"Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von kuαel- oder schlauchförmigen künstlichen Membranen"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von kugel- oder schlauchförmigen künstlichen Membranen aus selbstorganisierenden filmbildenden Molekülen, insbesondere aus Lipiden, bei welchem die filmbildenden Moleküle schichtförmig von zwei Seiten mit einer Lösung, insbesondere einer wassrigen Lösung, in Kontakt gebracht werden, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Künstliche Membranen, insbesondere aus Lipiden, sind bereits seit langer Zeit im Blickpunkt der Forschung. Diese Membranen sind einfache Modelle für biologische Membranen, die Zellen bzw. Zellbestandteile umgeben und an der zelluläre Prozesse, wie z.B. die Endo-/Exocytose, d.h. der Transport von Substanzen durch die Membran, beobachtet werden können.

Eine Aufgabe, die Membranen in der Natur erfüllen, ist die Bildung von Kompartimenten, die die jeweils eingeschlossenen Bereiche von der Umgebung abgrenzen. Dadurch kann z.B. eine hohe Osmolarität (hohe Ionenkonzentration) innerhalb der Zelle gegenüber einer geringen Osmolarität außerhalb der Zelle aufrechterhalten werden. Nur durch spezielle Prozesse kann ein Austausch von Substanzen erfolgen. Membranen besitzen weiterhin Zusammenhalt und Stabilität, z.B., um in Nervenzellen einen Transportweg für unterschiedliche ZeIl- bestandteile zu bilden.

Aufgrund ihres Potentials, Mikroreaktoren oder Schläuche zu bilden, sind Lipidmembranen auch für die Biotechnologie von großer Bedeutung. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um lipide Vesikel herzustellen. Bereits Mitte der 60er Jahre des letzten Jahrhunderts wurde beobachtet, dass Lipidfilme in wässriger Lösung schwellen, d.h. Wasser dringt in den Lipidfilm ein, und sich Vesikel verschiedener Größe formen. Durch Anlegen elektrischer Felder oder Er-

höhung der Temperatur konnte der Prozess der Vesikelbildung beschleunigt werden. Eine spontane Bildung von sehr kleinen Vesikeln (100 nm bis 250 nm) konnte auf einem Mikrochip erreicht werden. Dabei wurde eine organische Phase, die Lipi- de in gelöster Form enthält, durch zwei seitlich zufließende wässrige Lösungen hydrodynamisch fokussiert. An der Grenzfläche zwischen der organischen Phase und der wässri- gen Lösung werden die Vesikel gebildet.

Diese bekannten Herstellungsverfahren ermöglichen bisher keine direkte Kontrolle über die Größe der Vesikel, es liegt vielmehr eine breite Verteilung vor, die von Durchmessern im nm-Bereich bis zu Durchmessern von ca. 50 μm reicht. Eine Verbesserung der Größenverteilung wurde durch die Extrusion von Vesikelsuspensionen durch poröse Folien mit definierter Porengröße erreicht.

Allen bisher bekannten Herstellungsverfahren ist gemeinsam, dass während der Bildung der Membran ein Bereich der Lösung eingeschlossen wird. Dabei ist die Lösung im Inneren der Lipidstruktur identisch mit der Lösung außerhalb. Die äußere Lösung kann durch Verdünnung bzw. Abzentrifugieren der Vesikelsuspension abgetrennt werden. In vielen Anwendungen sollen in den Vesikeln Reaktionen unterschiedlicher Substanzen durchgeführt und untersucht werden. Hierzu können durch verschiedene Prozesse, z.B. Mikroinjektionen, Elek- troporation oder Fusion zweier unterschiedlich gefüllter Vesikel, weitere Substanzen in ein Vesikel eingeführt werden.

Die Herstellungsverfahren basieren auf der Eigenschaft von Lipiden oder anderen selbstorganisierenden filmbildenden Molekülen, sich spontan zu einer geordneten, ein- oder mehrschichtigen (sogenannte uni- oder multilamellaren) Membran zusammenzulagern. Dabei werden keine chemischen

(kovalenten) Bindungen gebildet, sondern es treten nur Wechselwirkungen zwischen den Lipiden auf, so dass sich die Strukturen unter entsprechenden Bedingungen leicht in ihrer Form oder Zusammensetzung verändern lassen.

So wurden ausgehend von sphärischen Vesikeln Membranschläuche gezogen, z.B. mittels einer Pipette, in der ein leichter Unterdruck besteht. Die so hergestellten Schläuche haben üblicherweise einen Durchmesser im Bereich von 20 bis 200 nm, die maximale Länge, die beschrieben wurde, liegt bei einigen hundert Mikrometern. Bei diesem Herstellungsverfahren sind die Membranschläuche nur stabil, solange sie an beiden Enden befestigt sind, d.h. sie bilden sich zurück, wenn der Unterdruck der Pipette gelöst wird. Mit der Pipettenmethode wurden weiterhin Netzwerke von Nanokanälen hergestellt, die verschiedene Vesikel bzw. Vesikel mit biologischen Zellen verbinden. Da diese Kanäle jedoch nur metastabil sind, sind beliebige Anordnungen von Netzwerken nicht möglich. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass sich lipide Schläuche in fließenden Systemen aus Zellmembranen oder Vesikeln ausbilden, die sich zurückbilden, sobald der Fluss gestoppt wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Lösung zu schaffen, mit der derartige künstliche Membranen in Kugel- oder Schlauchform reproduzierbar, stabil und weitgehend automatisiert hergestellt werden können.

Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die filmbildenden Moleküle auf eine zwei Kanäle eines Mikro- chips trennende, Mikroporen aufweisende Zwischenschicht aufgebracht wird und die beiden Kanäle jeweils mit einer wässrigen Lösung befüllt werden und dass anschließend zwischen den beiden Kanälen eine Druckdifferenz erzeugt wird.

Mit einem solchen Verfahren lassen sich kugelförmige, d.h. sphärische Strukturen und auch schlauchförmige Strukturen aus selbstorganisierenden filmbildenden Molekülen, insbesondere aus Lipiden, mit Durchmessern bis zu wenigen Mikrometern auf einem Mikrochip herstellen. Dazu wird die Poren aufweisende Zwischenschicht zwischen den beiden Kanälen des Mikrochips mit einer filmartigen Schicht aus den filmbildenden Molekülen beschichtet, d.h. ein solcher Film wird auf die Zwischenschicht aufgetragen. Dazu sind die filmbildenden Moleküle vorzugsweise in einer organischen Lösung als Lösungsmittel enthalten. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels werden die beiden Kanäle mit Wasser bzw. einer wässrigen Lösung befüllt. Durch Erzeugung einer Druckdifferenz zwischen den beiden Kanälen werden dann die sich bildenden Membranstrukturen durch die Poren in Richtung der filmabgewandten Seite hindurchgedrückt, also quasi extru- diert, wobei je nach Dimensionierung der Mikroporen und der Druckdifferenz bzw. der Flussgeschwindigkeit in den Kanälen reproduzierbar dreidimensionale Strukturen aus künstlichen Membranen erzeugt werden können. Diese Membranen können als Mikroreaktoren oder Transportkanäle für biotechnologische oder auch pharmazeutische Anwendungen eingesetzt werden.

Zur Erzeugung der Druckdifferenz ist bevorzugt vorgesehen, dass die wässrige Lösung aus einem Kanal abgesaugt wird. Wenn die Druckdifferenz gering ist, bilden sich bevorzugt sphärische und zylinderförmige, auch ringförmige Komparti- mente (Tori) sind zu beobachten. Sofern keine Scherkräfte an der Rückseite der Mikroporen einwirken, bleiben die gebildeten Membranen bzw. Vesikeln dort haften.

Erzeugt man eine hohe Druckdifferenz (durch Saugen auf der filmabgewandten Seite) , werden Schläuche erzeugt, die eine Länge von mehr als 1,5 cm erreichen können. Diese Schläuche sind stabil, auch wenn die Druckdifferenz gestoppt wird,

d.h. sie verändern nicht mehr ihren Durchmesser. Sie sind flexibel gegenüber Bewegung, d.h. sie können bewegt oder in beliebige Richtungen gedreht werden.

Der Durchmesser der Lipidschläuche wird (vermutlich) durch den Durchmesser der Poren in der dünnen Zwischenschicht bestimmt, der variiert werden kann. Ebenso kann die Geometrie des Mikrochips leicht verändert werden, z.B. das Design der Kanäle, der Einfüllöffnungen und das Muster der Poren. Damit können beliebig viele Membranstrukturen simultan erzeugt und beliebig angeordnet werden.

Je nachdem, ob kugelförmige oder schlauchförmige künstliche Membranen erzeugt werden sollen, wird ein Volumenstrom in der Größenordnung von 1 bis 100 μl/min. abgesaugt, wobei bei größeren Volumenströmen, d.h. großen Druckdifferenzen, schlauchförmige Membranen entstehen. Diese Volumenströme beziehen sich auf Mikrochips mit Kanälen in einer Größenordnung von 100 μm Breite und 30 μm Höhe.

Bevorzugt ist vorgesehen, dass eine Zwischenschicht mit Poren verwendet wird, deren Durchmesser in der Größenordnung von 2 bis 3 μm liegen.

In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass in die beiden Kanäle unterschiedliche wässrige Lösungen eingefüllt werden. Es können auch organische Lösungen verwendet werden.

Zur Lösung der eingangs gestellten Aufgabe sieht die Erfindung auch eine Vorrichtung zur Durchführung des vorbeschriebenen Verfahrens vor, welche einen Mikrochip mit zwei Kanälen aufweist, die durch eine Mikroporen aufweisende Zwischenschicht voneinander getrennt sind, wobei ein Kanal mit einer eine Druckdifferenz zwischen den beiden Kanälen

erzeugende Einrichtung verbunden ist.

Diese Einrichtung zur Erzeugung einer Druckdifferenz ist bevorzugt als Pumpe ausgebildet, so dass die Druckdifferenz dadurch erzeugt wird, dass aus dem (rückwärtigen) Kanal die wässrige Lösung mit den sich bildenden Membranen abgesaugt wird.

Bevorzugt ist vorgesehen, dass die Mikroporen in der Zwischenschicht Durchmesser in der Größenordnung von wenigen μm aufweisen.

Ferner hat es sich als bevorzugt herausgestellt, dass die Kanäle zwischen 10 und 100 μm breit und hoch sind.

Das vorbeschriebene Verfahren und die vorbeschriebene Vorrichtung ermöglichen eine automatisierte reproduzierbare Erzeugung von Mikroreaktoren oder Mikroschläuchen homogener Größe. Durch die Trennung der Bereiche vor und hinter der dünnen Zwischenschicht kann direkt eine Befüllung der Membranen bzw. Vesikel erfolgen bzw. können beliebig viele Substanzen gezielt durch die Lipidschläuche geleitet werden, d.h. die innerhalb der Strukturen eingeschlossene Lösung kann eine andere sein als die umgebende Lösung. Keine weiteren Aufreinigungs-/Abtrennungsschritte sind erforderlich. Da sämtliche Vorgänge auf einem Mikrochip und in wässriger Phase erfolgen, können weitere Reaktions-/Ma- nipulations-/Analyseschritte direkt im Anschluss auf dem Chip durchgeführt werden.

Die Vesikel können als Mikroreaktoren eingesetzt werden, z.B. für die Durchführung und Analyse von bio- /chemischen Reaktionen. Da sie mit hoher Geschwindigkeit (von vermutlich bis zu 100 Vesikel pro Sekunde und pro Pore) und in stets identischer Größe hergestellt werden können, können

sie als Träger von Wirkstoffen in der Pharmazie/Medizin Anwendung finden, ebenso für die Medikamententwicklung. Das Anwendungsspektrum läßt sich durch Einfügen von Membranproteinen in die Vesikelmembran noch erweitern.

Die Membranschläuche sind spannungsfrei erzeugt und nicht an ein Vesikel gebunden. Solange bei der Herstellung ausreichend Material zur Verfügung steht, wird der Durchmesser der Kanäle nicht mit zunehmender Länge geringer oder zieht sich nach Wegfall der Druckdifferenz wieder zurück. Es ist wahrscheinlich, dass sie sich durch geeignete Methoden, z.B. optisches Trappen oder Mikromanipulation untereinander verbinden lassen, so dass komplizierte, aber veränderbare Netzwerke aus Lipidschläuchen aufgebaut werden können. Beide Strukturtypen, sowohl kugelförmige als auch schlauchförmige Membranen, können weiterhin dazu beitragen, grundlegende Fragestellungen in der Zellbiologie zu lösen (z.B. wie der Transport von Substanzen entlang eines Lipidschlau- ches erfolgt usw.) .

Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Diese zeigen in:

Fig. 1 eine Seitenansicht auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens,

Fig. Ia ein vergrößertes Detail der Figur 1,

Fig. 2 eine Explosionsdarstellung der Figur 1,

Fig. 3 eine schematische Darstellung eines Lipidmoleküls, einer unilamellaren Lipidmembran und einer multi- lamellaren Lipidmembran,

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines kugelförmigen Vesikels,

Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Lipid- schlauches,

Fig. 6 eine fotographische Darstellung einer mit einem

Lipidfilm überdeckten Zwischenschicht der Vorrichtung,

Fig. 7 eine fotographische Darstellung der an den Poren der Zwischenschicht gebildeten lipiden Vesikel,

Fig. 8 eine Darstellung von an der Zwischenschicht gebildeten Lipidschläuchen und

Fig. 9 in anderer Darstellung die gebildeten Lipid- schläuche .

Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung von kugel- oder schlauchförmigen künstlichen Membranen aus selbstorganisierenden filmbildenden Molekülen, insbesondere aus Lipiden, weist einen allgemein mit 1 bezeichneten Mikrochip auf. Dieser Mikrochip 1 weist zwei Kanäle 2, 3 auf, die in zwei PDMS (Silikon) -Schichten des Mikrochips enthalten sind. Zwischen den beiden Kanälen 2, 3 ist eine Zwischenschicht 4 angeordnet, die vorzugsweise aus Silizium besteht, insbesondere SiO ₂ /Si ₃ N ₄ . Die Zwischenschicht 4 ist mit Mikroporen in einer Größe von beispielsweise 2,5 μm versehen. Unterseitig weist der Mikrochip 1 zur Stabilisierung einen Glasträger 5 auf.

In der vergrößerten Detaildarstellung gemäß Figur Ia ist

- S -

eine Mikropore 6 der Zwischenschicht 4 gezeigt. Ferner ist eine sich bildende kugelförmige Membran im Bereich der Pore 6 angedeutet und mit 7 bezeichnet.

Auf die dünne Zwischenschicht 4 wird ein Lipidfilm aufgetragen, z.B. 1, 2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Selbstverständlich können auch eine Vielzahl anderer Lipide und amphiphiler Moleküle verwendet werden oder in anderer Bezeichnung selbstorganisierende filmbildende Moleküle. Die Kanäle 2 und 3 werden mit Wasser bzw. einer wässrigen Lösung befüllt, dabei kann es sich auch um unterschiedliche wässrige Lösungen handeln.

Der Lipidfilm wird nun durch die Poren 7 gepresst. Dies kann durch positiven Druck auf der Seite des Lipidfilms (dem Kanal 2 zugewandte Seite) erfolgen, bevorzugt aber durch Unterdruck auf der anderen Seite der Zwischenschicht 4, also angrenzend an den Kanal 3. Dazu ist bevorzugt an den Ausgang des Kanals 3 eine nicht dargestellte Pumpe angeschlossen. Durch Anlegen einer Druckdifferenz zwischen dem Kanal 2 und dem Kanal 3 wird ein Fluss vor bzw. hinter den Mikroporen 6 erzeugt. Die Höhe der Druckdifferenz, die auf die Mikroporen 6 einwirkt, beeinflusst die entstehenden Membranstrukturen.

Für kleine Druckdifferenzen, welche Volumenströme in der Größenordnung von 1 μl/min. bei einer Breite von 100 μm und einer Höhe von 30 μm der Kanäle 2, 3 verursachen, bilden sich bevorzugt kugelförmige und zylinderförmige Vesikel. Auch ringförmige Kompartimente sind zu beobachten. Sofern keine Scherkräfte an der Rückseite der Mikroporen 6 einwirken, bleiben die gebildeten Vesikel dort haften.

Erzeugt man demgegenüber eine hohe Druckdifferenz durch

Saugen auf der Rückseite, so dass Volumenströme von bis zu 100 μl/min. entstehen, werden schlauchförmige Membranen erzeugt, die eine Länge von bis zu 1,5 cm und mehr erreichen können. Diese schlauchförmigen Membranen sind stabil, auch wenn keine Druckdifferenz mehr besteht, d.h. sie verändern ihren Durchmesser nicht mehr. Sie sind flexibel gegenüber Bewegung, d.h. sie können bewegt oder in beliebige Richtungen gedreht werden.

Der Durchmesser der Lipidschläuche (schlauchförmige Membranen) wird vermutlich durch den Durchmesser der Mikro- poren 6 in der Zwischenschicht 4 bestimmt, welcher innerhalb der Grenzen der Photolitographie variiert werden kann. Ebenso kann die Geometrie des Mikrochips leicht verändert werden, z.B. das Design der Kanäle 2, 3 der Einfüllöffnungen und das Muster der Mikroporen 6. Damit können beliebig viele Lipidstrukturen simultan erzeugt und beliebig angeordnet werden.

Zur besseren Erläuterung sind beispielhaft schematisch in der Figur 3 ein Lipidmolekül und daraus sich bildende Lipidmembranen dargestellt. Ein einzelnes Lipidmolekül ist links in Figur 3 dargestellt, es weist eine polare Kopfgruppe 8 und zwei unpolare Kohlenwasserstoffketten 9, 10 auf.

In der mittleren Darstellung der Figur 3 ist eine uni- lamellare Lipidmembran 11 gezeigt, wie sie sich in einer wässrigen Lösung anordnet, und zwar mit den polaren Kopf- gruppen nach außen.

Die rechte Darstellung der Figur 3 zeigt einen Lipidfilm bzw. eine multilamellare Lipidmembran 12.

Die Figuren 4 und 5 zeigen sich durch das Verfahren bil-

dende Membranstrukturen. Figur 4 zeigt eine kugelförmige Membran bzw. bei Lipiden ein sphärisches Vesikel 13, in Figur 5 ist eine schlauchförmige Membran 14 dargestellt.

In den Figuren 6 bis 9 sind experimentelle Ergebnisse gezeigt .

Figur 6 zeigt die Zwischenschicht 4 aus SiO ₂ /Si ₃ N ₄ mit einer beispielhaften Breite von 100 μm und Poren mit einem Durchmesser von ungefähr 2,5 μm, die Zwischenschicht ist mit einem Lipidfilm überdeckt, der mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt ist.

In Figur 7 ist zu erkennen, dass sich durch die Druckdifferenz zwischen den Kanälen 2, 3 beiderseits der Zwischenschicht 4 an den Mikroporen lipide Vesikel ausgebildet haben.

Figuren 8 und 9 zeigen in ähnlicher Darstellung wie in Figuren 6 und 7 die Bildung von Lipidschläuchen bei hohen Druckdifferenzen. In der Figur 8 ist die Zwischenschicht 4 aus SiO ₂ /Si ₃ N ₄ mit den einzelnen Mikroporen zu erkennen. Figur 9 zeigt die in Flussrichtung verlaufenden, sich bildenden Lipidschläuche.