Zur Vermessung der passiven elektrischen Eigenschaften von in Flüssigkeiten suspendierten Teilchen oder Mikroobjekten (wie La- texpartikeln, lebende Zellen etc.) werden seit langem über elek- trische Rotationsfelder induzierte Drehbewegungen genutzt [Über- sicht in ZIMMERMANN, U. et al., Electromanipulation of Cells, CRC Press Inc., 1996]. Es kann sich dabei um eine Rotationsbewegung in oder entgegengesetzt zur Felddrehrichtung handeln. Aus der Drehgeschwindigkeit des Objektes als Funktion der Winkelgeschwin- digkeit des Feldes (sogenannte Rotationsspektren) kann auf passi- ve elektrische Eigenschaften geschlossen werden. In der Regel liegen die Rotationsgeschwindigkeiten der Objekte im Bereich von 100 Umdrehungen pro Sekunde bis zu 1 Umdrehung pro Minute, typi- scherweise langsamer als 1 Umdrehung pro Sekunde.

Insbesondere für biologisch-medizinische Fragestellungen hat sich dieses Verfahren als der Impedanzmessung vergleichbar und hoch- auflösend erwiesen. Die Rotation des Objektes verhält sich dabei proportional zum Imaginärteil des Clausius-Mosotti-Faktors, [vgl. auch JONES, T. B., Electromechanics of Particles, Cambridge Uni- versity Press, Cambridge, 1995].

Nachteilig ist jedoch, daß zusätzlich zu dem induzierten Drehmo- ment immer eine zu den Elektroden hin oder von diesen weg gerich- tete Kraft, die sogenannte Dielektrophorese, auftritt. Dadurch dejustiert sich das Partikel bzw. verkürzt sich die Meßzeit un- kontrolliert. Beides steht einer automatischen Messung entgegen.

Versuche, die Rotationsmessung automatisch zu erfassen, sind mehrfach beschrieben worden [DE 33 25 843 ; DD WP 281223 (1986)].

Dabei handelt es sich um die alternierende Applikation zweier An- regungsfelder unterschiedlicher Drehrichtung, bei denen die An- schaltzeiten elektronisch verändert werden können. Diese werden so lange variiert, bis der Stillstand des Objektes eintritt. Der Stillstand des Objektes wurde bislang jedoch ebenfalls aus- schließlich über visuelle Beobachtung bestimmt.

Desweiteren ist bekannt, die Bewegung komplex strukturierter Ob- jekte über Bildverarbeitungssysteme zu erfassen. Dazu wird das mikroskopisch erzeugte Bild zu verschiedenen Zeitpunkten elektro- nisch aufgenommen und gespeichert und dann versucht, über eine entsprechende Raumtransformation einer Vielzahl von Bildpunkten die erfolgte Bewegung zu rekonstruieren. Diese Verfahren haben den Nachteil einer hohen Informationsverarbeitungsdichte und da- mit langwieriger und aufwendiger Rechnerverarbeitung. Besonders große Schwierigkeiten treten bei Veranderungen der Objektstruktur während der Messung auf, z. B. bei Verlagerung in der Fokusebene, und bei schwach kontrastierten Objekten.

Automatisch kann die Zellbewegung auch über Verfahren der dynami- schen Lichtstreuung ermittelt werden [GIMSA, J., PRUGER, B., EPPMANN, P. and DONATH, E., Electrorotation of particles measured by dynamic light scattering-a new dielectric spectroscopy technique, in"Colloids and Surfaces A", Bd. 98,243-249,1995].

Dieses Verfahren kann allerdings nicht an einzelnen Objekten ein- gesetzt werden, sondern liefert Mittelwerte über alle Partikel, die sich im Laserstrahl befinden. In der Regel sind dies einige Hundert oder mehr.

Die exakte Positionierung an einem Punkt im elektrischen Ro- tationsfeld wurde durch die Verwendung 3-dimensionaler Elektro- denanordnungen, sogenannter Feldkäfige, und die alternierende Applikation eines Zentrierfeldes und eines Rotationsfeldes ge- löst. Es zeigt sich allerdings, daß dadurch die Rotation der Ob- jekte auf 1/10 bis 1/40 verlangsamt wird, was eine Auswertung erschwert und die Meßzeiten verlängert (DE 196 53 659 C1, sowie Schnelle, Th., Glasser, H., Fuhr, G., An opto-electronic technique for automatic detection of electrorotational spectra of single cells, in"Cellular Engineering"Bd. 2,33-41,1997).

Es sind ferner optische Feldfallen, auch"optical tweezers", "Laser-Pinzetten"oder"optical traps"genannt, bekannt, die seit etwa zwei Jahrzehnten auf den Gebieten der Biotechnologie, Medi- zin und Molekularbiologie sowie auf anderen technischen Gebieten zur Positionierung und Manipulation mikrometergroßer und sub- mikrometergroßer Partikel eingesetzt [G. Weber et al. in"Int.

Rev. Cytol."Bd. 131,1992, S. 1 ; S. M. Block in"Noninvasive Techniques in Cell Biology", Wiley-Liss., New York 1990, S. 375] werden. Die Entwicklung der Laser-Pinzette geht vor allem auf A. Ashkin zurück [A. Ashkin in"Phys. Rev. Lett.", Bd. 24, 1970, S. 156]. Das Prinzip des Partikeleinfangs durch optisch in- duzierte Kräfte beruht darauf, daß neben dem Lichtdruck, der stets ein Teilchen von der Lichtquelle wegdrückt, Gradientenkraf- te auftreten, die dazu fuhren, daß ein Teilchen in einen Fokus gelangt bzw. stabil in diesem gehalten oder mit diesem bewegt wird. Voraussetzung ist, daß die Absorption und Reflexion des Teilchens gering ist, wahrend der Unterschied im Brechungsindex zur Umgebungslösung möglichst groß sein sollte.

Laser-Pinzetten haben in den letzten Jahren vor allem deshalb ei- ne größere Verbreitung erlangt, weil bei gleicher, stets starker Fokussierung des Lichtstrahls sowohl Teilchen, die größer als die Wellenlänge (sogenannte Mie-Teilchen), als auch Teilchen, die kleiner als die Wellenlange sind (sogenannte Rayleigh-Teilchen), gefangen werden können. Das sind vor allem biologische Objekte wie Zellen, Organellen und andere Zellbestandteile und auch grole Moleküle (wie DNA) und künstliche Mikropartikel [S. M. Block et al. in"Nature", 1990, S. 348 ; J. M. Colon et al. in"Fertility and Sterility", Bd. 57,1992, S. 695 ff.].

Von G. Fuhr et al. wird in"Topics in Current Chemistry", Bd. 194, Springer-Verlag Berlin, 1998, S. 83 ff., ein Mikroelek- trodensystem beschrieben, bei dem auf suspendierte Partikel elek- trische, optische oder hydrodynamische Kräfte wirken. Es wird die Realisierung von Hybridprozessen beschrieben, bei denen Partikel abwechselnd erst mit elektrischen oder mit optischen Kräften ma- nipuliert werden. Dieser Einsatz elektrischer oder optischer Kräfte ist dabei auf die Erfüllung bestimmter Ziele bei der Par- tikelhandhabung gerichtet. Mit den elektrischen Kraft erfolgen insbesondere elektrische Messungen an den Partikeln, wie sie oben erwähnt werden. Die optischen Kräfte hingegen dienen der Manipu- lierung der Partikel vor oder nach der elektrischen Messung. Die optischen Kraft werden beispielsweise in Abhängigkeit vom Ergeb- nis der elektrischen Messung ausgeübt (Sortieren). Die simultane Wirkung elektrischer und optischer Kräfte ist nicht vorgesehen.

Das Zusammenwirken elektrostatischer und optischer Kräfte bei der Erfassung schrittweiser Verstellungen von biologischen Zellen in Mikrosystemen wird von M. Nishioka et al. in"IEEE Transactions on Industry Application", Bd. 33,1997, S. 127 ff., beschrieben.

Unter der Wirkung des Strahlungsdrucks eines Lasers werden die zu untersuchenden Zellen gegen ein Deckglas über einer Elektrodenan- ordnung gedrückt, mit der umschaltbare elektrostatische Felder erzeugt werden. Die Zellen werden in Bezug auf ihre Orientierung in den elektrischen Feldern untersucht. Die Manipulation der Zel- len bleibt bei dieser sogenannten optoelektrostatischen Technik auf geringe Verstellraten beschränkt. Es wurde festgestellt, daß bei Verstellgeschwindigkeiten mit typischen Zeiten von 0,5 s die Zellbewegung nicht mehr den gewünschten Manipulierungsschritten folgt. Ein weiterer Nachteil der von M. Nishioka et al. beschrie- benen Technik besteht in deren Beschränkung auf nicht-sphärische Partikel oder Partikel mit einer inhomogenen Struktur. Die oben- genannte Messung passiver elektrischer Eigenschaften durch Auf- nahme von Rotationsspektren ist mit der optoelektrostatischen Technik nicht möglich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verfahren zur dielektrischen Einzelpartikelspektroskopie in Mikrosystemen und Vorrichtungen zu deren Implementierung anzugeben, mit denen die o. a. Probleme gelöst werden können und insbesondere die Teilchen in einem Rotationsfeld unabhängig davon, ob anziehende oder ab- stoßende dielektrophoretische Kräfte auftreten, freischwebend in einer Lösung an einem beliebigen Punkt mit einer Genauigkeit un- terhalb des Partikelradiuses im Rotationsfeld zu haltern, ohne daß die Rotationsgeschwindigkeit vermindert wird.

Diese Aufgabe wird durch die Kombination eines optischen Fang- strahl ("optische Pinzette") und einem oder mehreren rotierenden elektrischen Feldern variabler Winkelgeschwindigkeit mit den Merkmalen der Ansprüche 1 bzw. 6 gelöst. Vorteilhafte Ausfüh- rungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Wichtige Gesichtspunkte der Erfindung bestehen insbesondere dar- in, daß ein suspendiertes Teilchen (Partikel), das künstlich oder auch biologischer Natur sein kann, in einem stark fokussierten Laserstrahl gefangen wird, wie es von optischen Pinzetten bekannt ist. Der Fangpunkt des Lasers mit dem darin befindlichen Teilchen wird nun zwischen Mikroelektroden, die in der Regel planar auf ein glattes Substrat aufgebracht sind, geführt, bis sich das Teilchen im Bereich des sich in der Lösung ausbreitenden elektri- schen Feldes befindet, sofern die Elektroden mit hochfrequenten, in geeigneter Weise phasenverschobenen Wechselspannungssignalen beaufschlagt werden. Das Teilchen befindet sich im Zustand freier Suspension. Es wird durch das Zusammenwirken elektrischer und op- tischer Kräfte gehalten.

Zweckmäßigerweise positioniert man den Laserfokus auf einer Linie die senkrecht auf dem Punkt steht, der das Feldminiumum zwischen den Elektroden bezeichnet. Selbst wenn Kräfte durch das elektri- sche Rotationsfeld entwickelt werden, die das Teilchen an die Elektroden ziehen wollen, wirken diese an diesem Ort in alle Elektrodenrichtungen ziemlich gleichmäßig, so daß es erfindungs- gemäß nur sehr geringer Kräfte bedarf, das Teilchen trotz der feldinduzierten Anziehungskräfte stabil im Laserfokus zu halten.

Andererseits muß die Intensitat des Lasers so hoch gewählt wer- den, daß das Teilchen angehoben wird. Sollte das Teilchen über die elektrisch induzierten Polarisationskräfte von den Elektroden abgestoßen werden, so sind die Kräfte des optischen Feldes noch geringer wählbar, da sich das Teilchen selbst auf der bezeichne- ten Symmetrielinie zentriert. Hier wird es jedoch angehoben und aus dem Elektrodenbereich gedrängt. Diese Kraft muß wiederum über die Wahl der Intensität des Laserstrahl kompensiert werden. Die- ses auf optisch induziertem Wege sehr stabil in freier Lösung ge- fangene Teilchen erfährt durch das elektrische Drehfeld ein Drehmoment und kann frequenzabhängig in der an sich bekannten Art in langsame Drehung versetzt werden.

Es handelt sich somit um ein Verfahren und eine elektro-optischen Vorrichtung zur automatischen Rotationsmessung an einzelnen Mi- kropartikeln, insbesondere zur Messung der Rotationsgeschwindig- keit von lebenden Zellen als Funktion der Rotationsfrequenz eines elektrischen Feldes, wobei die Halterung des Meßobjektes im Rota- tionsfeld in einem Laserfokus erfolgt.

Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß beide Kräfte (optisch und elektrische) sich nahezu wechselwirkungsfrei ergänzen und wechselweise optimiert verringert werden können. Das optische Fangfeld ist zudem von der Leitfähigkeit der Suspen- sionslösung unabhängig, so daß in unbegrenzter Weise in leitfähi- gen bis wenig leitfähigen Lösungen gearbeitet werden kann, was bisher nicht möglich war. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß erfindungsgemäß sehr eng stehende Elektroden verwendet und damit anwendungsabhängig mit geringeren Amplituden gemessen werden kann. Ferner lassen sich neue Elektrodenformen zur Erzeugung von Feldgradienten einsetzen, was bisher ausgeschlossen war. Damit wird der Einsatzbereich der dielektrischen Spektroskopie erheb- lich erweitert.

Durch die überaus präzise (auf einen Mikrometer und weniger) ge- naue Positionierung der Teilchen lassen sich nunmehr in sehr ein- facher Weise automatische Meßverfahren, z. B. der Bilderkennung und der Streulichtmessung etc. zur automatischen Erfassung der Rotationsspektren der Partikeln adaptieren. Dies geschieht in bekannter Weise, z. B. tuber eine mikroskopische Beobachtung.

Im folgenden sind die wesentlichen Merkmale der Erfindung an in den Zeichnungen dargestellten Ausfuhrungsbeispielen erläutert. Es zeigen : Figur 1 : eine Ubersichtsdarstellung zur erfindungsgemäßen Halte- rung eines Teilchens in einer Quadrupolanordnung zur dielektri- schen Spektroskopie mit einer Laser-Pinzette ; Figur 2 : eine Kurvendarstellung der Abhängigkeit des Drehmomen- tes bzw. der an-oder abstoßenden Kräfte von der Frequenz f des Rotationsfeldes (= 2z f) ; Figur 3 : eine Ubersichtsdarstellung zur erfindungsgemäßen Kombi- nation eines Mikrosystems zur dielektrischen Spektroskopie mit einer Mikroskopanordnung, und Figur 4 : eine schematische Illustration eines Mikrosystems für Screening-Aufgaben.

Figur 1 zeigt einen perspektivischen Blick auf die Anordnung.

Einzelheiten des Mikrosystems, die an sich bekannt sind, werden nicht dargestellt. Ein Partikel 11, suspendiert in einer Umge- bungslösung 12, befindet sich im Strahlungsfeld eines stark fo- kussierten Laserstrahls 13 und wird im Fokus 14 gefangen. Vier planar auf einem Substrat 15 befindliche, in der Regel planare Elektroden 16a bis 16d werden über 90 Grad phasenverschobene Signale (Phasenlage 0°, 90,180°, 270°) gleicher Frequenz (Am- plituden z. B. etwa 1 bis 20 V) angesteuert, so daß ein Drehfeld in der x-y-Ebene entsteht. Entsprechend dreht das gefangene Par- tikel durch die starken Reibungskräfte gegenüber der Suspensions- flüssigkeit 12 wesentlich langsamer, als das Feld rotiert. Die Rotationsgeschwindigkeit des Objektes als Funktion der Frequenz wird durch Vermessung oder Beobachtung des Teilchens ermittelt und liefert die gewunschten Rotationsspektren. Alternativ können auch 3 oder mehr Elektroden in einer Ebene, von stärkerer Dicke als auch in einer Mehrebenenanordnung verwendet werden.

Das in Fig. 1 gezeigte Mikrosystem kann vorteilhafterweise mit Resonanzeinrichtungen zur Ausbildung einer resonanten Erhöhung oder Dämpfung der Feldstärke der elektrischen Wechselfelder bei vorbestimmten Frequenzen ausgestattet sein, wie sie in PCT/EP96/05244 beschrieben sind. Der Inhalt der Patentanmeldung PCT/EP96/05244 wird hiermit vollständig durch ausdrückliche Be- zugnahme in den Inhalt der vorliegenden Beschreibung einbezogen.

Dies betrifft insbesondere alle Maßnahmen zur Erzeugung von Reso- nanzerscheinungen in Partikelsuspensionen in Mikroelektrodenan- ordnungen.

Figur 2 zeigt ein Rotationsspektrum (Kurve 21, das Spektrum einer lebenden Zelle beschreibend) und die dazugehörige dielek- trophoretische Kraft (Kurve 22) an. Es zeigt sich, daß die Zelle ohne das optische Fangfeld im Frequenzbereich (m) zwischen 20 Hz und 1 GHz an die Elektroden gezogen würde. Bei den dargestellten Kurven handelt es sich um eine Messung an einer 20 um großen Zel- le in einer wässrigen Lösung mit einer Leitfähigkeit von lmS/m, wie sie für Algen typisch ist. Dadurch konnte bisher in diesem Frequenzbereich nicht oder nur mit verminderter Genauigkeit ge- messen werden, wie dies oben erlautert wurde. Erfindungsgemäß wird mit der Laser-Pinzette die durch die Kurve 22 repräsentierte Kraftwirkung kompensiert. Entsprechend wird die Laser-Pinzette mit derartigen Betriebsparametern eingesetzt, daß eine genügend große Fangkraft auf das Teilchen ausgeübt wird.

Figur 3 zeigt eine Vorrichtung, die mindestens einseitig transpa- rent ist, mit weiteren Einzelheiten, mit der die Rotationsmessun- gen durchgeführt werden können. Auf einem Substrat 31 (z. B. Glas) werden mit den Mitteln der Halbleitertechnologie planare Elektro- den 32a bis 32d prozessiert und tuber die Zuleitungen 33a bis 33d mit Wechselspannungssignalen zur Rotationsfelderzeugung beauf- schlagt. Durch die Seitenwände 34a, 34b und die weniger als 250 um dicke Deckplatte 35 wird ein Kanal gebildet, in den die Par- tikelsuspension eingespult werden kann (36, Pfeilrichtung). Die Kanaldecke besteht aus Glas, so daß ein Objektiv 37 hoher numeri- scher Apertur, z. B. auch als Olimmersionsobjektiv (01 38) einen stark fokussierten Laserfokus im Kanalinneren erzeugen kann, in dem das Partikel 39 gefangen wird. Sinngemaß können noch weitere Elektroden eingeführt werden und kann der Laserstrahl oder der Kanal relativ zueinander verschoben werden. Das Gesamtsystem ist als Zusatz zu einem Mikroskop ausführbar.

Eine bevorzugte Anwendung der Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf Fig. 4 erläutert. Fig. 4 zeigt ein Mikrosystem, das für den Aufbau eines Testsystems (Assaysystem) für das Hochdurchsatz- screening ausgebildet ist. Das Mikrosystem 40 weist eine Kanal- struktur 41a, 41b auf. Der erste Kanal 41a wird von einer Suspen- sion mit Partikeln durchströmt, die getestet werden sollen. Die Partikel umfassen beispielsweise biologische Zellen oder modifi- zierte synthetische Partikel oder Kombinationen aus biolgischen Zellen und synthetischen Partikeln. Der zweite Kanal 41b, der von einer Lösung oder Suspension einer Testsubstanz durchströmt wird, mündet in den ersten Kanal 41a. Die Testsubstanz umfaßt vorzugs- weise Liganden, z. B. Antikorper.

Stromaufwarts in Bezug auf die Einmundung des zweiten Kanals 41b ist am ersten Kanal 41a ein erstes Elektrodensystem 42a ange- bracht, das beispielsweise wie das Mikroelektrodensystem gemäß Fig. 1 aufgebaut ist. Stromabwärts gegenuber dem Mündungspunkt ist ein zweites Elektrodensystem 42b angeordnet. Die Elektroden- systeme 42a, 42b sind für Rotationsmessungen an den Partikeln 43 vor bzw. nach der Wechselwirkung mit der Testsubstanz ausgelegt.

Jede Elektrodenanordnung ist mit einer Lasereinrichtung und einer Mikroskopanordnung zur Erzeugung der optischen Fallen ausgestat- tet (s. Fig. 3). Ein Testablauf könnte beispielsweise wie folgt realisiert werden.

Zunächst werden die anströmenden Partikel 43 im ersten Elektro- densystem 42a einer ersten Rotationsmessung (bei simultaner Hal- terung mit einer optischen Falle) unterzogen. Nach Vermengung mit der Testsubstanz ergeben sich Wechselwirkungen (z. B. Partikel 43a), deren Einfluß auf die Partikeleigenschaften durch die zwei- te Rotationsmessung im Elektrodensystem 42b erfaßt wird. Die ge- änderten Eigenschaften können absolut durch charakteristische Spektren oder relativ durch Vergleich der Spektren der ersten und zweiten Rotationsmessungen ermittelt werden. Nach der zweiten Ro- tationsmessung werden die Partikel aus dem zweiten Elektroden- system freigegeben, ggf. weitere Rotationsmessungen in weiteren (nicht dargestellten) Elektrodenanordnungen unterzogen und je nach dem Meßergebnis einem Sortiervorgang unterzogen.

Typische Anwendungen für ein Testsystem gemäß Fig. 4 sind Bin- dungsstudien und die Ermittlung kinetischer Parameter (Asso- ziationskonstante, Dissoziationskonstante) im Rahmen der Charak- terisierung von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen unterein- ander oder mit kleinen organischen oder anorganischen Molekülen.

Biomoleküle und zugehörige Anwendungsbeispiele können dabei sein : Antigene-Antikörper, bei Studien zur Entwicklung von Imunoreagen- zien und Imunoassays, Epitope-Mapping und Screening von Phagen- Bibliotheken ; Liganden und ihre zellmembranständigen Rezeptoren ; Zelladhäsionsmoleküle und ihre Liganden, z. B. bei Untersuchungen der Affinität zwischen Cadherinen und Integrinen und ihren zell- membranständigen Rezeptoren ; Membranmoleküle, wie z. B. Lipide oder Glykoproteine, bei Untersuchungen der Wechselwirkung dieser Moleküle mit anderen löslichen oder zellmembranbeständigen Biomo- lekülen ; extrazelluläre Matrixmoleküle und ihre löslichen oder zellmembranständigen Liganden ; intrazellulare Botenstoffe, bei Untersuchungen der Signalweiterleitung innerhalb der Zelle durch Wechselwirkung von Molekülen einer Signalweiterleitungskaskade ; lösliche Proteine und Peptide, bei der Überwachung der Produktion von Proteinen und Peptiden in einem biotechnologischen Prozeß ; Enzyme und ihre Substrate und Cofaktoren, beispielsweise bei Un- tersuchungen von Blutgerinnungsfaktoren ; Proteine oder Peptide und DNA-oder RNA-Moleküle, beispielsweise bei der Mutationsana- lyse durch unterschiedlich starke Bindung von veränderter DNA an bestimmte Proteine oder Untersuchungen von Transskriptionsfakto- ren ; und Oberflächenmoleküle von Viren, Bakterien, Pilzen, Plas moiden oder anderen pathogenen Mikroorganismen und der Zellmem- bran einer Wirtszelle, beispielsweise zur Entwicklung anti- infektiver Strategien.

Ein erfindungsgemäßes Testsystem kann auch eine Vielzahl von Mi- krosystemen gemäß Fig. 4, die seriell oder parallel zusammenwir- ken, aufgebaut sein.