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Title:
METHOD AND DEVICE FOR PRODUCING COMMERCIAL MILK AND MILK HAVING REDUCED BIOLOGICAL EFFECT OF EXOSOMAL RIBONUCLEIC ACIDS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/161519
Kind Code:
A1
Abstract:
This invention describes the micro-ribonucleic acids (abbreviated miRNAs) contained in milk, in particular cow's milk, as an extreme health risk, hitherto unrecognised by science, for the development of the following lifestyle diseases: overweight, type 2 diabetes, and cancer. This patent provides a technical solution by deactivating the undesirable biological effects of the miRNAs of the milk by removing and/or destroying the miRNA-transporting 50 - 100 nm large exosomes of the milk. This is accomplished by treating the skim milk fraction by means of 20-kHz ultrasound and/or removing the milk exosomes by means of the immunoadsorption thereof and/or adding RNases before the further conventional milk processing The goal of this new method of milk treatment is to reduce the health-harming effects of the miRNA-mediated genetic signal systems of the milk on the long-term consumers and thus to improve the product safety of the milk and products of the further processing of the milk.

Inventors:
MELNIK, Bodo C. (Eickhoffstraße 20, Gütersloh, 33334, DE)
Application Number:
DE2013/100142
Publication Date:
October 09, 2014
Filing Date:
April 18, 2013
Export Citation:
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Assignee:
MELNIK, Bodo C. (Eickhoffstraße 20, Gütersloh, 33334, DE)
International Classes:
A23C3/07; A23C7/04
Domestic Patent References:
WO1993013674A1
Foreign References:
DE4226848A1
DE4206978A1
GB1176792A
Other References:
LÃ SSER CECILIA ET AL: "Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages", JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE, BIOMED CENTRAL, LONDON, GB, Bd. 9, 14. Januar 2011 (2011-01-14), Seiten 1-8, XP021088880, ISSN: 1479-5876, DOI: 10.1186/1479-5876-9-9
None
Attorney, Agent or Firm:
FROHOFF, Dietmar (Mauerstraße 8, Bielefeld, 33602, DE)
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Claims:
P a t e n t a n s p r ü c h e

1 . Verfahren zur Herstellung kommerzieller Milch mit reduzierter biologischer Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass die Milch in einem Hauptverfahrensschritt einer Ultraschallbehandlung unterzogen wird, während derer die Lipidmembranhüllen der Mikro-Ribonukleinsäuren (miRs) transportierenden Exosomen in der Milch durch Ultraschall zerstört werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraschall¬ behandlung der Milch mit einem niederfrequenten Ultraschall im Bereich zwischen 1 5 kHz und 25 kHz in einem Temperaturbereich von 4°C bis 25°C erfolgt.

3. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschallung kontinuierlich oder gepulst mit Zwischenpausen erfolgt und die akustischen Quellen plan oder fokussiert sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschallung in einem I ntervall von 1 0 bis 30 Minuten und mit einer akustischen Leistung von 0, 1 bis 1 0 W/cm2 erfolgt, wobei die Druckamplituden zwischen 50 und 1 50 kPa liegen.

5. Verfahrensschritt nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Milch in einem vorgeschalteten Verfahrensschritt zentrifugiert und nur die daraus gewonnene Magermilchfraktion der Ultraschallbehandlung unterzogen wird.

6. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einem dem Hauptverfahrensschritt nachgeschalteten Verfahrensschritt der Ultraschall behandelten Milch exogene RNAsen zugeführt werden, die neben den in der Milch natürlich vorkommenden RNAsen zu einer verstärkten Degradation der aus den Exosomen freigesetzten miRs und m RNAs der Milch führen.

7. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dem Hauptverfahrensschritt ein weiterer Verfahrensschritt eines

I mmunadsorptionsverfahrens vor- oder nachgeschaltet ist, bei dem mit Antiköpern beschichtete Trägermaterialien durch die Milch hindurch bewegt werden und/ oder die Milch entlang Antikörper-beschichteter Flächen geführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Hindurchbewegen der mit Antikörpern beschichteten Trägermaterialien über einen Zeitraum von 1 5 bis 60 Minuten oder das Vorbeiführen an Antikörperbeschichteten Flächen für einen Zeitraum zwischen 1 0 und 30 Minuten erfolgt.

9. Milch mit reduzierter biologischer Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen der vorgenannten Verfahrensschritte zur Reduzierung der biologischen Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren der Immunadsorption, der Ultraschallbehandlung oder der Ultraschallbehandlung mit nachfolgender RNAse-Zugabe durchlaufen hat. 0. Vorrichtung zur Herstellung kommerzieller Milch mit reduzierter biologischer Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein gekühltes Rohrsystem aufweist, mit einer Serie von darin hinter- und/ oder nebeneinander angeordneten Schallköpfen. 1 . Vorrichtung zur Herstellung kommerzieller Milch mit reduzierter biologischer Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine flache gekühlte Wanne aufweist, an oder in deren Boden, Decke und/ oder Sei- tenwänden die Schallköpfe angeordnet sind.

Description:
Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung kommerzieller Milch und Milch mit reduzierter biologischer Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung kommerzieller Milch und Milch mit reduzierter biologischer Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren.

Milch und Milchprodukte zählen zu den Grundelementen westlicher Ernährung. Durch Einführung flächendeckender Kühltechnologie Mitte der 1950iger Jahre, Optimierung der Hygienebedingungen, Haltbarkeitssteigerung der Milch und Milchprodukte sowie Vergrößerung der Produktpalette ist der Konsum von Milch und Milchprodukten wie Joghurt und Käse in den letzten Jahrzehnten signifikant in den Industrienationen angestiegen.

Der Erfinder teilt nicht die gegenwärtig vorherrschende Auffassung, dass die gesundheitlichen Vorteile des Milch- und Milchproduktkonsums die nachfolgend dargestellten gesundheitlichen Nachteile des Milchkonsums übertreffen, da übermäßiger Milch- und Milchprodukt-Konsum das Risiko an Zivilisationskrankheiten zu erkranken, maßgeblich steigert. Milchkonsum während der Schwangerschaft erhöht das fetale Größenwachstum und das Geburtsgewicht der Neugeborenen. Ein erhöhtes Geburtsgewicht von Mädchen ist mit einem erhöhten Brustkrebsrisiko assoziiert. Auf Kuhmilcheiweißbasis hergestellte Formula-Ernährung steht in kausalem Zusammenhang, die postnatale adipogene Fehlprogrammierung der Säuglinge und Übergewicht von Kleinkindern zu fördern. Milchkonsum bei Kindern steigert deren Längenwachstums, erhöht deren Body Mass Index (BMI), führt zum vorzeitigen Auftreten der Menarche, die als Risikofaktor für vorzeitiges Auftreten von Typ-2 Diabetes erkannt wurde. Milchkonsum begünstigt das Auftreten von Akne, steigert das Risiko für Adipositas, Typ 2-Diabetes, Prostatakrebs und Brustkrebs und ist somit als wichtiger Promotor westlicher Zivilisationskrankheiten zu betrachten. Milch-induzierte Zivilisationskrankheiten sind mit erhöhtem Zellwachstum, gesteigerter Zellproliferation und anabolen Stoffwechselreaktionen assoziiert. Auf molekularbiologischer Ebene spielt eine übermäßig gesteigerte Aktivität des zentralen Regulators des Stoffwechsels, des Enzyms mTORCI (mechanistic target of rapamycin complex 1 ; Synonym: mammalian target of rapamycin complex 1 ) hierbei die zentrale Rolle in der Pathogenese der mTORCI - assoziierten Zivilisationskrankheiten. Die vorliegende Erfindung betrachtet Milch nicht als herkömmliches Nahrungsmittel, sondern als ein Mikro-Ribonukleinsäure-, kurz: miR-gesteuertes Botensystem zur mTORCI -Aktivierung der miR-regulierten Körperzellen, das physiologischer Weise der Stimulierung postnatalen Wachstums der Säugetiere dient. Die Milch-induzierte mTORCI -Aktivierung erfolgt nach Ansicht des Erfinders insbesondere durch Übertragung regulatorischer Mikro-Ribonukleinsäuren (miRs) der Milch, die in Form kleinster Nanopartikel, sog. Exosomen, zum Empfänger transportiert werden. Milch ist das miR-reichste Sekretionsprodukt zum Lebensstart der Säugetiere. Muttermilch des Menschen enthält im Vergleich zu allen anderen Körperflüssigkeiten des Menschen den höchsten Gehalt an miRs. Mehr als 245 miR-Spezies wurden in der Kuhmilch nachgewiesen.

Eine miR hat die Fähigkeit durch komplementäre Bindung an jeweils spezifische 3 ' -UTR-Regionen einer zu regulierenden mRNAs komplementär zu binden und dadurch diese mRNAs zu hemmen oder völlig auszuschalten. miRs sind somit in der Lage, die Translation und Entstehung spezifischer Proteine abzuschalten.

Entsprechend der Einsicht des Erfinders induziert Milch Wachstum durch Bereitstellung spezifischer miRs, welche die Aufgabe haben, Zellzyklus-hemmende regulatorische Proteine, sog. Tumorsuppressor-Proteine, wie PTEN, PDCD4 und Sprouty abzuschalten.

Von zentraler Bedeutung für die schädliche biologische Langzeitwirkung chronischen Milchkonsums des Menschen sind nach Ansicht des Erfinders die miRs der Milch, die durch Milchkonsum in biologisch aktiver Form ständig vom Verbraucher aufgenommen werden. Von kritischer Bedeutung für den Transfer sind die ca. 50-1 00 nm großen M ikrovesikel (Exosomen), die die optimale und vorherrschende Transportform der miRs der Kuhmilch darstellen.

Diese Exosomen schützen die miRs der Milch vor den sauren pH-Bedingungen der Magen-Darm-Passage, vor thermischer Denaturierung (wie z. B. während der Pasteurisierung der Milch) als auch vor enzymatischer I naktivierung durch RNAsen und erlauben deren Endozytose mit zellulärem Eintritt der regulatorisch wirksamen miRs in die Zielzellen des Empfängers. I n der vorliegenden intakten exosomalen Transportform können die regulatorischen miRs der Milch von den Körperzellen des Milchempfängers (des Säuglings bzw. Milchkonsumenten) aufgenommen werden. Milch fungiert aus Sicht des Erfinders in Analogie zu einer Virusinfektion als ein genetisches Transfektionssystem, das dem Milchempfänger mTORCI -aktivierende miRs zuführt.

Eine der 7 immer in der Kuhmilch enthaltenen miRs, die als konstanter Qualitätsmarker der Milch während verschiedener Laktationsphasen vorkommt, ist die miR-21 . Höchst bedenklich ist die Tatsache, dass miR-21 als onkogene miR (Oncomir-21 ) betrachtet wird, da sie Tumorwachstum, Zelladhärenz, Zellmigration, I nvasion, Motilität und Angiogenese induziert und damit Metastasierung fördert. Eine ständige miR-induzierte Aktivierung der mTORC I -Signalkaskade steht aus Sicht des Erfinders in unmittelbarem Zusammenhang mit bekannter mTORC I - induzierter Kanzerogenese und Krebsprogression.

Kuhmilch enthält beträchtliche Mengen der miR-Familie let-7a, let-7b, let-7c und let-7f. Diese miRs spielen eine maßgebliche Rolle bei der Regulation des Glukosestoffwechsels. Tierexperimentelle Daten verdeutlichen, dass eine Überexpression von let-7 zur I nsulinresistenz führt und damit die Diabetesentwicklung begünstigt. Die I nsulinresistenz von Stammzellen des Fettgewebes von Patienten mit Adipositas konnte durch I naktivierung von let-7 beseitigt werden. Aus Sicht des Erfinders erklärt die durch ständigen Milchkonsum erfolgende exogene Zufuhr von let-7 die durch Milchkonsum induzierte I nsulinresistenz als auch die adipogene Wirkung der Milch.

Zentrale Aufgabe der Erfindung ist die Abschwächung bzw. Eliminierung gesundheitsschädlicher biologischer miR-Aktivität kommerzieller Milch, die erstmals vom Erfinder als schädlicher Faktor für die Volksgesundheit erkannt wurde. Als kommerzielle Milch ist hier insbesondere Kuhmilch zu nennen, die Erfindung bezieht sich jedoch ebenfalls auf alle anderen Tiermilchen, wie beispielsweise Büffelmilch, Ziegenmilch, Schafsmilch oder Stutenmilch

Der entscheidende Faktor für die Stabilität und biologische Wirksamkeit der schädlichen miRs der Milch ist deren Transfer in Form von Exosomen, die vom Brustdrüsenepithel der Kuh gebildet werden. Diese meist 50-1 00 nm großen membranösen Vesikel enthalten eine Lipidmembranhülle, die entsprechend der Lösung der gestellten Aufgabe dieser Erfindung durch U ltraschall zerstört werden kann und dadurch ein Eindringen der Milch-miRs in Körperzellen von Milchkonsumenten auf vorteilhaft einfache Art und Weise verhindert.

Ultraschall-induzierte Zerstörung der Transportform der miRs der Milch im Vorfeld ihrer weiteren Verarbeitung erlaubt somit die Beseitigung der krankheitsinduzieren- den biologischen Aktivität exosomaler miRs der Milch auf den Menschen und stellt damit eine vorteilhafte Maßnahme zur Erhöhung der Produktsicherheit der Milch und Milchprodukte und Verminderung ihrer negativen Gen-regulatorischen Wirkungen dar.

Entsprechend dieser Erfindung stellt Ultraschall eine geeignete physikalische Methode zur Zerstörung der Kuhmilch-Exosomen dar. Die Beeinträchtigung der strukturellen I ntegrität der Milch-Exosomen und ihrer Cargo-Moleküle (vor allem der miRs) ist die primäre Zielsetzung dieses Patents. Zum Erreichen dieses Zwecks wird die Milch mit niederfrequentem Ultraschall im Bereich von 1 5 bis 25 kHz, bevorzugt 20 kHz, beschallt. Die Zerstörung von Liposomen und Phospholipidvesikeln in der Größenordnung von 1 00 nm konnte in verschiedenen Modellsystemen durch Ultraschallbehandlung im kHz-Bereich demonstriert werden. Ausgangsmaterial für die Ultraschallbehandlung ist vorzugsweise die nach dem Zentrifugieren (Separieren) der Rohmilch gewonnene Magermilchfraktion, die vom Hauptteil des Milchfetts befreit ist. Durch die Ultraschall-induzierte transiente Kavitation werden die Lipidmembranen der Exosomen der Milch permeabel gemacht. I nfolge dieser Sonoporation verlieren die Exosomen ihren I nhalt, vor allem die unerwünschten regulatorischen miRs und mRNAs. Diese sind nach der Ultraschallbehandlung den in der Milch natürlich vorkommenden RNAsen ungeschützt ausgesetzt, die deren weitere I naktivierung bewirken. I n einer weiteren Modifikation dieser Methode werden zusätzlich exogene RNAsen nach der Ultraschallbehandlung der Magermilch zugeführt, um die Degradation der miRs und mRNAs der M ilch zu optimieren.

Die Magermilch wird in schalldurchlässige Behälter geleitet. Die Temperatur der Magermilch zur Beschallung liegt bei 4°C bis maximal 25°C, bevorzugt bei 7°C. Die abzugebende akustische Leistung der Schallköpfe liegt im Bereich von 0, 1 bis 1 0 W/cm 2 , bevorzugt bei 5 W/cm 2 . Die Druckamplituden betragen zwischen 50 und 1 50 kPa, bevorzugt bei 60 kPa. Der Ultraschall kann entweder kontinuierlich oder gepulst, z. B. 30 Sekunden Beschallung, 3 Minuten Pause, emittiert werden mit akustischen Quellen, die plan oder fokussiert sind. Die Beschallungszeit liegt in einem Intervall von 1 0 bis zu 30 Minuten, bevorzugt bei 1 5 Minuten . Die Milch strömt entweder durch eine ummanteltes, gekühltes ggf. mäanderndes Röhrensystem an einer in Serie geschalteten Reihe von Schallköpfen vorbei oder wird für den erforderlichen Zeitraum in eine flache gekühlte Wanne eingelassen, an oder in deren Boden, Decke und/ oder Seitenwänden die Schallköpfe in benötigter Dichte angebracht sind. Bevorzugt sollen modifizierte I ndustrie-Ultraschall ¬ prozessoren zur Anwendung kommen. Angestrebt werden Durchflussraten der beschallten Magermilch von ca. 5-1 0 m 3 pro Stunde oder mehr. Die Exosomen enthalten charakteristische Markerproteine, die Tetraspanine CD37, CD53, CD63, CD81 und CD82. In Milch-Exosomen wurden insbesondere die Tetraspanine CD63 sowie CD81 nachgewiesen . M it anti-CD63 und/ oder anti-CD81 - Antikörpern beschichtete Glaskugeln oder andere Trägermaterialien können zur Entfernung/Reduktion der Milch-Exosomen durch Immunadhäsion von Milch-Exosomen herangezogen werden. Die Antikörper-beschichteten Glaskugeln oder andere inerte Materialien werden unter vorsichtigem Rühren durch die Milch bewegt und nach einer Expositionszeit von 1 5-60 Minuten, bevorzugt 30 Minuten, von der Magermilch abgetrennt und zur Wiederverwendung reeluiert werden.

Ein weiteres Immunadsorptionsverfahren erfolgt durch Vorbeiströmen der Magermilch entlang Antikörper-beschichteter Flächen, die aus Glas oder geeigneten inerten Kunststoffen bestehen. Hierbei wird die Magermilch mit Anti-CD63 und/ oder Anti-CD81 -beschichteten Platten in Kontakt gebracht und für eine geeignete Zeit zwischen 10 und 30 Minuten, bevorzugt 1 5 Minuten, zur Adhäsion der Exosomen inkubiert. Die Platten mit gebundenen Exosomen werden von der Magermilch getrennt. Durch hochmolare NaCI-Lösung werden die Exosomen von den Platten eluiert und diese zur weiteren Verwendung wieder eingesetzt.

Zur Steigerung des Effizienzgrades der biologischen I naktivierung Milch-Exosomen- transportierter miRs werden beide o.g. Verfahren sequentiell kombiniert. Vorzugsweise soll die Immunadhäsion der Exosomen dabei der Sonoporation verbliebener Exosomen vorausgehen.

Insgesamt lässt sich mit dem erfinderischen Verfahren und der entsprechend ausgebildeten Vorrichtung ein Milchprodukt zur Verfügung stellen, welches eine reduzierte biologische Aktivität exosomaler Ribonukleinsäuren aufweist, wobei die behandelte Magermilch wieder mit einem Teil des vorher ggf. abzentrifugierten Milchfettanteiles vermischt und homogenisiert werden kann, um anschließend als eine von eine genetischen Signalwirkung boviner/tierischer miR/mRNA weitgehend befreite und für den Verbraucher unschädliche Milch zum direkten Verbrauch oder zur Weiteverarbeitung zu bekannten Milchprodukten zur Verfügung zu stehen. Hierzu sollte sie mindestens einen der vorgenannten Verfahrensschritte zur Reduzierung der biologischen Wirkung exosomaler Ribonukleinsäuren durchlaufen haben. Die Struktur der Exosomen wird nach den dargestellten Verfahren durch elektronen-mikroskopische Analyse der Magermilchfraktion untersucht im Vergleich zu unbehandelter Magermilch kontrolliert. Die Abnahme des Gehalts an CD63 bzw. CD81 nach Immunadsorption wird durch ein z. B. standardisiertes Western Blot-Verfahren oder einen CD63- bzw. CD81 -ELI SA überprüft.

Nachfolgend wird eine Variante eines möglichen Verfahrensablaufs anhand eines Ablaufschemas näher beschrieben. Es zeigt: Fig. 1 ein Ablaufschema des erfinderischen Milchveredelungsverfahrens

Das Ausgangsprodukt 1 , hier unbehandelte Rohmilch oder auch schon vorbehandelte, etwa pasteurisierte oder noch weiter verarbeitete Milch jeglicher Tierspezies, wird in einem ersten Verfahrensschritt 2 durch Zentrifugieren zu Magermilch 3 und Milchfett 4 separiert, wobei in der Magermilch 3 die biologisch aktiven Exosomen enthalten sind. Anschließend erfolgt in einem weiteren Verfahrensschritt 5 die I mmunadsorption, die zu Magermilch 6 mit einem reduzierten Exosomen-Gehalt führt. Nachfolgend wird die Magermilch 6 in dem Hauptverfahrensschritt 7 einer Ultraschallbehandlung 7 unterzogen, wodurch Magermilch 8 mit zerstörten Exosomenmembranen erzeugt wird. Abschließend erfolgt in einem letzten Verfahrensschritt eine RNAse-Zugabe, die, wie oben beschrieben, zu einer Magermilch 1 0 mit deaktivierter RNA führt

Jeder einzelne der genannten Verfahrensschritte 5;7;9 der Immunadsorption, der Ultraschallbehandlung und der RNAse-Zugabe führt bereits zu einer Magermilch 1 1 mit reduzierter biologischer Aktivität exosomaler RNA, wobei die Kombination aller Verfahrensschritte den größten Erfolg erzielt, woraufhin die so behandelte Milch 1 1 anschließend in die Weiterverarbeitung 12 zu den diversen Milchprodukten gelangt.