Verfahren und Vorrichtung zur Ermittlung einer Zellkontur einer Zelle

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Ermittlung einer Zellkontur einer Zelle und insbesondere auf berandungsgenaue Segmentierung von Plasma und Kernen bei Leukozyten.

Eine sichere Erkennung und exakte Segmentierung von weißen Blutzellen (Leukozyten) in gefärbten Ausstrichen des peripheren Blutes bildet die Grundlage für eine automatische, bildbasierte Erstellung eines sog. Differenzialblutbildes im Kontext der medizinischen Labordiagnostik (sog. Computer Assistierte Mikroskopie - CAM) . Die Vielfältigkeit der in einem Blutausstrich auftretenden weißen Blutzellen, verbunden mit ihrer jeweils charakteristischen Farbverteilung und Texturierung, erhöhen die Schwierigkeit bei der Klassifikation im Rahmen einer vollständigen Automatisierung. Während die automatische Detektion und Segmentierung weißer Blutzellen in digitalen Bildern mittlerweile zum Stand der Technik gehört, ist eine anschließende berandungsgenaue Segmentierung von Zellkern und speziell des Zellplasmas im Hinblick einer nachfolgenden Klassifikation noch nicht gelöst. Die digitalen Bilder können dabei in verschiedenen Farbschemas oder Farbräumen vorliegen. Ein RGB-Farbraum spezifiziert die Farbe eines Bildpunktes durch die Anteile der drei Grundfarben (rot, grün, blau) , wobei ein HSV- Farbraum die Farbe eines Bildpunktes durch einen H-Wert (Farbtyp), einen S-Wert (Saturierung) und einen V-Wert (va- lue oder Helligkeit) angegeben wird.

Bekannte Ansätze zur Segmentierung von Zellplasma und Zellkern weißer Blutzelle greifen oftmals auf Schwellwertverfahren zurück. Dies ist zum Beispiel in Cseke, I.: „A fast segmentation scheme for white blood cell images" in ll ^th I-

APR Int. Conf. On Pattern Recognition Vol. III: Image, Speech & Signal Analysis. (1992) 530-533 und in Liao, Q., Deng, Y. : "An accurate segmentation method for white blood cell images" in: IEEE Intl. Sym. on Biomedical Imaging. (2002) 245-248 beschrieben. Ein in "Leukocyte segmentation and Classification in blood-smear images" durch Ramoser, H., Laurain, V., Bischof, H., et al in IEEE Engineering Me- dicine and Biology Society (2005) 3371-3374 vorgeschlagenes Verfahren führt zusätzlich wahrscheinlichkeitstheoretische Elemente ein, um eine Unterscheidung in Hintergrund, rote Blutkörperchen, sowie Kern und Plasma der Leukozyten zu treffen. Ein Active Contour-Verfahren zur Zellumrissbestim- mung kommt in "An automated differential blood count sys- tem" durch Ongun, G., Halici, U., Leblebicioglu, K., et al in IEEE Eng. Med. and Biology Soc. 3 (2001) 2583-2586 zum Einsatz. Der in "A novel white blood cell segmentation scheme based on feature space clustering" durch Jiang, K., Liao, Q. M., Xiong, Y. in Soft Comput. 10 (2006) 12-19 vorgestellte Ansatz setzt auf Scale-Space-Filtering zur Be- Stimmung des Zellkerns und 3D-Watershed-Clustering des ins HSV-Modell transformierten Bildes. Außerdem wird in dem Preprint „Analysis of Blood and Bone Marrow Smears using Digital Image Processing Techniques" von H. Hengen, S. Spoor und M. Pandit eine Methode für ein Auflösen von Clustern von weißen Blutzellen entwickelt. In dem Preprint „Bildverarbeitung für ein motorisiertes Lichtmikroskop zur automatischen Lymphozytenidentifikation" von M. Beller, R. Stotzka, H. Gemmeke, K. F. Weibezahn und G. Knetlitschek wird ein motorisiertes Lichtmikroskop zusammen mit einer CCD-Kamera eingesetzt, um ein Detektionssystem weiter zu entwickeln, das für Lymphozyten angewendet werden kann. In dem Preprint „Automation of Differential Blood count" von N. Sinha und A. G. Ramakrishnan wird eine Technik zum Zählen von weißen Blutzellen entwickelt, die insbesondere den sog. K-Means-Clustering und EM-Algorithmus verwendet. In dem Preprint „Blood Cell Segmentation using EM-algorithm" von den gleichen Autoren wird ein Verfahren zur Segmentation von Blutzellen vorgestellt, die insbesondere den HSV-

Farbraum verwendet, und einer Erwartungswertmaximierung (EN) nutzt. In dem Preprint „Statistical Evaluation of Computer extracted Blood Cell Features for Screening Populati- ons to detect Leukemias" von H. M. Aus, H. Harms, V. ter Meulen und U. Gunzer (in NATO ASI Series Vol. F 30) wird eine Methode zur Segmentierung von Zellbildern verwendet, die Farbunterschiede, äqudistante Isogramme, geometrische Operationen mit einem Zellmodell kombiniert. In dem Preprint „ Microscopic Image Analysis using mathematical morphology: Application to haematological Cytology" von J. Angulo und G. Flandrin wird ein Verfahren zur Bildanalyse vorgestellt, bei dem mathematische Morphologie zur Mustererkennung verwendet wird.

Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Ermitteln einer Zellkontur einer Zelle zu schaffen, die zuverlässig, schnell und in hoher Qualität Ergebnisse liefert.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1, einer Vorrichtung gemäß Anspruch 17 oder ein Computerprogramm gemäß Patentanspruch 23 gelöst.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die Zellkontur einer Zelle durch einen vierstufigen Verfahrensablauf bestimmt werden kann. Dazu werden zunächst Bildpunkte ermittelt, die Kandidaten für einen Zellkern darstellt und in einem zweiten Schritt wird aus dieser Kan- didatenmenge ein mittlerer Kern-Kandidatenbildpunkt bestimmt. Ausgehend von diesem mittleren Kern- Kandidatenbildpunkt wird in einem dritten Schritt ein erster Rand-Kandidatenbildpunkt bestimmt, indem auf einem vorbestimmten Pfad, der von dem mittleren Kern- Kandidatenbildpunkt weg führt, Farbwerte des Bildes erfasst werden, so dass ein Wechsel von einem ersten Abschnitt zu einem zweiten Abschnitt des Farbraumes einen Rand des Zellplasmas signalisiert. Schließlich wird ausgehend von diesem

Rand-Kandidatenbildpunkt ein geschlossener Pfad vorzugsweise innerhalb des zweiten Abschnitts des Pfadraumes bestimmt, so dass das Zellplasma von dem geschlossenem Pfad zumeist eingeschlossen wird. Somit umfasst der letzte Schritt ein Finden fortführender Rand-Kandidatenbildpunkte von dem ersten Rand-Kandidatenbildpunkt aus, die einen die Zelle umgebende Grenze bilden, mittels eines Wegfindungsal- gorithmus, der dazu tendiert, kleinere Weglängen und Wege durch Bildpunkte im zweiten Abschnitt des Farbraumes zu be- Vorzügen.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Einrichtung zum Ermitteln von Kern-Kandidatenbildpunkte, eine Einrichtung zum Bestimmen eines mittleren Kern- Kandidatenbildpunktes, eine Einrichtung zum Bestimmen eines ersten Rand-Kandidatenbildpunktes sowie eine Einrichtung zum Finden fortführender Rand-Kandidatenbildpunkte auf.

Insbesondere wird bei Ausführungsbeispielen der vorliegen- den Erfindung ein neuartiger Ansatz verfolgt, der sogenannte Level-Set / Fast Marching-Methoden mit einem kürzeste Pfade-Algorithmus kombiniert, um dadurch eine möglichst vollständige und berandungsgenaue Segmentierung von Zellkern und Zellplasma zu erreichen. Als Ausgangsmaterial die- nen dabei Lichtmikroskopaufnahmen von Blutabstrichen, die mit einer MGG-Färbung (May-Grünwald-Giemsa-Färbung) behandelt wurden. Dadurch werden bestimmte Bestandteile der Zelle (Zellkern, Zellplasma), Hintergrund, rote Blutzellen etc. entsprechend farblich markiert und die entsprechenden farblichen Charakteristika finden ihren Niederschlag in der Wahl der Parametrisierung des folgenden Verfahrens. Um eine Segmentierung automatisch durchführen zu können, z.B. kann ein dreistufiger Algorithmus verwendet werden, der sich grob in:

1. Bildvorverarbeitung;

2. Auffinden von Kern und Plasma; und

3. Nachbearbeitung und Feinkorrektur

unterteilen lässt.

Da einige Bildelemente wie rote Blutkörperchen (bläulicher Rand durch die Färbung und Optik) und Granulozyten (Textur mit relativ hochfrequenter farblicher Varianz) lokal mit atypischen oder den Hauptalgorithmus störenden Eigenschaften versehen sind, können in der Vorverarbeitung die Bilder zunächst mit einem kantenerhaltenden und rauschunterdrü- ckenden Kuwahara-Filter vorverarbeitet werden. Der Kuwarara Filter ist zum Beispiel in "On the evaluation of edge pre- serving smoothing filter" durch Chen, S., Shih, T. Y. in: Proceedings of Geoinformatics. (2002) paper C43 beschrieben.

Die zweite Stufe (Auffinden von Kern und Plasma) kann wie folgt zusammengefasst werden. Um die Empfindlichkeit gegenüber Schwankungen der Farbkomponenten weiter zu reduzieren, findet die weitere Verarbeitung z.B. nach einer Transforma- tion des RGB-Eingangsbildes ins HSV-Modell statt. Als erstes werden mittels eines Schwellenwertverfahrens (Threshol- ding) Kandidaten für den relativ einfach grob zu lokalisierenden Zellkern (dunkle Blaufärbung) bestimmt. Diese dienen zunächst weniger zur Markierung als viel mehr zu einer Mit- telpunktsbestimmung der Zelle. Innerhalb dieser Kandidatenmenge N werden zufällig n Punkte S c N ausgewählt und derjenige, der min _xeS ∑ _yeS d(x, y) erfüllt, also den geringsten

Abstand d zu allen anderen Punkten aus S hat, zum vorläufigen Mittelpunkt m _seed erklärt. Als nächster Schritt erfolgt eine Bestimmung von Punkten knapp außerhalb des Zellplasmas beziehungsweise eine Markierung des letzteren, um die Kontur der Zelle erfassen zu können. Hierbei kann ein Fast- Marching-Algorithmus zum Einsatz kommen, der zum Beispiel in "Levelset methods and fast marching methods" Cambridge University Press (1999) durch Sethian, J.A. beschrieben ist und eine diskrete Variante der Eikonal-Gleichung: |Vu(x)|| F(x) = 1 in u löst, welche die Ausbreitung einer Welle, ausgehend von m _seed in Abhängigkeit der den Pixeln

zugrunde liegenden Farbeigenschaften F, simuliert (wobei V der Nabla-Operator ist und x einen Punkt in der Bildebene bezeichnet) .

Im Optimalfall ist durch { u < F(m _seed ) + ε } mit geeigneter

Funktion F und ε bereits die Zelle beschrieben. Dass dies in der Realität fast nie gegeben ist, liegt zumeist in der unscharfen Trennung der weißen und roten Zellen begründet; das Resultat ist aber zumeist sehr gut geeignet um mit ei- nem anderen Verfahren eine vollständige Trennung herbeizuführen. Als brauchbar für die Segmentierung von Leukozyten hat sich die Funktion F von der folgenden Struktur herausgestellt:

F(x) = I [ ^ß 0 ^f s ^a o ^l n ^l s ^S t ^: °^ ^≥ ^ ^V ^ ^≥ ^ ^{λ V} ^ ^{≤ Y)} (1)

wobei mit c(x) die Summe der drei Farbkomponenten im RGB- Raum und mit v(x) die Value-Komponente im HSV-Modell im Punkte x bezeichnet. Die Parameter sind so zu wählen, dass mittels αi der Bild-Hintergrund und α ₂ bzw. Y alles außerhalb von Hintergrund, der Zellkern durch c(x) < α ₂ und das Zellplasma durch v(x) > Y erfasst wird. Um nicht von einer speziellen Farbsituation abhängig zu sein, kann eine iterative Anpassung des Parameters Y implementiert werden, «i und c* ₂ können für Bilderserien unter gleichen Aufnahmebedingungen unverändert bleiben. Der Wert von Y hingegen, wird beispielsweise von einem niedrigen Niveau ausgehend schrittweise erhöht, bis bei einem Lauf in Nord-, Süd-, West- und Ostrichtung von Punkten nahe von m _see d jeweils Punkte P _N , P _S , P _W , P _O , aus {u > F(m _seed ) + ε} gefunden werden, die nach Wahl der Parameter Bereiche außerhalb der Zelle markieren sollen. Anschließend kann mittels eines Wegfin- dungsalgorithmus ein Pfad entlang der Kontur der Zelle bestimmt werden. So führt eine Dijkstra-Variante unter Ver- wendung einer farbabhängigen Kostenfunktion c(x,y) für die

(gerichtete) Kante zwischen benachbarten Punkte x und y (8er Nachbarschaft) mit

c(x, y) = ||x - y|| ₂ (l +α l _{u<F(m , _eed)+ε} (y)) + ß |m _seed - y| ₂ + _Y l„ _blι >(y)) (2 )

zur gewünschten Trennung der Zelle von ihrer Umgebung, wobei h (x) den Hue-Wert im HSV-Modell im Punkt x und H _b i _ue eine Untermenge des blauen Hue-Wertebereichs, sowie 1 _A < _X > die Indikatorfunktion der Menge A bezeichnet. Die Parameter α und Y sind beispielsweise derart gewählt, dass der Pfad möglichst nicht über die bläulich gefärbte Zelle verläuft, während ß den Weg auch nicht allzu weit von der Zelle wegführen lässt.

Auf solche Weise bestimmte Pfade, die die vier Punkte P _N , Ps, ?Wf Po durch vier Teilpfade verbinden, markieren oftmals den Zellenumriss schon recht genau. Das oben beschriebene Schwellwertverfahren zur Bestimmung des Zellkerns ist zwar geeignet einen guten Ausgangspunkt m _seed innerhalb der zu segmentierenden Zelle zu finden, hat sich jedoch als ungeeignet erwiesen, den vollen für das menschliche Auge als solchen wahrnehmbaren Zellkern zu erfassen. Für diese Aufgabe wurde ein anderes Schwellwertverfahren, das beim Verhältnis zwischen Blau- und Grün-Kanal des RGB- Eingangsbildes ansetzt, verwendet.

Da es sich gezeigt hat, dass mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens bestimmte Pfade Konkavitäten des Zellplasmas nur schwer gerecht werden, kann eine Nachbearbeitung des Pfades das Resultat verbessern. Dabei kann der Pfad punktweise in Richtung m _seec ] verschoben werden und zwar solange wie sich die Punkte auf dem durch die Farbe klar zu erkennenden Hintergrund oder auf auch roten Blutkörperchen befinden. Die so erhaltene Punktemenge, jeweils durch Kanten verbunden und geglättet, stellt ein Ergebnis des gesamten Verfahrens des Zellplasma betreffend dar.

Auch das Ergebnis hinsichtlich des Zellkerns kann mittels eines Nachverarbeitungschrittes verbessert werden. Beispielsweise kann mittels eines morphologischen Open-Close- Filters störende, isoliert liegende Punkte entfernt werden.

Die Leistungsfähigkeit des vorgestellten Algorithmus kann anhand einer Sammlung von Proben überprüft werden, die die verschiedensten Typen von Leukozyten enthalten. Dabei kann mit Hilfe verschiedener Kenngrößen die Qualität der automa- tischen Segmentierung mit einer zuvor per Hand durchgeführten Segmentierung verglichen werden. Bei der Evaluation kann beispielsweise zum Einen der Dice-Koeffizient

, . 2A n Bl C ₀ (A, B) = --——I (3)

|A| ₊ |B|

zum Einsatz kommen als auch eine normierte Hausdorff-Metrik

Die Ergebnisse können für Zellkern und -plasma getrennt in folgendermaßen zusammengefasst werden:

Zellplasma: C _D = 0,94 ± 0,02; H = 0,91 ± 0,03

und für den

Zellkern: C _D = 0,94 ± 0,02; H = 0,90 ± 0,04.

Die optischen Eindrücke der Segmentierungsergebnisse bestä- tigen die Resultate der Evaluierung durch Kennzahlen.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Segmentierung von Leukozyten in Kern und Plasma, welches anhand von Bildern in Blutausstrichen ausgeführt wird, kann demnach beispielswei- se einen Schritt der Vorverarbeitung durch einen Kuwahara- Filter und einen anschließenden Fast-Marching-Verfahren zur

Bestimmung der groben Zellumrisse umfassen. Ferner kann ein erfindungsgemäßes Verfahren einen kürzesten Wegealgorithmus umfassen, der zum großen Teil auf den bestimmten Level-Sets operiert, um die Zellfläche zu erhalten. Die Markierung des Zellkerns kann beispielsweise im Wesentlichen durch reine Schwellenwertoperationen erfolgen. Die damit erzielten Ergebnisse erreichen bei einer Evaluierung sowohl auf visueller Basis als auch mittels Standard-Maßzahlen wie Dice- Koeffizienten und Hausdorff-Distanz gute Ergebnisse.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend bezugnehmend auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 eine Schrittfolge zum Ermitteln einer Zellkontur gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 eine erweiterte Schrittfolge zum Ermitteln einer Zellkontur mit Vorbearbeitung und Nachbearbeitung;

Fig. 3 eine Schleifenverarbeitung zur Bestimmung eines Parameters γ;

Fig. 4 eine Darstellung des Algorithmus einschließlich

Vor- und Nachbearbeitung;

Fig. 5 eine graphische Darstellung einer Zellkontur mit

Zellkern und Zellplasma;

Fig. 6 eine Veränderung von Farbwerten im Zellkern, Zellplasma und Hintergrund;

Fig. 7 eine Darstellung zur Veranschaulichung des kürzesten Wege-Algorithmus;

Fig. 8 Bilder für verschiedene Stufen der Verarbeitung des Algorithmus; und

Fig. 9 Bilder von vier Typen von Leukozyten und deren Verarbeitung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Bevor im Folgenden die vorliegende Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert wird, wird darauf hingewiesen, dass gleiche Elemente in den Figuren mit den gleichen oder ähnlichen Bezugszeichen versehen sind und dass eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente weggelassen wird.

Fig. 1 zeigt eine Schrittfolge zur Ermittlung einer ZeIl- kontur 110 einer Zelle mit einem Zellkern 114 und einem Zellplasma 116 in einem Bild (siehe auch Fig. 5 unten) , das an einem Eingang 131 anliegt.

Zunächst werden Kern-Kandidatenbildpunkte Ki, die zu dem Zellkern 114 gehören, ermittelt und in einem Folgeschritt wird ein mittlerer Kern-Kandidatenbildpunkt Ko bestimmt, wobei der mittlere Kern-Kandidatenbildpunkt Ko im Innern eines durch die Kern-Kandidatenbildpunkte Ki gebildetes Gebiet liegt. Daran anschließend wird ein erster Rand- Kandidatenbildpunkt P _N bestimmt, wobei der ersten Rand- Kandidatenbildpunkt P _N auf einen von dem mittleren Kern- Kandidatenbildpunkt K ₀ aus wegführenden vorbestimmtem Pfad 120 liegt, und durch einen Wechsel von einem ersten Abschnitt zu einem zweiten Abschnitt des Farbraumes erfasst wird. In Abhängigkeit eines verwendeten Farbraumes, sind die unterschiedlichen Abschnitte durch unterschiedliche Farbkomponenten gegeben und ein Wechsel kann beispielsweise dadurch signalisiert sein, dass eine dieser Komponenten des verwendeten Farbraumes sich nicht kontinuierlich, sondern sprunghaft ändert. Im Anschluss an die Bestimmung des ersten Rand-Kandidatenbildpunktes P _N wird ein Pfad 122 gefunden, der die Zellkontur 110 im Wesentlichen umschließt, zum Beispiel indem zumindest 90 % des Pfades 122 außerhalb der

Zellkontur 110 liegt. Dieses Finden kann durch ein Wegfin- dungsalgorithmus geschehen, bei dem fortführend Rand- Kandidatenbildpunkte, ausgehend von dem ersten Rand- Kandidatenbildpunkt P _N aus gefunden werden und die eine die Zelle umgebende Grenze bilden. Der Wegfindungsalgorithmus kann dabei derart ausgeführt werden, dass sowohl kleinere Weglängen als auch Wege durch Bildpunkte im zweiten Abschnitt des Farbraumes bevorzugt werden. Dies kann beispielsweise durch eine entsprechend gewählte Kostenfunktion realisiert werden. Das Ergebnis der Ausführung dieser Verfahrensschritte liegt dann an einem Ausgang 139 an.

Fig. 2a zeigt eine erweiterte Schrittfolge, wobei die in der Fig. 1 gezeigte Schrittfolge als Hauptschrittfolge 130 dargestellt ist, wobei die Bilddaten am Eingang 131 anliegen und der Ausgang 139 das Resultat des Abarbeitens der Hauptschrittfolge 130 bereitstellt. Gemäß der Schrittfolge aus Fig. 2a erfolgt zunächst eine Eingabe von Bilddaten, z. B. in digitaler Form im RGB-Farbschema. Diese Bilddaten können anschließend in einem Kuwahara-Filter vorbearbeitet werden. Ein Kuwahara-Filter ist ein nicht-linearer glättender Filter, der Kanten erhält. Wie in Fig. 2b gezeigt, werden dabei um einen gegebenen Bildpunkt 161 herum ein Gebiet mit einer ungeraden Anzahl von Bildpunkten (5x5 in Fig. 2b) gebildet, so dass der gegebene Bildpunkt 161 in der Mitte des Gebietes liegt. Schließlich werden vier Regionen 161a, 161b, 161c, 161d gebildet, so dass der zentrale Bildpunkt 161 jeweils ein Eckpunkt der vier Regionen 161a, ... , 161d darstellt. Für jede Region wird eine durchschnittliche HeI- ligkeit mit einer entsprechenden Standardabweichung gebildet. Das Kuwahara-Filter ordnet nun den zentralen Bildpunkt 161 den durchschnittlichen Wert jener Region zu, die die kleinste Standardabweichung aufweist.

Damit ist eine Vorbereitung 160 der Bilddaten abgeschlossen und das Resultat wird an einem Ausgang 162 einem Folgeschritt, bei dem die Bilddaten in einen Farbraum transformiert werden können, der in der Hauptschrittfolge 150 ver-

wendet wird. Das kann beispielsweise der sog. HSV-Farbraum sein. Dabei charakterisiert ein H-Wert den Farbtyp, wie beispielsweise Rot, Blau oder Gelb und wird typischerweise in einer Region oder einem Winkel von 0 bis 360° angegeben. Ein S-Wert bezeichnet die Saturierung des jeweiligen Farbtyps und wird typischerweise in einem Bereich von 0 bis 100 angegeben. Bei manchen Anwendungen wird diese Saturierung auch als Reinheit der jeweiligen Farbe bezeichnet und je geringer die Saturierung einer Farbe ist, umso stärker ist ein gräulicher Farbton erkennbar und umso mehr ist ein Verblassen der Farbe erkennbar. Ein letzter Wert im HSV- Farbraum ist der V-Wert, der die Helligkeit einer Farbe kennzeichnet und typischerweise in Prozent (von 0 und 100 %) angegeben wird. Eine Darstellung des HSV-Farbraumes kann beispielsweise mittels einer Kegelpyramide erfolgen, wobei die Winkelvariable dem H-Wert, die radiale Richtung den S-Wert und die Höhe dem V-Wert entspricht. Dabei entspricht der Spitze der Kegelpyramide der schwarzen Farbe und dem Ursprung der Kegelgrundfläche der weißen Farbe. In diesem Bild kann jeder Bildpunkt durch einen Zeiger dargestellt werden, wobei der Zeiger auf einen der Farbe entsprechenden Punkt innerhalb oder auf dem Rand des Kegels zeigt.

Bei weiteren Ausführungsbeispielen kann auch ein anderer Farbraum verwendet werden, jedoch erweist sich der HSV- Farbraum für die Anwendung der Segmentierung von weißen Blutzellen als günstig. Zum Beispiel ist der Wechsel beim übergang von Zellplasma 116 zu einem Hintergrund bzw. auch der übergang vom Zellkern 114 zum Zellplasma 116 im HSV- Farbraum besonders leicht zu detektieren. Zum Beispiel kann ein eindeutiger Sprung in einem der Werte des Farbraumes leicht durch ein Computerprogramm feststellbar sein. Im HSV-Raum kann es beispielsweise zu einem Sprung des Zeigers kommen. Nachdem die Bilddaten in dem HSV-Farbraum transformiert wurden, erfolgt die Abfolge der Schritte, wie sie in Fig. 1 gezeigt wurden und das Resultat liegt an dem Ausgang 139 an. In einem Folgeschritt kann nun eine Segmentierung

164 des Zellkerns 114 ausgeführt werden, das heißt, die Kern-Kandidatenbildpunkte Ki werden zu einem Zellkern 114 verschmolzen, dessen Form gemäß verschiedener Typen variieren kann. Für die Segmentierung 164 des Zellkerns 114 kann ein Schwellwertverfahren verwendet werden, bei dem nicht das HSV-Farbschema zugrunde liegt, sondern bei dem im RGB- Farbraum ein Verhältnis zwischen dem Blau- und dem Grünkanal untersucht wird. Das heißt, dass sich Bildpunkte, die zu einem Zellkern 114 gehören, sich eindeutig in diesem Verhältnis von anderen Bildpunkten unterscheiden.

Das Ergebnis der Segmentierung 164 des Zellkerns 114 liegt am Ausgang 166 an, und die Daten werden anschließend einer Nachbearbeitung 170 zugeführt. Die Nachbearbeitung 170 kann dabei beispielsweise ein Verschieben des Pfades in Richtung des Zellkerns 114 (Anpassung des Pfades an die Zellkontur) aufweisen und in einem letzten Schritt eine Nachbearbeitung des Zellkerns 114 umfassen. Die Verschiebung des Pfades in Richtung des Zellkerns 114 ist deshalb sinnvoll, da an dem Wegfindungsalgorithmus das Finden des Pfades derart ausgeführt wurde, dass Punkte entlang des Pfades, die außerhalb des Zellplasmas 116 liegen, bevorzugt wurden und demzufolge wird der Pfad 122 eher außerhalb des Zellplasmas 116 als innerhalb des Zellplasmas 116 liegen (es wird nur sehr sel- ten zu einer Verletzung der Zellgrenze bzw. der Zellkontur 110 durch den Pfad 122 kommen) . Die Verschiebung des Pfades in Richtung des Zellkerns 114 kann dabei derart geschehen, dass punktweise der Pfad 122 in Richtung des Zellkerns 114 verschoben wird und zwar solange, bis der Wechsel vom Ab- schnitt 2 des Farbraumes zum Abschnitt 1 des Farbraumes erkennbar wird. Somit wird die durch den Pfad 122 eingeschlossene Fläche solange verkleinert, bis sie der Zellkontur 110 der Zelle weitestgehend entspricht. Bei der abschließenden Nachbearbeitung des Zellkerns 114 werden ins- besondere Kandidatenbildpunkte ki eliminiert, die von der Menge der Kern-Kandidatenbildpunkte Ki, die eindeutig als Zellkern 114 identifizierbar sind, separiert sind (z. B.

isoliert liegende Bildpunkte ki innerhalb des Zellplasmas 116) .

Fig. 3 zeigt einen Schrittzyklus zur Bestimmung eines Para- meters γ, der das Zellplasma 116 parametrisiert . Zum Beispiel kann in dem HSV-Farbmodell das Zellplasma 116 dadurch charakterisiert werden, dass der V-Wert bzw. die V- Komponente im HSV-Modell einen bestimmten Schwellwert überschreitet und dieser Schwellwert entspricht dem Wert γ. Da dieser Wert oft nicht universell gewählt werden kann, wird er iterativ den jeweiligen Bedingungen angepasst und diese Anpassung kann durch einen Schrittzyklus geschehen, wie er in Fig. 3 gezeigt ist. Da der Rand des Zellplasmas 116 durch ein Unterschreiten der V-Komponente im HSV-Modell un- terhalb der Grenze γ signalisiert ist, kann ein geeigneter γ-Wert dadurch festgesetzt werden, dass dieses Unterschreiten der Grenze für mehrere unterschiedliche Pfade eindeutig signalisierbar ist. Dabei wird zunächst in einem Schritt 140 ein Anfangswert γo gewählt und anschließend entlang ei- nes ersten Pfades 120 wird ein erster Rand- Kandidatenbildpunkt P _N durch ein Unterschreiten der Schwelle V = γo ermittelt. Sofern diese Ermittlung in dem Prozessschritt 142 nicht möglich ist, kommt es zu einer Rückkopplung und zwar zu einer Erhöhung des Anfangswerts γo auf einen neuesten Wert γi. Unter Verwendung des Werts γi erfolgt in dem Prozessschritt 142 wiederum eine Abfrage, ob die Ermittlung eines ersten Rand-Kandidatenbildpunktes P _N möglich ist. Sofern es wiederum nicht möglich ist, folgt eine Wiederholung der Prozessschritte, das heißt, eine wei- tere Erhöhung des γ-Wertes und zwar solange bis der erste Rand-Kandidatenbildpunkt P _N ermittelbar ist. Daran anschließend wird entlang eines zweiten Pfades 230 versucht, ein zweiter Rand-Kandidatenbildpunkt P ₀ unter Verwendung des aktuellen Wertes für γ zu ermitteln. Sofern dies nicht möglich ist, wird wiederum von vorne mit einem neuen, erhöhten Wert für γ die Prozedur von Neuem gestartet. Sofern auch der zweite Rand-Kandidatenbildpunkt P ₀ ermittelbar ist, erfolgt in einem dritten Schritt entlang eines dritten

Pfades 240 eine Ermittlung eines dritten Rand- Kandidatenbildpunktes P _s . Wenn dies mit dem aktuellen Wert für γ möglich ist, erfolgt in einem vierten Schritt 178 eine Bestimmung eines vierten Rand-Kandidatenbildpunktes P _w entlang eines vierten Pfades 250. Nur wenn alle vier Rand- Kandidaten-Bildpunkte P _N , P _O/ Psr Pw für einen bestimmten Wert für γ ermittelbar sind, werden die ermittelten Rand- Kandidatenbildpunkte dazu verwendet, um in den Wegfindungs- algorithmus eine Verbindung zwischen den ersten, zweiten, dritten und vierten Rand-Kandidatenbildpunkt P _N , P ₀ , P _S/ P _W zu ermitteln.

Fig. 4 zeigt ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, bei dem das digitale Bild zunächst im RGB- Farbschema und die Bilddaten in einer Vorverarbeitung 160 mittels eines Kuwahara-Filters bearbeitet werden. Anschließend werden die vorverarbeiteten Bilder in das HSV- Farbschema transformiert und es erfolgt eine Kandidatenbe- stimmung für Kern-Kandidatenbildpunkte Ki, die zu dem ZeIl- kern 114 gehören. Daran anschließend wird der Mittelpunkt K ₀ der Kandidatenmenge bestimmt und schließlich in einem Fast-Marching-Algorithmus kann beispielsweise ein erster Rand-Kandidatenbildpunkt P _N bestimmt werden. Wie zuvor beschrieben, ist es vorteilhaft, wenn nur ein Rand- Kandidatenbildpunkt, sondern vier Rand-Kandidatenbildpunkte P _N , Po _/ Ps, Pw entlang vier verschiedener Pfade bestimmt werden, die mittels eines Wegfindungsalgorithmus an die Zellkontur 110 angepasst werden. Anschließend erfolgt die Segmentierung des Zellkerns 114 und die so ermittelten Da- ten werden an dem Ausgang 166 ausgegeben und in eine Nachbearbeitung 170 weiter verbessert. Die Nachbearbeitung 170 kann beispielsweise eine Nachbearbeitung des Zellplasmas 116 umfassen, bei der der Pfad 122 punktweise in Richtung des Zellkerns 114 so lange verschoben wird, bis er den Rand des Zellplasmas 116 erreicht und darüber hinaus kann eine Nachbearbeitung des Kerns 114 mit dem Ziel erfolgen, dass isolierte Punkte eliminiert werden.

Fig. 5 gibt eine schematische Darstellung der Prozessabfolge anhand eines Beispiels. Es ist eine Anzahl von Kern- Kandidatenbildpunkten Ki gezeigt, die eine äußere Begrenzung 114 aufweisen. Ausgehend von einem mittleren Kern- Kandidatenbildpunkt Ko sind vier Pfade eingezeichnet, ein erster Pfad 120 zu dem Punkt P _N , ein zweiter Pfad 230 zu dem Punkt P ₀ , ein dritter Pfad 240 zu dem Punkt P _s und ein vierter Pfad 250 zu dem vierten Rand-Kandidatenbildpunkt P _w . Unter Verwendung des Parameters γ, so wie es in Fig. 3 gezeigt wurde, kann entlang dieser vier Pfade ein überschreiten der Zeilkonturrandkurve 110 festgestellt werden. Das geschieht z. B. für den dritten Pfad 240, von dem mittleren Kern-Kandidatenbildpunkt K ₀ zu dem dritten Rand- Kandidatenbildpunkt P _s bei dem überschreiten des Punktes 270. In analoger Weise erfolgt die Detektierung auch für den ersten Pfad 120, für den zweiten Pfad 230 und für den vierten Pfad 250. Nachdem der erste Rand- Kandidatenbildpunkt P _N , der zweite Rand-Kandidatenbildpunkt Po, der dritte Rand-Kandidatenbildpunkt P ₃ und der vierte Rand-Kandidatenbildpunkt P _w gefunden sind, erfolgt in dem Wegfindungsalgorithmus die Bestimmung des Pfades 122, der alle vier Rand-Kandidatenbildpunkte P _N , P ₀ , P _S und P _w verbindet. Wie zuvor beschrieben, basiert der Wegfindungsalgorithmus auf eine Prozedur, so dass der Pfad 122 vorzugswei- se außerhalb der durch die Zellkontur 110 dargestellten Zelle bzw. Randes des Zellplasmas 116 verläuft. Bei dem Nachbearbeitungsalgorithmus 170 werden u.a. isoliert liegende Kern-Kandidatenbildpunkte ki und k ₂ eliminiert, so dass der Kern durch die Randkurve 114 identifiziert ist. Es sei jedoch hier erwähnt, dass innerhalb einer Zelle auch verschiedene Kerne, die voneinander getrennt sind, vorkommen können. Dies würde jedoch implizieren, dass nicht nur einzelne Kern-Bildpunkte k _x oder k ₂ im Bild erscheinen würden, sondern dass stattdessen weitere „Wolken" oder Gebiete von Bildpunkten auftreten würden.

Fig. 6 gibt eine graphische Darstellung, wie sich ein übergang vom Zellkern 114 zum Zellplasma 116 bzw. vom Zellplas-

ma 116 zum Hintergrund bestimmte Komponenten des Farbraumes sprunghaft verändern können. Es ist dabei die änderung der Farbkomponenten entlang einer Richtung gezeigt, die z.B. von dem mittleren Kern-Kandidatenbildpunkt Ko zu dem vier- ten Rand-Kandidatenbildpunkt P _w führt. Die gestrichelte Linie 114 stellt die Randkurve des Zellkerns 114 und die gestrichelte Linie 110 die Randkurve der Zellkontur (d.h. Randkurve des Zellplasmas 116) dar. Da der Zellkern 114 eine spezifische Farbe bzw. Farbkombination aufweist, kommt es an der Grenzlinie 114 zu einem plötzlichen Wechsel der entsprechenden Farbkomponente, die in dieser Darstellung mit Fi bezeichnet ist. Die Farbkomponente Fi weist jedoch sowohl innerhalb des Zellkerns 114 (rechts der Linie 114) als auch außerhalb des Zellkerns 114 (links der gestrichel- ten Linie 114) gewisse Fluktuationen o _\ , σ ₂ auf, deren Mittelwert sich jedoch deutlich voneinander unterscheiden, beispielsweise um mehr als 30 %.

Das Zellplasma 116 weist eine andere Färbung auf als der Zellkern 114, so dass in dem Gebiet des Zellplasmas 116, das heißt zwischen der gestrichelten Linie 114 und der gestrichelten Linie 110, eine andere Farbkomponente, die hier mit F ₂ bezeichnet ist, einen deutlich überhöhten Wert aufweist. Auch für die weitere Farbkomponente F ₂ kann es in- nerhalb des Zellplasmas 116 als auch außerhalb des Zellplasmas 116 zu Fluktuationen 0 ₃ , 0 ₄ kommen, wobei jedoch Mittelwerte für F ₂ sich innerhalb und außerhalb des Zellplasmas 116 deutlich z.B. um mehr als 30 % voneinander unterscheiden.

Die Einfärbung des Zellkerns 114 als auch des Zellplasmas 116 und des Zellhintergrunds (links der Linie 110) erfolgt dabei durch eine entsprechend gewählte Vorverarbeitung des Blutausstriches und kann von dem gewählten Verfahren abhän- gig sein.

Um die Rand-Kandidatenbildpunkte P _N , P ₀ , P _S und P _w zu identifizieren, wurde ein Wechsel von einem ersten Abschnitt zu

einem zweiten Abschnitt des Farbraumes verwendet und dieser Wechsel entspricht dem deutlichen Abfall der Komponente F ₂ bei der gestrichelten Linie 110. Das heißt, das entsprechend gewählte Verfahren sollte sensitiv für einen plötzli- chen Abfall der Komponente F ₂ sein, nicht jedoch auf einem plötzlichen Anstieg der Komponente F ₂ , wie er beispielsweise bei der Kerngrenzlinie 114 auftritt.

Fig. 7 gibt eine graphische Veranschaulichung des Wegfin- dungsalgorithmus, der verwendet wird, um eine Verbindung zwischen den Randkandidatenbildpunkten P _N , P ₀ , P _S und P _w zu finden. Der Wegfindungsalgorithmus basiert auf einer Kostenfunktion, so dass der bevorzugte Weg durch minimale Kosten ausgezeichnet ist. Fig. 7 gibt eine graphische Darstel- lung für eine solche Kostenfunktion in Form eines Höhenprofils, wobei die Grenze der Zellkontur 110 mit der Linie 110 gekennzeichnet ist und der Wegfindungsalgorithmus den Pfad 122 liefert. Die Kostenfunktion ist dabei derart gewählt, dass ein überschreiten der Linie 110 bestraft wird, so dass das Resultat des Wegfindungsalgorithmus nahezu ausschließlich außerhalb der Linie 110, das heißt außerhalb der Zellkontur, verläuft. Dies geschieht dadurch, dass die Kostenfunktion ab der Linie 110 sehr stark ansteigt, was sich in einer Häufung von Höhenlinien HOi, IIO ₂ , HO ₃ , ..., zeigt. Andererseits sollte der Pfad 122 sich auch nicht zu weit von der Zellkonturlinie 110 entfernen, so dass eine geeignet gewählte Kostenfunktion auch mit zunehmendem Abstand von der Zellkonturgrenzlinie 110 ansteigt. Dies ist durch die Höhenlinien 290i, 29O ₂ und 29O ₃ gegeben.

Der Wegfindungsalgorithmus bestimmt den Pfad 122 möglichst „im Tal", d.h. unter Vermeidung eines überschreitens von möglichst wenigen Höhenlinien. Andererseits wird entlang einer Höhenlinie oder entlang einer Ebene mit gleicher Hö- henlinie der Weg geometrisch minimiert wird und somit weitgehend als eine Gerade verlaufen. Dies ist der Fall für den Pfad 122 von dem Punkt P ₀ bis zu dem Punkt p ₂ , bei dem der Pfad 122 aufgrund des überschreitens der Zellkonturgrenzli-

nie 110 sich plötzlich ändert, so dass das Innere der Zellkonturgrenzlinie 110 sofort wieder verlassen wird. Daran anschließend erfolgt zunächst eine gradlinige Fortführung des Pfades 122, der wegen der leicht ansteigenden Kosten- funktion bei der Höhenlinie 29ü ₂ sich in einem weiten Bogen hin zur Zellkontur 122 fortsetzt. Dieser Wegfindungsalgo- rithmus wird solange fortgesetzt, bis ein geschlossener Weg entsteht, der sich von wenige Ausnahmen abgesehen (wie bei dem Punkt p ₂ zum Beispiel) um die Zellkonturgrenzlinie 110 herum bewegt.

Fig. 8 zeigt vier verschiedene Bilder für vier verschiedene Stadien bei der Ausführung des Algorithmus. Fig. 8a zeigt ein Ausgangsbild und Fig. 8b die Zellkonturverteilung, die mittels eines Fast-Marching-Algorithmus erhalten wurde. In Fig. 8c ist der Pfad 122 als Ergebnis der Wegfindungsalgo- rithmen vor der Nachbearbeitung und Fig. 8d ein modifizierter Pfad 122' als Ergebnis der Nachbearbeitung (d.h. einer punktweisen Verschiebung nach innen) gezeigt.

In Fig. 9 sind vier verschiedene Typen von Leukozyten dargestellt, wobei Segmentierungsergebnisse von Zellkern 114 und Zellplasma 116 (durch die Pfade 122a, 122b. 122c und 122d) gezeigt sind. Fig. 9b zeigt zum Beispiel mehrere Zellkerne, Fig. 9c zeigt ein Beispiel für Monozyten und Fig. 9a ein Zellkern 114, der ein Loch aufweist.

Zusammenfassend kann das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt beschrieben werden. Die Segmentierung von Zellkern 114 und Zellplasma 116 weißer Blutzellen bildet die Grundlage für die Erstellung eines automatischen, bildbasierten Differenzialblutbildes . In einem erfindungsgemäßen Verfahren zur entsprechenden Segmentierung von Leukozyten kann zunächst eine Vorverarbeitung durch ein Kuwahara-Filter vorgenommen und anschließend ein Fast-Marching-Verfahren zu einer Bestimmung der groben Zellumrisse verwendet werden. Um die Zellflächen zu erhalten, kann anschließend ein kürzester Wege-Algorithmus angewendet werden. Die Markierung

des Zellkerns 114 kann z.B. durch eine Schwellenwertoperation erfolgen. Eine Evaluierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mit Hilfe einer repräsentativen Stichprobe erfolgen und mit einer Handsegmentierung auf der Basis von Dice-Koeffizienten sowie der Hausdorff-Distanz verglichen werden.

Insbesondere wird darauf hingewiesen, dass abhängig von den Gegebenheiten das erfindungsgemäße Schema auch in Software implementiert sein kann. Die Implementierung kann auf einem digitalen Speichermedium, insbesondere einer Diskette oder einer CD mit elektronisch auslesbaren Steuersignalen erfolgen, die so mit einem programmierbaren Computersystem zusammenwirken können, dass das entsprechende Verfahren aus- geführt wird. Allgemein besteht die Erfindung somit auch in einem Computerprogrammprodukt mit auf einem maschinenlesbaren Träger gespeicherten Programmcode zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn das Computerprogrammprodukt auf einem Rechner abläuft. In anderen Worten ausge- drückt kann die Erfindung somit als ein Computerprogramm mit einem Programmcode zur Durchführung des Verfahrens realisiert werden, wenn das Computerprogramm auf einem Computer abläuft.