Reaktoren

Beschreibung

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Zustands von Zellen in Reaktoren sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Sie ist insbesondere anwendbar zur Beurteilung der Viabilität und des Kontaminationsgrads von Zellsuspensionen. Vorteilhafte Anwendung findet die Erfindung in der Säugerzellkultur und anderen Kultivierungs- oder Fermentationsprozessen, in denen sich der Anteil der lebenden Zellen an der Gesamtzellkonzentration im Verlauf der Kultivierung ändert oder die ein besonderes Kontaminationsrisiko aufweisen. Auch zur Beurteilung weiterer Zustandsparameter von Zellen kann die Erfindung eingesetzt werden, beispielsweise zur Charakterisierung des Metabolismus.

Die Kultivierung von Zellen in Reaktoren ist ein grundlegender Prozess in vielen Bereichen der chemischen, biologischen, biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie und Forschung. Dabei werden Zellen in einem Nährmedium unter definierten Bedingungen kultiviert, wobei sich das Nährmedium mit den Zellen in einem Reaktor befindet. Zur Überwachung und Steuerung solcher Bioprozesse werden verschiedenste Parameter erhoben, wie die Zelldichte, die Sauerstoffkonzentration, der pH, die Temperatur, und viele mehr. Um eine optimale Ausbeute und eine konstante Qualität des Bioprozesses sicherzustellen, müssen zudem häufig, insbesondere aber nicht ausschließlich im Bereich der Säugerzellkultur, weitere Parameter erhoben werden, die den Zustand der kultivierten Zellen beschreiben. Dabei wird insbesondere überwacht, wie hoch der Anteil der lebenden Zellen an der Gesamtzellzahl ist (Viabilität) und ob die Kultur mit unerwünschten Zellen kontaminiert bzw. infiziert ist.

Während Prozessparameter wie Zelldichte, Sauerstoffkonzentration, pH oder Temperatur bereits automatisiert inline oder online am Reaktor erfasst werden können, erfordert die Bestimmung des Zustands der Zellen zumeist das aufwendige und zeitintensive Ziehen von Proben mit nachfolgender manueller Auswertung, was nachteilig eine geringe Datendichte und damit eine schlechtere Überwachungsqualität sowie ein erhöhtes Kontaminationsrisiko mit sich bringt.

Stand der Technik

Dem Fachmann sind verschiedenste Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung des Zustands von Zellen bekannt, die Proben, welche aus einem Reaktor gezogen wurden, verarbeiten oder anderweitig nutzen oder analysieren. Solche Verfahren sind beispielsweise mikroskopische Verfahren zur Zellzählung und -klassifizierung, Färbemethoden mit anschließender Auswertung im Mikroskop oder Cell-Counter, enzymatische oder immunologische Assays, genomische oder proteomische Untersuchungen sowie Verfahren der Durchflusszytometrie. Nachteilig ist all diesen Verfahren gemein, dass sie die Entnahme einer Probe aus der Zellsuspension im Reaktor erfordern, was aufwendig ist und eine Kontaminationsgefahr birgt.

Bekannt sind weiterhin Verfahren, die über einen durchströmten Sample-Loop oder eine Immersionssonde die oben genannten Verfahren derart optimieren, dass keine Probennahme mehr notwendig ist. Bekannte Verfahren sind beispielsweise die In-Situ- Mikroskopie oder At-Line-Durchflusszytometer. Da jedoch die dabei eingesetzten Messvorrichtungen vergleichsweise groß sind (meist größer als 1000 cm ³ ), sind diese Verfahren nur für entsprechend großvolumige Reaktoren sinnvoll einsetzbar. Daraus ergibt sich nachteilig, dass für die besonders häufig eingesetzten kleineren Reaktoren wie Schüttelkolben, Schüttelflaschen, Mikrotiterplatten, Kulturröhrchen oder Mini- und Mikrobioreaktoren keine Möglichkeit zur probenahmefreien Bestimmung des Zustands von Zellen besteht. Dies ist insbesondere auch nachteilig, weil diese kleineren Reaktoren hoch parallelisierbar sind und daher gerade im Bereich der Prozessentwicklung eingesetzt werden, wo hohe Datendichten von besonderer Wichtigkeit sind.

Bekannt sind zudem die Verfahren der Impedanzspektroskopie. Dabei werden die Zellen mittels mit der Kulturflüssigkeit in Kontakt stehenden Elektroden einem elektrischen Wechselfeld unterschiedlicher Frequenz ausgesetzt. Da intakte Zellen infolge ihrer Zellmembran großen- und frequenzabhängig polarisierbar sind, kann somit zwischen lebenden und toten Zellen unterschieden werden, sodass nur die Lebendzellzahl bestimmt wird. Nachteilig erfordern diese Verfahren jedoch einen direkten elektrischen Kontakt zwischen Elektroden und Kulturflüssigkeit, sodass erstere entweder als invasive Immersionssonden oder aber als in die Reaktorwand integrierte Sonden ausgeführt sein müssen, sodass die üblicherweise eingesetzten Reaktoren nicht mehr nutzbar sind. Auch erlaubt die aus dem Stand der Technik bekannte Impedanzspektroskopie neben der Lebendzellzahl keine weiteren Aussagen über den Zustand der kultivierten Zellen, z.B. hinsichtlich Kontamination oder Metabolismus.

Somit sind keinerlei Verfahren und Vorrichtungen bekannt, die geeignet sind, den Zustand von Zellen in Reaktoren ohne direkten Kontakt mit der Kulturflüssigkeit und ohne die Notwendigkeit zur Probenentnahme zu bestimmen und die gleichzeitig hoch miniaturisierbar und parallelisierbar sind, um größenunabhängig an allen gängigen Reaktoren eingesetzt werden zu können.

Aufgabenstellung

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, mittels dessen ohne die Entnahme von Proben mindestens ein Zustand von Zellen in Reaktoren bestimmt werden kann, ohne dass ein direkter Kontakt zwischen der Kulturflüssigkeit und einem Sensor besteht, bei gleichzeitig hoher Parallelisierbarkeit und Miniaturisierbarkeit der einzusetzenden Verfahren und Vorrichtungen im Vergleich zum Stand der Technik. Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 7; bevorzugte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüche sowie der Beschreibung.

Definitionen

Zur Sicherstellung der Klarheit einiger in der Beschreibung verwendeter Begriffe, werden diese nachfolgend und im Verlauf der Beschreibung definiert und erläutert. Zellen im Sinne der Erfindung sind sämtliche (zumeist durch Membranen) abgegrenzten biologischen oder chemischen Systeme, die Merkmale des Lebens aufweisen, die sich also insbesondere aber nicht ausschließlich auszeichnen durch die Fähigkeit zur Vermehrung oder Zellteilung und durch die Fähigkeit Stoffwechsel und Energiewechsel zu betreiben. Zellen im Sinne der Erfindung sind daher insbesondere aber nicht ausschließlich sämtliche Eukaryoten und Prokaryoten (Bakterien und Archaeen), künstliche bzw. synthetisch erzeugte Zellen, sowie abgegrenzte Systeme, die aus mindestens einer der vorgenannten Zellen hervorgegangen sind. Zellen besitzen Zellstrukturen auf verschiedensten Ebenen molekularer oder makromolekularer Organisation. Als Zellstruktur im Sinne der Erfindung gilt jeder Bestandteil einer Zelle, der sich von mindestens einem anderen Bestandteil der Zelle unterscheidet aufgrund seiner Funktion, Zusammensetzung, Form, Struktur, Lokalisation oder zeitlicher und räumlicher Präsenz. Zellstrukturen im Sinne der Erfindung sind insbesondere aber nicht ausschließlich Biomoleküle (Kohlenhydrate, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Lipide, Nukleinsäuren) und deren Komplexe sowie Zellorganellen und Kompartimente (z.B. Mitochondrien, Kern, Endoplasmatischer Retikulum, Golgi-Apparat, Vesikel, Lysosomen, Vakuolen, Endosomen, Exosomen, Chloroplasten, Membranen, Zellwände, Cytoskelett, Cytoplasma, etc.). Zellstrukturen im Sinne der Erfindung können aber auch andere physikalische, chemische oder biologische Strukturen sein, sofern sie sich innerhalb der äußersten Ausdehnung der Zelle befinden, insbesondere aber nicht ausschließlich phagozytierte Partikel oder Zellstrukturen, andere Zellen, Viren, Phagen, Mykoplasmen und viele mehr.

Sämtliche Eigenschaften von Zellen definieren Zustände von Zellen, deren Bestimmung Teil der Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist. Ein Zustand von Zellen im Sinne der Erfindung beschreibt mindestens eine Eigenschaft, den Zustandsparameter, mindestens einer Zelle zu mindestens einem Zeitpunkt, wobei jeder Zustandsparameter zumindest zwei verschiedene Werte annehmen können muss. Beispiele für Zustände von Zellen sind insbesondere aber nicht ausschließlich die Wachstumsphase, die Zellzyklusphase, die Lebendigkeit oder Viabilität, die Gesundheit, die Infektionsfreiheit, die metabolische Aktivität, die Membranintegrität, die Größe, die Form, die Produktivität, das Alter, die Differenzierung, das Proteom, die Genaktivität, etc., wobei jede Zelle zu jedem Zeitpunkt eine Vielzahl von Zuständen aufweist. Eine Vielzahl der erfindungsgemäßen Zustände umfasst mehrere Eigenschaften der Zelle. Da die Eigenschaften der Zelle und damit ihre Zustände definiert werden durch die Struktur, Form, chemische Zusammensetzung, Lokalisation, Aktivität uvm. der Zellbestandteile oder Zellstrukturen, kann über die Interaktion von Lumineszenzfarbstoffen mit diesen Zellstrukturen auf die durch sie definierten Zustände geschlossen werden. Im Sinne der Erfindung sind Zustände von Zellen aber nicht nur individuell für jede Zelle beschreibbar, sondern auch als Summen oder anderweitige Mischzustände für Populationen von Zellen oder die Gesamtheit aller Zellen in einem Medium oder Reaktor. Im Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung solcher Summenzustände häufig von großer Bedeutung, um die Qualität und Integrität einer Kultivierung von Zellen beurteilen zu können. So beschreibt beispielsweise die Viabilität einer Kultur den Anteil lebender Zellen an der Gesamtzahl aller Zellen im Medium. Erfindungsgemäß lassen sich für nahezu jeden individuellen Zustand einer Zelle auch Summen- oder Mischzustände definieren, die sich insbesondere aber nicht ausschließlich durch Verhältnisse (z.B. Viabilität in Prozent) oder durch Verteilungen (z.B. Größenverteilung) mit zugehörigen Verteilungsparametern (z.B. Erwartungswert, Varianz, Schiefe, Verteilungsfunktion, etc.) beschreiben lassen.

Ein Medium im Sinne der Erfindung ist eine Materiegemisch, das bei der Durchführung von Prozessen mit Zellen (z.B. Kultivierung, Expression, Lagerung, Transport) als Träger für die Zellen fungiert. Medien im Sinne der Erfindung sind häufig Fluide und können unter anderem Nährstoffe, Wachstumsfaktoren, Spurenelemente, Lumineszenzfarbstoffe und Puffer enthalten. Medien werden häufig im Prozess durchmischt, um die Verteilung ihrer Inhaltsstoffe gleichmäßig zu erhalten. Medien im Sinne der Erfindung sind insbesondere aber nicht ausschließlich alle Arten von Wachstums-, Differenzierungs- und Expressionsmedien für die Kultivierung von Zellen und Lagerungsflüssigkeiten.

Ein Reaktor im Sinne der Erfindung ist jedes Behältnis, das mit Zellen oder zellhaltigen Gemischen oder Medien befüllt werden kann und insbesondere aber nicht ausschließlich zur Kultivierung, Aufbewahrung, Aufarbeitung, Abtrennung oder zum Transport von Zellen einsetzbar ist. Reaktoren im Sinne der Erfindung sind insbesondere Rührkesselfermenter, Blasensäulenfermenter, Schüttelkolben, T-Flasks, Mikrotiterplatten, Deep-Well-Plates, Schüttelfässer, Fermentation-Bags, Mehrzweckröhrchen, Serumflaschen und Zellkulturschalen. Reaktoren können gegenüber ihrer Umwelt geschlossen oder offen sein. Reaktoren im Sinne der Erfindung zeichnen sich dadurch aus, dass Licht in sie eingestrahlt werden kann. Dazu können erfindungsgemäße Reaktoren teilweise oder vollständig transparente Wände (mit Transparenz insbesondere im Wellenlängenbereich des zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten Lichtes), Wandabschnitte, Fenster, Ports, Sonden oder Faseranschlüsse aufweisen.

Eine Kontamination im Sinne der Erfindung ist ein Stoff, eine Struktur, eine Zelle oder ein Partikel (z.B. Viren, Phagen, Mykoplasmen, andere Bakterien, Prionen), die das Verhalten oder verschiedene Zustände einer Zelle so beeinflusst, dass sich die Zelle in Anwesenheit der Kontamination anders, und zumeist unerwünscht anders, verhält als in Abwesenheit der Kontamination.

Lumineszenzfarbstoffe im Sinne der Erfindung sind sämtliche Stoffe, Ionen, Moleküle, Makromoleküle oder deren Komplexe, die Lumineszenz zeigen, die sich also in Abhängigkeit ihrer Elektronenstruktur durch mindestens ein Photon in einen angeregten Zustand versetzen lassen und mit einer bestimmten Lebenszeit diesen angeregten Zustand unter Emission mindestens eines Photons wieder verlassen. Lumineszenzfarbstoffe im Sinne der Erfindung sind insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe und Phosphorenszenzfarbstoffe. Die Lumineszenz von Lumineszenzfarbstoffen ist Abhängig von ihrer Umgebung und kann durch Interaktion des Lumineszenzfarbstoffes mit der Umgebung geändert werden, insbesondere aber nicht ausschließlich hinsichtlich der Anregungs- und Emissionsspektren, der Lebenszeit des angeregten Zustands sowie der Polarisation bzw. Polarisationsdrehung des emittierten Lichts. Erfindungsgemäße Lumineszenzfarbstoffe zeigen in Abhängigkeit der Lumineszenz-Lebensdauer und der Interaktion mit ihrer Umgebung eine Lumineszenz-Anisotropie, die insbesondere aber nicht ausschließlich beschreibt, wie stark das emittierte Licht nach Anregung eines Lumineszenzfarbstoffes mit polarisiertem Licht depolarisiert ist. Je höher die Depolarisierung des emittierten Lichtes, umso geringer ist die Lumineszenz-Anisotropie und je höher die Polarisation des emittierten Lichtes, umso höher ist die Lumineszenz- Anisotropie. Die Lumineszenz wird durch geeignete Lichtsensoren erfasst. Im Sinne der Erfindung können Lumineszenzwerte insbesondere aber nicht ausschließlich anhand statischer Intensitätsmessungen oder mittels zeitaufgelöster Verfahren im Frequenz oder Zeitbereich aufgenommen werden. Die dazu notwendigen Verfahren und Modulationstechniken sind dem Fachmann bekannt.

Als Lichtquelle zählt jede Vorrichtung, die dazu geeignet ist, Licht in den Reaktor und/oder das Medium einzustrahlen. Als Lichtquellen im Sinne der Erfindung gelten insbesondere aber nicht ausschließlich LED, OLED, Laser, Glühlampen, Leuchtstoffröhren, Blitzröhren und Kombinationen dieser Lichtquellen mit mindestens einer fluoreszierenden Schicht. Lichtquellen im Sinne der Erfindung können zur Erzeugung von polarisiertem Licht einen variablen oder fixen Polarisator enthalten, mit einem externen variablen oder fixen Polarisator kombiniert werden, oder selbst polarisiertes Licht produzieren. Lichtquellen im Sinne der Erfindung können nur eine Wellenlänge oder einen schmalen Wellenlängenbereich abdecken (Laser, LED, OLED), oder einen breiten Wellenlängenbereich aufweisen. Da für die Lumineszenzerfassung häufig ein schmaler Wellenlängenbereich vorteilhaft ist, können Lichtquellen wellenlängenselektive optische Elemente wie Bandbass- oder Kantenfilter, anderweitige Filter, Monochromatoren, Prismen oder Beugungsgitter enthalten oder mit solchen optischen Elementen kombiniert werden. Lichtquellen weisen ein Sichtfeld auf, welches dem beleuchteten Volumen im Allgemeinen, insbesondere aber dem beleuchteten Volumen des Mediums im Reaktor entspricht. Lichtquellen können mit verschiedenen optischen Elementen kombiniert werden, um das Sichtfeld im Medium zu modifizieren.

Die Wellenlänge von Licht beschreibt im Sinne der Erfindung sowohl definierte Wellenlängenlinien, als auch Wellenlängenbereiche mit zumindest einer, meist aber zwei Grenzen. Beispiele für die Nutzung des Begriffs Wellenlängen im Sinne der Erfindung sind „Laser mit einer Wellenlänge von 532 nm“ oder „Anregungswellenlänge kleiner als Emissionswellenlänge“, wobei letzteres auch mehreren Wellenlängenbereichen entsprechen kann. Die Wellenlänge wird in den Figuren mit dem griechischen Buchstaben Lambda abgekürzt.

Ein Polarisator im Sinne der Erfindung ist jede Vorrichtung, die geeignet ist, Licht zu polarisieren oder nur einen bestimmten Teil des Lichts mit bestimmten Eigenschaften hinsichtlich der Polarisation zu transmittieren oder zu reflektieren. Polarisatoren im Sinne der Erfindung können einzelne polarisierende Elemente oder Anordnungen mehrerer polarisierender Elemente mit gleichen oder unterschiedlichen Polarisationsrichtungen sein.

Der Polarisationswinkel im Sinne der Erfindung ist der Winkel zwischen der Polarisation des polarisierten anregenden Lichts und der Polarisation des polarisierten emittierten Lichts oder polarisierten Streulichts.

Ein Lichtsensor im Sinne der Erfindung ist jede Vorrichtung, die dazu geeignet ist, Licht zu detektieren, indem mindestens eine Eigenschaft des detektierten Lichtes (insbesondere die Intensität) eine elektrische Reaktion des Sensors (z.B. Änderung einer elektrischen Spannung, eines elektrischen Potentials, eines elektrischen Stroms) hervorruft, welche durch weitere elektronische Komponenten (z.B. Analog-Digital- Converter, Operationsverstärker, Komparatoren, Widerstände, Kondensatoren, Prozessoren, Rechner etc.), die Teil des Lichtsensors oder ihm nachgeschaltet sein können, erkannt, ausgelesen, weiterverarbeitet, umgewandelt oder gespeichert werden kann und letztlich die detektierte Eigenschaft des Lichtes als mindestens einen Wert erfasst. Ein Lichtsensor erfasst somit ein direktes oder verarbeitetes bzw. modifiziertes Abbild der elektrischen Reaktion des Sensors zu einer bestimmten Zeit. Als Lichtsensoren im Sinne der Erfindung gelten insbesondere aber nicht ausschließlich einzeln oder als Array oder anderweitige Kombination einzelner Sensoren vorliegende Fotodioden, Fotowiderstände und Fototransistoren, sowie 1 D-CCD-Chips (Zeilensensor), 2D-CCD-Chips, 1 D-CMOS-APS-Chips (Zeilensensor), 2D-CMOS-Chips, Photomultiplierröhren, Silizium-Photomultiplier, Avalanche-Fotodioden, sowie Lichtsensoren mit fluoreszierender Beschichtung (z.B. für UV-Detektion). Die oben genannten elektronischen Komponenten von Lichtsensoren können teilweise zwischen mehreren Sensoren geteilt sein, beispielsweise über geeignete Multiplexer. Lichtsensoren können Polarisatoren oder wellenlängenselektive Optiken enthalten, oder mit ihnen kombiniert werden. Ähnlich wie Lichtquellen weisen auch Lichtsensoren ein Sichtfeld auf und können mit verschiedenen optischen Elementen kombiniert werden, um das Sichtfeld im Medium oder Reaktor zu modifizieren.

Wellenlängenselektive Optiken im Sinne der Erfindung sind all jene optischen Elemente, die die Propagation, insbesondere Transmission, Reflexion und Beugung, von Licht bestimmter Wellenlänge bevorzugen, verhindern oder umlenken. Wellenlängenselektive Optiken im Sinne der Erfindung sind insbesondere aber nicht ausschließlich Filter (Kanten-, Kerb-, Bandpass-, Kurzpass-, Langpassfilter), Prismen, optische Gitter und Spalte sowie Monochromatoren.

Mathematische Verfahren im Sinne der Erfindung sind alle Verfahren, die geeignet sind, Daten und Messwerte, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfasst oder berechnet oder abgeleitet wurden, zu analysieren, zu verarbeiten, zu neuen Werten zu kombinieren, oder Schlüsse aus ihnen zu ziehen. Mathematische Verfahren im Sinne der Erfindung sind insbesondere aber nicht ausschließlich Verfahren der Statistik, der Regressionsanalytik, der Optimierung und der Ausgleichsrechnung, des maschinellen Lernens sowie evolutionäre Algorithmen und neuronale Netze.

Als Anisotropiewert im Sinne der Erfindung gilt jeder Wert oder jede Kombination oder Reihe von Werten, die die Lumineszenz-Anisotropie mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes zu einem bestimmten Zeitpunkt oder in einem bestimmten Zeitraum beschreibt.

Ein Rechner im Sinne der Erfindung ist jede Vorrichtung, die Daten (insbesondere arithmetische und logische) speichern und auf der Grundlage programmierbarer Vorschriften verarbeiten kann. Als Rechner im Sinne der Erfindung gelten insbesondere aber nicht ausschließlich Mikrocontroller, Mikroprozessoren, FPGAs, System-on-a-Chip Rechner (SoC), PCs und Server.

Lösung

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des Zustands von Zellen in Reaktoren, welches den Effekt der Lumineszenz-Anisotropie nutzt, um als optisches Verfahren ohne direkten Kontakt zur Kulturflüssigkeit und mit hohem Minimierungs- und Parallelisierungspotential implementiert zu werden.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt dabei durch ein Verfahren zur Bestimmung des Zustands von Zellen, die in einem Medium kultiviert werden, welches sich in einem Reaktor befindet, wobei sich im Reaktor mindestens ein Lumineszenzfarbstoff befindet, dessen Lumineszenz-Anisotropie abhängig von seinen Umgebungsbedingungen ist und wobei mindestens eine Umgebungsbedingung des Lumineszenzfarbstoffes durch mindestens einen Zustand der Zellen beeinflusst wird. Somit beruht die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe auf der optischen Erfassung der Lumineszenz-Anisotropie mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes als Maß mindestens eines Zustands der Zellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass von mindestens einer Lichtquelle polarisiertes Licht in das Medium eingestrahlt wird und den mindestens einen Lumineszenzfarbstoff zur Lumineszenz anregt und dass das von mindestens einem Lumineszenzfarbstoff emittierte Licht zumindest teilweise das Medium verlässt und von mindestens einem Polarisator polarisiert wird. Weiterhin kennzeichnend ist, dass das so erhaltene polarisierte emittierte Licht durch mindestens einen Lichtsensor erfasst wird und dass das polarisierte emittierte Licht unter mindestens zwei verschiedenen Polarisationswinkeln als mindestens zwei Lumineszenzwerte erfasst wird, aus denen mittels geeigneter mathematischer Verfahren mindestens ein Anisotropiewert ermittelt wird, welcher infolge der Umgebungsabhängigkeit des Lumineszenzfarbstoffes mit mindestens einem Zustand der Zellen korreliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die Abhängigkeit der Lumineszenz-Anisotropie mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes von seinen Umgebungsbedingungen. Dabei verändert sich die Lumineszenz-Anisotropie durch verschiedenste physikalische Prozesse, insbesondere aber nicht ausschließlich durch Diffusion und Rotation des Lumineszenzfarbstoffes, durch verschiedene Arten strahlungsfreien Energietransfers (RET, FRET, etc.) oder durch Strahlungstransfer sowie durch andere, die Elektronenstruktur oder die Molekülbeweglichkeit und Rotationsrate des Lumineszenzfarbstoffes beeinflussende Parameter (z.B. pH, Form, Stabilität und Größe der Hydrathülle, Viskosität des Lösungsmittels, Temperatur, Druck) und Prozesse.

Erfindungsgemäße Lumineszenzfarbstoffe zur Bestimmung mindestens eines Zustands von Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass ihre Lumineszenz-Anisotropie durch mindestens einen Zustand der Zellen beeinflussbar ist. Insofern müssen sich die Umgebungsbedingungen erfindungsgemäßer Lumineszenzfarbstoffe in Abhängigkeit mindestens eines Zustands der Zellen verändern können. Dies wird insbesondere aber nicht ausschließlich erreicht durch die zellzustandsabhängige Interaktion erfindungsgemäßer Lumineszenzfarbstoffe mit mindestens einer Zellstruktur, wie Zellkompartimente oder Zellbestandteile (Proteine, Polysaccharide, Lipide, Nukleinsäuren etc. sowie deren Verbindungen, Komplexe oder abgeleiteter Strukturen). Dies wird aber auch erreicht durch die zellzustandsabhängige Interaktion erfindungsgemäßer Lumineszenzfarbstoffe mit mindestens einer Struktur, die nicht im eigentlichen Sinne Teil der Zelle ist, sich aber innerhalb der Zelle oder des Mediums befindet und damit den Zustand der Zellen beeinflusst. Solche Strukturen, die nicht im eigentlichen Sinne Teil der Zelle sind, sind insbesondere aber nicht ausschließlich Kontaminationen, Bakterien, Viren, Phagen, Prionen, Mykoplasmen, etc.

Erfindungsgemäß ist die Interaktion der mindestens einen Zellstruktur mit dem mindestens einen Lumineszenzfarbstoff abhängig von mindestens einer Eigenschaft dieser Zellstruktur, insbesondere aber nicht ausschließlich vom Vorhandensein, der Konzentration, der Konformation, der Ladung, der Größe und der Lokalisation der Zellstruktur, sowie von deren Erreichbarkeit durch den Lumineszenzfarbstoff. Erfindungsgemäß ergeben sich in Abhängigkeit des Zustands der Zellen Unterschiede hinsichtlich mindestens einer Eigenschaft der mit mindestens einem Lumineszenzfarbstoff interagierenden Zellstruktur, sodass aus der ermittelten Lumineszenz-Anisotropie auf die Interaktion mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes mit mindestens einer Zellstruktur und daraus auf den, die mindestens eine Interaktionseigenschaft der Zellstruktur mit dem Lumineszenzfarbstoff beeinflussenden, Zellzustand geschlossen werden kann.

In einigen Ausführungen der Erfindung erfolgt die zellzustandsabhängige Änderung der Lumineszenz-Anisotropie mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes durch dessen Bindung an mindestens eine Zellstruktur bzw. durch dessen Dissoziation von mindestens einer Zellstruktur. Erfindungsgemäß ändert sich in diesen Ausführungen in Abhängigkeit des Bindungszustands des Lumineszenzfarbstoffes dessen Beweglichkeit, insbesondere aber nicht ausschließlich dessen Diffusions- oder Rotationsrate, und somit seine Lumineszenz-Anisotropie. In einigen Ausführungen der Erfindung erfolgt die zellzustandsabhängige Änderung der Lumineszenz-Anisotropie mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes durch dessen Lokalisation in oder an mindestens einer Zellstruktur, wobei mit der Lokalisation (z.B. Lysosom, Vakuole, Mitochondrien, Zellwand, Zellkern, etc.) unterschiedliche Umgebungsbedingungen einhergehen, insbesondere aber nicht ausschließlich hinsichtlich des pH, des Redoxpotentials, der Ladung, der Polarität, der Viskosität, der lonenstärke oder Lösungsmittelzusammensetzung. Erfindungsgemäß ändert sich in diesen Ausführungen in Abhängigkeit der lokalen Umgebungsbedingungen des Lumineszenzfarbstoffes dessen Beweglichkeit oder Elektronenstruktur, und somit seine Lumineszenz-Anisotropie.

In einigen Ausführungen der Erfindung erfolgt die zellzustandsabhängige Änderung der Lumineszenz-Anisotropie mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes durch Energietransfer auf geeignete benachbarte Zellstrukturen als Akzeptormoleküle. Dieser Energietransfer kann strahlungsfrei (RET/FRET) oder unter Aussendung von Strahlung stattfinden. Da insbesondere strahlungsfreier Energietransfer abhängig ist von der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor, können in solchen Ausführungen Zustände von Zellen bestimmt werden, deren Änderung mit einer Abstandsänderung an mindestens einer Zellstruktur oder zwischen zwei Zellstrukturen oder der Desintegration von Zellstrukturen einhergeht. Erfindungsgemäß ändert sich in diesen Ausführungen in Abhängigkeit der Effizienz des Energietransfers oder der Lebensdauer der angeregten Zustände von Donor oder Akzeptor die Lumineszenz-Anisotropie, wobei sich sowohl die Lumineszenz-Anisotropie des Donors als auch die des Akzeptors ändern kann.

In einigen Ausführungen der Erfindung erfolgt, unabhängig von der Art der Interaktion mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes mit mindestens einer Zellstruktur, die Bestimmung des Zustands der Zellen über die Erreichbarkeit der zur Interaktion notwendigen Zellstruktur. Dies kann in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung insbesondere zur Bestimmung der Integrität von Zellmembranen oder Zellwänden sowie zur Bestimmung des Zustands von Transportproteinen, Kanälen und Endo- bzw. Exozytose-Vorgängen genutzt werden. Erfindungsgemäße Lumineszenzfarbstoffe können intrinsische Moleküle der Zellen sein, die durch diese gebildet, verbraucht oder ausgeschieden werden (z.B. NADH, NADPH, Flavine, aromatische Aminosäuren und deren Derivate, Porphyrine, Pigmente, Fluoreszenzproteine, etc.). Erfindungsgemäße Lumineszenzfarbstoffe können auch extern zugegebene Moleküle sein (z.B. Neutralrot, Methylenblau, Toluidinblau, DAPI, Trypanblau, etc.). Diese können Bestandteil des Mediums sein oder bei Bedarf zugegeben werden.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird die Lumineszenz-Anisotropie eines Lumineszenzfarbstoffes durch nur einen Zustand der Zellen beeinflusst, sodass über die Quantifikation der Lumineszenz-Anisotropie direkt der Zustand der Zellen quantifiziert werden kann.

Um deutliche Unterschiede in der Lumineszenz-Anisotropie eines interagierenden und eines nicht interagierenden Lumineszenzfarbstoffes detektieren zu können, ist, je nach Auflösung und Sensitivität der erfindungsgemäßen Vorrichtung, in einigen Ausgestaltungen der Erfindung die Lebenszeit oder Zeitkonstante der Lumineszenz kleiner als die Korrelationszeit oder Korrelationskonstante des interagierenden Lumineszenzfarbstoffes und größer als die Korrelationszeit oder Korrelationskonstante des nicht interagierenden Lumineszenzfarbstoffes. In anderen Ausführungen der Erfindung ist zum gleichen Zweck die Korrelationszeit oder Korrelationskonstante des interagierenden Lumineszenzfarbstoffes bis zu 10fach, bis zu 100fach, bis zu 1000fach oder mehr als 1000fach größer als die Korrelationszeit oder Korrelationskonstante des nicht interagierenden Lumineszenzfarbstoffes.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Lumineszenz- Anisotropie als ratiometrischer Anisotropiewert über die Erfassung der polarisierten emittierten Strahlung für mehrere, mindestens aber zwei unterschiedliche Polarisationswinkel. Vorteilhaft können durch Verwendung ratiometrischer Anisotropiewerte nachteilige Phänomene wie Photobleaching, Metabolisierung, Neubildung oder Zerfall von Lumineszenzfarbstoffen vermieden werden.

Erfindungsgemäß erfolgt die Berechnung mindestens eines Anisotropiewertes aus mindestens zwei Lumineszenzwerten mittels geeigneter mathematischer Verfahren auf mindestens einem Rechner.

In einigen Ausführungen der Erfindung wird zur Einstellung mindestens zweier unterschiedlicher Polarisationswinkel die Polarisation des anregenden Lichtes konstant gehalten und das emittierte Licht durch mindestens einen Polarisator zwischen dem Medium und mindestens einem Lichtsensor polarisiert, wobei die unterschiedlichen Polarisationswinkel durch den mindestens einen Polarisator oder aber durch mehrere Polarisatoren in Kombination mit einem oder mehreren Lichtsensoren eingestellt werden. In einigen anderen Ausführungen der Erfindung erfolgt zur Einstellung mindestens zweier unterschiedlicher Polarisationswinkel die Erfassung der Lichts durch mindestens einen Lichtsensor unter konstanter Polarisation, während die Polarisation des anregenden Lichtes verändert wird, beispielsweise durch mindestens einen variablen Polarisatoren vor mindestens einer Lichtquelle oder durch mehrere Lichtquellen mit fixen integrierten oder externen Polarisatoren unterschiedlicher Anordnung oder durch polarisiertes Licht abstrahlende Lichtquellen mit polarisationsdrehender Optik (bspw. durch Verzögerungsplatten wie l/2-Platten).

In einigen Ausführungen der Erfindung kommen mehrere, mindestens aber zwei Lumineszenzfarbstoffe zum Einsatz, um gleichzeitig oder sequentiell verschiedene Zustände von Zellen bestimmen zu können (z.B. Viabilität, metabolische Aktivität, Wachstumsphase, Kontamination, etc.). Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung der Anisotropiewerte dann vorteilhaft bei verschiedenen Anregungs- oder Emissionswellenlängen.

In einigen Ausführungen der Erfindung kommen mehrere, mindestens aber zwei Lumineszenzfarbstoffe zum Einsatz, die zur komplementären Bestimmung desselben Zustands eingesetzt werden (z.B. Bestimmung der Viabilität über Bestimmung der lebenden Zellen mit einem und der toten Zellen mit einem anderen Lumineszenzfarbstoff). Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung der Anisotropiewerte dann vorteilhaft bei verschiedenen Anregungs- oder Emissionswellenlängen.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung strahlt während der Erfassung mindestens eines Lumineszenzwertes keine Lichtquelle Licht in das Medium, das dieselbe Wellenlänge aufweist wie das von mindestens einem Lumineszenzfarbstoff emittierte Licht. In einigen Ausführungen der Erfindung wird dies erreicht durch Lichtquellen mit passender Wellenlängencharakteristik (Laser, LED). In anderen Ausführungen wird dies erreicht durch Kombination mindestens einer Lichtquelle mit mindestens einer wellenlängenselektiven Optik, die vorteilhaft nur Licht der für die Anregung des Lumineszenzfarbstoffes erforderlichen Wellenlänge in das Medium einstrahlt.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung befindet sich im Strahlengang zwischen Medium und mindestens einem Lichtsensor mindestens eine wellenlängenselektive Optik, die sicherstellt, dass von dem ihr zugeordneten Lichtsensor nur solches Licht detektiert wird, dass die korrekte Wellenlänge aufweist. So sind in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung insbesondere Lichtsensoren zur Detektion von aus Lumineszenzvorgängen emittiertem Licht derart eingerichtet und mit einer wellenlängenselektiven Optik versehen, dass sie ausschließlich oder zumindest überwiegend das emittierte Licht und kein anderes Licht, wie bspw. Anregungslicht oder Umgebungslicht erfassen. Ähnliches gilt für Sensoren zur Streulichterfassung von anregendem und emittiertem Licht.

In einigen Ausführungen der Erfindung ist ein bestimmter Anteil mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes mittels geeigneter Verfahren in einem definierten Zustand und somit mit unveränderlicher Lumineszenz-Anisotropie fixiert, um als Referenzgröße zu fungieren, auf die Änderungen der Lumineszenz-Anisotropie bezogen werden können. In einigen Ausführungen der Erfindung sind solche Referenzen in Patches innerhalb des Reaktors fest lokalisiert (z.B. durch Einbettung in ein Gel oder einen Kunststoff) und werden über einen eigenen Referenzkanal aus Lichtquelle, Polarisator und Lichtsensor ausgewertet.

In einigen Ausführungen der Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den Einsatz von Monochromatoren, Filtern, Gittern, oder anderen wellenlängenselektiven Optiken, um das Anregungslicht und das Emissionslicht für jeden Lumineszenzfarbstoff zu separieren. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung erzeugen die Polarisatoren linear polarisiertes Licht.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung befinden sich sämtliche optischen Komponenten, sowie Sensoren, Lichtquellen und Rechner außerhalb des Reaktors. In anderen Ausführungen können sich diese aber auch, gegebenenfalls mit geeigneter Ummantelung und optischen Fenstern, innerhalb des Reaktors befinden oder als Immersionssonden in das Medium eingetaucht werden.

In einigen Ausführungen der Erfindung kann Streuung sowohl des polarisierten anregenden Lichtes als auch des emittierten Lichtes die Bestimmung des Anisotropiewertes beeinflussen oder verfälschen. Um dem entgegenzuwirken und Streulichtartefakte mittels geeigneter mathematischer Verfahren zu korrigieren, umfasst das erfindungsgemäße Verfahren in einigen Ausführungen die Aufnahme von Streulichtwerten, insbesondere unter den gleichen Polarisationswinkeln wie bei der Erfassung der Lumineszenzwerte sowie insbesondere bei den für den jeweiligen Lumineszenzfarbstoff eingesetzten Anregungs- und Emissionswellenlängen.

In einigen Ausführungen der Erfindung sind mindestens eine Lichtquelle und mindestens ein Lichtsensor derart angeordnet, dass das Zellen enthaltende Volumen im gemeinsamen Sichtfeld des mindestens einen Lichtsensors und der mindestens einen Lichtquelle so gering ist, dass die Streuung von Licht innerhalb dieses Sichtfeldes sehr unwahrscheinlich ist und somit der Einfluss von Lichtstreuung auf die ermittelten Anisotropiewerte minimiert oder eliminiert wird. Erfindungsgemäß muss dieses Volumen im gemeinsamen Sichtfeld mindestens eines Lichtsensors und mindestens einer Lichtquelle mit steigender Zelldichte kleiner ausfallen, um effizient die Streuung an den Zellen oder Zellstrukturen zu unterbinden. In einigen Ausführungen der Erfindung ist das gemeinsame Sichtfeld mindestens eines Lichtsensors und mindestens einer Lichtquelle daher durch geeignete optische oder optomechanische Vorrichtungen variabel einstellbar. In einigen anderen Ausführungen der Erfindung ist das gemeinsame Sichtfeld mindestens eines Lichtsensors und mindestens einer Lichtquelle daher so ausgelegt, dass bis zu einer bekannten maximalen Zelldichte im Medium keine oder nur geringe und für die Anisotropie-Erfassung akzeptable Streueffekte auftreten. In einigen anderen Ausführungen der Erfindung können Streueffekte in Abhängigkeit der Zelldichte durch Kombination verschiedener Lichtquellen und Lichtsensoren zu mindestens einem Lichtquelle-Lichtsensor-Paar unterbunden werden. Dabei sind verschiedene Lichtquellen und Lichtsensoren derart angeordnet, dass sich durch Kombination mindestens einer Lichtquelle und mindestens eines Lichtsensors verschieden große gemeinsame Sichtfelder ergeben, sodass sich vorteilhaft ein Optimum zwischen minimalem Streulicht und maximaler Lumineszenzintensität erreichen lässt. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird auch die Zelldichte erfasst, um den Einfluss von Streueffekten einschätzen zu können und abhängig davon optimale Lichtquelle-Lichtsensor- Kombinationen zu erzeugen. Zur Zelldichtebestimmung sind dem Fachmann verschiedenste Verfahren und Vorrichtungen bekannt. In einigen Ausführungen der Erfindung werden Lumineszenzwerte desselben Lumineszenzfarbstoffes durch mehrere Lichtquelle-Lichtsensor-Paare mit unterschiedlichen Sichtfeldern parallel erfasst, um dann mittels geeigneter mathematischer Verfahren den Einfluss von Lichtstreuung zu detektieren und in der Berechnung des Anisotropiewertes zu minimieren oder zu eliminieren.

In einigen Ausführungen der Erfindung wird das anregende oder emittierte Licht durch faseroptische Komponenten, Lichtleiter oder andere optische Elemente wie Linsen, Blenden, Spalte, Prismen oder Spiegel gelenkt oder anderweitig beeinflusst, insbesondere aber nicht ausschließlich um optimale Sichtfeldgeometrien, Sichtfeldpositionen oder Sichtfeldanordnungen für Lichtsensoren oder Lichtquellen zu erzielen.

In einigen Ausführungen der Erfindung sind einige oder sämtliche Bestandteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die im Strahlengang des anregenden oder emittierten Lichtes liegen, derart vergütet oder anderweitig dazu eingerichtet, angefertigt oder beschaffen, dass in ihnen oder an ihnen und der sie umgebenden Materie keine oder nur eine äußerst geringe Lichtstreuung im Bereich der eingesetzten Wellenlängen stattfindet.

In einigen Ausführungen der Erfindung befinden sich die Polarisatoren der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Kontakt mit dem Medium, sodass abgesehen von Streueffekten innerhalb des Mediums und der Zellen keine weiteren Streueffekte die Erfassung der Lumineszenzwerte oder der Streulichtwerte beeinflussen. In einigen Ausführungen der Erfindung sind die Polarisatoren der erfindungsgemäßen Vorrichtung dazu in die Wand des Reaktors integriert.

Erfindungsgemäß kann die Erfassung des emittierten Lichts unter mehreren, mindestens aber zwei unterschiedlichen Polarisationswinkeln sowohl parallel als auch sequentiell erfolgen. Ausführungen zur parallelen Erfassung des emittierten Lichts unter mindestens zwei unterschiedlichen Polarisationswinkeln umfassen in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung für jeden zu erfassenden Polarisationswinkel mindestens einen Polarisator mit zugehörigem Lichtsensor. Vorteilhaft lassen sich solche Verfahren in erfindungsgemäßen Vorrichtungen ohne den Einsatz beweglicher Komponenten implementieren, was insbesondere in harschen industriellen, geschüttelten oder vibrierenden Applikationen wünschenswert ist. Ausführungen zur sequentiellen Erfassung des emittierten Lichts unter mindestens zwei unterschiedlichen Polarisationswinkeln umfassen zumindest einen variablen Polarisator und mindestens einen Lichtsensor.

In einigen Ausführungen der Erfindung kann die Erfassung des emittierten Lichts bei mehreren Anregungs- und/oder Emissionswellenlängen erfolgen. Dies kann sowohl parallel als auch sequentiell durchgeführt werden. Ausführungen zur parallelen Erfassung des emittierten Lichts unter mindestens zwei unterschiedlichen Polarisationswinkeln umfassen in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung für jeden zu erfassenden Polarisationswinkel mindestens einen Polarisator mit zugehörigem Lichtsensor. Vorteilhaft lassen sich solche Verfahren in erfindungsgemäßen Vorrichtungen ohne den Einsatz beweglicher Komponenten implementieren, was insbesondere in harschen industriellen, geschüttelten oder vibrierenden Applikationen wünschenswert ist. Ausführungen zur sequentiellen Erfassung des emittierten Lichts unter mindestens zwei unterschiedlichen Polarisationswinkeln umfassen zumindest einen variablen Polarisator und mindestens einen Lichtsensor.

In einigen Ausführungen der Erfindung werden für einen Lumineszenzfarbstoff mehrere Anisotropiewerte bei verschiedenen Anregungs- und/oder Emissionswellenlängen erfasst. Dies kann insbesondere aber nicht ausschließlich zur Verbesserung der Auflösung von Zellzuständen, zur Erhöhung der Robustheit der Zustandsbestimmung sowie zur Bestimmung mehrerer Zustände über denselben Lumineszenzfarbstoff eingesetzt werden.

In einigen Ausführungen der Erfindung, insbesondere bei Verfahren mit kontinuierlichem Schüttelbetrieb, erfolgt die Erfassung der Lumineszenzwerte vorteilhaft mit einer Frequenz, die größer ist als die Schüttelfrequenz, um den Einfluss verschiedener Flüssigkeitsverteilungen des Mediums im Reaktor kompensieren zu können. Zur Kompensation und Anpassung optischer Messungen an dynamische Fluidsysteme sind dem Fachmann verschiedenste Verfahren und Vorrichtungen bekannt.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung für dynamische Fluidsysteme, insbesondere aber nicht ausschließlich für kontinuierlich durchmischte Reaktoren, werden sämtliche Lumineszenzwerte oder sämtliche Lumineszenzwerte und Streulichtwerte unter den jeweils erfindungsgemäß vorgesehenen Polarisationswinkeln parallel erfasst. Dies ermöglicht, insbesondere für die Bestimmung ratiometrischer Anisotropiewerte, den Einsatz längerer Integrationszeiten, die auch die Detektion niedrig konzentrierter Lumineszenzfarbstoffe erlauben. Sofern sämtliche Lumineszenzmessungen ratiometrisch parallel durchgeführt werden, ändert sich das Verhältnis der einzelnen Lumineszenzwerte nicht, auch wenn sich beispielsweise durch periodische Schwankungen der Flüssigkeitshöhe im Schüttelbetrieb die absoluten Lumineszenzwerte permanent ändern.

In einigen Ausführungen der Erfindung kommen zum Zweck der Umgebungslichtkompensation gepulste oder anderweitig modulierte Lichtquellen zum Einsatz, sodass durch geeignete Signalprozessierung der Lumineszenz- und Streulichtwerte der Einfluss von Umgebungslicht auf die ermittelten Anisotropiewerte minimiert oder eliminiert werden kann.

In einigen Ausführungen der Erfindung wird zu jeder Messung die Temperatur des Mediums erfasst, um Einflüsse der Temperatur insbesondere auf die Rotations- und Diffusionsrate der erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffe mittels geeigneter mathematischer Verfahren korrigieren zu können. Erfindungsgemäß werden einzelne Anisotropiewerte zu Zeitreihen zusammengefasst, die über den gesamten Verlauf einer Kultivierung oder anderweitigen Prozessierung von Zellen Auskunft über den zu bestimmenden Zustand oder die zu bestimmenden Zustände geben und dem Anwender des erfindungsgemäßen Verfahrens Rückschlüsse auf das biologisch Geschehen während der Kultivierung sowie nachfolgende Prozessoptimierung erlauben.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der Figuren und Ausführungsbeispiele näher erläutert. Auf Bezugszeichen in den Figuren, welche Komponenten der Erfindung bezeichnen, die bereits in der gleichen Figur oder aber in einer anderen Figur unter gleichen Umständen oder gleicher Darstellung verwendet wurden, wird teilweise verzichtet, um die Klarheit und Übersichtlichkeit der Figuren zu erhalten. Graphische Elemente ohne Bezugszeichen sind daher unter Beachtung der Bezugszeichenliste, der anderen Figuren, der bezeichneten Darstellungen innerhalb derselben Figur, der Musterung oder Strukturierung bereits bezeichneter graphischer Elemente sowie unter Flinzuziehung der gesamten Beschreibung und der Ansprüche zu interpretieren.

Ausführungsbeispiele und Figuren

Figur 1 , eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Figur 2, eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes mit einer Zellstruktur zur Bestimmung des Zustands einer Zelle.

Figur 3, eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes zur Bestimmung des Anteils lebender Zellen.

Figur 4, eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes zur Bestimmung des Anteils toter Zellen.

Figur 5, eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes zur Bestimmung des Anteils infizierter Zellen. Figur 6, eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes zur Bestimmung des Anteils infizierter und toter Zellen.

Figur 7, eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Streulichterfassung.

Figur 8, eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mehreren Lichtquellen und Lichtsensoren.

Figur 9, eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mehreren Lichtquellen und Lichtsensoren und mit Polarisatoren, die mit dem Medium in Kontakt stehen.

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens. In einem mit Medium 2 befüllten Reaktor 3 werden Zellen 1 kultiviert, deren Zustand mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden soll. Diese Zustandsbestimmung erfolgt über die Interaktion mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes 5 mit einer Zellstruktur 1.1, wobei diese Interaktion zu einer Änderung der Umgebungsbedingungen und somit zu einer Änderung der Lumineszenz-Anisotropie des Lumineszenzfarbstoffes 5 führt. Dies ist in Figur 1 dargestellt als interagierender Lumineszenzfarbstoff 5.1, der infolge der Interaktion mit der Zellstruktur 1.1 eine hohe Lumineszenz-Anisotropie aufweist (parallele Füllung), sowie als nicht interagierender Lumineszenzfarbstoff 5.2, der infolge der fehlenden Interaktion eine geringere Lumineszenz-Anisotropie aufweist (gewellte Füllung).

Wie in Figur 1 dargestellt, ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass von mindestens einer Lichtquelle 6 polarisiertes Licht 7 in den Reaktor 3 und das Medium 2 eingestrahlt wird, wo es Moleküle des Lumineszenzfarbstoff 5 zur Lumineszenz anregt. Die angeregten Moleküle des Lumineszenzfarbstoffes 5 emittieren daraufhin Licht 8, welches in Abhängigkeit der Anteile des interagierenden Lumineszenzfarbstoffes 5.1 und des freien Lumineszenzfarbstoffes 5.2 eine bestimmte Anisotropie hinsichtlich der Intensitätsverteilung in den verschiedenen Polarisationsebenen aufweist. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist die Wellenlänge des polarisierten anregenden Lichtes 7 kleiner als die des emittierten Lichtes 8. Erfindungsgemäß verlässt zumindest ein Teil des emittierten Lichts 8 das Medium 2, sowie wie in Figur 1 als vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung dargestellt auch den Reaktor 3 und wird durch mindestens einen Polarisator 9 polarisiert. Das derart erhaltene polarisierte emittierte Licht 10 wird durch mindestens einen Lichtsensor 11 als Lumineszenzwert 12 erfasst. Erfindungsgemäß werden mindestens zwei Lumineszenzwerte 12.1 und 12.2 erfasst, die sich hinsichtlich der Polarisationswinkel des polarisierten emittierten Lichtes 10.1 und 10.2 unterscheiden. Dazu erlaubt der erfindungsgemäße Polarisator 9 die Polarisierung von Licht unter mindestens zwei unterschiedlichen Polarisationswinkeln (dargestellt als horizontale bzw. vertikale Füllung) und kann insbesondere aber nicht ausschließlich sowohl als variabler Polarisator 9 oder als dedizierte Anordnung unterschiedlich ausgerichteter Einzelpolarisatoren 9 ausgeführt sein. Erfindungsgemäß werden die mindestens zwei unter verschiedenen Polarisationswinkeln erfassten Lumineszenzwerte 12.1 und 12.2 mittels geeigneter mathematischer Verfahren 13 zu mindestens einem Anisotropiewert 14 verrechnet, welcher infolge der interaktionsabhängigen Lumineszenz-Anisotropie des mindestens einen Lumineszenzfarbstoffes 5 mit mindestens einem Zustand der Zellen 1 korreliert und somit die Bestimmung ebendieses Zustands der Zellen 1 erlaubt.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung werden solche Verhältnisse zwischen den Wellenlängen l der verschiedenen Lichtfraktionen wie in Figur 1 abgebildet, genutzt. Diese werden je nach Ausführungsform durch geeignete wellenlängenselektive Optiken 23, insbesondere aber nicht ausschließlich durch optische Filter, Monochromatoren, Prismen, Gitter oder durch vollständige oder teilweise spektrale Scans voneinander soweit erforderlich separiert (siehe dazu auch Figuren 8 und 9).

Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes 5 mit einer Zellstruktur 1.1 zur Bestimmung des Zustands von Zellen 1. Exemplarisch zeigt Figur 2 dabei ein Verfahren zur Bestimmung des Anteils lebender Zellen bzw. der Viabilität. In einem mit Medium 2 befüllten Reaktor 3 werden Zellen 1 kultiviert. Die Zellen weisen in lebendem Zustand mindestens eine Zellstruktur 1.1 (insbesondere aber nicht ausschließlich Proteine, z.B. Enzyme mit NADH oder NADPH als Co-Faktor/Substrat/Produkt) auf, mit der mindestens ein Lumineszenzfarbstoff s interagieren kann (insbesondere aber nicht ausschließlich durch Bindung). In Figur 2 ist exemplarisch ein intrinsischer Lumineszenzfarbstoff s dargestellt (z.B. NADH, NADPH), der im Zellinneren lebender Zellen 1 (links oben) gebildet wird und infolge seiner Ladung lebende Zellen 1 mit intakter Zellmembran nicht verlassen kann. Die intakte Zellmembran stellt dabei ebenfalls eine Zellstruktur 1.3 dar, die an der erfindungsgemäßen Zustandsbestimmung der Zellen 1 beteiligt sein kann, weil sie die Lokalisation des Lumineszenzfarbstoffes 5 definiert und begrenzt. Ändert sich der Zustand einer Zelle 1 von lebend zu tot (rechts unten), so desintegriert die Zellmembran (gestrichelte Umrandung) und wird zu einer für den Lumineszenzfarbstoff 5 permeablen Zellstruktur 1.2. Weiterhin besteht im Ausführungsbeispiel von Figur 2 für tote Zellen 1 keine Interaktion mehr zwischen dem Lumineszenzfarbstoff 5 und der Zellstruktur 1.1, insbesondere aber nicht ausschließlich, weil der Lumineszenzfarbstoff 5 von der Zellstruktur 1.1 dissoziiert und durch die desintegrierte Zellmembran 1.2 ins Medium 2 diffundiert oder weil die Zellstruktur 1.1 in toten Zellen 1 nicht mehr vorhanden oder denaturiert ist. Dadurch ist es unter Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, den Zustand der Zellen 1 bestimmen.

In Figur 2 zeigt der mit der Zellstruktur 1.1 interagierende Lumineszenzfarbstoff 5.1 eine hohe Lumineszenz-Anisotropie, wohingegen der freie Lumineszenzfarbstoff 5.2 eine geringere Lumineszenz-Anisotropie aufweist. Dies ist in Figur 2, Diagramm A dargestellt als Lumineszenzwert 12 in Abhängigkeit des Polarisationswinkels. Die interagierende Form des Lumineszenzfarbstoffes 5.1 weist dabei hohe Lumineszenzwerte 12 bei geringen Polarisationswinkeln und deutlich geringere Lumineszenzwerte 12 bei größeren Polarisationswinkeln auf. Im Gegensatz dazu sind die Lumineszenzwerte 12 des freien Lumineszenzfarbstoffes 5.2 deutlich gleichmäßiger über die verschiedenen Polarisationswinkel verteilt.

Befindet sich nun gemäß dem in Figur 2 dargestellten Beispiel im Reaktor 3 ein Gemisch aus lebenden und toten Zellen 1, so ergeben sich aus der interaktionsabhängigen Lumineszenz-Anisotropie des Lumineszenzfarbstoffes 5 in Abhängigkeit des Anteils lebender Zellen 1 die in Figur 2, Diagramm B dargestellten gemischten Lumineszenzwerte 12 bei den dargestellten Polarisationswinkeln. Die erfindungsgemäße Erfassung mindestens zweier Lumineszenzwerte 12.1 und 12.2 bei unterschiedlichen Polarisationswinkeln erlaubt somit eine Beurteilung der Lumineszenz-Anisotropie. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung werden dabei die Lumineszenzwerte 12.1 und 12.2 bevorzugt bei solchen Polarisationswinkeln gemessen, bei denen der Unterschied der Lumineszenz-Anisotropie der interagierenden Form des Lumineszenzfarbstoffes 5.1 und der freien Form des Lumineszenzfarbstoffes 5.2 besonders stark ausgeprägt ist. Eine solche Auswahl der Polarisationswinkel ist in Figur 2, Diagramm B für die Lumineszenzwerte 12.1 und 12.2 mit Pfeilen markiert. Insbesondere ist bei Hinzuziehung von Figur 2, Diagramm A deutlich der Unterschied der Lumineszenz-Anisotropien zu erkennen, da bei 0° Polarisationswinkel der Lumineszenzwert für den interagierenden Lumineszenzfarbstoff 5.1 deutlich höher liegt als der des freien Lumineszenzfarbstoffes 5.2. Bei 40° Polarisationswinkel sind diese Verhältnisse genau umgekehrt.

Erfindungsgemäß wird nun aus den mindestens zwei bei verschiedenen Polarisationswinkeln aufgenommenen Lumineszenzwerten 12.1 und 12.2 mittels geeigneter mathematischer Verfahren 13 mindestens ein Anisotropiewert 14 errechnet. Dies ist exemplarisch in Figur 2, Diagramm C für die in Figur 2, Diagramm B eingezeichneten Lumineszenzwerte 12.1 und 12.2 dargestellt. Von den vielen geeigneten mathematischen Verfahren 13 zeigt Figur 2, Diagramm C die Subtraktion des Lumineszenzwertes 12.2 vom Lumineszenzwert 12.1 sowie die Division des Lumineszenzwertes 12.1 durch den Lumineszenzwert 12.2. Damit ergibt die Subtraktion eine Differenz als Anisotropiewert 14 und die Division einen Quotient als Anisotropiewert 14. Diese sind in Figur 2, Diagramm C gegen den Anteil des interagierenden Lumineszenzfarbstoffes 5.1 aufgetragen. Da dieser Anteil infolge der zellzustandsabhängigen Interaktion mit dem Zustand der Zellen 1 korreliert, zeigt sich hier deutlich, dass die erfindungsgemäß ermittelten Anisotropiewerte 14 zur Bestimmung des Zustands von Zellen 1 genutzt werden können.

Die Figuren 3 bis 6 zeigen schematische Darstellungen der Interaktion mindestens eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes 5 zur Bestimmung verschiedener Zustände von Zellen 1. In einem Reaktor 3 werden in dem in ihm enthaltenen Medium 2 Zellen 1 kultiviert, für die erfindungsgemäß jeweils mindestens ein Zustand über mindestens einen Anisotropiewert 14 zu bestimmen ist, der über die Interaktion mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes 5 mit mindestens einer Zellstruktur 1.1 bis 1.3 mit dem zu bestimmenden Zustand korreliert. In den vorgenannten Figuren ist dazu jeweils links die erfindungsgemäße Interaktion mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes 5 schematisch dargestellt, während rechts die Korrelation zwischen dem zu bestimmenden Zustand (auf der X-Achse) und dem mindestens einen erfindungsgemäß erfassten Anisotropiewert 14 (auf der Y-Achse) mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes 5 exemplarisch abgebildet wird.

Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes 5 zur Bestimmung des Anteils lebender Zellen 1. Der dabei eingesetzte Lumineszenzfarbstoff 5 zeigt bei Interaktion mit der Zellstruktur 1.1 eine erhöhte Lumineszenz-Anisotropie. Zur Bestimmung des Anteils lebender Zellen 1 interagiert der Lumineszenzfarbstoff s mit der Zellstruktur 1.1, die nur in lebenden Zellen 1 vorhanden ist. Zudem reichert sich der Lumineszenzfarbstoff s in lebenden Zellen 1 an, da diese von mindestens einer intakten Zellmembran als Zellstruktur 1.3 umgeben sind. Sterben die Zellen 1, so wird die Zellmembran zur permeablen Zellstruktur 1.2, sodass der Lumineszenzfarbstoff 5 aus toten Zellen 1 herausdiffundiert und sich dort abreichert, sowie gegebenenfalls und je nach Lage des Interaktionsgleichgewichts von der möglicherweise noch vorhandenen Zellstruktur 1.1 dissoziiert. Daraus ergibt sich die rechts dargestellte Korrelation zwischen dem Anteil lebender Zellen 1 und dem Anisotropiewert 14. Je mehr mit Lumineszenzfarbstoff 5 angereicherte und über Zellstruktur 1.1 mit ihm interagierende lebende Zellen 1 vorhanden sind im Vergleich zu nicht interagierenden toten Zellen 1, umso höher ist der Anisotropiewert 14. Insofern steigt der Anisotropiewert 14 mit dem Anteil lebender Zellen 1 im Medium 2. In einigen Ausgestaltungen der Erfindung wird der Anisotropiewert 14 in einen prozentualen Viabilitätswert umgerechnet. Beispiele für sich in lebenden Zellen 1 anreichernde Lumineszenzfarbstoffe sind NADH/NADPH oder Neutralrot, wobei erstere durch die lebende Zelle selbst gebildet werden, wogegen letzterer von außerhalb der Zelle ungeladen über die Zellmembran diffundiert und dann in sauren Kompartimenten als „lonenfalle“ in geladenem Zustand angereichert wird. Exemplarische Zellstrukturen 1.1 zur Interaktion mit NADH oder NADPH sind Enzyme. Exemplarische Zellstrukturen 1.1 zur Interaktion mit Neutralrot sind Lysosomen, Endosomen sowie deren Membranen oder Membranbestandteile. Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes 5 zur Bestimmung des Anteils toter Zellen 1. Der dabei eingesetzte Lumineszenzfarbstoff 5 zeigt bei Interaktion mit der Zellstruktur 1.1 eine erhöhte Lumineszenz-Anisotropie. Im Gegensatz zur in Figur 3 dargestellten Ausführung liegt der Lumineszenzfarbstoff 5 jedoch zunächst nur im Medium 2 vor und kann, insbesondere aber nicht ausschließlich aufgrund seiner Ladung, nicht über die Zellmembran 1.2 in lebende Zellen 1 gelangen, um dort mit der Zellstruktur 1.1 zu interagieren. Da aber tote Zellen 1 eine löchrige und somit für den Lumineszenzfarbstoff 5 permeable Membran 1.2 aufweisen, kann er in die toten Zellen 1 gelangen und dort mit der Zellstruktur 1.1 interagieren. Daraus ergibt sich die rechts dargestellte Korrelation, wobei mit einem steigenden Anteil toter Zellen der Anisotropiewert 14 steigt. In einigen Ausgestaltungen der Erfindung wird der Anisotropiewert 14 in einen prozentualen Viabilitätswert umgerechnet. Geeignete Lumineszenzfarbstoffe 5 für diese Ausführungsform sind beispielsweise geladene Nukleinsäure-Farbstoffe wie Propidiumiodid mit DNA oder RNA als Zellstruktur 1.1 zur Interaktion.

In einigen Ausführungen der Erfindung wird die Viabilität als Zustand der Zellen 1 bestimmt über die Kombination der Bestimmung des Anteils lebender Zellen 1 (siehe Figur 3) mittels eines ersten Lumineszenzfarbstoffes 5 mit der Bestimmung des Anteils toter Zellen 1 (siehe Figur 4) mittels eines zweiten Lumineszenzfarbstoffes 5. In vorteilhafter Ausführung unterscheiden sich die beiden Lumineszenzfarbstoffe dabei hinsichtlich ihrer Anregungs- oder Emissionwellenlängen. Die Bestimmung der Viabilität erfolgt dann unter Einsatz geeigneter mathematischer Verfahren 13 aus den für jeden eingesetzten Lumineszenzfarbstoff s erfassten Anisotropiewerten 14.

Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Lumineszenzfarbstoffes 5 zur Bestimmung des Anteils infizierter Zellen 1. Dabei interagiert der Lumineszenzfarbstoff 5 nicht mit einer Zellstruktur 1.1, sondern mit einer Struktur, die im eigentlichen Sinne kein Teil der Zelle 1 ist, in diesem Falle mit einer Kontamination 4, die sich hier in der Zelle 1 befindet und diese infiziert hat, wie beispielsweise Mykoplasmen oder Viren. Durch Interaktion des Lumineszenzfarbstoffes 5 mit mindestens einem Bestandteil der Kontamination 4 erhöht sich dessen Lumineszenz-Anisotropie, sodass der erfindungsgemäß erfasste Lumineszenzwert 14 mit dem Anteil infizierter Zellen 1 steigt. Geeignete Lumineszenzfarbstoffe 5 können sowohl extern hinzugegeben werden, sich im Medium 2 befinden, oder aber durch die Zellen 1 selbst gebildet werden. So bilden in einigen Ausführungen der Erfindung alle Zellen 1 konstitutiv ein Antikörperfragment gegen eine spezifische Kontamination (z.B. Mykoplasma oder Virus). Dieses Antikörperfragment ist mit einem Lumineszenzfarbstoff 5 oder einer Lumineszenzfarbstoff 5 bindenden Struktur fusioniert oder konjugiert, sodass intrazelluläre Infektionen bzw. Kontaminationen 4 entdeckt werden können.

Figur 6 zeigt eine schematische Darstellung der Interaktion mehrerer erfindungsgemäßer Lumineszenzfarbstoffe 5A/5B zur Bestimmung des Anteils infizierter und toter Zellen 1. Dargestellt ist dabei insbesondere die Kombination verschiedener Lumineszenzfarbstoffe zur simultanen bzw. parallelisierten Bestimmung verschiedener Zustände von Zellen 1. Die in Figur 6 abgebildete Ausführung kombiniert eine Ausführung zur Bestimmung des Anteils toter Zellen 1 aus Figur 4 über den Lumineszenzfarbstoff 5B mit einer Ausführung zur Bestimmung des Anteils infizierter Zellen 1 aus Figur 5 überden Lumineszenzfarbstoff 5A. Erfindungsgemäß lassen sich somit durch Kombination geeigneter Lumineszenzfarbstoffe 5 mehrere verschiedene Zustände von Zellen 1 parallel erfassen. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung unterscheiden sich die dabei eingesetzten Lumineszenzfarbstoffe 5 hinsichtlich ihrer Anregungswellenlänge oder hinsichtlich ihrer Emissionswellenlänge oder hinsichtlich beider vorgenannter Wellenlängen.

Figur 7 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Streulichterfassung. In einem mit Medium 2 befüllten Reaktor 3 werden Zellen 1 kultiviert, deren Zustand mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden soll. Diese Zustandsbestimmung erfolgt über die Interaktion mindestens eines Lumineszenzfarbstoffes 5 mit einer Zellstruktur 1.1, wobei diese Interaktion zu einer Änderung der Umgebungsbedingungen und somit zu einer Änderung der Lumineszenz- Anisotropie des Lumineszenzfarbstoffes 5 führt. Dies ist in Figur 7 dargestellt als interagierender Lumineszenzfarbstoff 5.1, der infolge der Interaktion mit der Zellstruktur 1.1 eine hohe Lumineszenz-Anisotropie aufweist (parallele Füllung), sowie als freier Lumineszenzfarbstoff 5.2 der infolge der fehlenden Interaktion eine geringere Lumineszenz-Anisotropie aufweist (gewellte Füllung). Die in Figur 7 dargestellte Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erweitert die in Figur 1 dargestellte Ausführung um eine Streulichterfassung.

Das in Figur 7 dargestellte Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass von mindestens einer Lichtquelle 6.1 polarisiertes Licht 7 in den Reaktor 3 und das Medium 2 eingestrahlt wird, wo es Moleküle des Lumineszenzfarbstoff 5 zur Lumineszenz anregt. Die angeregten Moleküle des Lumineszenzfarbstoffes 5 emittieren daraufhin Licht 8, welches in Abhängigkeit der Anteile des interagierenden Lumineszenzfarbstoffes 5.1 und des freien Lumineszenzfarbstoffes 5.2 eine bestimmte Anisotropie hinsichtlich der Intensitätsverteilung in den verschiedenen Polarisationsebenen aufweist. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist die Wellenlänge des polarisierten anregenden Lichtes 7 kleiner als die des emittierten Lichtes 8. Erfindungsgemäß verlässt zumindest ein Teil des emittierten Lichts 8 das Medium 2, sowie wie in Figur 7 als vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung dargestellt auch den Reaktor 3 und wird durch mindestens einen Polarisator 9 polarisiert. Das derart erhaltene polarisierte emittierte Licht 10 wird durch mindestens einen Lichtsensor 11 als Lumineszenzwert 12 erfasst. Erfindungsgemäß werden mindestens zwei Lumineszenzwerte 12.1 und 12.2 erfasst, die sich hinsichtlich der Polarisationswinkel des polarisierten emittierten Lichtes 10.1 und 10.2 unterscheiden. Dazu erlaubt der erfindungsgemäße Polarisator 9 die Polarisierung von Licht unter mindestens zwei unterschiedlichen Polarisationswinkeln (dargestellt als horizontale bzw. vertikale Füllung) und kann insbesondere aber nicht ausschließlich sowohl als variabler Polarisator 9 oder als dedizierte Anordnung unterschiedlich ausgerichteter Einzelpolarisatoren 9 ausgeführt sein.

Das in Figur 7 dargestellte Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sowohl der Einfluss der Lichtstreuung (z.B. an Zellen oder anderen Partikeln oder Grenzflächen) des anregenden Lichts 7 als auch des emittierten Lichts 8 erfasst und in die Verarbeitung zu einem streuungskorrigierten Anisotropiewert 22 einbezogen wird. Dazu wird neben dem emittierten Licht 8 auch das zumindest teilweise das Medium 2 oder den Reaktor 3 verlassende Streulicht 16 bei Anregungswellenlänge erfasst, wobei dieses durch einen Polarisator 9 in den gleichen mindestens zwei Polarisationswinkeln des polarisierten emittierten Lichts 10 polarisiert und als polarisiertes Streulicht 18 (unter mindestens zwei Polarisationswinkeln als 18.1/18.2) bei Anregungswellenlänge durch mindestens einen Lichtsensor 11 erfasst wird als Streulichtwerte 20 bei Anregungswellenlänge (unter mindestens zwei Polarisationswinkeln als 20.1/20.2). Zur selektiven Erfassung des polarisierten Streulichts 18 bei Anregungswellenlänge ohne störende Einflüsse von Umgebungslicht oder Emittiertem Licht 8 können geeignete wellenlängenselektive Optiken 23 zwischen Medium 2 und Lichtsensor 11 zum Einsatz kommen (z.B. Gitter in Kombination mit CCD-Zeilensensor).

Das in Figur 7 dargestellte Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass auch das zumindest teilweise das Medium 2 oder den Reaktor 3 verlassende Streulicht 17 bei Emissionswellenlänge erfasst wird. Um den reinen Streueffekt zu quantifizieren, wird dazu bei abgeschalteter Lichtquelle 6.1 und somit nicht vorhandener Lumineszenz des Lumineszenzfarbstoffes 5 durch mindestens eine zweite Lichtquelle 6.2 polarisiertes Licht 15 zur Streuungskorrektur bei Emissionswellenlänge in das Medium 2 bzw. den Reaktor 3 eingestrahlt, wo es von Zellen oder anderen Partikeln oder Grenzflächen gestreut wird und als Streulicht bei Emissionswellenlänge 17 das Medium 2 oder den Reaktor 3 zumindest teilweise wieder verlässt. Das Streulicht 17 bei Emissionswellenlänge wird durch mindestens einen Polarisator 9 unter den gleichen mindestens zwei Polarisationswinkeln wie das polarisierte emittierte Licht 10 polarisiert und als polarisiertes Streulicht 19 (unter mindestens zwei Polarisationswinkeln als 19.1/19.2) bei Emissionswellenlänge durch mindestens einen Lichtsensor 11 erfasst als Streulichtwerte 21 bei Emissionswellenlänge (unter mindestens zwei Polarisationswinkeln als 21.1/21.2) Zur selektiven Erfassung des polarisierten Streulichts 19 bei Emissionswellenlänge ohne störende Einflüsse von Umgebungslicht können geeignete wellenlängenselektive Optiken 23 zwischen Medium 2 und Lichtsensor 11 zum Einsatz kommen (z.B. Gitter in Kombination mit CCD-Zeilensensor).

Das in Figur 7 dargestellte Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass aus den mindestens zwei erfassten Lumineszenzwerten 12.1/12.2, den mindestens zwei erfassten Streulichtwerten bei Anregungswellenlänge 20.1/20.2 sowie den mindestens zwei erfassten Streulichtwerten bei Emissionswellenlänge 21.1/21.2, die alle unter den gleichen mindestens zwei voneinander unterschiedlichen Polarisationswinkeln erfasst wurden, mittels geeigneter mathematischer Verfahren 13 mindestens ein streuungskorrigierter Anisotropiewert 22 errechnet wird. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung werden solche Verhältnisse zwischen den Wellenlängen l der verschiedenen Lichtfraktionen wie in Figur 7 abgebildet, genutzt. Diese werden je nach Ausführungsform durch geeignete wellenlängenselektive Optiken 23, insbesondere aber nicht ausschließlich durch optische Filter, Monochromatoren, Prismen, Gitter oder durch vollständige oder teilweise spektrale Scans voneinander soweit erforderlich separiert (siehe dazu auch Figuren 8 und 9).

Figur 8 zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mehreren Lichtquellen 6 und Lichtsensoren 11 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Vorrichtung umfasst einen Reaktor 3, in dem Zellen 1 in einem Medium 2 kultiviert werden. Die Vorrichtung umfasst zwei Lichtquellen 6, wobei sich die Wellenlängenbereiche der Lichtquelle 6.1 und der Lichtquelle 6.2 unterscheiden, sodass entweder mehrere Lumineszenzfarbstoffe 5 parallel evaluiert werden können (siehe auch Figur 6) oder eine Streulichtkorrektur erfolgen kann (siehe auch Figur 7).

Die in Figur 8 dargestellte Ausführung umfasst weiterhin vier Lichtsensoren 11, wobei jeder einzelne Lichtsensor 11 mit einem eigenen Polarisator 9 und einer wellenlängenselektiven Optik 23 ausgestattet ist und als ein Detektor-Set zusammengefasst wird als A, B, C oder D. Dabei gleichen sich bei den Detektor-Sets A/B bzw. C/D die selektierten Wellenlängen der wellenlängenselektiven Optiken 23, wohingegen die Polarisationswinkel der Polarisatoren 9 zwischen den Detektor-Sets A/B bzw. C/D unterschiedlich sind. Durch den Einsatz mehrerer Lichtsensoren 11 mit zugehöriger wellenlängenselektiver Optik 23 und Polarisator 9 kann die erfindungsgemäße Erfassung von Lumineszenzwerten 12 oder Streulichtwerten 20/21 und damit die Bestimmung von Anisotropiewerten 14 vorteilhaft parallelisiert werden.

Die in Figur 8 dargestellte Ausführung umfasst weiterhin einen Rechner 24, der mit den Lichtsensoren 11 verbunden ist, um diese anzusteuern und Daten, insbesondere Lumineszenzwerte 12 oder Streulichtwerte 20/21, von ihnen zu erhalten. Der Rechner 24 ist weiterhin mit den Lichtquellen 6 verbunden, um diese anzusteuern oder Daten von ihnen zu erhalten. Die erfindungsgemäße Bestimmung von Anisotropiewerten 14 aus Lumineszenzwerten 12 oder Streulichtwerten 20/21 erfolgt unter Einsatz geeigneter mathematischer Verfahren 13 auf dem Rechner 24.

Die optischen Komponenten 9/23, Lichtquellen 6 und Lichtsensoren 11 der in Figur 8 dargestellten Ausführung befinden sich in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung außerhalb des Reaktors 3, können sich aber in anderen Ausführungen auch innerhalb des Reaktors 3 befinden oder als Immersionssonden in das Medium 2 eingetaucht werden.

Figur 9 zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mehreren Lichtquellen 6 und Lichtsensoren 11 und mit Polarisatoren 9, die mit dem Medium 2 in Kontakt stehen. Grundsätzlich gleicht die Ausführung der in Figur 8 dargestellten Ausführung. Einziger Unterschied ist die Lokalisation der Polarisatoren 9, die in Figur 9 im Kontakt zum Medium 2 stehen, um die Streuung von Licht an optischen Elementen, Grenzflächen oder anderen Vorrichtungsbestandteilen zu minimieren oder zu eliminieren. Somit beeinflussen in dieser Ausführung der Erfindung nur noch Streueffekte innerhalb des Mediums 2 die Bestimmung von Anisotropiewerten 14.

In Figur 9 ist ein gemeinsamer Polarisator 9 für die beiden Lichtquellen 6.1/6.2 dargestellt, dieser kann aber in anderen Ausführungen auch bereits Bestandteil der Lichtquellen 6 sein, oder anderweitig jeder einzelnen Lichtquelle 6 zugeordnet sein.

Der in Figur 9 dargestellte Kontakt der Polarisatoren 9 mit dem Medium 2 kann insbesondere aber nicht ausschließlich erreicht werden durch Immersionssonden, sowie durch Integration der Polarisatoren 9 in die Außenwand des Reaktors 3, beispielsweise als Polarisationsfilterfolie in Einwegreaktoren aus Kunststoff.

Zusammenfassend ist eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, mittels dessen ohne die Entnahme von Proben mindestens ein Zustand von Zellen in Reaktoren bestimmt werden kann, ohne dass ein direkter Kontakt zwischen der Kulturflüssigkeit und einem Sensor besteht, bei gleichzeitig hoher Parallelisierbarkeit und Miniaturisierbarkeit der einzusetzenden Verfahren und Vorrichtungen im Vergleich zum Stand der Technik. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe beispielsweise gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des Zustands von Zellen in Reaktoren, welches den Effekt der Lumineszenz-Anisotropie nutzt, um als optisches Verfahren ohne direkten Kontakt zur Kulturflüssigkeit und mit hohem Minimierungs- und Parallelisierungspotential implementiert zu werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass von mindestens einer Lichtquelle polarisiertes Licht in das Medium eingestrahlt wird und mindestens einen Lumineszenzfarbstoff zur Lumineszenz anregt und dass das von mindestens einem angeregten Lumineszenzfarbstoff emittierte Licht zumindest teilweise das Medium verlässt und von mindestens einem Polarisator polarisiert wird. Weiterhin kennzeichnend ist, dass das so erhaltene polarisierte emittierte Licht durch mindestens einen Lichtsensor erfasst wird und dass das polarisierte emittierte Licht unter mindestens zwei verschiedenen Polarisationswinkeln als mindestens zwei Lumineszenzwerte erfasst wird, aus denen mittels geeigneter mathematischer Verarbeitung mindestens ein Anisotropiewert ermittelt wird, welcher infolge der Umgebungsabhängigkeit des Lumineszenzfarbstoffes mit mindestens einem Zustand der Zellen korreliert.

Bezugszeichenliste

Zur jeweiligen Interpretation der Bezugszeichen sind Beschreibung und Ansprüche zu beachten.