zonas de mayor actividad del termograma. y =∑C,x'

A modo de ejemplo de realización de la presente invención, y entendiendo que para el resto de bacterias el procedimiento es similar, se describe a continuación el termograma de E. faecalis 10 ⁶ UFC/ml. El método utilizado puede ser aplicado al termograma de cualquier bacteria estudiada por microcalorimetría. En este caso, y a modo de ejemplo, el termograma de E. faecalis 10 ⁵ UFC/ml ha sido fraccionado en 9 tramos que se ajustan a sendas ecuaciones matemáticas.

La primera fase del termograma se ajusta a una ecuación de tipo exponencial y su representación gráfica puede observarse en la figura 16. y = 9,6e ^1,721 R = 0,9684 La segunda fase del termograma de E. faecalis se adapta a una ecuación polinómica y describe el primer pico de F.E.M. (ver figura 17). y = 192,5x ⁶ - 55,12 · 10 ^"2 x ⁵ + 65,65■ 10 ³ x ⁴ - 41,61 · 10" x ³ + 148,1 · 10" x ² - 28,04* + 22,07 R ² = 0,927 La tercera fase del termograma se ajusta a una ecuación exponencial y su representación se observa en la figura 18. y = 0,016e ^U52 R ² = 0,9684

La cuarta fase del termograma de E. faecalis está definida por otra ecuación polinómica, y su representación se recoge en la figura 19. y = 388,3■ 1(TV - 144,4· 10" x ⁵ + 223,7 · 1(TV - 184,9 · 10 ^~ V + 859,3 · 10 ^" V - 212,9 · \< *x + 219,9■ 10^ R ² = 0,9896

La quinta fase se ajusta también a una ecuación de tipo polinómico, cuya representación podemos observar en la figura 20. y = 75,09x ⁶ - 3496,9x ⁵ + 669,lx ⁴ - 675,9 · 10 ^~3 x ³ + 379,5 · 10 ^_3 x ² - 112,9 · 10 ⁵ x + 138,9 R ² = 0,9949

El sexto tramo del termograma de E. faecalis se ajusta a una ecuación exponencial y en la figura 21 podemos ver su representación gráfica. y = 0,145e ⁰ ' ⁸⁰⁴ R ² = 0,9865

La siguiente fase del termograma de E. faecalis se ajusta a una ecuación exponencial. En la figura 22 podemos observar su representación. y = 3,159 - 10 ^" V - 9,461· 10" x ³ + 10,62 · ÍO ^' V - 5,298 · 10 ^"5 x + 0,9628 R ² = 0,9928

El octavo tramo del termograma también se ajustó a una ecuación polinómica, cuya representación recoge la figura 23. _y = 22,75x ⁶ - 12,24 · 10 ^" V + 272,9 · 10 ^"2 x ⁴ - 322,9 · 10 ^~ V + 213,9 · 10" x ² - 753,5■ 10"x + 110,2 R ² = 0,9949

La última fase del termograma de E. faecalis se ajusta a una ecuación exponencial. La figura 23 recoge su representación. y = 26,99 · 10 ^"13 e ^{' 62} R ² = 0, 9865 La representación gráfica de las nueve ecuaciones expuestas anteriormente dan forma al termograma de E. faecalis XO ⁶ UFC/ml que podemos observar en la figura 24.

El lector entiende que la división del termograma en nueve ecuaciones diferentes es solamente un modo de realización particular de uno de las etapas del procedimiento de la presente invención, y que cualquier otro número de divisiones y/o de ecuaciones diferentes es igualmente realizable, dependiendo del microorganismo estudiado y del resultado de la curva original, sin más que efectuar un proceso de adaptación a las circunstancias de cada caso por medio de mera experimentación.

Análisis térmico

A partir del análisis microcalorimétrico de un medio de cultivo bacteriano, obtenemos un termograma caracterizado por una serie de puntos máximos y mínimos de F.E.M. que definen el comportamiento de una determinada especie bacteriana en un medio de cultivo definido. El análisis de la curva de crecimiento bacteriana obtenida a partir del registro de la diferencia de potencial durante el periodo de cultivo, nos permite obtener parámetros propios de cada especie bacteriana. Teniendo en cuenta las condiciones de estudio en las que se han realizado el análisis microcalorimétrico de las 10 especies bacterianas en el que se basa la presente invención, se ha aceptado que la actividad en el termograma se inicia cuando la diferencia de potencial es igual a 2 μν ^" .

Además, como se ha expuesto anteriormente, las zonas de mayor actividad del termograma se ajustan a ecuaciones de tipo polinómico. Por lo tanto, la primera derivada de estas ecuaciones, nos permite conocer el valor de los picos máximos de F.E.M. y sus tiempos de registro.

En la fase logarítmica de la curva de crecimiento, nO es el número de células a tiempo 0, y nt el número de células a tiempo t, por lo tanto: n, = n ₀ e ^{(k )} donde k es la constante de crecimiento.

Si consideramos Pw como la energía desprendida por cada célula, entonces:

Teniendo en cuenta que la energía desprendida a t cero es P ₀ y P _t a tiempo t:

\nP _t = Kt + \aP

Por lo tanto, a partir de la ecuación exponencial de ajuste de la fase ascendente de un pico de fuerza electromotriz (F.E.M) del termograma de una bacteria podemos obtener la constante de crecimiento. Se define tiempo de generación (G) como el tiempo que tarda una población en duplicar su número, y se expresa como: k

Utilizando el método trapezoidal podemos calcular el área bajo la curva (AUC) de cualquier termograma para un tiempo definido. Multiplicando el AUC por C (constante de calibrado), calculada en nuestro caso mediante un calibrado eléctrico por efecto Joule y verificada mediante un calibrado químico realizado con una mezcla de hexano y ciclohexano, podemos obtener el valor de la cantidad de calor intercambiado durante un tiem o determinado en el medio de cultivo.

En consecuencia, a partir de los termogramas obtenidos por microcalorimetría, podemos conocer de forma rápida y sencilla el valor de la constante de crecimiento, el tiempo de generación de una determinada bacteria y la cantidad de calor intercambiado en un medio de cultivo.

Las tablas que se muestran a continuación, se recogen los principales parámetros de las curvas de crecimiento obtenidas por microcalorimetría para E. faecalis.

Para cada bacteria: 1. En la primera tabla se muestra el tiempo hasta la detección de la señal, los voltajes máximos y sus tiempos de registro. El primer pico máximo considerado, se caracteriza por presentar una potencia moderada respecto a los posteriores, pero ha sido destacado por ser característico de todos los termogramas

2. La segunda tabla recoge el valor de la constante de crecimiento y el tiempo de generación de cada fase del termograma. Se representa por K y G, la constante de crecimiento y el tiempo de generación, respectivamente, de los picos de voltaje máximo. Así mismo, se marca con el apóstrofo ""' relativo a su posición en el termograma, el resto de las constantes de crecimiento y tiempos de generación que se pueden extraer del gráfico.

3. La tercera tabla recopila los AUC (área bajo la curva) y Q. (calor acumulado) en las primeras 24 horas de cultivo.

Tabla primera. Tiempo de detección de la señal (t _d ), primer, segundo, tercer y cuarto pico de máximo voltaje (V _p i, V _p2 , V _p3 , V _p4 ) y tiempos de registro (t _p i, t _p2 , t _p3 , t _p ), de E. faecalis

Conc. td tpl Vpi t _P 2 _P2

(UFC/m) (h) (h) (μν) (h) (μν)

10 ⁶ 2,67 4,43 16 6,13 58

10 ⁵ 3,32 4,99 19 6,61 59

10 ³ 3,63 4,55 13 6,37 53

10 4,72 6,97 15 8,98 45

Conc. t _P 3 V _P 3 t _p4 V _p4

(UFC/m) (h) (μ ) (h) (μν)

10 ⁶ 7,46 56 8,14 47

10 ⁵ 7,87 59 8,49 51

10 ³ 7,88 51 8,59 39

10 10,27 45 11,36 31 Tabla segunda. Constante de crecimiento (Κ', K, K ^" ) y tiempo de generación (G ^' , G, G ^" ) de E. faecalis

Conc. K ^' G ^' R ² K G R ²

(UFC/ml) (h- ¹ ) (h) (h ¹ ) (h)

10 ⁶ 1,7208 0,4028 0,9684 1,3518 0,5128 0,9955

10 ⁵ 1,9813 0,3498 0,9579 1,1075 0,6259 0,9963

10 ³ 3,0279 0,2289 0,9625 1,4104 0,4915 0,9908

10 1,1972 0,5789 0,9160 1,0133 0,6840 0,9913

Conc. K" G ^" R ²

(UFC/ml) (h- ¹ ) (h)

10 ⁶ 0,8036 0,7055 0,9825

10 ⁵ 0,8415 0,8237 0,9656

10 ³ 0,8493 0,8161 0,9839

10 0,4671 1,4839 0,9680

(*) Debido a los limitados datos en esta fase del termograma, no se ha podido extraer la constante de crecimiento ni el tiempo de generación correspondiente al cuarto pico de F.E.M.

Tabla tercera. AUC2 ₄ y calor intercambiado en el cultivo E. faecalis durante las primeras 24 horas de cultivo

Conc. AUC ₂₄ Q24

10 ⁶ 188,6361 4,414

10 ⁵ 203,8 4,769

10 ³ 175,4822 4,106

10 219,4869 5,136