TEJEDOR HERNANDEZ DIEGO (ES)
CASTILLO FERNANDEZ SERGIO (ES)
MALLEN PEREZ MIGUEL (ES)
MARTINEZ MARTINEZ ANTONIO (ES)
POCOVI MIERAS MIGUEL (ES)
TEJEDOR HERNANDEZ DIEGO (ES)
CASTILLO FERNANDEZ SERGIO (ES)
MALLEN PEREZ MIGUEL (ES)
MARTINEZ MARTINEZ ANTONIO (ES)
| WO2002006467A1 |
| US4966837A |
FOUCHIER S.W. ET AL.: 'The molecular basis of familial hypercholesterolemia in the Netherlands' HUMAN GENETICS vol. 109, no. 6, December 2001, pages 602 - 615
PISCIOTTA LIVIA ET AL.: 'A "de novo" mutation of the LDL receptor gene as the cause of familial hypercholesterolemia' BIOCHIMIA ET BIOPHYSICA ACTA vol. 1587, no. 1, 21 May 2002, pages 7 - 11
LIND S. ET AL.: 'Genetic characterization of Swedish patients with familial hypercholesterolemia. A heterogenous pattern of mutations in the LDL receptor gene' ATHEROSCLEROSIS vol. 163, no. 2, August 2002, pages 399 - 407
VARRET M. ET AL.: 'Results of the molecular analysis of the 220 point mutations in the human LDL receptor gene database' ATHEROSCLEROSIS vol. 134, no. 1-2, October 1997, page 74
| 1. | Secuencia génica correspondiente a SEQ ID NO :1 que comprende al menos una de las siguientes mutaciones: C134Y, C195Y, S174N, ClOOY, C304Y, W422S, S533X, 1705delG, 17062 A>C, 19882 A>T, 2266delA, 23902 A>G, de aplicación en métodos de diagnóstico extracorpóreos e in vitro de la hipercolesterolemia familiar. |
| 2. | Secuencia génica según la reivindicación 1, que comprende además alguna de las siguientes mutaciones: T433N , 818del8, 1423delGC/insA, 1204insT, 451del3, G516X, 2389+4A>G, 1815dell 1, 1186+5G>A, T740M, I771T, R279G, T446I, H562Q, C74Y, D686Y, G(2)R, E579D, S205C, D200V, V766E, L(6)P, 2544insC, C42Y, 2389+3A>C, [15875del5;1587del31], (23)A>C, 1054 delll, 108delC, 1197del9, 1207delT, 1432delG, 1912delAinsCT, 2184delG, 231delC, 2399del5/ins4, 313+linsT, 338dell6, 510insC, 675dell5, 684dupl2, 94139 OT, C127R, C195R, C255G, C319Y, D157G, D630N, E291X, H635N, N59K, T41M, W515X, Y379X, Y421X, 2393del9, ( 42) C/G, (49) C/T, 1045delC, 10618 T>C, A378T, C358R, 1358 + 1 G/A, 170610 G>A, 1845 + 1 G/C, 2085dell9, 211del G, 2140 + 5 G/A, 2207insT, 23901G/C, 313+1 G>C, 313+1 G/A, 313+2GinsT, 518 del G, 7delC, 872delC, 884delT, 920ins4, A519T, C113W, C255X, C281Y, C297F, C347Y, C371X, C646Y, C677Y, C68W, C74G, C95R, D151N, D200G, D200Y, D280G, ElOX, E246A, E256K, F634L, G322S, G352D, G571E, N543H, N804K, Q12X, Q133X, Q357P, Q427X, Q71E, R395Q, R574W, R612C, S156L, S205P, T413K, T7051, V502M, W(18)X, W541X, D679E, 1359 1 G>A, 681ins21, C122X, V408M, G528D, D412H, N619N, E80K, L534P, 621S, C356Y, R329X, G248D, C201Y, 313+5G>A, C358Y, C331R, D157N, V776M, 664L, W462X, Q328X, L584P, R395W, G314V, W469X, P678L, R612H, R236W, C660X, W792X, C152X, A29S, R60C, N644T, 15871G>C, D471N, de aplicación en métodos de diagnóstico extracorpóreos e in vitro, de la hipercolesterolemia familiar. |
| 3. | Secuencia génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que comprende, además, alguno de los siguientes polimorfismos: 81T>C BstUI Exón 2, 1060+10G>C Smal Exón 7, 1171G>A Stul Exón 8, 1413G>A Ddel Exón 10, 1617OT BstNI Exón 11, 1725OT SSCP Exón 12, 1771OT HincII Exón 12, 1959 T>C Avall, Exón 13, 2232G>A MspI Exón 15, de aplicación en métodos de diagnóstico extracorpóreos e in vitro, de la hipercolesterolemia familiar. |
| 4. | Uso de las secuencias génicas de la reivindicación 1 en el diseño y la preparación de sondas oligonucleotídicas capaces de hibridar con alguna de las siguientes mutaciones: C134Y, C195Y, S174N, C100Y, C304Y, W422S, S533X, 1705delG, 17062 A>C, 19882 A>T, 2266delA, 23902 A>G. |
| 5. | Sondas oligonucleotídicas capaces de hibridar con cualquiera de las mutaciones descritas en la reivindicación 1. |
| 6. | Sondas oligonucleotídicas según la reivindicación 5, seleccionadas entre al menos una de las correspondientes a SEQ ID NO:34 a SEQ ID NO:81. |
| 7. | Oligonucleótidos seleccionados entre SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:33, capaces de actuar como cebadores para la amplificación de cualquiera de los fragmentos de ADN que contengan las mutaciones C134Y, C195Y, S174N, C100Y, C304Y, W422S, S533X, 1705delG, 17062 A>C, 19882 A>T, 2266delA, 23902 A>G, T433N, 818del8, 1423delGC/insA, 1204insT, 451del3, G516X, 2389+4A>G, 1815dell l, 1186+5G>A, T740M, I771T, R279G, T446I, H562Q, C74Y, D686Y, G(2)R, E579D, S205C, D200V, V766E, L(6)P, 2544insC, C42Y, 2389+3A>C, [1587 5del5;1587del31], (23)A>C, 1054 dell l, 108delC, 1197del9, 1207delT, 1432delG, 1912delAinsCT, 2184delG, 231delC, 2399del5/ins4, 313+linsT, 338dell6, 510insC, 675dell5, 684dupl2, 94139 OT, C127R, C195R, C255G, C319Y, D157G, D630N, E291X, H635N, N59K, T41M, W515X, Y379X, Y421X. |
| 8. | Uso de las sondas oligonucleotídicas de la reivindicación 5 en un método extracorpóreo de detección in vitro de mutaciones del gen rLDL para el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar. |
| 9. | Uso de las sondas oligonucleotídicas de la reivindicación 6 en un método extracorpóreo de detección in vitro de mutaciones del gen rLDL para el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar. |
| 10. | Uso de los oligonucleótidos de la reivindicación 7 en un método extracorpóreo de detección in vitro de alguna de las mutaciones del gen rLDL seleccionadas entre C134Y, C195Y, S174N, ClOOY, C304Y, W422S, S533X, 1705delG, 17062 A>C, 19882 A>T, 2266delA, 23902 A>G, T433N , 818del8, 1423delGC/insA, 1204insT, 451del3, G516X, 2389+4A>G, 1815dell l, 1186+5G>A, T740M, 177 IT, R279G, T446I, H562Q, C74Y, D686Y, G(2)R, E579D, S205C, D200V, V766E, L(6)P, 2544insC, C42Y, 2389+3A>C, [15875del5;1587del31], ( 23)A>C, 1054 dell l, 108delC, 1197del9, 1207delT, 1432delG, 1912delAinsCT, 2184delG, 231delC, 2399del5/ins4, 313+linsT, 338dell6, 510insC, 675dell5, 684dupl2, 94139 OT, C127R, C195R, C255G, C319Y, D157G, D630N, E291X, H635N, N59K, T41M, W515X, Y379X, Y421X, para el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar. |
| 11. | Dispositivo de ensayo que comprende un soporte al que se acopla al menos una de las sondas oligonucleotídicas de la reivindicación 5, de aplicación en el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar. |
| 12. | Dispositivo de ensayo que comprende un soporte al que se acopla al menos una de las sondas oligonucleotídicas de la reivindicación 6, de aplicación en el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar. |
| 13. | Dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 que comprende además alguno de los oligonucleótidos seleccionados entre SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO: 33, de aplicación en el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar. |
| 14. | Método extracorpóreo de diagnóstico in vitro de la hipercolesterolemia familiar, caracterizado por detectar en una muestra biológica de un individuo al menos una de las mutaciones descritas en la reivindicación 1. |
| 15. | Método extracorpóreo de diagnóstico in vitro de la hipercolesterolemia familiar, caracterizado por detectar en una muestra biológica de un individuo al menos una de las mutaciones descritas en la reivindicación 1, en combinación con alguna de las mutaciones descritas en la reivindicación 2. |
| 16. | Método extracorpóreo de diagnóstico in vitro de la hipercolesterolemia familiar, caracterizado por detectar en una muestra biológica de un individuo al menos una de las mutaciones descritas en la reivindicación 1, en combinación con alguno de los polimorfismos descritos en la reivindicación 3. |
| 17. | Método de diagnóstico según las reivindicaciones 14 a 16, que comprende amplificar fragmentos de ADN que contengan las mutaciones de la reivindicación 1, solas o en combinación con las mutaciones de la reivindicación 2 y/o los polimorfismos de la reivindicación 3, por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando para ello alguno de los oligonucleótidos seleccionados entre SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO:33 o combinaciones de los mismos, sometiendo los productos de PCR a: a) un análisis por la técnica de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) , secuenciando aquellos fragmentos que presenten un patrón anómalo por SSCP; o bien b) un proceso de secuenciación inicial, seguido de un proceso adicional de secuenciación de segundos productos de PCR de las mismas muestras en aquellos casos en los que se detecten variaciones con respecto al fragmento correspondiente de SEQ ID NO: 1, para detectar las mutaciones descritas en la reivindicación 1, que opcionalmente pueden ser confirmadas con posterioridad mediante análisis de restricción o mediante el dispositivo de ensayo de las reivindicaciones 11 a 12. |
| 18. | Método de diagnóstico según las reivindicaciones 14 a 16, que comprende amplificar fragmentos de ADN que contengan las mutaciones de la reivindicación 1, solas o en combinación con las mutaciones de la reivindicación 2 y/o los polimorfismos de la reivindicación 3, por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), analizando posteriormente los productos de la PCR en un dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 mediante la cuantificación de la hibridación con las sondas oligonucleotídicas contenidas en dicho dispositivo de ensayo, para detectar la presencia de dichas mutaciones y/o polimorfismos. |
| 19. | Método de diagnóstico según la reivindicación 17, que comprende amplificar fragmentos de ADN que contengan las mutaciones de la reivindicación 1, solas o en combinación con las mutaciones de la reivindicación 2 y/o los polimorfismos de la reivindicación 3, por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando como cebadores oligonucleótidos seleccionados entre SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO:33, analizando posteriormente esos productos en un dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 mediante la cuantificación de la hibridación con las sondas oligonucleotídicas contenidas en dicho dispositivo de ensayo, para detectar la presencia de dichas mutaciones y/o polimorfismos. |
DE LA HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR BASADO EN LA
DETECCIÓN DE MUTACIONES EN LA SECUENCIA DEL GEN DEL
RECEPTOR DE LIPOPROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD (r-LDL)
Ámbito de la invención
La invención se adscribe al sector técnico-industrial del diagnóstico in vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante técnicas de ingeniería genética, para diagnosticar la posible existencia o determinar la predisposición de un individuo al desarrollo de la enfermedad denominada hipercolesterolemia familiar.
Antecedentes de la invención
La aterosclerosis se define según la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una combinación de cambios que se produce en la íntima de las arterias a consecuencia de un acumulo focal de lípidos y componentes complejos que se acompaña con la formación de tejido fibroso y calcificación que a su vez se asocia con cambios en estructura de la media.
La aterosclerosis puede considerarse como una forma especial de arteriosclerosis con un depósito patogénico de lípidos en la pared arterial. La mayoría de formas de la arteriosclerosis implican la degeneración grasa de la pared vascular, con lo que los términos arteriosclerosis y aterosclerosis suele utilizarse de forma indistinta (Assmann
G. en "Lipid Metabolism and Atherosclerosis" Schattauer Verlag GmbH, Stuttgart
1982:1).
Los lípidos son sustancias insolubles en disoluciones acuosas. Las lipoproteínas son las partículas que posibilitan el transporte de los lípidos en la sangre. Las lipoproteínas se dividen en varias categorías según su densidad dependiendo de cómo pueden separarse por ultracentrifugación, (Havel RJ y col. J Clin Invest 1955,34:1345).
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (d=l,019-l,063 g/mL) son las que mayoritariamente transportan el colesterol en el torrente circulatorio. Estas lipoproteínas están formadas por el 75% de lípidos (principalmente colesterol libre, colesterol esterificado y fosfolípidos); alrededor del 70 % del colesterol total de la sangre es transportado por las partículas LDL.
El término hipercolesterolemia se utiliza para reflejar la elevación del colesterol del plasma por encima de los niveles considerados normales para una determinada población y es uno de los factores cruciales para el inicio y progresión de la
arteriesclerosis. Más de la mitad de todas las muertes que se producen en los países desarrollados están relacionados con la enfermedad cardiovascular arteriosclerosa (Murray CJL y López AD, Lancet 1997; 349:1269-1276).
La hipercolesterolemia familiar (HF) es una enfermedad de herencia autosómica dominante causada por mutaciones que se producen en el gen del receptor de las LDL (r-LDL); este gen codifica una proteína que permite la captación y degradación intracelular de las LDL (Goldstein JL, y Brown MS Ann Rev CeIl Biol l985; 1:1-39).
La penetrancia de la HF es cercana al 100%, lo que significa que la mitad de la descendencia de una persona afectada tendrá su colesterol plasmático muy elevado desde el momento de nacer, afectando por igual a hombres y mujeres (Goldstein JL, Brown MS. The metabolic basis of inherited disease. Editores: Scriver CR, Beaudet AL, SIy WS, Valle D. McGraw HiIl New York 6 th edition, 1989; 1215-1250).
Los pacientes con HF presentan como síntomas característicos clínicos arco corneal, xantomas tendinosos y enfermedad coronaria prematura (Scientific Steering Committee on behalf of the Simón Broome Register Group. Atherosclerosis 1999; 142: 105-115). La HF es una de las enfermedades monogénicas más frecuentes, con una prevalencia estimada de pacientes heterocigotos de una en cada 500 personas y de heterocigotos de una en cada 1.000.000.
Determinadas poblaciones tales como los canadienses de habla francesa (Leitersdorf E y col. J Clin Invest 1990; 85:1014-1023), cristianos libaneses (Lehrman MA y col. J Biol Chem 1987; 262:401-410), drusos (Landsberger D y col. Am J Hum Genet 1992; 50:427-433) finlandeses (Koivisto UM y col. J Clin Invest 1992; 90:219- 228), los "afrikaners" de Suráfrica (Kotze MJ y col. Ann Hum Genet 1991; 55:115- 121), los judíos Ashkenazi de descendencia lituana (Meiner V y col. Am J Hum Genet 1991; 49:443-449) presentan la particularidad que sólo tienen unas pocas mutaciones responsables de la HF; esto es consecuencia de un efecto fundador y, por lo tanto, la frecuencia de heterocigotos en estas poblaciones es más alta que lo estimado para otras poblaciones.
Los pacientes con HF presentan una concentración de colesterol en plasma muy elevada, por regla general superior al percentil 95. La mortalidad de los pacientes con HF, ajustada por edad y sexo, es entre cuatro y cinco veces más alta que en la población general (Scientific Steering Committee on behalf of the Simón Broome Register Group. Atherosclerosis 1999; 142:105-115). Los pacientes que heredan dos mutaciones en el locus del gen del r-LDL se denominan HF homocigotos o HF heterocigotos compuestos, en cuyo caso prácticamente no hay receptores funcionales, lo que
condiciona que la concentración de c-LDL se eleve entre seis y ocho veces en relación a la considerada normal. La mayoría de pacientes de esta categoría presentan enfermedad coronaria antes de los 20 años (Goldstein JL y col. N Engl J Med 1983; 309:288-296). Si los pacientes homocigotos o los heterocigotos fueran diagnosticados antes de que presentaran signos de enfermedad coronaria y tratados de forma preventiva, su riesgo de infarto de miocardio se vería reducido de forma sustancial.
El r-LDL es una glicoproteína ubicua de membrana de 839 aminoácidos que capta e internaliza partículas LDL por un mecanismo denominado de endocitosis (Goldstein J. y Brown M. J Biol Chem 1974; 249:5153-5162). El gen del r-LDL se encuentra situado en el brazo corto del cromosoma 19 región pl3.1-13.3 (Yamamoto T y col. CeIl 1984; 39:27-38), tiene un tamaño de 45.000 pares de bases (pb). Este gen consta de 18 exones y 17 intrones los cuales codifican los seis dominios funcionales de la proteína: el péptido señal, el dominio de unión del ligando, el dominio homólogo al factor de crecimiento epidérmico (EGF), la zona de glicosilación, el dominio transmembrana y el citoplásmico (Sundhof T y col. Science 1985; 228:893-895).
La síntesis de r-LDL se encuentra regulada por un sofisticado mecanismo de retroalimentación que controla la transcripción del gen del r-LDL en función de las variaciones de la concentración intracelular de esteróles y la demanda celular de colesterol (Sudhof TC y col. J Biol Chem 1987; 262:10773-10779). Las secuencias del ADN necesarias para la regulación de la transcripción del gen del r-LDL están situadas en una región de 177 pb de la zona promotora (Sudhof TC y col. J Biol Chem 1987; 262:10773-10779). Esta región contiene todos los elementos en cis que permiten la expresión basal así como la regulación por esteróles y contiene tres repeticiones de 16 pb cada una.
Las repeticiones 1 y 3 contienen un sitio de unión para el factor de transcripción SpI y son esenciales para que se produzca la expresión basal del gen, pero requieren de la contribución de la repetición 2 para la expresión completa (Dawson PA y col. J Biol Chem 1988; 263;3372-3379). La repetición 2 incluye un elemento de regulación por esteróles de 10 pb, SRE-I (Smith JR y col. J Biol Chem 1990; 265:2306-2310) que posibilita la unión del factor de transcripción denominado SREBP-I, el cual aumenta la transcripción cuando la concentración de esteróles intracelulares disminuye. Hasta la fecha, se han descrito varias mutaciones situadas en los elementos reguladores de la transcripción del receptor LDL (Hobbs HH, y col. Hum Mutat 1992; 1:445-466;
Koivisto UM, y col. Proc Nati Acad Sci USA, 1994; 91:10526-10530), Mozas P, y col J Lipid Res 2002; 43:13-18, http://www.ucl.ac.uk/fh; http://www.umd.necker.fr).
El exón 1 codifica el péptido señal, el cual consiste en una secuencia de 21 aminoácidos que es eliminada de la proteína durante la translocación que tiene lugar en el retículo endoplásmico. Se han descrito varias mutaciones en este exón que incluyen cambios de pauta de lectura, cambios de aminoácido o codones de parada
(http://www.ucl.ac.uk/fh; http://www.umd.necker.fr).
Los exones del 2 al 6 codifican el dominio de unión al ligando, el cual consta de siete repeticiones en tándem de 40 aminoácidos. La estructura de este dominio ha sido resuelta de forma parcial (Jeon H y col. Nature Struc Biol 2001; 8:499-504). En cada repetición tiene una agrupación de aminoácidos cargados negativamente Asp-X-Ser- Asp-Glu y seis restos de cisteína que forman tres enlaces disulfuro.
El segundo dominio del r-LDL consta de una secuencia de 400 aminoácidos codificada por los exones 7 al 14. Esta secuencia tiene un 33% de homología con el factor precursor del crecimiento de la epidermis (EGFP). Al igual que el dominio de unión al ligando, esta región contiene tres repeticiones de 40 aminoácidos con secuencias ricas en cisteína. Las dos primeras repeticiones, denominadas A y B, son contiguas y están separadas de la tercera repetición por una región de 280 aminoácidos que contiene cinco copias de la secuencia YWTD (Tyr-Trp-Thr-Asp). El dominio análogo al EGFP es fundamental para la disociación acida del r-LDL de las partículas recubiertas de clatrina que tiene lugar en el endosoma durante el proceso de reciclado del receptor. De todas las mutaciones descritas hasta la fecha, aproximadamente el 55% están localizadas en la región homologa EGFP y el 35% están localizadas en las repeticiones YWTD (http://www.ucl.ac.uk/fh). El tercer dominio del r-LDL , codificado por el exón 15, es una región en la que abundan los aminoácidos treonina y serina. La función de este dominio se desconoce, pero se sabe que en esta región están ancladas las cadenas de carbohidratos. Esta zona está muy poco conservada en seis especies analizadas y se cree que desempeña una función estabilizadora del receptor. (Goldstein y col. en The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. Editores: Sciver CR, Beaudet AL, SIy WS, Valle D. 7 th Edition. McGraw Hill, 1995: 1981-2030).
El dominio transmembrana consta de 22 aminoácidos hidrofóbicos codificados por el exón 16 y el extremo 5' del exón 17. Este dominio es esencial para el anclaje del receptor a la membrana celular.
El dominio citoplásmico del r-LDL está formado por una secuencia de 50 aminoácidos codificada por la región 3' del exón 17 y la 5' del exón 18. Este dominio contiene dos secuencias señal que permiten dirigir la proteína a la superficie celular y situar al receptor en las partículas revestidas (Yokode M, y col. J CeIl Biol 1992; 117: 39-46). Este dominio es uno de los más conservados, con un porcentaje de aminoácidos conservados del 86 % entre seis especies analizadas.
Las mutaciones del r-LDL que se han encontrado en pacientes con HF se clasifican en 5 clases: alelos nulos, defectuosos en el transporte, defectuosos en la unión, en la internalización y reciclado. Por regla general cada categoría está asociada con mutaciones localizadas en una región del gen que codifica un dominio particular de la proteína. (Hobbs HH, y col. Hum Mutat 1992; 1:445-466).
La heterogeneidad que presentan los pacientes con HF en cuanto a los niveles plasmáticos de colesterol ligado a LDL(c-LDL) y enfermedad coronaria se debe en parte a diferencias en cuanto al tipo de mutación (Sun XM y col. Arterioscler Thromb Vas Biol 1993; 13:1680-1688, Kotze y col. Arterioscler Thromb Vas Biol 1993; 13:1460-1468; Gudnason V y col. Arterioscler Thromb Vas Biol 1997; 17:3092-3101). Por otra parte, el descenso que se produce en la concentración del c-LDL en pacientes HF heterocigotos tras el tratamiento con inhibidores de la hidroxi-metilglutaril coenzima A (HMGCoA) reductasa depende, en parte, de la naturaleza de la mutación del gen r-LDL (Leisterdorf E y col. Circulation 1993; 87:35-44; Jeenah M y col. Atherosclerosis 1993; 98:51-58, Sijbrands EJG y col. Atherosclerosis 1998; 136:247- 254).
El principal ligando del receptor es la partícula LDL, la cual contine una sola copia de una proteína denominada la apolipoproteína B-100 (ApoB-100) (Goldstein J y Brown M J Biol Chem 1974; 249:5153-5162). Esta apolipoproteína tiene una zona en la que abundan los aminoácidos básicos y es el lugar donde se une al receptor (Borén J y col. J Clin Inves 1998; 101: 1084-1093). Se han encontrado varias mutaciones en el gen de la apoB-100 que alteran la funcionalidad de la proteína y disminuyen la capacidad de retirada de las partículas LDL, dando como resultado el acumulo de c- LDL en plasma. Hasta la fecha se han descrito cuatro mutaciones en el gen de apo B- 100 que cursan con una hipercolesterolemia que se denomina apolipoproteína B defectuosa familiar (BDF); todas estas mutaciones se encuentran localizadas en el dominio de unión de la apo-BlOO; aminoácidos 3130-3630: R3480W, R3500Q, R3500W y R3531C (Soria L y col. Proc Nati Acad Sci USA 1989; 86: 587-591; Pullinger CR, y col. J Clin Invest 1995; 95:1225-1234; Gaffney D, y col. Arterioscler
Thromb Vasc Biol 1995; 15:1025-1029; Boren J, y col. J Biol Chem 2001; 276:9214- 9218). Una mutación que cambia el codón de la posición 3500, CGG, por CAG, dando lugar a una sustitución de una Glutamina por Arginina (R3500Q), es la más frecuente de todas las que cursan con BDF. Los pacientes heterocigotos para la mutación apo B-3500 son por regla general hipercolesterolémicos, aunque su concentración de colesterol total plasmático varía dentro del rango observado en pacientes con HF hasta concentraciones moderadamente elevadas. (Tybjaerg-Hansen A, y col. Atherosclerosis 1990; 80:235- 242; Hansen PS, y col. Arterioscl Throm Vasc Biol 1997; 17:741-747). Dado que las características y bioquímicas de estos pacientes son muy similares, el diagnóstico diferencial entre los pacientes con BDF o HF sólo es posible a través del diagnóstico genético molecular.
El diagnóstico clínico de la HF se fundamenta en los datos analíticos de lípidos y lipoproteínas del plasma, sintomatología clínica (xantomas) e historia familiar y personal de enfermedad coronaria. La OMS, a través de su programa MedPed, recomienda una serie de criterios a seguir para llevar a cabo el diagnóstico clínico de HF. Estos criterios están basados en una puntuación que depende de la historia personal y familiar de hipercolesterolemia, características clínicas y analítica del paciente. Cuando la puntuación que alcanza el paciente es igual o superior a 8 puntos el criterio clínico de diagnóstico de HF se clasifica como "seguro", entre 5 y 8 puntos de "probable" y entre 3 y 5 puntos de "posible" (Familial Hypercholesterolemia. Report of a second WHO consultation. The International MedPed FH Organization, Geneva 1998). Sin embargo, algunos pacientes no cumplen con los criterios de HF porque la historia familiar es incompleta o desconocida, o bien porque en el momento del análisis sólo presentan concentraciones moderadas de colesterol plasmático y carecen de signos de depósito de colesterol en tejidos, tales como xantomas tendinosos, arco corneal o xantelasmas.
En familias cuya mutación del gen del r-LDL se conoce se ha demostrado que el mejor "punto de corte" para el diagnóstico es utilizar el percentil 90 para la concentración de c-LDL (Umans-Eckenhausen MAW y col. Lancet 2001; 357:165-168. Sin embargo, el 18% de los pacientes portadores de la mutación presentan una concentración de colesterol total por debajo de este percentil; por otra parte, la proporción de falsos positivos fue también del 18%. Por lo tanto, se comete un porcentaje alto de diagnósticos equivocados si se utiliza sólo la cifra de colesterol plasmático. Se ha publicado que más del 50% de los pacientes con HF no reciben tratamiento farmacológico hipolipemiante ni consejo dietético como consecuencia de no
haber sido diagnosticados correctamente como pacientes con HF (Williams RR y col. Am J Cardiol 1993; 72:18D-24D).
El conocimiento de las bases moleculares de la HF ha permitido que se pueda realizar el diagnóstico inequívoco a nivel del ADN en la gran mayoría de casos: la demostración de un defecto molecular en el gen del r-LDL constituye una confirmación definitiva del diagnóstico (Familial Hypercholesterolemia. Report of a second WHO consultation. The International MedPed FH Organization, Geneva 1998). El diagnóstico preciso de la HF es posible utilizando métodos de biología molecular; sin embargo, en la actualidad su utilidad en poblaciones heterogéneas se encuentra limitada debido a la gran heterogeneidad de las mutaciones del gen del r-LDL.
En la solicitud PCT WO-88/03175 (Biotechnology Research Partners, Ltd.) se reivindica un método para el diagnóstico de la aterosclerosis que se basa en la detección de la presencia o ausencia de varios polimorfismos en la región génica de la apolipoproteína AI-CIII-AIV, o en los genes apoB, apoCI, apoAII, así como en el gen del receptor de LDL. Concretamente para este gen, se presenta el empleo de los polimorfismos Cfrl31 y BstEII.
Otro documento de interés es la patente japonesa JP- 10099099, que se refiere al empleo de una mutación en el triplete codificante del aminoácido 109, en concreto la inserción de una C, para el diagnóstico de anormalidades en el gen del receptor de LDL, aunque no se menciona concretamente el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar.
Las patentes norteamericanas US-4.745.060 y US-4.966.837, ambas de la
Universidad de Texas, presentan métodos para el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar basándose en mutaciones en el gen del receptor de LDL. Sin embargo, lo que se reivindica en US-4.745.060 son secuencias correspondientes al gen "normal", presentando un ejemplo puntual de una mutación que se define por el cambio del mapa de restricción con Xba I. En US-4.966.837, por su parte, se reivindica el empleo de varias enzimas de restricción (Eco RI, Asp 718, Taq I, Bam HI, Xba I, Inf. I, BgI II, CIa I, Eco RV, Kpn I, Pvu II, Sph I, Sst I, Sst II, Stu I, Xho I, Nde I y Nsi I) en un método para determinar mutaciones en el gen r-LDL, que se basa en observar la alteración del modelo de restricción con estas enzimas frente al modelo correspondiente al gen normal.
Los documentos de patente más próximos a la invención son WO02/06467 y WO01/53520, en los que se describen métodos de detección de errores en el metabolismo lipídico basados en una serie de mutaciones y polimorfismos del gen r- LDL. Sin embargo, ninguna de las mutaciones ni polimorfismos descritos en dichas
patentes coinciden con los reivindicados en la presente solicitud, por lo que la presente invención pone de manifiesto un método de diagnóstico alternativo al descrito en el Estado de la Técnica.
Descripción detallada de la invención
La nomenclatura de las mutaciones y los polimorfismos viene definida en
- Antoranakis S. E and the Nomenclatura Working Group, Recommendations for a Nomenclature Systems for Human Gene Mutations. Human Mutation 11:1-3; 1998. - Dunnen JT, Antoranakis S.E. Mutation Nomenclature Extrensions and
Suggestions to describe Complex Mutations: A Discusión. Human Mutation 15:7-12, 2000. Asimismo el concepto del polimorfismos se define en
Harris H. The Principies of Human Biochemical Genetics 3rd Edition. Amsterdam. North-Holland 1980.
- Beauder AL, Scriver CL, SIy WS, Valle D. Genetics, Biochemistry and Molecular Basis of Variant Human Phenotypes, en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. Editores Beaudet AL, Scriver CR, SIy WS, Valle D 7 a Edition. pg. 53 MacGraw HiIl. New York 1995. Se han detectado, aislado y caracterizado toda una serie de mutaciones nuevas que se detallan a continuación. Asimismo, toda una serie de mutaciones y polimorfismos ya descritos, se han combinado con aquéllas para analizar la probabilidad de que un individuo desarrolle hipercolesterolemia familiar. Todas las mutaciones y polimorfismos que en esta invención se relacionan con el desarrollo de la hipercolesterolemia familiar, se producen en la secuencia génica SEQ ID NO :1 correspondiente al gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad (r-LDL). Es decir, todas las mutaciones se producen en el mismo gen, se emplean en el mismo dispositivo de ensayo, utilizándose la misma tecnología, para determinar, según un mismo método, extracorpóreamente e in vitro, la probabilidad de desarrollar la misma enfermedad, lo que apoya el carácter unitario de la invención.
En la Tabla I se detallan todas las mutaciones nuevas detectadas, según la nomenclatura científicamente aprobada y detallada en las publicaciones mencionadas anteriormente. Asimismo se les otorga un código alfa-numérico. La Tabla IA contiene las mutaciones de la patente principal ES 200300206 y de la primera Patente de Adición
a ella, ES200302671 y la Tabla IB contiene las mutaciones de la presente patente de adición a dicha patente principal.
En la Tabla II se detallan mutaciones conocidas, cuyo uso en combinación con las mutaciones de la Tabla I, en dispositivos de ensayo in vitro para diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar es una de las formas preferidas de realización de la invención. Asimismo, de forma análoga a lo mencionado para las mutaciones conocidas, en la Tabla III se detallan polimorfismos.
Las mutaciones de aminoácidos se representan en códigos de una letra que tienen su equivalencia según la Tabla IV.
TABLA IA: Mutaciones de la Patente Principal y de la primera Patente de Adición
TABLA IB: Mutaciones de la presente Patente de Adición
TABLA III.
TABLA IV.- CÓDIGOS AMINOÁCIDOS
Dispositivo de ensayo (biochip)
El dispositivo de ensayo (biochip) desarrollado en la invención consta de un soporte que presenta en su superficie toda una serie de sondas que se recogen en el listado de secuencias. Estas sondas oligonucleotídicas son capaces de hibridar con las
secuencias mutadas contenidas en las Tablas I (IA y/o IB), II y III. La sistemática a utilizar sería la siguiente, para cada una de las mutaciones:
Impresión de los portas de vidrio • Se imprimen las sondas oligonucleotídicas capaces de detectar la mutación en un porta de vidrio aminosilanado empleando DMSO como tampón de impresión.
• La impresión se lleva a cabo con un "spotter" o impresor de oligonucleótidos en el que se controlan la temperatura y la humedad.
Procesamiento de los portaobjetos de vidrio
• Tras la impresión se somete a un tratamiento con radiación ultravioleta.
Preparación de la muestra a hibridar
• Se extrae el ADN del paciente a partir de una muestra de sangre de aproximadamente 300 μl mediante un protocolo de filtración.
• Se amplifican para dicho paciente todos los exones y el promotor del gen del receptor LDL, a través de PCR multiplex.
• En la misma reacción de amplificación se incorpora un nucleótido unido a biotina constituyendo un mareaje indirecto que requiere un revelado final con un complejo fluoróforo-estreptavidina.
• Se comprueba en gel de agarosa que ha tenido lugar reacción de amplificación.
• Se somete a fragmentación la muestra a hibridar.
• Se añade el tampón de hibridación.
• Se procede a la desnaturalización durante 15 minutos a 95 0 C.
Hibridación
• La hibridación se lleva a cabo automáticamente en la estación desarrollada para tal fin por Amersham Biosciences.
• Se hibrida el portaobjetos. • Se inyecta con una pipeta Hamilton la solución a hibridar.
• Se híbrida durante 1 hora.
• Se lava 3 veces con tampón de lavado.
• La estación procede al secado del soporte de vidrio.
Escaneado del portaobjetos
• Se introduce el portaobjetos en el escáner.
• Se procede a escanear la señal emitida por el mareaje estándar al ser excitado por el láser.
Cuantífícación de la imagen
• El software del escáner nos permite cuantificar en la imagen obtenida la señal de los puntos donde se ha producido hibridación.
• A partir de la señal que se obtiene en los oligonucleótidos que detectan el alelo normal y el mutado establecemos la presencia o ausencia de la mutación en el paciente.
Cada mutación presenta en el portaobjetos cuatro sondas oligonucleotídicas repetidas 10 veces para su detección. Dos de ellas detectan el alelo normal y otras dos el mutado. La base interrogada se encuentra siempre en posición central. En el caso de un individuo normal, éste no presenta alelo mutado. Por consiguiente, en la imagen que se obtiene del soporte de vidrio los oligonucleótidos que detectan dicho alelo no presentan señal de hibridación o una señal menor que los oligonucleótidos que detectan el alelo normal.
Por el contrario, un individuo heterocigoto para la mutación presenta el alelo normal y el mutado. De ahí que los oligonucleótidos que detectan el alelo normal y el mutado presentan un señal de hibridación equivalente.
A continuación se detallan mediante ejemplos el análisis de algunas de las mutaciones detectadas con el dispositivo de ensayo de la invención.
Identificación de Mutaciones Puntuales
A partir de una muestra de ADN de un paciente se procedió a la amplificación de todos los exones y del promotor del gen r-LDL mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de los cebadores y tamaños de los fragmentos amplificados en estas PCR son los descritos a continuación en la Tabla V:
TABLA V.- Cebadores y fragmentos amplificados en la muestra del paciente
La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 20 μL con
200 ng de ADN en una mezcla de 2OmM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl. 1,5 mM MgCl2, 200 μM de cada dNTP, 0,2 μM de cada oligonucléotido y 0,6 unidades de Taq
ADN polimerasa (Eco Taq). Los ciclos de amplificación fueron: 2 minutos de desnaturalización a 94°C, seguido de 35 ciclos: desnaturalización a 94°C durante 20 segundos, hibridación a 63°C durante 20 segundos y elongación a 72°C durante 50 segundos. Al final de los ciclos se realizó una extensión a 72°C durante 4 minutos.
EJEMPLO 1: Identificación de mutaciones localizadas en el exón 4 del gen del r-
LDL
Se amplificó un fragmento de 561 pb del exón 4 por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebadores los oligonucleótidos A4F (SEQ ID NO: 8) y A4R (SEQ ID NO:9), utilizando las condiciones de reacción anteriormente descritas.
Los productos de PCR fueron caracterizados por secuenciación para detectar mutaciones, confirmándose los cambios observados mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La presencia de una mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente mediante el dispositivo descrito ("biochip").
Análisis de la mutación C 134 Y
Esta mutación (464G>A, TGOTAC, Cysl34Tyr) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 561 pb correspondiente al exón 4 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores A4F (SEQ ID NO: 8) y A4R (SEQ ID NO:9).
El cambio G>A observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37. Esta mutación se encontró en una mujer de 41 años cuyas cifras máximas de CT y cLDL alcanzaron unos niveles de 380 y 302 mg/dl respectivamente, con niveles de TG y cHDL normales. El padre había sido hipercolesterolémico y sufrido un infarto de miocardio (IAM) a los 51 años y un hermano de la probando con cifras de colesterol de 321 mg/dl había sufrido un IAM prematuro a los 31 años de edad. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 9
puntos. El tratamiento hipolipemiante con Simvastatina (20 mg/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 272 y 197 mg/dl respectivamente.
Análisis de la mutación C195Y Esta mutación (647G>A, TGT>TAT, Cysl95Tyr) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 561 pb correspondiente al exón 4 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores A4F (SEQ ID NO: 8) y A4R (SEQ ID NO:9).
El cambio G>A observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44 y SEQ ID NO:45.
Esta mutación se encontró en una mujer hipercolesterolémica de 54 años con xantomas aquileos y arco corneal completo y cuyas cifras máximas de CT y cLDL alcanzaron unos niveles de 415 y 335 mg/dl respectivamente, con niveles de TG y cHDL normales. El padre y un hijo de la paciente también presentaron hipercolesterolemia con cifras de CT superiores a 300 mg/dL. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 16 puntos. El tratamiento hipolipemiante con Simvastatina (30mg/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 257 y 166 mg/dl respectivamente.
Análisis de la mutación S174N
Esta mutación (584G>A, AGOAAC, Serl74Asn) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 561 pb correspondiente al exón 4 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores A4F (SEQ ID NO: 8) y A4R (SEQ ID NO:9).
El cambio G>A observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación
puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 y SEQ ID NO:53.
Esta mutación se encontró en un varón hipercolesterolémico de 44 años con xantomas en los extensores de las manos y arco corneal y cuyas cifras máximas de CT y cLDL alcanzaron unos niveles de 353 y 289 mg/dl, con niveles de TG y cHDL normales. Su madre y un hermano también presentaron hipercolesterolemia. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 16 puntos. El tratamiento hipolipemiante con Simvastatina (40mg/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 306 y 242 mg/dl respectivamente.
Análisis de la mutación C100Y
Esta mutación (362G>A, TGOTAC, CyslOOTyr) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 561 pb correspondiente al exón 4 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores A4F (SEQ ID NO: 8) y A4R (SEQ ID NO:9).
El cambio G>A observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 y SEQ ID NO:57.
Esta mutación se encontró en una mujer hipercolesterolémica de 62 años con xantomas aquíleos y en los extensores de la mano, arco corneal y xantelasmas y cuyas concentraciones de CT y cLDL plasmático eran de 355 y 294 mg/dl respectivamente, y TG y cHDL normales. La madre, una hermana y una hija de la probando también presentaron hipercolesterolemia. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 12 puntos.
EJEMPLO 2: Identificación de mutaciones localizadas en el exón 7 del gen del r- LDL
Se amplificó un fragmento de 291 pb del exón 7 por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebadores los oligonucleótidos A7F (SEQ ID NO: 14) y A7R (SEQ ID NO: 15), utilizando las condiciones de reacción anteriormente descritas.
Los productos de PCR fueron caracterizados por secuenciación para detectar mutaciones, confirmándose los cambios observados mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La presencia de una mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente mediante el dispositivo descrito ("biochip").
Análisis de la mutación C304Y
Esta mutación (974G>A, TGT>TAT, Cys304Tyr) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 291 pb correspondiente al exón 7 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores A7F (SEQ ID NO: 14) y A7R (SEQ ID NO: 15). El cambio G>A observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO:41.
Esta mutación se encontró en una mujer hipercolesterolémica de 65 años cuyas cifras máximas de CT y cLDL alcanzaron unos niveles de 423 y 348 mg/dl, con niveles de TG y cHDL normales. No fue posible conocer datos familiares de lípidos plasmáticos. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 10 puntos. El tratamiento hipolipemiante con Atorvastatina (lOmg/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 299 y 240 mg/dl respectivamente.
EJEMPLO 3: Identificación de mutaciones localizadas en los exones 9 y 10 del gen del r-LDL
Se amplificó un fragmento de 646 pb correspondiente a los exones 9 y 10 por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebadores los oligonucleótidos A9F (SEQ ID NO: 18) y A9R (SEQ ID NO: 19), utilizando las condiciones de reacción anteriormente descritas.
Los productos de PCR fueron caracterizados por secuenciación para detectar mutaciones, confirmándose los cambios observados mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La presencia de una mutación
identificada por secuenciación se analizó posteriormente mediante el dispositivo descrito ("biochip").
Análisis de la mutación W422S Esta mutación (1328G>C, TGOTCG, Trp422Ser) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 646 pb correspondiente a los exones 9 y 10 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores A9F (SEQ ID NO: 18) y A9R (SEQ ID NO: 19).
El cambio G>C observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72: y SEQ ID NO:73.
Esta mutación se encontró en un varón de 51 años con xantelasmas y cuyas cifras CT y cLDL alcanzaron fueron de 397 y 325 mg/dl respectivamente, con niveles de cHDL de 45 mg/dl y TG de 137 mg/dl. Varios familiares de primer grado también presentaron hipercolesterolemia. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 8 puntos.
EJEMPLO 4: Identificación de mutaciones localizadas en el exón 11 del gen del r- LDL
Se amplificó un fragmento de 302 pb del exón 11 por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebadores los oligonucleótidos AlOF (SEQ ID NO:20) y AlOR (SEQ ID NO:21), utilizando las condiciones de reacción anteriormente descritas.
Los productos de PCR fueron caracterizados por secuenciación para detectar mutaciones, confirmándose los cambios observados mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La presencia de una mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente mediante el dispositivo descrito ("biochip").
Análisis de la mutación S533X
Esta mutación (1661OA, TCOTAG, Ser533Stop) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 302 pb correspondiente al exón 11 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores AlOF (SEQ ID NO:20) y AlOR (SEQ ID NO:21).
El cambio OA observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64 y SEQ ID NO:65.
Esta mutación se encontró en una mujer de 51 años que había tenido un IAM a los 48 años y cuyas cifras de CT y cLDL alcanzaron unos niveles de 474 y 377 mg/dl respectivamente, con niveles de TG y cHDL normales. Varios familiares de primer grado también presentaron hipercolesterolemia. Un hermano con hipercolesterolemia sufrió un IAM prematuro a los 44 años. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 12 puntos.
Análisis de la mutación 1705delG
Esta deleción (1705delG) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 302 pb correspondiente al exón 11 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores AlOF (SEQ ID NO:20) y AlOR (SEQ ID NO:21).
Esta mutación observada se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68 y SEQ ID NO:69.
Esta mutación se encontró en una mujer de 64 años con arco corneal y CT y cLDL de 516 y 412 mg/dl respectivamente, con TG y cHDL normales. Varios familiares de primer grado también presentaron hipercolesterolemia. Un hermano falleció a los 54 años de muerte súbita y una hermana con elevados niveles de CT sufrió un IAM prematuro a los 57 años. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar
alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 10 puntos. El tratamiento hipolipemiante con Atorvastatina (40mg/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 332 y 244 mg/dl respectivamente.
EJEMPLO 5: Identificación de mutaciones localizadas en el exón 12 del gen del r- LDL
Se amplificó un fragmento de 376 pb del exón 12 por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebadores los oligonucleótidos AI lF (SEQ ID NO:22) y AI lR (SEQ ID NO:23), utilizando las condiciones de reacción anteriormente descritas.
Los productos de PCR fueron caracterizados por secuenciación para detectar mutaciones, confirmándose los cambios observados mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La presencia de una mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente mediante el dispositivo descrito ("biochip").
Análisis de la mutación 1706-2 A>C
Esta mutación (1706-2 A>C) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 376 pb correspondiente al exón 12 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores Al IF (SEQ ID NO:22) y Al IR (SEQ ID NO:23).
El cambio A>C observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 y SEQ ID NO:49.
Esta mutación se encontró en dos familias nos relacionadas y con historia de hipercolesterolemia. Uno de los sujetos portadores era un varón de 42 años con xantomas aquíleos, arco corneal y xantelasmas y cuyas cifras máximas de CT y alcanzaron unos niveles de 390 mg/dl, con niveles de TG y cHDL normales. Varios familiares de primer grado también presentaron hipercolesterolemia grave. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 18 puntos. El tratamiento hipolipemiante con pravastatina (40mg/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 350 y 274 mg/dl respectivamente.
EJEMPLO 6: Identificación de mutaciones localizadas en los exones 13 y 14 del gen del r-LDL
Se amplificó un fragmento de 607 pb que incluía los exones 13 y 14 por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebadores los oligonucleótidos Al 2F (SEQ ID NO:24) y Al 2R (SEQ ID NO:25), utilizando las condiciones de reacción anteriormente descritas.
Los productos de PCR fueron caracterizados por secuenciación para detectar mutaciones, confirmándose los cambios observados mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La presencia de una mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente mediante el dispositivo descrito ("biochip").
Análisis de la mutación 1988-2 \>T Esta mutación (1988-2 A>T) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 607 pb correspondiente a los exones 13 y 14 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores Al 2F (SEQ ID NO:24 y Al 2R (SEQ ID NO:25).
El cambio A>T observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80 y SEQ ID NO:81.
Esta mutación se encontró en una mujer de 67 años con arco corneal cuyas cifras de CT y cLDL alcanzaron unos niveles de 480 y 402 mg/dl, con niveles de TG y cHDL normales. La madre también presento una hipercolesterolemia grave con cifras de colesterol plasmático de 400 mg/dl.. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 9 puntos. El tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (lOmg/día) combinado con colestiramina (4g/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 261 y 188 mg/dl respectivamente.
EJEMPLO 7: Identificación de mutaciones localizadas en el exón 15 del gen del r- LDL
Se amplificó un fragmento de 359 pb del exón 15 por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebadores los oligonucleótidos Al 3F (SEQ ID NO:26) y Al 3R (SEQ ID NO:27), utilizando las condiciones de reacción anteriormente descritas.
Los productos de PCR fueron caracterizados por secuenciación para detectar mutaciones, confirmándose los cambios observados mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La presencia de una mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente mediante el dispositivo descrito ("biochip").
Análisis de la mutación 2266delA
Esta mutación (2266delA) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 359 pb correspondiente al exón 15 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores Al 3F (SEQ ID NO:26) y Al 3R (SEQ ID NO:27). La deleción de una adenina observada se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 y SEQ ID NO:61. Esta mutación se encontró en una mujer hipercolesterolémica de 21 años cuyas cifras de CT y cLDL fueron de 411 y 356 mg/dl respectivamente, con niveles de cHDL y TG normales. Varios familiares de primer grado (padre y hermana) presentaron también hipercolesterolemia. Su padre había fallecido de muerte súbita a la temprana edad de 39 años. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 12 puntos.
EJEMPLO 8: Identificación de mutaciones localizadas en el exón 17 del gen del r- LDL
Se amplificó un fragmento de 384 pb del exón 17 por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebadores los oligonucleótidos Al 5F
(SEQ ID NO:30) y Al 5R (SEQ ID NO:31), utilizando las condiciones de reacción anteriormente descritas.
Los productos de PCR fueron caracterizados por secuenciación para detectar mutaciones, confirmándose los cambios observados mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La presencia de una mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente mediante el dispositivo descrito ("biochip").
Análisis de la mutación 2390-2 A>G Esta mutación (2390-2 A>G) se caracterizó mediante secuenciación automática del fragmento de 384 pb correspondiente al exón 17 del gen del rLDL al analizar este fragmento en pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit Dyenamic Et Dye Terminador Kit (Amersham Biosciences) y los cebadores A15F (SEQ ID NO:30) y A15R (SEQ ID NO:31).
El cambio A>G observado se confirmó mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. Alternativamente, esta mutación puede analizarse con el dispositivo descrito ("biochip") utilizando en el soporte los oligonucleótidos SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76 y SEQ ID NO:77. Esta mutación se encontró en una mujer de 46 años con arco corneal y concentraciones plasmáticas de CT y cLDL de 443 y 370 mg/dl respectivamente, con niveles de TG y cHDL normales. Su madre y un hijo también presentaron hipercolesterolemia. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 12 puntos. El tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (20mg/día) combinado con colestipol redujo su concentración de CT y cLDL a 198 y 146 mg/dl respectivamente.
Next Patent: INTRAOCULAR LENS FOR ACHROMATISING THE EYE AND REDUCING THE ABERRATIONS THEREOF