Verfahren und Vorrichtung zur Messung der Aktivität einer biologisch wirksamen Substanz in einem histologischen Präparat Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Aktivität einer biologisch wirksamen Substanz, wie etwa eines Enzyms oder eines Enzymsubstrats in einem histologischen Präparat, insbesondere zur Stoffwechsel-oder/und Tu- mordiagnostik, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Aus der DE 195 27 160 ist ein Verfahren zur Messung der Konzentration ei- nes Enzyms bekannt, bei dem man die Konzentration eines durch Umsetzung des Enzyms mit einer Substratlösung enzymatisch gebildeten Farbstoffs in einer Meßlösung photometrisch bestimmt.

Aus der DE 36 14 470 ist es bekannt, die Enzymkonzentration über eine An- derung der optischen Dichte quantitativ zu bestimmen.

Aus der DE 196 40 121 ist ein Verfahren zur Bestimmung einer sich zeitab- hängig ändernden Meßgröße bekannt, wobei der Maximalwert in einem Be- reich mit linearem Reaktionsverlauf ermittelt wird und der Zeitpunkt sowie die Größe des Reaktionszeitfensters mit dem linearen Bereich variabel ist und von der Art der Reaktion und den Reaktionsbedingungen abhängig ist.

Bei diesen bekannten Verfahren wird die Konzentration. der zu messenden Substanz in der Lösung gemessen und sie gestatten keine unmittelbare Mes- sung an einem Gewebepräparat selbst.

übliche Praxis ist es, histologische Schnittpräparate mit einem für eine be- stimmte Enzymreaktion spezifischen Farbstoff zu färben, sodaß unter dem Mikroskop Bereiche unterschiedlicher Farbintensität zu erkennen sind. Analy- sen in bezug auf eine Enzymverteilung oder gar Enzymkonzentration in den verschiedenen Bereichen des Schnittpräparats sind nicht möglich.

Aus Lojda et al, 1965, Folia Morphol. 13 : 84 ist es bekannt, Dehydrogenasen in histologischen Strukturen qualitativ ortsaufgelöst darzustellen. Ferner bekannt ist es, daß die maximale angenähert lineare Reaktionsgeschwindigkeit des Umsatzes (V-max) für ein Enzym unter definierten Bedingungen, wie Tempe- ratur, pH-Wert lonenkonzentration, spezifisch ist, und diesen V-max-Wert zur Quantifizierung des Enzymumsatzes zu verwenden.

Die DE 44 11 661 zeigt schließlich ein videotechnisches Analyseverfahren zur gleichzeitigen quantitativen hydrogeologischen Ermittlung einer Vielzahl von chemischen Parametern eines flüssigen oder gasförmigen Mediums, wie etwa Grundwasser, in matrixartigen Reagentienfeldern anhand von Farbintensitäten.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, mit denen man unmittelbar an einem histologischen Präparat die Aktivität einer bestimmten biologisch wirksamen Substanz zumindest angenähert quantitativ messen kann.

Zur Lösung der Aufgabe wird ein Verfahren zur Messung der Aktivität einer biologisch wirksamen Substanz in einem histologischen Präparat vorgeschla- gen, mit folgenden Schritten : -Anordnen des Präparats mit Reagentien, welche durch Aktivität der Substanz zumindest eine optische Eigenschaft des Präparats ändern, vor einer Bildaufnahmevorrichtung ; -nacheinander Aufnehmen mehrerer Bilder von dem Präparat ; -Ermitteln einer zeitlichen änderung der optischen Eigenschaft in zumindest einem ausgewählten Bildbereich durch Vergleichen der nacheinander aufgenommenen Bilder ; und -Ermitteln der Konzentration der Substanz in dem ausgewähiten Bildbereich aus der zeitlichen änderung der optischen Eigen- schaft in dem ausgewählten Bildbereich.

Hierbei wird das Präparat-etwa ein histologisches Schnittpräparat oder eine Gewebeprobe-mitsamt den Reagentien, welche aufgrund der Aktivität der zu messenden Substanz die jeweilige optische Eigenschaft des Präparats ändern, vor der Bildaufnahmevorrichtung angeordnet. Die zu messende Substanz be- wirkt eine änderung der optischen Eigenschaft in jenem Bereich des Präpa- rats, in dem die zu messende Substanz vorhanden ist. Nimmt man dann nach- einander mehrere Bilder des Präparats auf, erkennt man eine änderung der optischen Eigenschaft in dem Bereich des Präparats über die Zeit. Die ände- rungsgeschwindigkeit, insbesondere die maximale änderungsgeschwindigkeit der optischen Eigenschaft steht in einem vorbekannten proportionalen Verhält- nis zur Konzentration der Substanz. Man erhält somit aus der zeitlichen ände- rung ein Maß für die Substanzkonzentration, und zwar in Zuordnung zum je- weils gewählten Bildbereich des Präparats, zur Unterscheidung zwischen sol- chen Bildbereichen, in denen die Substanz aktiv ist, und solchen, in denen sie nicht oder im abweichenden Maße aktiv ist. Man erhält somit eine bildlich Darstellung von Substanzkonzentrationen.

Eine besonders genaue Messung der Substanzkonzentration ist möglich, wenn die Konzentration der Substanz aus der stärksten zeitlichen änderung der optischen Eigenschaft in dem ausgewählten Bildbereich ermittelt wird, und wenn die Konzentration der Substanz in einem Bereich angenähert linearer zeitlicher änderung der optischen Eigenschaft, insbesondere die Extinktions- änderung, in dem ausgewählten Bildbereich ermittelt wird.

Die optische Eigenschaft kann die Helligkeit oder/und die Farbe oder/und die Farbintensität oder/und die Zunahme einer Farbstoffkonzentration oder/und die Fluoreszenz des Präparats beinhalten.

Zur Entfernung von Störkomponenten kann man vor dem Aufnehmen der mehreren Bilder von dem Präparat zumindest ein Referenzbild aufnehmen.

Dann kann man auf die optische Eigenschaft bezogene Datenwerte des Refe- renzbilds mit auf die optische Eigenschaft bezogenen Datenwerten der nach- einander aufgenommenen Bilder verrechnen, insbesondere hiervon subtrahie- ren. Sodann kann die änderung der optischen Eigenschaft des gewählten Bildbereichs durch Vergleich der entstörten, nacheinander aufgenommenen Bilder ermittelt werden.

Hierbei kann das Referenzbild zur Nullwertfestlegung herangezogen werden, und zur Bestimmung der Konzentration der Substanz nicht deren Absolutwert, sondern die Differenz der optischen Eigenschaft zwischen dem Referenzbild und den späteren Bildern zur Bestimmung der Aktivität der zu messenden Substanz herangezogen werden.

Hierbei kann das Referenzbild denselben Bildausschnitt des Präparats wieder- geben wie die späteren Meßbilder, wobei das Refer. enzbild bevorzugt das erste Bild der nacheinander aufgenommenen Bilder ist.

Alternativ oder zusätzlich läßt sich ein Referenzwert verwenden, der in einem gewebefreien Bereich des Präparats aufgenommen wird, in dem keine Aktivi- tät der zu messenden Substanz zu erwarten ist, wobei dieser Referenzwert mit Bilddaten des zumindest einen ausgewähiten Bildbereichs verrechnet, insbesondere davon abgezogen wird.

Die biologisch aktive Substanz kann Enzymsubstrat oder ein Enzym sein, des- sen Aktivität anhand der zeitlichen Konzentrationsänderung des zugeordneten Enzymsubstrats oder des zugeordneten Enzymprodukts gemessen wird.

Zur Erhöhung der Meßgenauigkeit können während der Messung die Tempe- ratur, der pH-Wert oder/und die lonenkonzentration in dem Präparat oder/und die Intensität der Beleuchtung konstant gehalten werden.

Zur Messung von Enzymaktivitäten hat es sich bewährt, wenn über 5 bis 30 Minuten, insgesondere 15 Minuten hinweg, nacheinander Einzelbilder mit ei- nem gleichmäßigen Abstand von 5 Sekunden bis 2 Minuten, insbesondere 1 Minute, aufgenommen werden.

Bevorzugt wird mit der Bildaufnahmevorrichtung im Durchlicht die Extinktions- änderung im histologischen Schnittpräparat gemessen, wobei die Kalibrierung mit Filtern, insbesondere Grauwertfiltern, erfolgen kann.

Als Bildaufnahmevorrichtung kann eine Fotokamera, eine Filmkamera oder, besonders bevorzugt, eine Videokamera verwendet werden, wobei die ände- rung der optischen Eigenschaft im ausgewähiten Bildbereich pixelweise aufge- löst gemessen und ausgewertet wird.

Insbesondere zur Durchführung des obigen Verfahrens wird eine Vorrichtung zur Messung der Aktivität einer biologisch wirksamen Substanz in einem histo- logischen Präparat vorgeschlagen, umfassend : -eine Bildaufnahmevorrichtung zum nacheinander Aufnehmen mehrerer Bilder von dem Präparat, das mit Reagentien behandelt ist, welche durch Aktivität der Substanz zumindest eine optische Eigenschaft des Präparats ändern, -eine Vorrichtung zum Ermitteln einer zeitlichen änderung der op- tischen Eigenschaft in zumindest einem ausgewählten Bildbe- reich durch Vergleichen der nacheinander aufgenommenen Bil- der ; und -eine Vorrichtung zum Ermitteln der Konzentration der Substanz in dem ausgewählten Bildbereich aus der zeitlichen änderung der optischen Eigenschaft in dem ausgewählten Bildbereich.

Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen unter Hinweis auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 zeigt ein Schema einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ; Fig. 2 zeigt ein Zeitdiagramm einer typischen Enzym-Enzymsubstrat-Reaktion ; Fig. 3 zeigt ein Meßbeispiel mit Angabe von Grauwerten ; und Fig. 4 zeigt das Meßbeispiel von Fig. 3 nach Umrechnung der Grauwerte in Extinktionswerte.

Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver- fahrens. Ein Mikroskop 1, hier ein Durchlichtmikroskop, zur Betrachtung eines zu untersuchenden Präparats 3 ist mit einer Farb-oder Schwarzweiß-Videoka- mera 5 zur Aufnahme eines Bilds von dem Präparat 3 ausgestattet. Das Mi- kroskop 1 und die Kamera 5 bilden eine Bildaufnahmevorrichtung, die in einer hier auf 0, 5°C klimatisierten Klima-und Verdunklungskammer 7 angeordnet ist. Die Kamera 5 ist über einen Videorecorder 9 mit einem Computer 11 ver- bunden, in dem die von der Kamera 1 oder dem Videorecorder 9 gelieferten Bilder rechnerisch ausgewertet werden können.

Die Klimakammer 7 wird von einem externen Klimagerät 13 klimatisiert, wel- ches von einem Kyrostatwasserbad 15 mit Kühlwasser versorgt wird. Sowohl das Klimagerät 13 als auch die Beleuchtung des Mikroskops 1 werden mit einem Netzteil 17 mit Strom, hier Gleichstrom, versorgt. Die Videokamera 5 ist mit einem außerhalb der Klimakammer 7 angeordneten Steuernetzteil 19 ver- bunden. Der Videorecorder 9 ist an einen Videomonitor 21 angeschlossen, und der Computer 11 an einen Computermonitor 23.

Zur überwachung konstanter Versuchsbedingungen ist nahe dem Präparat 3 ein Temperaturfühler 25-angeordnet, dessen Ausgang über ein Temperatur- meßgerät 27 an einen Kanal eines Zweikanal-Spannung-Zeit-Schreibers 29 angeschlossen ist. Der andere Kanal des Schreibers 29 erhält ein Signal von einer Lux-Meßsonde 31, die auf einem Randbereich des Bildschirms des Computermonitors 23 fixiert ist, um eventuelle Grundhelligkeitsschwankungen des gesamten Aufnahmesystems aus Mikroskopbeleuchtung, Kamera 5, Com- puter 11, etwa durch Netzspannungsschwankungen, zu überwachen.

Zur Messung der Aktivität einer Substanz in dem histologischen Präparat 3 wird das Präparat 3 mit Reagentien, insbesondere Farbstoffen, behandelt, welche eine optische Eigenschaft, wie etwa die Farbintensität des Präparats, durch Aktivität der zu messenden Substanz ändern, um letztlich eine Extink- tionsänderung in dem Präparat zu bewirken. Das so behandelte Präparat wird unter das Objektiv des Mikroskops 1 gebracht. Mittels der Videokamera 5 wer- den ausgewählte Bildbereiche Ba (in Fig. 1 auf dem Computermonitor 23 dar- gestellt) der Schnitte bei definierten Lichtintensitäten und konstanter Tempera- tur aufgenommen. über einen Zeitverlauf von hier ca. 15 Minuten wird jede Minute ein Bild B aufgenommen. Die resultierenden Bilddaten werden über eine Bilderfassungskarte (AD-Wandler) dem Computer 11 übermittelt und dort mit einem Bildverarbeitungsprogramm verrechnet.

Die Meßreihe ergibt in den jeweiligen Pixeln oder den ausgewählten Bildberei- chen Ba, in denen die Substanz gemessen werden soll, aufgrund der Aktivität der zu messenden Substanz eine zeitliche änderung der jeweiligen optischen Eigenschaft, etwa eine als Extinktion meßbare zunehmend intensive Färbung.

Die Geschwindigkeit, insbesondere die maximale Geschwindigkeit, der Zu- nahme wird als Maß für die Substanzaktivität herangezogen.

Zur Verbesserung der Störunempfindlichkeit der Bildauswertung können die Daten der einzelnen Pixel des ersten Bildes als Referenzbild Bref der Bildserie als Nullwerte von denen der nachfolgend aufgenommenen Bilder abgezogen werden. Dann wähit man einen Bereich im histologischen Schnitt, der nicht gemessen werden soll oder/und der keinerlei Gewebesubstanz aufweist (nicht- ausgewählter Bereich Bna) aus und ermittelt dort einen Leerwert. Auch dieser Leerwert wird von den Daten der Pixel der jeweiligen Bilder abgezogen. Dieser zweistufige Nullwert-und Leerwertabzug führt zu Bildern B ohne die durch Licht erzeugte unspezifische Färbung des Farbstoffs, wobei gleichzeitig Ver- änderungen im System, z. B. Lichtschwankungen durch Spannungsschwankun- gen im Versorgungsnetz, ausgeglichen werden. Durch diese doppelte Nullwert-bzw. Leerwertsubtraktion können die Bilder rechnerisch geglättet werden, d. h. von Rauschen befreit werden. Man erhält Bildinformationen, die einzig die änderung der optischen Eigenschaft über die Zeit angeben.

Die Kalibrierung der Aufnahmevorrichtung kann mittels geeichter Graufilter erfolgen. Die Umrechnung der gemessenen Extinktion in Substanzkonzen- tration erfolgt in bekannter Weise nach dem Lambert-Beerschen Gesetz.

Was Enzyme betrifft, so ist die Umsatzrate eines Substrats durch ein Enzym bei hohem Substratüberschuß hauptsächlich von der Konzentration dieses Enzyms abhängig, bis es zu einem Mangel an Substrat oder einer Hemmung durch das Produkt kommt und die Umsatzgeschwindigkeit sinkt. Zu Beginn des Versuchs benötigt ein EnzymmoVekül eine gewisse Zeit zur Aufnahme des Substrats, zur Umsetzung sowie zur Freigabe des Produkts, bis es zur maxi- malen Umsatzgeschwindigkeit kommt. Wenn hierbei die Produktkonzentration ansteigt, wird die Abgabe des Produkts erschwert und die Umsatzrate nimmt ab. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit des Umsatzes (V-max) ist jedoch für ein Enzym bei definierten Bedingungen, wie Temperatur, pH-Wert, lonen- konzentration, spezifisch. Die Messung der Enzymaktivitäten unter V-max-Be- dingungen über die Zeit gestattet eine Quantifizierung der Enzymaktivität. Der allgemeine Verlauf einer solchen Enzymkinetik ist schematisch in Fig. 2 dar- gestellt.

Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz entspricht die Extinktion E dem Loga- rithmus aus dem Verhältnis der Intensität lo des eingestrahiten Lichts zur In- tensität I des des durchgelassenen Lichts. Gleichzeitig entspricht sie einer Stoffkonzentration c bei konstanter durchstrahfter Schichtdicke s in Abhängig- keit einer stoffspezifischen Konstante. in<BR> EIn-------------=c s E 1) übertragen auf die oben erwähnten V-max-Bedingungen bedeutet dies, daß man durch den oben beschriebenen Nullwert-bzw. Leerwertabzug eine Aus- gangsintensität lo'bestimmen kann. Um nun zu erkennen, welcher gemessene Wert z. B. einer Extinktion von 0,1 entspricht, wird das System, d. h. die Kombi- nation aus Kamera, Mikroskop in der jeweils gewähren Vergrößerungsein- stellung, AD-Wandler und Bildverarbeitungsprogramm, mit Graufiltern bekann- ter Extinktion kalibriert, so daß man bei ansonsten konstanten Bedingungen die ermittelten Grauwertänderungen einer Extinktionsänderung zuordnen kann.

Dabei wird die Ausgangsintensität 1o'als maximal mögliche Aufspreitung der Kameraempfindlichkeit gesetzt (bei 8 Bit 256 Werte) und die Abnahme x die- ses Werts über die Zeit in jedem Pixel des Bilds ermittelt (I = lo-x). Setzt man diese Werte in die obige Gleichung ein, erhält man eine System-"Extink- tionsänderung" (AE'), gemäß 256 AE'= In-----------------2) 256-x die mit dem durch die Kalibrierung des Systems ermittelten Korrekturfaktor k in Beziehung zur tatsächlichen Extinktionsänderung (A E) pro Minute steht.

AE/min = AE'/min-k 3) Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, in jedem Pixel des Bilds die Zu- nahme der Farbstoffkonzentration darzustellen.

überträgt man die Verhältnisse bei den oben stehenden Enzymkinetiken auf dieses Modell, so zeigt sich, daB die Farbstoffzunahme unter V-max-Bedin- gungen proportional zur Enzymkonzentration im gewählten Bereich des histo- logischen Schnitts ist. Stellt man von dem gewähren Gewebsbereich diesen Anstieg über die Zeit dar, so ist er etwa in den ersten 15 bis 20 Minuten line- ar, bevor er dann durch Substratmangel oder Produktüberschuß geringer wird.

Der Anstieg der Färbung in diesen ersten 15 bis 20 Minuten kann also als V- max angesehen werden. Die Figuren 3 und 4 zeigen die relative Grauwert- änderung und die daraus berechnete Extinktionsänderung von vier Meßreihen mit zugeordneten Regressionsgeraden im Bereich von Vmax, die an vier Ge- websbereichen eines Präparats gleichzeitig gemessen wurden.

Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es also möglich, in jedem Pixel der Bildserie die Aktivität verschiedener Enzyme ortsaufgelöst quantitativ darzustellen. Da die Aktivität der Enzyme eine Funktion ihrer Konzentration ist, läßt sich die En- zymmenge in jedem Pixel oder im gewählten Bildbereich Ba über den zuge- ordneten Substrat-oder Produktumsatz messen. Die Bildinformation kann bis auf zelluläre und subzelluläre Ebene aufgelöst werden, wobei z. B. die Mes- sung der Aktivitäten von Enzymen in einzelnen Mitrochondrien möglich ist.

Kurz gesagt, wird zum quantitativen Nachweis enzymatischer Aktivität die Ex- tinktion indirekt gemäß Gleichung 3) ermittelt. Die Grauwertänderung oder Absorptionsänderung in einem Pixel oder dem ausgewähiten Bereich Ba wird über die Zeit gemessen. Die Ergebnisse dieser Messung werden in eine Sy- stemextinktion E'umgerechnet. Der Korrekturfaktor k wird durch die Eichung des Systems mit Graufiltern ermittelt. Die Menge des jeweiligen Enzyms bzw.

Substrats wird durch die änderung der Extinktion über die Zeit gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz ermittelt.

Beispiel Zur Messung der Dehydrogenase-Aktivität wurden Nematoden der Art Cae- norhabditis elegans zu verschiedenen Bedingungen in Gewebeeinbettungs- mittel inkubiert und tiefgefroren und im Kyrostaten auf eine Dicke von zum geschnitten und auf mit Polylysin behandelte Objektträger aufgebracht. Die Gewebsschnitte wurden angetaut, 10 bis 15 Minuten getrocknet und entweder sofort weiterverwendet oder zum späteren Gebrauch bei-70° C tiefgefroren.

Vor dem Einbringen in die Meßvorrichtung wurden die Schnitte mit dem Hand- rücken aufgetaut und vorsichtig mit einer Inkubationslösung überschichtet.

Diese Inkubationslösung enthielt Substrat im überschuß, Tetrazoliumfarbstoff, Phenazinmethosulfat (PMS), Cyanid zur Blockierung der Atmungskette sowie Tris-HCI-Puffer zum Konstanthalten des pH-Werts von 7,4. Nach dem Aufle- gen eines Deckglases wurden die Objektträger mit den Gewebsschnitten in die Klimakammer 7 unter das Mikroskop 1 gelegt und dort die interessieren- den Gewebsbereiche eingestellt. Die Temperatur betrug konstant 25° C bei 0, 5°C. Der Verlauf der Reaktion wurde 20 Minuten mit der Videokamera 5 auf den Recorder 9 aufgezeichnet und entweder sofort zur on-line-Messung oder als Aufnahme später im Computer 11 ausgewertet. Mit einem Makro des Bildverarbeitungsprogramms Optimas 6.1 wurde ein Referenzbild zum Zeit- punkt tO aufgenommen und dieses von den weiteren-Bildern, die in Minuten- abständen aufgenommen wurden, abgezogen. Fünf ausgewählte geometri- sche Bereiche Ba der Bilder wurden vermessen und deren Daten eingespei- chert. Der erste dieser Bereiche Bna ergab den Leerwert, und die anderen vier Bereiche Ba dienten als Meßbereiche. Mit Hilfe eines Makros von Excel 7.0 wurden die Mittelwerte der Grauwerte errechnet und graphisch dargestellt (Fig. 3) und anschließend in Extinktionswerte E'umgerechnet (Fig. 4).

Insbesondere anwendbar ist das Verfahren auch zur Quantifizierung von Stoff- wechselenzymen wie SDH (Succinat-Dehydrogenase), MDH (Malat-Dehydro- genase) und LDH (Lactat-Dehydrogenase). Weitere NAD-abhängige Stoff- wechselenzyme sind ebenfalls meßbar. Mit diesem Verfahren lassen sich alle Enzyme quantifizieren, für die eine spezifische Färbemethode zur Verfügung steht, wie etwa die saure Phosphatase, Cytochromoxidase und verschiedene Proteasen.

Ferner nachweisbar ist auch die ß-Galactosidase über die lacz--&gt; f3-Galacto- sidase--> Xgal-Reaktion. Das lac-Z Gen codiert in E. coli für das Enzym ß- Glactosidase, das Lactose in Glucose und Galactose hydrolysiert, und wird in der Gentechnik als Selektionsmarker und Reportergen verwendet. Die ein- zubringende genetische Substanz kann neben speziellen Wirkungsgenen auch das lac-Z-Gen enthalten. Wenn die f3-Galactosidase expremiert wird, so ist die Sequenz im Genom des Wirtes aufgenommen worden. Nachgewiesen wird das Vorhandensein der f3-Galactosidase mit einem Substratanalogon Xgal (5- Brom-4-chlor-3-indolyl-f3-D-galactosid), das in f3-Galactose und ein blaues Chromophor hydrolysiert wird, das im Präparat eine Färbungsänderung ver- ursacht. Aus der Geschwindigkeit der Färbungsänderung läßt sich die Kon- zentration der ß-Galactosidase und somit die Stärke der Expression der einge- brachten Sequenz ablesen.

Außer der Extinktion kommt als Meßgröße die änderung der Fluoreszenzei- genschaften der Substratumsetzung in Frage. Geeignete Farbstoffe sind z. B.

Methyl-Umbellipheryl-Substrate. Hierfür ist eine besonders empfindliche Kame- ra zu verwenden.

Die änderung der Extinktion kann, wie oben beschrieben, mit künstlich zu- geführten Farbstoffen ermittelt werden, wobei aber auch in der Zelle vorhande- ne native Stoffe zur Messung der Enzymaktivitäten herangezogen werden können. In Frage kommen NAD (Nikotinamid-adenin-dinucleotid) oder FAD (Flavin-adenin-dinucleotid) und deren Derivate. Die hohe Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt bei dieser Variante besonders zur Gel- tung. Zu verwenden ist hier allerdings eine besonders empfindliche Kamera und UV-Licht.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich auch Hemmstoffe von Enzymen unter nahezu vitalen Bedingungen prüfen, ohne daß aufwendige Tierversuche nötig wären. insbesondere anwendbar ist das Verfahren in der Tumordiagnostik, insbesondere bei der Quantifizierung von Stoffwechselenzy- men wie SDH und LDH in Tumorgeweben.