Gebiet der Erfindung

[0001] Die Erfindung betrifft die Performanzüberwachung und -regelung einer lonenquelle, die mit Laser-unterstützter Ionisierung arbeitet, insbesondere mit MALDI-Ionisierung. Im Speziellen betrifft die Erfindung ein lonenspektrometriesystem mit einem lonenanalysator, einer lonenquelle, die an den lonenanalysator angeschlossen ist, und einer Prozessoreinheit, die mit dem lonenanalysator und der lonenquelle kommuniziert.

Hintergrund der Erfindung

[0002] Der Stand der Technik wird im Folgenden mit Bezug auf einen speziellen Aspekt erläutert. Dies soll jedoch nicht als Einschränkung verstanden werden. Nützliche Fortentwicklungen und Änderungen vom aus dem Stand der Technik Bekannten können auch über den vergleichsweise engen Rahmen dieser Einleitung hinaus anwendbar sein und werden sich geübten Praktikern auf diesem Gebiet nach Lektüre der dieser Einleitung nachfolgenden Offenbarung der Erfindung umstandslos erschließen.

[0003] In der MALDI-Flugzeit-Massenanalyse (MALDI, matrix-assisted laser desorption and ionisation) gibt es einige Betriebsparameter, die für eine brauchbare Messung wichtig sind. Zu diesen Betriebsparametern gehören unter anderen die Spektrengrundlinie, diverse elektrische Spannungen an Beschleunigungselektroden zur Flugstrecke, die Detektorspannung und die Laserenergiedichte der lonenquelle, um nur einige zu nennen. Üblicherweise werden diese Parameter entweder im Prüffeld des Massenspektrometer-Herstellers oder im Labor des Nutzers von qualifiziertem Service-Personal des Herstellers oder eines Vertragspartners geprüft und für bestmögliche Ergebnisse eingerichtet. Diese Maßnahmen sind jedoch vereinzelte Ereignisse, so dass das Massenspektrometer nach erfolgter Einrichtung oder Neu-Einstellung unüberwacht über einen langen Zeitraum funktionieren muss.

[0004] Es ist allerdings bekannt und entspricht der Erfahrung, dass sich einige Parameter über die Betriebs- und Einsatzzeit des Massenspektrometers verändern. Man kann auch von einer Alterung oder Abnutzung sprechen. Von den zuvor genannten Parametern sind davon insbesondere die Detektorspannung unmittelbar und die Laserenergiedichte mittelbar betroffen. [0005] Die Detektoralterung äußert sich insbesondere darin, dass der Verstärkungsfaktor z.B. eines Sekundärelektronenvervielfachers mit fortschreitendem Betrieb nachlässt. Diesem Abfall begegnet man üblicherweise mit einer Erhöhung der Detektorspannung, also des Spannungsgefälles, über das die Sekundärelektronen beschleunigt werden. Dieser Anpassungsbedarf der Detektorspannung baut sich in der Praxis über einen recht langen Zeitraum auf und lässt sich weitgehend automatisiert bestimmen, z.B. in Kalibrierphasen, in denen Einzelionen- signale beobachtet werden, wie in der Patentveröffentlichung DE 10 2008 010 118 Al beschrieben (entspricht GB 2 457 559 A und US 2009/0206247 Al).

[0006] Im Fall der Laserenergiedichte kann es passieren, dass die lonenquelle und insbesondere die Oberflächen darin, z.B. von Elektroden oder begrenzenden Gehäuseteilen, bei fortschreitendem Betrieb verschmutzen und damit die Bedingungen, unter denen die elektrischen Felder in der lonenquelle zustande kommen, verändern. Dies manifestiert sich dann in einer verringerten lonenausbeute. Einem solchen Leistungsabfall kann man beispielsweise durch halb- oder vollautomatisierte Reinigung begegnen, die die Störung durch physikalisch-chemische Einwirkung zu beseitigen oder zumindest abzumildem sucht. Ein Beispiel einer solchen Reinigung wird in der Patentveröffentlichung DE 10 2008 008 634 Al vorgestellt (entspricht GB 2 457 362 A und US 2009/0200457 Al). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die La- serenergiedichte oder Laserfluenz zu erhöhen, da die lonenausbeute mit einer vielfachen Potenz der Energiedichte oder Fluenz skaliert, wie in dem Übersichtsartikel von Klaus Dreise- werd erläutert (Chem. Rev. 2003, 103, 395-425). Je nach Nutzung des Analysators, man denke an nahezu ununterbrochene Messphasen täglich von früh bis spät, kann sich der durch Verschmutzung bedingte Abhilfebedarf im Vergleich zur Detektoralterung recht rasch aufbauen.

[0007] Sobald ein Massenspektrometer erstmal im Labor eines Nutzers installiert ist, kann intensiver Betrieb dazu führen, beispielsweise bei mit hohem Durchsatz wiederholten Identifizierungsmessungen von krankheitsverursachenden Mikroorganismen im klinischen Bereich, dass derartige Leistungsabfälle so schnell auftreten, dass Wartungsarbeiten mit hoher Frequenz, z.B. wöchentlich oder sogar noch häufiger, notwendig werden; ein gewaltiger Aufwand für das Service-Personal und gleichzeitig ein Kostentreiber für die Nutzer.

[0008] Im Folgenden werden einige Dokumente des Stands der Technik, die für die Offenbarung relevant sein können, ohne Anspruch auf Vollständigkeit kurz gewürdigt: [0009] Die in der Patentveröffentlichung DE 10 2010 019 857 Al (entsprechend GB 2 483 322 A und US 2011/0272573 Al) offenbarte technische Lehre basiert darauf, mehrere Serien von Massenspektren eines Gemischs aus Analytsub stanzen mit stufenweiser Erhöhung der Energiedichte in den Laserfoki aufzunehmen, dabei aber das daraus eventuell resultierende Problem der Signal Sättigung am Detektor durch besondere Maßnahmen zu bewältigen.

[0010] Die Patentveröffentlichung WO 2014/140625 Al offenbart ein Verfahren zur lonen- bildgebung, das das Testen eines ersten Probenteils durch automatisches Variieren eines oder mehrerer Laserparameter und die manuelle oder automatische Bestimmung eines oder mehrerer optimaler oder bevorzugter Laserparameter aus dem ersten Probenteil umfasst. Ein zweiter Probenteil wird dann unter Verwendung des einen oder der mehreren optimalen oder bevorzugten Parameter analysiert.

[0011] Die Patentveröffentlichung WO 2017/160857 Al betrifft Systeme und Verfahren zur Echtzeitüberwachung von Laboranalysegeräten zum Zwecke der Qualitätskontrolle.

[0012] Die Patentveröffentlichung EP 3 806 135 Al beschreibt eine MALDI-Ionenquelle, in der Laserlicht von einer Laserlichtquelle durch einen Spiegel reflektiert und die Energie des Laserlichts durch Drehung eines Polarisationsstrahlteilers eingestellt wird. Dann wird das Laserlicht mit angepasster Energie auf eine Probe gelenkt.

[0013] Die Patentveröffentlichung EP 3 651 184 Al bezieht sich auf ein Massenspektrometer sowie Verfahren und Programme zur Einstellung der Laserlichtintensität, die in dem Massenspektrometer für die MALDI-Ionisierung verwendet wird.

[0014] Es besteht angesichts der vorherigen Erläuterungen ein Bedarf, Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, mit denen die Performanzüberwachung und -regelung einer lonen- quelle über einen längeren Zeitraum gewährleistet und verbessert werden kann. Weitere von der Erfindung zu lösende Aufgaben ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres bei der Lektüre der nachfolgenden Offenbarung.

Zusammenfassung der Erfindung

[0015] In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Performanzüberwachung und -regelung einer lonenquelle, aufweisend: (a) Laser-unterstütztes Ionisieren einer Kontrollprobe, deren Zusammensetzung substantiell bekannt ist und die vor, parallel zu oder nach einer analytischen Probe beprobt wird, (b) Erzeugen von Kontrollproben- Spektraldaten aus der ionisierten Kontrollprobe in einem an die lonenquelle angeschlossenen lonenanaly sator, (c) Wiederholen der Schritte (a) und (b) über eine Vielzahl von Kontrollproben, um eine Vielzahl von Kontrollproben-Spektraldaten zu sammeln und derart auszuwerten, dass Spektraldaten einzelner Kontrollproben geringes Gewicht haben und ein Performanztrend in der Auswertung aufscheint, (d) Anpassen eines Betriebsparameters des Lasers der lonenquelle, falls der Performanztrend in einen Bereich außerhalb eines vordefinierten Performanzintervalls eintritt, um den Laser Intervall-konform einzuregeln, und (e) Wiederholen der Schritte (a) bis (d) zwecks kontinuierlicher Überwachung und -regelung der lonenquelle.

[0016] In verschiedenen Ausführungsformen kann in Schritt (a) die Kontrollprobe in einem gleichen Messvorgang wie die analytische Probe beprobt werden und in Schritt (c) können die Schritte (a) und (b) über eine Vielzahl von Messvorgängen und Kontrollproben wiederholt werden. Ein Messvorgang im Sinne der vorliegenden Offenbarung kann insbesondere in Bezug auf die Betriebsweise des lonenspektrometriesystems zu verstehen sein. Zum Beispiel kann ein Messvorgang alle Messungen umfassen, die von (Kontroll-)Proben auf einem Probenträger aufgenommen werden, solange er sich räumlich in der lonenquelle befindet. Ein Beispiel wäre das Einführen des Probenträgers in einen Unterdruckbereich der lonenquelle, sofern diese im Unterdrück arbeitet, wie z.B. bei Vakuum-MALDI. Wird der Probenträger aus der lonenquelle, z.B. dem Unterdruckbereich, entfernt und anschließend ein weiterer Probenträger mit neuen (Kontroll-)Proben wieder eingeführt, können alle Messungen von den neuen (Kontroll-)Proben auf diesem nächsten Probenträger als separater Messvorgang angesehen werden.

[0017] Auf einem Probenträger für die Laser-unterstützte Ionisierung können neben Präparationen analytischer Proben auch mehrere Kontrollproben-Präparationen angeordnet sein. Wenn es sowohl Kontrollproben als auch analytische Proben auf dem Probenträger gibt, z.B. 2-10 technische Kontrollproben-Replikate, insbesondere 4-8 technische Kontrollproben-Rep- likate, können alle Kontrollproben-Spektraldaten dieser Präparationen zur Ermittlung des Performanztrends und/oder dessen zeitlichem Verlauf herangezogen werden. Eine Kontrollpro- ben-Präparation auf dem Probenträger kann einmal oder auch mehrere Male zur Erzeugung von Kontrollproben-Spektraldaten beprobt werden, begrenzt grundsätzlich nur durch die Ergiebigkeit der Kontrollprobe. Im Ergebnis können die Kontrollproben-Spektraldaten vereinzelte und gesonderte Spektren umfassen. Wiederholtes Beproben der gleichen Kontrollpro- ben-Präparation erhöht die Grundlage der Kontrollproben-Spektraldaten für eine anschließende statistische Auswertung und verringert den Einfluss insbesondere sehr kurzzeitig auftretender Störungen des Messablaufs, die Ausreißermessungen verursachen können.

[0018] Die Beprobung der Kontrollprobe vor, parallel zu oder nach einer analytischen Probe kann insbesondere bedeuten, dass Kontrollprobe und analytische Probe in einem gleichen Messvorgang untersucht werden. Die Beprobung der Kontrollprobe kann insbesondere unmittelbar vor oder unmittelbar nach einer analytischen Probe erfolgen. Die Messmodi oder Messeinstellungen des lonenspektrometriesystems können für die Beprobung analytischer Proben und Kontrollproben übereinstimmen oder sich auch unterscheiden. Wenn ein Messvorgang das Aufnehmen von Spektraldaten aller (Kontroll-)Proben auf einem Probenträger umfasst, wie zuvor ausgeführt, kann dies beinhalten, dass der Probenträger eine Vielzahl von ausgezeichneten Probenorten, z.B. ein Feld von Probenpunkten wie auf den bekannten Anchor- Chip- oder MBT Biotarget 96-Trägern von Bruker oder auch auf einer Stahlplatte, aufweist und einige dieser Probenorte einerseits mit einer vorbestimmten Anzahl von Kontrollproben präpariert sind, wohingegen einige oder alle der verbleibenden Probenorte mit analytischen Proben belegt sind. Kontrollproben und analytische Proben können dann in Blöcken getrennt voneinander (z.B. zuerst alle Kontrollproben, dann alle analytischen Proben oder umgekehrt) oder auch abwechselnd (z.B. Kontrollprobe => analytische Probe => Kontrollprobe => analytische Probe usw.) beprobt werden. In lonenquellen mit vielfachen Laserstrahlen können gegebenenfalls analytische Proben und Kontrollproben auch parallel vom gleichen Probenträger gemessen werden, wenn der angeschlossene lonenanalysator auf die Verarbeitung multiple- xierter lonenströme ausgelegt und eingerichtet ist oder wenn mehr als ein lonenanalysator vorhanden ist.

[0019] In verschiedenen Ausführungsformen kann der lonenanalysator als Massenanalysator ausgebildet sein, der die ionisierte Kontrollprobe insbesondere nach dem Prinzip der Flugzeit- Dispersion (time-of-flight, TOF) sortiert. Ein Massenanalysator trennt geladene Moleküle oder Molekülionen gemäß ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis, üblicherweise als m/z bezeichnet. Neben den in der Einleitung bereits genannten Flugzeitanalysatoren, für die sowohl Linearais auch Reflektoraufbauten und/oder solche mit axialer oder orthogonaler Beschleunigung von Ionen in die Flugstrecke vorgesehen sein können, lassen sich grundsätzlich auch andere Arten massendispergierender Separatoren verwenden, z.B. Quadrupol-Massenfilter (single quads'), Tripel-Quadrupol-Analysatoren („Tripel-Quads“), lonenzyklotronresonanz-Zellen (ion cyclotron resonance, ICR), Analysatoren des Kingdon-Typs wie die Orbitrap® (Thermo Fisher Scientific) und andere. [0020] In verschiedenen Ausführungsformen kann der lonenanaly sator auch ein Mobilitätsanalysator oder kombinierter Mobilitäts-Massenanalysator sein. Ein Mobilitätsanalysator trennt geladene Moleküle oder Molekülionen gemäß ihrem Stoßquerschnitt-zu-Ladungsver- hältnis, gelegentlich als Q/z oder o/z bezeichnet. Grundlage hierfür ist die Wechselwirkung der lonenspezies mit einem elektrischen Feld, das mit der Ladung der Ionen koppelt, bei gleichzeitiger Einwirkung eines Puffergases, das auf die mittlere Querschnittsfläche des Ions einwirkt. Bekannt sind insbesondere Driftröhren-Mobilitätsseparatoren mit statischem elektrischen Feldgradient, die Ionen durch ein im Wesentlichen ruhendes Gas treiben, wobei sich die Driftgeschwindigkeit einer lonenspezies aus der vorantreib enden Kraft des elektrischen Feldes und der bremsenden Kraft der Stöße mit den Gasteilchen ergibt. Ebenso geläufig sind Speicher-Ionenmobilitätsseparatoren (trapped ion mobility separators, TIMS) mit einem die Ionen vorantreib enden stetigen laminaren Gasstrom, dem ein schrittweise veränderter elektrischer Feldgradient mit entsprechend veränderlicher Bremskraft entgegenwirkt. Erwähnt werden können auch Wanderwellen-Mobilitätsseparatoren (travelling wave). Es versteht sich, dass Analysatoren der vorgenannten Typen gekoppelt werden können, um lonenspezies mehrdimensional, also gemäß mehr als einer physikalisch-chemischen Eigenschaft wie m/z, Q/z oder o/z trennen zu können.

[0021] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Kontrollprobe eine Aufbereitung eines Mikroorganismus, z.B. eines prokaryoti sehen Organismus, insbesondere eine Aufbereitung einer Bakterienspezies, umfassen. Mikroorganismenzellen mit genau bekanntem Taxon und definiertem Gehalt an löslichen Molekülen, z.B. ribosomalen Proteinen und Peptiden, lassen sich kommerziell erwerben. Eine solche Ausgestaltung lässt bei standardisierter Präparation eine gut vorhersehbare und beständige Analysator- und Detektorantwort bezüglich z.B. Massensignalprofil bzw. Abundanz erwarten. Ein Beispiel ist der Bacterial Test Standard für den MALDI Biotyper® von Bruker, ein MALDI axial-lineares Flugzeit-Massenspektrometriesystem; der Standard umfasst ein typisches Escherichia coli DH5 alpha-Peptid- und Proteinprofil sowie zusätzliche Proteine, unter anderem geeignet für die Massenkalibration.

[0022] Vorzugsweise sind die Vielzahl von Kontrollproben deckungsgleich oder identisch; insbesondere werden über die Vielzahl der Messvorgänge Kontrollproben verwendet, die deckungsgleich oder identisch sind. Im Fall einer Mikroorganismenaufbereitung als Kontrollprobe können die Messungen über viele Präparationen und einen langen Zeitraum von biologischen und/oder technischen Replikaten des Mikroorganismus aufgenommen werden. [0023] Umfasst die Kontrollprobe einen Mikroorganismus, ist dieser vorzugsweise sterilisiert. Das Sterilisieren kann ein Exponieren des Mikroorganismus gegenüber einer Stoffwechsel -hemmenden Flüssigkeit, z.B. einem Alkohol wie Ethanol oder Iso-Propanol oder einer Säure wie Ameisensäure, und/oder Energieeinwirkung, z.B. unter Verwendung von Wärme oder hochenergetischer Strahlung (insbesondere ultraviolettes Licht), umfassen. Unter Sterilisieren wird insbesondere verstanden, dass der Mikroorganismus die Fähigkeit verliert, sich selbst unter für ihn günstigen Bedingungen zu vermehren. Auf diese Weise können die mit unbeabsichtigter/unkontrollierter Verbreitung einhergehenden biologischen Gefahren in einem Analyselabor vermieden werden. Unter bestimmten Bedingungen kann es entbehrlich sein, den Mikroorganismus einer Kontrollprobe zu sterilisieren, beispielsweise dann, wenn in einem Analyselabor der biologischen Sicherheitsstufe 2 oder höher gearbeitet wird. Dort kann davon ausgegangen werden, dass hinreichend geschultes Fachpersonal zum Einsatz kommt.

[0024] In verschiedenen Ausführungsformen kann die lonenquelle nach dem MALDI- Prinzip arbeiten. Das Prinzip der Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) ist an anderer Stelle bereits ausführlich beschrieben, siehe zum Beispiel den in der Einleitung erwähnten Artikel von Klaus Dreisewerd. In einer verbreiteten Variante der MALDI-Probenpräparation werden lösliche Moleküle, z.B. ribosomale Proteine eines Mikroorganismus oder Bakteriums, in eine Struktur von Matrixkristallen eingefügt, die ein hohes Absorptionsvermögen für Laserlicht aufweisen. Als Matrixsub stanzen werden kleine organische Moleküle gewählt, die bei der verwendeten Laserwellenlänge, z.B. Festkörper Nd: YAG bei einer frequenzverdreifachten Wellenlänge von 355 Nanometern, Energie stark absorbieren. Beispiele dafür sind Sinapinsäure, 2, 5 -Dihydroxybenzoesäure, a-Cyanohydroxyzimtsäure oder 2,4,6-Trihydroxyacetophenon. Wird die Matrixkri stall Struktur Pulsen einer Laserstrahlung ausgesetzt, verdampft sie explosionsartig und setzt die eingebetteten Moleküle frei. Es werden während dieses energiereichen Abtragprozesses darüber hinaus Moleküle ionisiert. Diese sind damit einer folgenden ionenspektrometri sehen Untersuchung zugänglich. Für diese Untersuchung werden die Ionen im Regelfall in elektrischen Feldern gemäß ihrer Masse auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt und treffen nach Durchlaufen einer längeren, weitgehend feldfreien Flugstrecke zeitaufgelöst auf einen Detektor mit Sekundärelektronenvervielfacher. Die Zeitspannen von der Laserdesorption des Probenmaterials oder von einem Beschleunigungspuls in die Flugstrecke des Massenanalysators bis zum Empfang der verschiedenen lonenstromsignale am Detektor ergeben über eine Umrechnung die ladungsbezogenen Massen m/z der Ionen. [0025] Beispiel der Erstellung einer MALDI Messung. Bei der Neuerstellung einer MALDI- Messmethode werden einige Betriebsparameter idealerweise mit Hilfe eines Standards definiert, der kontrolliert hergestellt wurde und eine möglichst definierte Anzahl und Konzentration von Zielmolekülen im gesuchten Massenbereich enthält (Kontrollprobe). Dieser Standard, z.B. Bacterial Test Standard von Bruker, wird frisch präpariert und im Gerät vermessen. Vor der Messung dieses Standards können andere Betriebsparameter, z.B. eine Nivellierungsspannung zur Einstellung eines weitgehend feldfreien Raumes im Desorptionsbereich eines MALDI-Probenträgers (englisch back bias genannt), die Detektorspannung oder Grundlinie, auch getrennt definiert werden. Ein wichtiger Parameter einer MALDI Messung ist die Laserenergi edichte. Wenn die Laserenergiedichte zu niedrig ist, werden keine oder kaum Ionen erzeugt. Wenn die Laserenergiedichte zu hoch ist, ist die erzeugte lonenwolke mit zu vielen Ladungsträgern besetzt und die Massenauflösung im angeschlossenen Analysator stößt an Grenzen. Daher ist es bevorzugt, eine sogenannte „Desorptionsschwelle“ zu finden und definieren. Diese Schwelle der Laserenergiedichte definiert den Punkt, an dem man nach stufenweiser Erhöhung der Laserenergiedichte von einem niedrigen Anfangswert die ersten lonensignale am Detektor ausmachen kann. Ausgehend von dieser Desorptionsschwelle, wird die Laserenergiedichte daraufhin für die anfängliche Geräteeinstellung vorzugsweise weiter erhöht, um einen Kompromiss zwischen Signalanzahl sowie -stärke und Verschlechterung der Massenauflösung zu erreichen. Typischerweise liegt eine derartige bevorzugte Laserenergiedichte einige Prozentpunkte über der Desorptionsschwelle.

[0026] Die Laserenergiedichte für spätere Messungen analytischer Proben wird so eingestellt, dass sowohl Proben mit geringer wie auch hoher Analytkonzentration gemessen werden können. D.h. die Laserenergiedichte wird während der Messung analytischer Proben um wenige Prozentpunkte variiert, z.B. kann nach dem ersten Messversuch die Energiedichte erhöht oder erniedrigt werden, um optimal auswertbare Signale zu bekommen. Wenn die Analytkonzentration in der Probe zu groß ist, wird die initiale Laserleistung verringert. Wenn der Ana- lytgehalt der Probe zu niedrig ist, wird die Laserleistung erhöht. Eine Folge dieser Vorgehensweise in der Praxis kann jedoch sein, dass ein suboptimal eingestellter Laser oder eine verschmutzte lonenquelle lange Zeit unentdeckt bleiben, weil während der Messung die Laserenergiedichte ständig erhöht werden darf, was z.B. für Proben niedrigen Analytgehalts einen Messnachteil darstellt. Eine MALDI-Messung analytischer Proben ist nach der gegenwärtigen Praxis daher nur bedingt in der Lage, die anfänglich optimal eingestellte Laserenergiedichte zu überwachen und nachzuführen, da die MALDI-Messung selber sehr variabel sein und von vielen Parametern abhängen kann. Eine nachlassende Laserleistung oder eine verschmutzte lonenquelle sind Faktoren, die eine Erhöhung der Laserenergiedichte bedingen können. Die hier vorgestellte Erfindung beruht im Wesentlichen auf der häufigen Messung eines definierten Standards oder einer Kontrollprobe, deren Zusammensetzung substantiell bekannt ist, mit einer für die Performanzüberwachungsmessung fest eingestellten Laserenergiedichte mit dem Ziel, insbesondere eine erwartete Signalintensität zu finden. Da eine einzelne MALDI- Messung trotzdem sehr variabel sein kann, werden diese Messungen über einen längeren Zeitraum gemittelt, um den Einfluss kurzzeitiger oder „Tagesform“-abhängiger Varianzen zu unterdrücken. Wenn die zu erwartende Signalintensität nicht mehr gefunden wird, kann ein Laserenergiedichte- Ausgangswert für die Messungen analytischer Proben nachjustiert werden und dient als Sockel, auf dem die zuvor erläuterte Einzelmessungsbasierte Variation für analytische Proben aufsetzt.

[0027] In verschiedenen Ausführungsformen kann der Performanztrend von einer Abundanz oder Intensität im Analysator nachgewiesener Ionen abgeleitet werden; insbesondere kann eine durchschnittliche Abundanz oder Intensität herangezogen werden. Als Intensitätsmaß oder Abundanzmaß kann beispielsweise die Gesamtmenge an nachgewiesenen lonenströmen in den Spektraldaten verwendet werden; dies wird gelegentlich total ion count (TIC) genannt. Der TIC kann über den gesamten Spektralbereich oder auch über einen abgegrenzten Unterbereich erfasst werden, beispielsweise einen Bereich aus den Spektraldaten von 30.000 oder mehr atomaren Masseneinheiten (amu), 20.000 oder mehr amu, 10.000 oder mehr amu, 5.000 oder mehr amu oder 1.000 amu oder mehr. Möglich ist auch, eine durchschnittliche Intensität über den gesamten Spektralbereich oder einen Ausschnitt davon, beispielsweise einen Bereich aus den Spektraldaten von 30.000 oder mehr atomaren Masseneinheiten (amu), 20.000 oder mehr amu, 10.000 oder mehr amu, 5.000 oder mehr amu oder 1.000 amu oder mehr, als Grundlage zu nehmen. Eine breite Datenbasis gewährleistet dabei statistische Stabilität, d.h. geringes Gewicht von Ausreißern bei der Betrachtung über mehrere Kontrollproben, Kontrollprob en-Beprobungen oder Messvorgänge hinweg.

[0028] In verschiedenen Ausführungsformen kann das Performanzintervall Abweichungen bis zu einem vordefinierten Prozentsatz, insbesondere ± 30 Prozent oder weniger, ± 25 Prozent oder weniger, ± 20 Prozent oder weniger, ± 15 Prozent oder weniger, oder ± 10 Prozent oder weniger, von einem Performanzrichtwert umfassen. Wenn ein Intensitätsmaß für die Bewertung der Performanz herangezogen wird, kann - durch die substantielle Kenntnis des molekularen Gehalts der Kontrollprobe ermöglicht - z.B. ein Intensitätsrichtwert bestimmt werden, der in ein Intervall gesetzt wird, dessen Grenze zu höheren Intensitäten sich durch die Vermeidung von Detektorsättigung ergibt und dessen Grenze zu niedrigeren Intensitäten aus der Erfahrung abgeleitet wird, wie hoch ein lonenstromsignal sein muss, um eine nachweisbare und verlässliche Spektraldatenauswertung zuzulassen. Die Intervallgrenzen können äquidistant oder auch nicht-äquidistant von dem Performanzrichtwert angeordnet sein. In einer Ausführungsform kann eine obere Intervallgrenze näher am Performanzrichtwert liegen als eine untere Intervallgrenze; in einer anderen Ausführungsform kann eine untere Intervallgrenze näher am Performanzrichtwert liegen als eine obere Intervallgrenze.

[0029] In alternativen Ausführungsformen kann der Performanztrend auch aus der Güte der Charakterisierung des Molekülgehalts der substantiell bekannten Kontrollprobe abgeleitet werden. Wird zum Beispiel ein Mikroorganismus als Kontrollprobe verwendet, kann die höchste Ähnlichkeitsmaßzahl [auch log(score) genannt] der einschlägigen Referenz-Spektraldaten eines auf die Identifizierung des Taxons ausgelegten lonenspektrometriesy stems wie dem MALDI Biotyper® von Bruker als Performanzrichtwert dienen. Da das Taxon des Mikroorganismus in der Kontrollprobe substantiell bekannt ist, sollte der sogenannte log(score) des MALDI Biotypers® deutlich über 2,00 liegen. Führt der Trend dazu, dass die untere Intervallgrenze von 2,00 über einen längere Beobachtungszeitspanne und damit ausreißerunab- hängig unterschritten wird, kann es erforderlich sein, einen Betriebsparameters des Lasers anzupassen, um diesem Leistungsabfall entgegenzuwirken.

[0030] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Auswertung in Schritt (c) die Vielzahl von Kontrollproben-Spektraldaten einer Mittelung, insbesondere Mittelwert- oder Medianbildung, unterziehen. Die Mittelwertbildung kann insbesondere auf dem arithmetischen Mittel beruhen. Durch die Aufnahme von Kontrollproben-Spektraldaten über eine Vielzahl von Kontrollproben, Kontrollproben-Beprobungen oder Messvorgängen kann ein gleitendes Mittel gebildet werden, d.h. aus einer Menge von Messungen lässt sich eine zeitlich variierende Untermenge, z.B. durch Berücksichtigung von Kontrollproben-Spektraldaten aus einem sich verschiebenden Zeitfenster, ggfs. über eine Vielzahl von Messvorgängen hinweg, für die Mittelwertbildung heranziehen.

[0031] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Mittelung auf eine vorbestimmte Zahl von (i) Kontrollproben, z.B. 50-250 Kontrollproben, (ii) Messvorgängen, z.B. 10-30 Messvorgängen, (iii) Laseraktivierungen, z.B. über 10 ⁵ -10 ⁷ Laserschüsse für Einzelspektraldaten-Auf- nahmen, oder (iv) eine Zahl von Kontrollproben oder Messvorgängen aus einem vorbestimmten Zeitraum, z.B. über einen Zeitraum von 7-21 Tagen, 1-4 Wochen oder 1-2 Monaten, angewendet werden. Es ist ebenso möglich, die Mittelung auf eine vorbestimmte Zahl von vereinzelten Kontrollproben-Beprobungen anzuwenden, beispielsweise 400-2000 vereinzelte Kontrollproben-Beprobungen. Alle Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung haben gemein, dass der Anpassungsbedarf des Laser-Betriebsparameters nicht von einer einzelnen Kontrollprobe und schon gar nicht von einer einzelnen Kontrollproben-Beprobung anhängig gemacht wird, sondern auf einer Vielzahl von Kontrollproben und einer Vielzahl von Kontrollproben-Beprobungen fußt.

[0032] In verschiedenen Ausführungsformen kann für die Anpassung des Betriebsparameters die Laserenergiedichte, Laserfluenz, Laserleistung und/oder Laserintensität beim Laserunterstützten Ionisieren geändert werden. Insbesondere kann die Laserenergiedichte, Laserfluenz, Laserleistung und/oder Laserintensität um einen voreingestellten Prozentsatz erhöht werden, wenn eine Performanztrend-Abweichung erkannt wird. Eine Erhöhung kann sich im Bereich substantiell einstelliger Prozentwerte bewegen, z.B. 1-10 Prozent, insbesondere etwa 1 Prozent. Bei MALDI-Ionisierung skaliert die lonenausbeute etwa mit der sechsten bis achten Potenz der Laserfluenz, so dass deren Erhöhung um 1 Prozent einen Anstieg der nachweisbaren Ionen um etwa 6-8 Prozent mit sich bringt. Eine solche Maßnahme kann bereits ausreichen, um einem negativen Performanztrend entgegenzuwirken und den Laser Intervallkonform einzuregeln. Die Anpassung des Betriebsparameters des Lasers kann alternativ ein vordefiniertes Inkrement, z.B. einen bestimmten Prozentsatz, umfassen; sie kann aber auch in Abhängigkeit des Trendverlaufs und/oder der absoluten Abweichung von der Intervallgrenze berechnet werden, z.B. mit einem festen Inkrement (ggfs. ein Prozentsatz) als Basis, das durch einen Trend-abhängigen Term korrigiert wird, um eine Übersteuerung bei der Anpassung zu vermeiden und die Anpassungsroutine unabhängiger von Ausreißern zu machen.

[0033] In verschiedenen Ausführungsformen kann eine Benachrichtigung und/oder Kennzeichnung erzeugt werden, sofern eine Anzahl von Anpassungen des Betriebsparameters einen vorbestimmten Wert, z.B. 2-10 Anpassungen, insbesondere 3-5 Anpassungen, erreicht oder überschreitet. Die Benachrichtigung kann in Form eines Eintrags in die Log-Datei des verwendeten lonenspektrometriesystems erfolgen. Möglich sind auch Nachrichten zur unmittelbaren Kenntnisnahme eines Nutzers, z.B. ein aufklappendes Fenster mit Text- oder Bildnachricht in der grafischen Nutzeroberfläche am Rechner des lonenspektrometriesystems oder eine automatisch erzeugte E-Mail oder SMS mit einem Inhalt, der das Ergebnis der Spektral- daten-Auswertung zusammenfasst. Eine solche Text/Bildnachricht, E-Mail oder SMS kann unmittelbar an eine Empfängeradresse des lonenspektrometriesystem-Herstellers oder eines Service-Partners übermittelt werden, um automatisch einen Wartungsauftrag zu erteilen. Eine Kennzeichnung kann insbesondere einen Eintrag in ein Kommentarfeld der Metadaten zu den Spektraldaten beinhalten, die unter den veränderten Laserbedingungen aufgenommen wurden. Auf diese Weise kann es dem Nutzer ermöglicht werden, die automatisierte Laser-Nachregelung auch zu einem späteren Zeitpunkt, z.B. bei der Auswertung der Spektraldaten von den analytischen Proben, die neben den Spektraldaten der Kontrollproben erfasst wurden, nachzuverfolgen.

[0034] In verschiedenen Ausführungsformen kann eine Zusammensetzung der analytischen Probe substantiell unbekannt sein. Kontrollprobe und analytische Probe unterscheiden sich insbesondere dadurch, dass die Kontrollprobe, ihr Molekülgehalt sowie ihr Verhalten während der Laser-unterstützten Ionisierung sehr gut bekannt und charakterisiert sind, weswegen sie als Regelgröße eingesetzt wird. Demgegenüber muss die Information über die analytische Probe durch ggfs. ausgefeiltes Postprozessieren aus den entsprechenden Spektraldaten erst ermittelt werden. Im Fall der MALDLIonisierung ist bei der Präparation der analytischen Probe lediglich die Matrixsub stanz gut bekannt, Molekülgehalt und lonisierungsverhalten der Ana- lytmoleküle hingegen sind nicht verifiziert und zu ermitteln. Die analytische Probe kann zum Beispiel eine Präparation sein, von der man annimmt, dass sie einen Mikroorganismus und/oder extrahierte Moleküle davon enthält, mit dem Ziel, das Taxon des Mikroorganismus bis hinunter zur Art/Spezies und/oder auch ein Resistenzverhalten gegenüber einer antimikrobiellen Substanz zu bestimmen. Die analytische Probe kann auch eine Präparation sein, die Zellen enthält, z.B. eukaryotische Zellen, deren Verhalten und/oder Reaktion auf die Exposition gegenüber einem bestimmten Reiz untersucht werden soll, z.B. die Aussetzung gegenüber einer toxikologisch und/oder pharmakologisch wirksamen Substanz.

[0035] In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung ein lonenspektromet- riesystem mit einem lonenanalysator, einer lonenquelle, die an den lonenanalysator angeschlossen ist, und einer Prozessoreinheit, die mit dem lonenanalysator und der lonenquelle kommuniziert und dazu ausgelegt und programmiert ist, ein wie zuvor erläutertes und beschriebenes Verfahren abzustimmen und auszuführen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

[0036] Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgenden Abbildungen verwiesen. Die Elemente in den Abbildungen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu dargestellt, sondern sollen in erster Linie die Prinzipien der Erfindung (größtenteils schematisch) veranschaulichen. In den Abbildungen sind einander entsprechende Elemente in den verschiedenen Ansichten durch gleiche Bezugszeichen gekennzeichnet.

[0037] Abbildung 1 veranschaulicht schematisch das Prinzip eines axial-linearen Flugzeit- Massenspektrometriesystems mit Laser-unterstützter Ionisierung; beispielsweise das micro- flex® LT/SH von Bruker.

[0038] Abbildung 2 zeigt schematisch einen typischen Ablauf einer MALDI-Punkt- Prob enpräparati on .

[0039] Abbildung 3 illustriert schematisch das Prinzip einer Performanzüberwachung und - regelung im Sinne der vorliegenden Offenbarung.

[0040] Abbildung 4 zeigt schematisch und beispielhaft ein lonenspektrometriesystem, mit dem sich die in der vorliegenden Offenbarung geschilderten Verfahren umsetzen lassen.

Detaillierte Beschreibung

[0041] Während die Erfindung anhand einer Anzahl von Ausführungsformen dargestellt und erläutert wurde, werden Fachleute auf dem Gebiet anerkennen, dass verschiedene Änderungen in Form und Detail daran vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der in den beigefügten Patentansprüchen definierten technischen Lehre abzuweichen.

[0042] Einzelne Kontrollproben-Messungen zur Performanzüberwachung und -regelung einer lonenquelle heranzuziehen, kann zu irritierenden Ergebnissen führen, da eine einzelne Kontrollprobe selbst fehlerbehaftet sein kann, z.B. durch Versäumnisse während der Präparation. Für die MALDI-Präparation ist eine schlecht auskristallisierte Matrixsub stanz vorstellbar, z.B. wenn das Verhältnis von Matrixsub stanz zu einzubettendem Molekül (normalerweise -10.000-5.000: 1) nicht den Vorgaben entspricht. Gerade im Bereich klinischer Anwendungen wie z.B. dem MALDI Biotyper® von Bruker kann es vorkommen, dass das Analysesystem von einer nur mit dem nötigsten Wissen zu dessen Betrieb geschulten Person bedient wird. Aus diesem Grund ist es möglich, dass dieser Bediener nicht in der Lage ist, etwaige Fehlpräparationen einzelner Kontrollproben zu erkennen. Wie in der Einleitung bereits erwähnt, kann regelmäßige Überprüfung durch geschulte Fachkräfte der Hersteller oder deren Servicepartner Abhilfe schaffen, allerdings nur zu hohen Kosten und mit gewaltigem Personalaufwand. Kontrollproben-Präparationen, die den Anforderungen nicht entsprechen, können auch durch das Alter des verwendeten Kontrollprobensubstrats selbst oder durch Minderwertigkeit der für die Kontrollproben-Präparation verwendeten Reagenzien verursacht werden, z.B. wenn vom Anwender der Ablauf von Haltbarkeitsdaten übersehen oder ignoriert wird.

[0043] Ziel ist, das lonenspektrometriesystem nach Auslieferung an den Nutzer einmal optimal durch Fachpersonal einstellen zu lassen und die Zahl der im laufenden Betrieb erforderlichen Wartungsvorgänge durch Fachpersonal oder Nutzer zu verringern oder zumindest so gering wie möglich zu halten. Auf diese Weise lassen sich Arbeitsaufwand und Kosten reduzieren. Dieses Ziel kann, neben anderen Maßnahmen wie der eingangs erwähnten lonenquellen- reinigung oder Detektorspannungsregelung, die aber nicht Gegenstand dieser Offenbarung sind, sondern nur als Ergänzung dienen können, mit einem (quasi-) automatisierten Nachregeln eines Betriebsparameters des Lasers für die Laser-unterstützte Ionisierung erreicht werden.

[0044] Ein Verfahren zur Performanzüberwachung und -regelung einer lonenquelle enthält folgende Schritte: (a) Laser-unterstütztes Ionisieren einer Kontrollprobe, deren Zusammensetzung substantiell bekannt ist und die, vorzugsweise in einem gleichen Messvorgang, vor, parallel zu oder nach einer analytischen Probe beprobt wird, (b) Erzeugen von Kontrollproben- Spektraldaten aus der ionisierten Kontrollprobe in einem an die lonenquelle angeschlossenen lonenanaly sator, (c) Wiederholen der Schritte (a) und (b) über eine Vielzahl von Kontrollproben und ggfs. Messvorgängen, um eine Vielzahl von Kontrollproben-Spektraldaten zu sammeln und derart auszuwerten, dass Spektraldaten einzelner Kontrollproben geringes Gewicht haben und ein Performanztrend in der Auswertung aufscheint, (d) Anpassen eines Betriebsparameters des Lasers der lonenquelle, falls der Performanztrend in einen Bereich außerhalb eines vordefinierten Performanzintervalls eintritt, um den Laser Intervall-konform einzuregeln, und (e) Wiederholen der Schritte (a) bis (d) zwecks kontinuierlicher Überwachung und - regelung der lonenquelle.

[0045] In Schritt (a) kann die Kontrollprobe in einem gleichen Messvorgang wie die analytische Probe beprobt werden und in Schritt (c) können die Schritte (a) und (b) über eine Vielzahl von Messvorgängen und Kontrollproben wiederholt werden. Ein Messvorgang im Sinne der vorliegenden Offenbarung kann insbesondere in Bezug auf die Betriebsweise des lonen- spektrometriesystems zu verstehen sein. Zum Beispiel kann ein Messvorgang alle Messungen umfassen, die von (Kontroll-)Proben auf einem Probenträger aufgenommen werden, solange er sich räumlich in der lonenquelle befindet. Ein Beispiel wäre das Einführen des Probenträgers in einen Unterdruckbereich der lonenquelle, sofern diese im Unterdrück arbeitet, insbesondere bei Vakuum-MALDI. Wird der Probenträger aus der lonenquelle, z.B. dem Unterdruckbereich, entfernt und anschließend ein weiterer Probenträger mit neuen (Kontrollgroben wieder eingeführt, können alle Messungen von den neuen (Kontroll-)Proben auf diesem nächsten Probenträger als separater Messvorgang angesehen werden.

[0046] Auf einem Probenträger für die Laser-unterstützte Ionisierung können neben Präparationen analytischer Proben auch mehrere Kontrollproben-Präparationen angeordnet sein. Wenn es sowohl Kontrollproben als auch analytische Proben auf dem Probenträger gibt, z.B. 2-10 technische Kontrollproben-Replikate, insbesondere 4-8 technische Kontrollproben-Rep- likate, können alle Kontrollproben-Spektraldaten dieser Präparationen zur Ermittlung des Performanztrends und/oder dessen zeitlichem Verlauf herangezogen werden. Eine Kontrollpro- ben-Präparation auf dem Probenträger kann einmal oder auch mehrere Male zur Erzeugung von Kontrollproben-Spektraldaten beprobt werden, begrenzt grundsätzlich nur durch die Ergiebigkeit der Kontrollprobe. Im Ergebnis können die Kontrollproben-Spektraldaten vereinzelte und gesonderte Spektren umfassen. Wiederholtes Beproben der gleichen Kontrollpro- ben-Präparation erhöht die Grundlage der Kontrollproben-Spektraldaten für eine anschließende statistische Auswertung und verringert den Einfluss insbesondere sehr kurzzeitig auftretender Störungen des Messablaufs, die Ausreißermessungen verursachen können.

[0047] Die Beprobung der Kontrollprobe vor, parallel zu oder nach einer analytischen Probe kann insbesondere bedeuten, dass Kontrollprobe und analytische Probe in einem gleichen Messvorgang untersucht werden. Die Beprobung der Kontrollprobe kann insbesondere unmittelbar vor oder unmittelbar nach einer analytischen Probe erfolgen. Die Messmodi oder Messeinstellungen des lonenspektrometriesystems können für die Beprobung analytischer Proben und Kontrollproben übereinstimmen oder sich auch unterscheiden. Wenn ein Messvorgang das Aufnehmen von Spektraldaten aller (Kontroll-)Proben auf einem Probenträger umfasst, wie zuvor ausgeführt, kann dies beinhalten, dass der Probenträger eine Vielzahl von ausgezeichneten Probenorten, z.B. ein Feld von Probenpunkten wie auf den bekannten Anchor- Chip- oder MBT Biotarget 96-Trägern von Bruker oder auch auf einer Stahlplatte, aufweist und einige dieser Probenorte einerseits mit einer vorbestimmten Anzahl von Kontrollproben präpariert sind, wohingegen einige oder alle der verbleibenden Probenorte mit analytischen Proben belegt sind. Kontrollproben und analytische Proben können dann in Blöcken getrennt voneinander (z.B. zuerst alle Kontrollproben, dann alle analytischen Proben) oder auch abwechselnd (z.B. Kontrollprobe => analytische Probe => Kontrollprobe => analytische Probe usw.) beprobt werden. In lonenquellen mit vielfachen Laserstrahlen können gegebenenfalls analytische Proben und Kontrollproben auch parallel vom gleichen Probenträger gemessen werden, wenn der angeschlossene lonenanaly sator auf die Verarbeitung multiplexierter lonen- ströme ausgelegt und eingerichtet ist oder wenn mehr als ein lonenanalysator vorhanden ist.

[0048] Der lonenanalysator kann als Massenanalysator ausgebildet sein, der die ionisierte Kontrollprobe insbesondere nach dem Prinzip der Flugzeit-Dispersion (time-of-flight, TOF) sortiert. Ein Massenanalysator trennt geladene Moleküle oder Molekülionen gemäß ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis, üblicherweise als m/z bezeichnet.

[0049] Abbildung 1 zeigt schematisch das Prinzip eines axial-linearen Flugzeit-Massenspektrometriesystems. Oberes Diagramm: Ein Laser beschießt eine (Kontroll-)Probe auf dem Probenträger 2, die beispielsweise mit einer MALDI-Matrixsub stanz präpariert worden ist. Eine Baugruppe aus Elektroden 4 beschleunigt die beim Laserbeschuss entstandenen Ionen ggfs. nach einer Verzögerungszeit in ein Flugrohr 6 des Flugzeitanalysators entlang einer geradlinigen Trajektorie 8. Da die unterschiedlichen Molekülspezies, die beim Laserbeschuss entstehen, unterschiedliche Massen haben und weitgehend einheitliche Ladung tragen, so dass sie bei der Beschleunigung mit der annähernd gleichen kinetischen Energie versehen werden, ergeben sich unterschiedliche Geschwindigkeiten. Leichte Moleküle, dargestellt als kleine schwarze Kreise, fliegen somit schneller als schwere Moleküle, dargestellt als Kreise mit größerem Umfang, und treffen eher am Detektor 10 ein, der z.B. als Dynodenreihe oder als Vielkanalplatte (multichannel plate, MCP) ausgebildet sein kann. Diese zeitliche Abhängigkeit des Eintreffens am Detektor erlaubt die Zuordnung von ladungsbezogenen Massen m/z zu den Detektionsereignissen; unteres Diagramm.

[0050] Neben Flugzeitanalysatoren, für die sowohl axial-lineare Aufbauten wie in Abbildung 1 angedeutet als auch Reflektoraufbauten und/oder solche mit orthogonaler Beschleunigung von Ionen in die Flugstrecke (OTOF) vorgesehen sein können, lassen sich grundsätzlich auch andere Arten massendispergierender Separatoren verwenden, z.B. Quadrupol -Massenfilter (single quads'), Tripel-Quadrupol-Analysatoren („Tripel-Quads“), lonenzyklotronreso- nanz-Zellen (ion cyclotron resonance, ICR), Analysatoren des Kingdon-Typs wie die Orbitrap® (Thermo Fisher Scientific) und andere. Es ist gleichfalls vorstellbar, den lonenanalysator als Mobilitätsanalysator oder kombinierten Mobilitäts-Massenanalysator auszubilden, wie bereits zuvor ausgeführt.

[0051] Die Kontrollprobe kann eine Aufbereitung eines Mikroorganismus, z.B. eines proka- ryotischen Organismus, insbesondere eine Aufbereitung einer Bakterienspezies, umfassen. Mikroorganismenzellen mit genau bekanntem Taxon und definiertem Gehalt an löslichen Molekülen, z.B. ribosomal en Proteinen und Peptiden, lassen sich kommerziell erwerben. Eine solche Ausgestaltung lässt bei standardisierter Präparation eine gut vorhersehbare und beständige Analysator- und Detektorantwort bezüglich z.B. Massensignalprofil bzw. Abundanz erwarten. Ein Beispiel ist der Bacterial Test Standard für den MALDI Biotyper® von Bruker, ein MALDI axial-lineares Flugzeit-Massenspektrometriesystem; der Standard umfasst ein typisches Escherichia coli DH5 alpha-Peptid- und Proteinprofil sowie zusätzliche Proteine, unter anderem geeignet für die Massenkalibration.

[0052] Vorzugsweise sind die Vielzahl von Kontrollproben deckungsgleich oder identisch; insbesondere werden über die Vielzahl der Messvorgänge Kontrollproben verwendet, die deckungsgleich oder identisch sind. Im Fall einer Mikroorganismenaufbereitung als Kontrollprobe können die Messungen über einen langen Zeitraum von biologischen und/oder technischen Replikaten des Mikroorganismus aufgenommen werden.

[0053] Umfasst die Kontrollprobe einen Mikroorganismus, ist dieser vorzugsweise sterilisiert. Das Sterilisieren kann ein Exponieren des Mikroorganismus gegenüber einer Stoffwechsel -hemmenden Flüssigkeit, z.B. einem Alkohol wie Ethanol oder Iso-Propanol oder einer Säure wie Ameisensäure, und/oder Energieeinwirkung, z.B. mit Wärme oder hochenergetischer Strahlung (ggfs. ultraviolettes Licht), umfassen. Unter Sterilisieren wird insbesondere verstanden, dass der Mikroorganismus die Fähigkeit verliert, sich selbst unter für ihn günstigen Bedingungen zu vermehren. Auf diese Weise können die mit unbeabsichtigter/unkontrol- lierter Verbreitung einhergehenden biologischen Gefahren in einem Analyselabor vermieden werden. Unter bestimmten Bedingungen kann es entbehrlich sein, den Mikroorganismus einer Kontrollprobe zu sterilisieren, beispielsweise dann, wenn in einem Analyselabor der biologischen Sicherheitsstufe 2 oder höher gearbeitet wird. Dort kann davon ausgegangen werden, dass hinreichend geschultes Fachpersonal zum Einsatz kommt.

[0054] Wie zuvor ausgeführt kann die lonenquelle nach dem MALDI-Prinzip arbeiten. Abbildungen 2A-C zeigen schematisch einen MALDI-Prozess von der Präparation der (Kontrollgroben bis zur Aufnahme von Spektraldaten. In Abbildung 2A werden (Kontroll-)Proben wie beispielsweise eine Mikroorganismensuspension 12 oder eine Suspension, die aus einem Mikroorganismus extrahierte lösliche Moleküle enthält, mit einer Pipette 14 oder einem anderen geeigneten Dispensiergerät auf den MALDLProbenträger 2* aufgetragen. Als MALDI- Probenträger lassen sich beispielsweise die AnchorChip- oder MBT Biotarget 96-Träger von Bruker oder auch Stahlplatten verwenden. Nachdem überschüssiges Fluid der Suspension entfernt worden ist, kann eine Matrixsubstanz-Lösung auf die fluidabgereicherte Zellschicht und/oder Schicht löslicher Moleküle aufgebracht werden, z.B. mittels einem geeigneten Werkzeug 16 wie einer weiteren Pipette, die hier mit Kachel Schraffur veranschaulicht ist. Nach dem Einbetten, Eintrocknen und Auskristallisieren der Matrix sind die einzelnen (Kon- troll-)Proben 18 bereit für die Beprobung mit einem Laserstrahl 20. Die dabei entstehenden Ionen 22 können dann beispielsweise in die Flugstrecke eines Flugzeitanalysators beschleunigt werden, wie schematisch in Abbildung 1 angedeutet.

[0055] Der Performanztrend kann von einer Abundanz oder Intensität im Analysator nachgewiesener Ionen abgeleitet werden; insbesondere kann eine durchschnittliche Abundanz oder Intensität herangezogen werden. Als Intensitätsmaß oder Abundanzmaß kann beispielsweise die Gesamtmenge an nachgewiesenen lonenströmen in den Spektraldaten verwendet werden; dies wird gelegentlich total ion count (TIC) genannt. Der TIC kann über den gesamten Spektralbereich oder auch über einen abgegrenzten Unterbereich erfasst werden, beispielsweise einen Bereich aus den Spektraldaten von 30.000 oder mehr atomaren Masseneinheiten (amu), 20.000 oder mehr amu, 10.000 oder mehr amu, 5.000 oder mehr amu oder 1.000 amu oder mehr. Möglich ist auch, eine durchschnittliche Intensität über den gesamten Spektralbereich oder einen Ausschnitt davon, beispielsweise einen Bereich aus den Spektraldaten von 30.000 oder mehr atomaren Masseneinheiten (amu), 20.000 oder mehr amu, 10.000 oder mehr amu, 5.000 oder mehr amu, oder 1.000 amu oder mehr, als Grundlage zu nehmen. Eine breite Datenbasis gewährleistet dabei statistische Stabilität, d.h. geringes Gewicht von Ausreißern über mehrere Kontrollproben, Kontrollproben-Beprobungen oder Messvorgänge hinweg.

[0056] Abbildung 3 illustriert schematisch die Rückkoppelung von Überwachung eines Performanztrends über einen längeren Zeitraum, Erkennung einer Performanztrend-Abweichung und dadurch ausgelöster Änderung eines Betriebsparameters des Lasers für die Laser-unter- stützte Ionisierung. Das untere Diagramm zeigt eine Zeitreihe eines (mittleren) lonenstroms am Detektor auf der vertikalen Achse über mehrere Messvorgänge auf der horizontalen Achse. Ein Messvorgang kann die ionenspektrometrische Untersuchung aller auf einem Probenträger abgelegten (Kontroll-)Proben umfassen, z.B. solange der Probenträger in einem Unterdruckbereich der lonenquelle angeordnet ist. In dem gezeigten Beispiel sind demnach 9 Probenträger mit Kontrollprobenbelegung in die Auswertung eingeflossen. Die Zahl der für den Performanztrend ausgewerteten Kontrollproben oder Kontrollproben-Beprobungen pro Messvorgang ist hier schematisch und beispielhaft mit drei angegeben und durch drei Balken pro Messvorgang im Diagramm repräsentiert. Es versteht sich, dass die Anzahl der Kontrollproben oder Kontrollproben-Beprobungen pro Messvorgang auch davon abweichen kann. Es können pro Messvorgang beispielsweise 2-10 oder 3-5 Kontrollproben beprobt oder ein Vielfaches davon an Kontrollproben-Beprobungen durchgeführt werden, z.B. an einer entsprechenden Anzahl technischer Kontrollproben-Replikate auf dem Probenträger. Im Fall eines Probenträgers mit ausgezeichneten Punkten für die Probenaufgabe, wie z.B. beim Anch- orChip- oder MBT Biotarget 96, ist die Zahl der Kontrollproben abzuwägen gegen die Zahl der analytischen Proben unbekannten molekularen Gehalts, die der Nutzer durch die ionen- spektrometrische Messung charakterisieren möchte. Bei beschränktem Raum auf dem Probenträger kann alternativ das Aufbringen und Präparieren einer ergiebigen einzelnen Kontrollprobe unter erhöhten Qualitätsanforderungen bei der Präparation in Erwägung gezogen werden, die dann zur Gewinnung einer umfassenden Spektraldaten-Grundlage für einen einzelnen Messvorgang einer Vielzahl von Beprobungen unterworfen wird.

[0057] Die mittlere horizontale gestrichelte Linie 24 im unteren Diagramm kennzeichnet einen lonenstromrichtwert, der eine durch ausführliche Prüfung und Kalibration gefundene optimale Einstellung darstellen kann. In einem typischen MALDI-Flugzeit-Massenspektrum kann dieser lonenstrom einer durchschnittlichen Intensität von 25.000-30.000 Zählern entsprechen, insbesondere 27.000 Zählern. Die um diese mittlere Linie 24 angeordneten äußeren gestrichelten Linien 26 repräsentieren die Intervallgrenzen um den lonenstromrichtwert herum, innerhalb dessen die Performanz des Systems aus lonenquelle und Analysator als den Anforderungen entsprechend oder befriedigend bezeichnet werden kann. Das Performanzintervall kann Abweichungen bis zu einem vordefinierten Prozentsatz, insbesondere ± 30 Prozent oder weniger, ± 25 Prozent oder weniger, ± 20 Prozent oder weniger, ± 15 Prozent oder weniger, oder ± 10 Prozent oder weniger, umfassen. Die Grenze zu höheren lonenströmen kann sich durch die Vermeidung von Detektorsättigung ergeben und die Grenze zu niedrigeren lonenströmen kann aus der Erfahrung abgeleitet werden, wie hoch ein lonenstromsignal sein muss, um eine nachweisbare und verlässliche Spektraldatenauswertung zuzulassen. Die Intervallgrenzen können äquidistant oder auch nicht-äquidistant von dem Performanzrichtwert angeordnet sein. In einer Ausführungsform kann eine obere Intervallgrenze näher am Performanzrichtwert liegen als eine untere Intervallgrenze; in einer anderen Ausführungsform kann eine untere Intervallgrenze näher am Performanzrichtwert liegen als eine obere Intervallgrenze.

[0058] Der Performanztrend kann auch aus der Güte der Charakterisierung des Molekülgehalts der substantiell bekannten Kontrollprobe abgeleitet werden. Wird zum Beispiel ein Mikroorganismus als Kontrollprobe verwendet, kann die höchste Ähnlichkeitsmaßzahl [der sogenannte log(score)) der einschlägigen Referenz-Spektraldaten eines auf die Identifizierung des Taxons ausgelegten lonenspektrometriesystems wie dem MALDI Biotyper® von Bruker als Performanzrichtwert dienen. Da das Taxon des Mikroorganismus in der Kontrollprobe substantiell bekannt ist, sollte der log(score) des MALDI Biotypers® deutlich über 2,00 liegen. Führt der Trend dazu, dass die untere Intervallgrenze von 2,00 über einen längere Beobachtungszeitspanne und damit ausreißerunabhängig erreicht und/oder unterschritten wird, kann es erforderlich sein, einen Betriebsparameters des Lasers anzupassen, um diesem Leistungsabfall entgegenzuwirken.

[0059] Die Auswertung in Schritt (c) kann die Vielzahl von Kontrollproben-Spektraldaten einer Mittelung, insbesondere Mittelwert- oder Medianbildung, unterziehen. Die Mittelwertbildung kann insbesondere auf dem arithmetischen Mittel beruhen. In Abbildung 3 sind die über drei Kontrollproben oder Kontrollproben-Beprobungen pro Messvorgang gemittelten lo- nenstromwerte durch gestrichelte Kreise 28 veranschaulicht. Durch die Aufnahme von Kontrollproben-Spektraldaten über eine Vielzahl von Kontrollproben, Kontrollproben-Beprobungen oder Messvorgängen kann ein gleitendes Mittel gebildet werden, d.h. aus einer Menge von Messungen lässt sich eine zeitlich variierende Untermenge, z.B. durch Berücksichtigung von Kontrollproben-Spektraldaten aus einem sich verschiebenden Zeitfenster, ggfs. über eine Vielzahl von Messvorgängen hinweg, für die Mittelwertbildung heranziehen.

[0060] Die Mittelung kann auf eine vorbestimmte Zahl von (i) Kontrollproben, z.B. 50-250 Kontrollproben, (ii) Messvorgängen, z.B. 10-30 Messvorgänge, (iii) Laseraktivierungen, z.B. über 10 ⁵ - 10 ⁷ Laserschüsse für Einzel spektraldaten- Aufnahm en, oder (iv) eine Zahl von Kontrollproben oder Messvorgängen aus einem vorbestimmten Zeitraum, z.B. über einen Zeitraum von 7-21 Tagen, 1-4 Wochen oder 1-2 Monaten, angewendet werden. Es ist ebenso möglich, die Mittelung auf eine vorbestimmte Zahl von vereinzelten Kontrollproben-Beprobungen anzuwenden, beispielsweise 400-2000 vereinzelte Kontrollproben-Beprobungen. Alle Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung haben gemein, dass der Anpassungsbedarf des Laser-Betriebsparameters nicht von einer einzelnen Kontrollprobe und schon gar nicht von einer einzelnen Kontrollproben-Beprobung anhängig gemacht wird, sondern auf einer Vielzahl von Kontrollproben und einer Vielzahl von Kontrollproben-Beprobungen fußt.

[0061] In Abbildung 3 ist eine die verschiedenen lonenstrommittelwerte verbindende Trendlinie 30 eingezeichnet, die eine Abschätzung darüber erlaubt, wie sich die beobachteten lo- nenstromwerte der Kontrollproben im weiteren Verlauf entwickeln könnten. In dem gezeigten konkreten Beispiel wird im dritten Messvorgang festgestellt, dass der lonenstrommittelwert die untere Intervallgrenze 26 erreicht hat; für den vierten Messvorgang wird sogar gefunden, dass der lonenstrommittelwert den Intervallbereich verlassen hat. Dieser Befund führt dazu, dass als Gegenmaßnahme ein Betriebsparameter des Lasers verändert wird, um diesem Leistungsabfall entgegenzuwirken, siehe Pfeil 32.

[0062] Für die Anpassung des Betriebsparameters kann die Laserenergiedichte, Laserfluenz, Laserleistung und/oder Laserintensität beim Laser-unterstützten Ionisieren geändert werden, wie anhand der Beschriftung der vertikalen Achse des oberen Diagramms in Abbildung 3 ersichtlich. Insbesondere kann die Laserenergiedichte, Laserfluenz, Laserleistung und/oder Laserintensität um einen voreingestellten Prozentsatz erhöht werden, wenn eine Performanztrend-Abweichung erkannt wird, siehe Inkrement #1. Eine Erhöhung kann sich im Bereich substanziell einstelliger Prozentwerte bewegen, z.B. 1-10 Prozent, insbesondere etwa 1 Prozent. Die Anpassung des Betriebsparameters des Lasers kann alternativ ein vordefiniertes Inkrement, z.B. einen bestimmten Prozentsatz, umfassen, sie kann aber auch in Abhängigkeit des Trendverlaufs und/oder der absoluten Abweichung von der Intervallgrenze berechnet werden, z.B. mit einem festen Inkrement (ggfs. ein Prozentsatz) als Basis, das durch einen Trendabhängigen Term korrigiert wird, um eine Übersteuerung bei der Anpassung zu vermeiden und eine Anpassungsroutine unabhängiger von Ausreißern zu machen.

[0063] Nach der im oberen Diagramm von Abbildung 3 gezeigten Anpassung des Laserparameters zwischen dem vierten und dem fünften Messvorgang ist der mittlere lonenstrom wieder in einen im Intervall befindlichen Bereich eingeregelt, ohne dass ein Eingriff eines Menschen erforderlich gewesen wäre. Das lonenspektrometriesystem mit lonenanalysator und derart überwachter und eingeregelter lonenquelle kann dann weiter betrieben werden und liefert fortgesetzt eine den Anforderungen entsprechende oder befriedigende Messleistung.

Sollte sich im Verlauf weiterer Messvorgänge ergeben, dass der Performanztrend sich wieder einer Intervallgrenze nähert, wie hier beispielhaft im 7. Messvorgang zu sehen, und dieser dann aus dem Intervallbereich herausfällt, wie im 8. Messvorgang angedeutet, kann wiederum der Betriebsparameter des Lasers angepasst werden, siehe Anpassung #2, ähnlich wie zuvor erläutert. Die Anpassung #2 kann dabei zu der Anpassung #1 identisch sein oder auch mit anderen Anpassungsinkrementen ausgeführt werden.

[0064] Eine Benachrichtigung und/oder Kennzeichnung kann erzeugt werden, sofern eine Anzahl von Anpassungen des Betriebsparameters über die Zeit einen vorbestimmten Wert, z.B. 2-10 Anpassungen, insbesondere 3-5 Anpassungen, erreicht oder überschreitet. Die Benachrichtigung kann in Form eines Eintrags in die Log-Datei des verwendeten lonenspekt- rometriesystems erfolgen. Möglich sind auch Nachrichten zur unmittelbaren Kenntnisnahme eines Nutzers, z.B. ein aufklappendes Fenster mit Text- oder Bildnachricht in der grafischen Nutzeroberfläche am Rechner des lonenspektrometriesystems oder eine automatisch erzeugte E-Mail oder SMS mit einem Inhalt, der das Ergebnis der Spektraldaten-Auswertung zusammenfasst. Eine solche Text/Bildnachricht, E-Mail oder SMS kann telekommunikativ unmittelbar an eine Empfängeradresse des lonenspektrometriesystem-Herstellers oder eines Service- Partners übermittelt werden, um automatisch einen Wartungsauftrag zu erteilen. Eine Kennzeichnung kann insbesondere einen Eintrag in ein Kommentarfeld der Metadaten zu den Spektraldaten beinhalten, die unter den veränderten Laserbedingungen aufgenommen wurden, um es dem Nutzer zu ermöglichen, die automatisierte Laser-Nachregelung auch zu einem späteren Zeitpunkt, z.B. bei der Auswertung der Spektraldaten von den analytischen Proben, die neben den Spektraldaten der Kontrollproben erfasst wurden, nachzuverfolgen.

[0065] Eine Zusammensetzung der analytischen Probe kann substantiell unbekannt sein. Kontrollprobe und analytische Probe unterscheiden sich insbesondere dadurch, dass die Kontrollprobe, ihr Molekülgehalt sowie ihr Verhalten während der Laser-unterstützten Ionisierung sehr gut bekannt und charakterisiert sind, weswegen sie als Regelgröße eingesetzt wird, wohingegen die Informationen über die analytische Probe durch ggfs. ausgefeiltes Postprozessieren erst ermittelt werden muss. Im Fall der MALDI-Ionisierung ist bei der Präparation der analytischen Probe lediglich die Matrixsub stanz gut bekannt, Molekülgehalt und Ionisierungsverhalten der Analytmoleküle hingegen sind zu ermitteln. Die analytische Probe kann zum Beispiel eine Präparation sein, von der man annimmt, dass sie einen Mikroorganismus und/oder extrahierte Moleküle davon enthält, mit dem Ziel, das Taxon des Mikroorganismus bis hinunter zur Art/Spezies und/oder auch ein Resistenzverhalten gegenüber einer antimikrobiellen Substanz zu bestimmen. Die analytische Probe kann auch eine Präparation sein, die Zellen enthält, z.B. eukaryotische Zellen, deren Verhalten und/oder Reaktion auf die Exposition gegenüber einem bestimmten Reiz untersucht werden soll, z.B. die Aussetzung gegenüber einer toxikologisch und/oder pharmakologisch wirksamen Substanz.

[0066] Abbildung 4 zeigt schematisch ein lonenspektrometriesystem 40 mit einem lonen- analysator 42, einer lonenquelle 44, die an den lonenanalysator 42 angeschlossen ist, und einer Prozessoreinheit 46, die mit dem lonenanalysator 42 und der lonenquelle 44 kommuniziert und dazu ausgelegt und programmiert ist, ein wie zuvor insbesondere mit Bezug zu Abbildung 3 erläutertes und beschriebenes Verfahren auszuführen. Der Weg der Ionen von lonenquelle 44 zum lonenanalysator 42 ist durch einen Pfeil 48 symbolisiert. Die Steuer- und Informationsempfangskommunikation der Prozessoreinheit 46 mit der lonenquelle 44 und dem lonenanalysator 42 ist durch doppelköpfige Pfeile 50 gekennzeichnet.

[0067] Die Erfindung ist vorstehend mit Bezug auf verschiedene besondere Ausführungsbeispiele beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass diverse Gesichtspunkte oder Einzelheiten der beschriebenen Ausführungen geändert werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Weiterhin können die im Zusammenhang mit unterschiedlichen Ausführungsformen offenbarte Merkmale und Maßnahmen beliebig kombiniert werden, sofern dies einem Fachmann praktikabel erscheint. Überdies dient die vorstehende Beschreibung nur zur Veranschaulichung der Erfindung und nicht zur Einschränkung des Schutzbereichs, der ausschließlich durch die beigefügten Patentansprüche unter Berücksichtigung etwaig vorhandener Äquivalente definiert wird.