Verfahren und Vorrichtung für das Fixieren/ Stabilisieren einer Probe

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Fixierung und / oder Stabilisierung einer Probe. Es werden Biomoleküle stabilisiert und/ oder Gewebe fixiert, also haltbar gemacht. Zu stabilisierende Biomoleküle sind insbesondere DNA, RNA sowie Proteine.

Aus den Druckschriften WO 03/040697 sowie DE 40 1 9 1 82 Al ist bekannt, Gewebeproben zu fixieren, eine fixierte Probe zu entwässern und in Paraffin einzubetten . Die in Paraffin eingebettete Probe wird in dünne Scheiben geschnitten und unter dem Mikroskop untersucht. Gemäß der Druckschrift DE 40 1 9 1 82 Al wird die Durchtränkung von Proben mit Hilfe von Ultraschall unterstützt. Der Druckschrift DE 1 98 20 466 Al ist entnehmen, eine biologische Probe mit Hilfe von Ultraschall aufzuschließen.

Um eine biologische Probe stabilisieren zu können, ist es besonders wichtig, dass eine Stabilisierungslösung bzw. Stabilisierungsflüssigkeit die Probe, die die Biomoleküle enthält, schnell genug durchdringt. Insbesondere wenn es sich bei der biologischen Probe um ein Gewebe handelt, ist es von Vorteil, dass das Gewebe von einer Fixierlösung bzw. Fixierflüssigkeit schnell genug durchdrungen wird, um das Gewebe erfolgreich zu fixieren.

Nach dem Stand der Technik gibt ein Hersteller einer Stabilisierungslösung vor, welche Randbedingungen bei der Stabilisierung zu beachten sind . So gibt ein Hersteller einer Stabilisierungslösung beispielsweise an, welche Dimensionen eine Probe nicht überschreiten darf, damit bestimmte Biomoleküle zum Beispiel RNA an jeder Stelle der Probe gleichermaßen stabilisiert werden . Eine solche Angabe besteht beispielsweise darin, dass eine bestimmte Dicke vorgegeben wird, die eine Probe nicht überschreiten darf, um die gewünschte Stabilisierung zu erreichen . In einigen Fällen werden auch weitere geometrische Angaben hinzugefügt. Beispielsweise ein Laborant muss dann beispielsweise mithilfe eines Skalpells eine Probe in die gewünschte Größe bringen, bevor die Probe in eine Stabilisierungslösung gegeben wird . Zusatz-

lieh geben Hersteller in vielen Fällen ergänzend an, welches Verhältnis zwischen Stabilisierungslösung und Probe einzuhalten ist, um eine gewünschte Stabilisierung zu erreichen .

Soll Gewebe fixiert werden, so werden häufig keine zu beachtenden Randbedingungen für die Fixierung vom Hersteller angegeben und zwar insbesondere dann, wenn das Gewebe für histologische Untersuchungen fixiert werden soll. Für histologische Untersuchungen wird in der Regel Formalin als Fixierlösung eingesetzt. Das gewünschte Gewebe wird dann in Formalin ein- gelegt und so fixiert.

Auch wenn bei der Fixierung mit Fixierlösungen, welche Formaldehyd enthalten wie zum Beispiel Formalin in der Regel keine Vorgaben gemacht werden, so macht sich eine zu große Größe einer Probe im Fall der Stabilisierung von Gewebe doch nachteilhaft bemerkbar. Auch bei Formaldehyd enthaltenden Fixierlösungen ist es daher ratsam, bestimmte Größen bzw. Dimensionen nicht zu überschreiten, um ein Gewebe erfolgreich zu fixieren .

Die Druckschrift US 7, 1 47,826 B2 offenbart das Vorsehen eines verschließba- ren, durchströmbaren Korbes, der in ein weiteres Gefäß mit einer darin befindlichen Stabilisierungslösung hinein gestellt werden soll . Von allen Seiten kann Flüssigkeit in den durchströmbaren Korb eindringen. Befindet sich eine zu stabilisierende biologische Probe im Korb, so soll so sichergestellt werden, dass die Stabilisierungslösung von allen Seiten an die Probe gelangen kann.

Die Druckschrift US 2003/0087423 Al offenbart ebenfalls das Vorsehen eines durchströmbaren Korbs für eine biologische Probe. Allerdings wird hier der Korb an einem Deckel des Gefäßes befestigt, um so die Handhabung zu erleichtern . Wiederum soll eine im Korb befindliche Probe zuverlässig und voll- ständig von allen Seiten von einer Lösung erreicht werden können.

Der Druckschrift EP 1 262 758 Al ist ein weiterer durchströmbarer Behälter für die Präparation von Gewebe zu entnehmen .

Aus dem Stand der Technik sind unter dem Markennamen „Histosette" aus Kunststoff bestehende Kassetten mit aufklappbarem Deckel bekannt, die für die Aufnahme von θewebeproben für Prozessierung oder Entwässerung des Gewebes vorgesehen sind . Die Fläche des Bodens bzw. Deckels einer Histosette beträgt wenigstens 3 cm * 2,5 cm . Eine solche Kassette ist wenigstens 0,5 cm hoch bzw. dick. Boden und Deckel sind siebförmig ausgestaltet oder mit einer Vielzahl von Schlitzen versehen, damit Flüssigkeit in die Kassette beispielsweise während einer Entwässerung eines Gewebes gelangen kann .

Werden Histosetten eingesetzt, um Gewebe zu entwässern, um so beispielsweise im Anschluss daran histologische Untersuchungen durchführen zu können, so wird bereits fixiertes Gewebe, welches zuvor beispielsweise in Forma- lin eingelegt war, zunächst auf die gewünschte passende Größe für die His- tosette zurechtgeschnitten. Anschließend wird das Gewebe in die Histosette hineingelegt und die Histosette verschlossen . Nun wird die Histosette zusammen mit dem darin befindlichen Gewebe in einen Automaten gegeben, in dem eine Entwässerung automatisiert durchgeführt wird .

Die beispielsweise in dem genannten Automaten vorgesehenen Entwässerungsschritte können umfassen, dass das bereits fixierte Gewebe noch einmal mit einer Fixierlösung behandelt wird. Das Gewebe wird dadurch allerdings nicht im Sinne der vorliegenden Erfindung fixiert, da das Gewebe zuvor bereits fixiert worden ist. Danach wird die Histosette mit dem darin befindli- chen Gewebe nacheinander in verschiedene Alkoholbäder mit zunehmend höherer Alkoholkonzentration getaucht. Durch Alkohol wird dem Gewebe das darin befindliche Wasser entzogen . Damit die Entwässerung des Gewebes schonend verläuft, wird die Alkoholkonzentration nur langsam von Bad zu Bad gesteigert.

Anschließend wird die Histosette mit dem darin befindlichen Gewebe in ein Intermediärmedium wie zum Beispiel XyIoI getaucht. Das Intermediärmedium verdrängt den im Gewebe befindlichen Alkohol . Im Unterschied zum Alkohol

ist das Intermediärmedium mit Paraffin mischbar, was die nachfolgende Paraffinbehandlung vorbereitet.

Im Anschluss daran wird die Histosette mit dem darin befindlichen Gewebe nämlich in heißes und damit flüssiges Paraffin getaucht. Paraffin dringt dann in das Gewebe ein. Ist das Paraffin in gewünschter Weise in das Gewebe eingedrungen, so wird die Histosette aus dem Automaten herausgeholt. Das dann bereits leicht ausgehärtete Paraffin mit dem darin befindlichen Gewebestück wird anschließend in ein Förmchen, also einen nach oben hin offe- nen, kleinen Behälter überführt und mit heißem, flüssigem Paraffin überschichtet, um so nach dem Erkalten des Paraffins einen Paraffinblock zu erhalten, in dem sich das Gewebe befindet. Erkaltet dieses Paraffin, so liegt eine in Paraffin eingebettete, entwässerte Probe vor. Zur Durchführung von histologischen Untersuchungen werden mikrometerdünne Gewebsschnitte hergestellt. Diese Gewebeschnitte können auf Objektträger aufgezogen, entparaffiniert, gefärbt und mit Hilfe eines Mikroskops beurteilt werden . Ein Nachteil der Fixierung mit formaldehydhaltigen Fixierlösungen besteht darin, dass Biomoleküle zum Teil irreversibel kreuzvernetzt und damit zerstört werden . Die Isolierung von Biomolekülen für analytische Untersuchungen wird dadurch erschwert oder unmöglich gemacht.

Eine durchströmbare Kassette mit aufklappbarem Deckel für die Aufnahme von Gewebeproben ist aus der Druckschrift US 2007/01 40920 Al bekannt. Eine Probe wird in die Kassette gebracht und die Kassette verschlossen . Die Probe wird in der Kassette entwässert, gesäubert und mit Wachs infiltriert. Die Probe vor der Entwässerung zu fixieren bzw. zu stabilisieren, während sich diese in der Kassette befindet, ist der US 2007/01 40920 Al nicht zu entnehmen .

Durchströmbare Kassetten für die Aufnahme von biologischen Proben, sind ferner den Druckschriften US 2005/01 47538 Al sowie WO 2005/0371 82 A2 zu entnehmen . Aus beiden Druckschriften geht hervor, dass eine Probe erst zu

fixieren ist. Erst im Anschluss an die Fixierung wird Probenmaterial in eine Kassette gebracht und weiter in gewünschter Weise behandelt.

Aus der Druckschrift US 2006/01 78598 Al geht ein Werkzeug mit vorstehen- den, nadeiförmigen Teilen hervor, die mit Haken versehen sind . Die vorstehenden, nadeiförmigen Teile sollen in eine Probe hineingestochen werden, um anschließend von den vorstehenden, nadeiförmigen erfasstes Probenmaterial aus der übrigen Probe herauszureißen. Dieses Werkzeug umfasst keinen Behälter im Sinne der Erfindung, da die nadeiförmigen Teile keine Behälterwände sind . Insbesondere gibt es keine siebförmigen, gitterförmigen oder mit Schlitzen versehene Wände.

Aufgabe der Erfindung ist es, Biomoleküle sowie Gewebe verbessert zu stabi- lisieren bzw. zu fixieren und in einer Ausgestaltung vereinfacht untersuchen zu können .

Die Aufgabe der Erfindung wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Ein Gegenstand zur Durchführung des Verfahrens umfasst die Merkmale des Nebenanspruchs. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Gemäß der Erfindung weist ein durchströmbarer Behälter, der die Dimension und zwar insbesondere die Dicke eines zu fixierenden Gewebes geeignet beschränkt, an einer Seite und zwar vorzugsweise an einer schmalen Seite eine scharfkantige öffnung auf . Die scharfkantige öffnung ist dafür vorgesehen, in eine zu fixierende und/ oder zu stabilisierende Probe gestoßen zu werden. Durch eine Drehbewegung kann der dann im durchströmbaren Be- hälter befindliche Teil der Probe abgetrennt und herausgezogen werden . Der durchströmbare Behälter ist dann seitlich bevorzugt mit Löchern und dergleichen beispielsweise siebartig ausgestaltet. Es befindet sich dann das Gewebe in einer für die Fixierung und / oder Stabilisierung besonders geeigneten Dimensionierung in dem durchströmbaren Behälter.

Eine scharfkantige öffnung im Sinne der Erfindung wird insbesondere durch eine Verjüngung der Wandstärke in Richtung öffnung verwirklicht, so dass schließlich die entsprechende Wand mit einer Kante endet, die den Rand der öffnung bildet bzw. Teil des Randes ist.

Der durchströmbare Behälter kann im Inneren mit Haken versehen sein, die so gerichtet sind, dass die Haken einem Herausrutschen der Probe aus dem Behälter entgegenwirken. Dies unterstützt zwar die Abtrennung des im Behälter befindlichen Teils der Probe von dem übrigen Teil . Allerdings kann dies eine spätere Entnahme der Probe erschweren . Zu bevorzugen ist daher eine Ausführungsform des durchströmbaren Behälters, der im Unterschied zu dem aus der Druckschrift US 2006/01 78598 Al bekannten Stand der Technik nicht mit den hieraus bekannten Haken versehen ist.

Eine Probe wird in einer Ausführungsform in einen durchströmbaren Behälter mit einer maximalen Bauhöhe von 1 0 mm, vorzugsweise von 5 mm gegeben . Der mit der Probe befüllte Behälter wird in Mittel für das Fixieren und/ oder Stabilisieren eingetaucht. Als Folge wird die Probe fixiert und/ oder stabilisiert.

Eines der dringensten Probleme bei der Fixierung von Gewebeproben besteht im Mangel an Standardisierung. Es gibt keine allgemein akzeptierten und umgesetzten Vorschriften darüber, welches Volumen an Fixiermittel, z. B. Formalin, pro Volumen Gewebe eingesetzt werden muss, obwohl bekannt ist, dass zu wenig Fixiermittel eine Schädigung der Gewebestrukturen im Inneren der Probe durch Autolyse zur Folge haben kann . Außerdem kann sich in nicht fixierten Bereichen das Expressionsmuster der Zellen verschieben durch Geninduktion oder Abbau von mRNA.

Ein Behälter im Sinne des Hauptanspruchs weist eine maximale Bauhöhe von 1 0 mm bzw. 5 mm auf, wenn zwei Innenwände oder aber entsprechend Boden und Deckel des Behälters nicht mehr als 1 0 mm bzw. 5 mm auseinander liegen . Befindet sich die Probe in diesem Behälter, so wird dadurch sichergestellt, dass flüssige Fixiermittel und/ oder Stabilisierungsmittel die im

Behälter befindliche Probe schnell zu durchdringen vermögen und zwar in besonders guter Weise, wenn die Bauhöhe nicht mehr als 5 mm beträgt. Da der Behälter durchströmt werden kann, kann flüssiges Fixiermittel und/ oder Stabilisierungsmittel, die in Form von ein oder mehreren Lösungen vorliegen können, in das Innere des Behälters gelangen und in die Probe eindringen . Erst durch das Eintauchen bzw. als Folge davon wird die im durchströmbaren Behälter befindliche Probe fixiert bzw. stabilisiert. Dies umfasst, dass die Probe zuvor noch nicht fixiert sowie stabilisiert war.

Vorzugsweise sind die beiden Wände bzw. Boden und Deckel des durchströmbaren Behälters siebförmig ausgestaltet oder mit Schlitzen und dergleichen versehen, die nicht mehr als 1 0 mm, vorzugsweise nicht mehr 5 mm auseinanderliegen . Bei dieser Ausgestaltung wird weiter verbessert sichergestellt, dass die im durchströmbaren Behälter befindliche Probe ordnungsge- maß fixiert und/ oder stabilisiert wird.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Fixierung und/ oder Stabilisierung der in dem durchströmbaren Behälter befindlichen Probe in einem Gefäß mit genau definierten Ausmaßen, gefüllt mit einem genau definierten Volumen an Fixier- und/oder Stabilisierungslösung . Die Größe des durchströmbaren Behälters definiert dabei die maximale Größe der Gewebeprobe und das Gefäß das Volumen an Fixier- und/oder Stabilsierungsrea- genz. Dies hat den erheblichen Vorteil, dass durch die gewählte Anordnung ein genau definiertes Verhältnis von Fixier- und/oder Stabilsierungsreagenz zu Gewebeprobe erzielt wird . Ein in seiner Größe genau definierter durchströmbarer Behälter in Kombination mit einem in seiner Größe genau definierten Gefäß führt zu einer Standardisierung der Gewebefixierung. Ein optimal gewähltes Verhältnis aus Fixier- und/oder Stabilsierungsreagenz zu Gewebeprobe vermeidet Unterfixierung und sorgt für eine Standardisierung der Fixierung und damit auch eine bessere Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Proben . Zur Ausführung dieser Ausgestaltung der Erfindung wird also ein Set bereitgestellt bzw. vorgegeben, welches wenigstens ein Gefäß mit vorgegeben Ausmaßen nebst dem durchströmbaren Behälter umfasst. Vorzugsweise um-

fαsst das Set zusätzlich eine vorgegebene Fixierlösung, um so eine Probe in standardisierter Weise fixieren bzw. stabilisieren zu können .

Das Gefäß mit dem durchströmbaren Behälter kann neben der Fixierung auch als Lagerungsgefäß oder zum Transport der Probe dienen.

In einer weiteren Ausgestaltung ist der durchströmbare Behälter ein Bestandteil des Gefäßes. Zum Beispiel kann der durchströmbare Behälter durch einen Steg mit dem Deckel des Aufnahmegefäßes, in dem sich die Fixier- und/oder Stabilisierungslösung befindet, verbunden sein . Der durchströmbare Behälter bildet auf diese Weise einen integralen Bestandteil des Gefäßes. Indem der durchströmbare Behälter mit dem Deckel verbunden ist, kann der Behälter für Be- und Entladen aus dem Gefäß leicht entnommen werden . Es ist nicht notwendig, mit Hilfsmitteln wie einer Pinzette oder ähnlichem nach dem durchstömbaren Behälter zu greifen. Die Kontaminationsgefahr bzw. der Kontakt mit potenziell giftigen Fixierreagenzien wird auf diese Weise minimiert. Sofern die Gewebeprobe durch mehrere Lösungen passagiert werden muss, kann dies vereinfacht durchgeführt werden . Alle benötigten Lösungen werden in Gefäße mit gleicher Bauart bzw. gleichen Dimensionen befüllt. Ein Deckel, der auf diese Gefäße passt, enthält über einen Steg den durchströmbaren Behälter. Nach der Beladung mit der Gewebeprobe wird der Deckel nacheinander auf die verschiedenen Gefäße aufgesetzt, ohne das für den Transfer die Probe aus dem durchströmbaren Behälter entnommen werden muss.

In einer weiteren Ausführung ist der durchströmbare Behälter nicht ein integraler Bestandteil z. B. des Deckels des Gefäßes, kann aber durch eine Halte- rung am Deckel befestigt werden . Diese Halterung kann direkt unterhalb des Deckels oder an einem Steg, welcher mit dem Deckel verbunden ist, befes- tigt sein. Vorteil dieser Anordnung ist es, dass der durchströmbare Behälter trocken beladen werden kann, da er vor seiner Beladung mit der Gewebeprobe nicht mit potenziell toxischen Fixierreagenzien im Gefäß in Berührung gekommen ist.

In einer weiteren Ausgestaltung kann der durchstömbare Behälter, der über einen Steg mit dem Deckel eines Gefäßes verbunden ist, vom Deckel durch eine einfache mechanische Manipulation abgetrennt werden . Z. B. kann der Steg in der Nähe des durchströmbaren Behälters eine Sollbruchstelle enthal- ten. In einer weiteren Ausgestaltung läßt sich der durchströmbare Behälter durch eine Abwurfvorrichtung, welche sich am Deckel des Aufnahmegefäßes befindet abtrennen. Z. B. kann der durchströmbare Behälter in einer Ausführungsform durch mechanischen Druck abgeworfen werden, wobei der Druck durch einen Stempel, der sich im Inneren des Steges befindet, ausgeübt wird . Der Stempel sitzt auf einer Seite auf dem durchströmbaren Behälter auf und ragt auf der anderen Seite aus dem Deckel des Gefäßes heraus. Durch Druck von außen auf den Stempel wird der durchströmbare Behälter abgeworfen . Vorteil einer solchen Vorrichtung wäre, dass der durchströmbare Behälter für den Transfer in z.B. einen Entwässerungsautomaten oder eine an- dere Lösung nicht angefasst oder manipuliert werden muss.

In einer Ausgestaltung der Erfindung sind die Dimensionen des durchströmbaren Behälters so gewählt, dass der durchströmbare Behälter in einen Entwässerungsautomaten eingesetzt werden kann, um die im durchströmbaren Behälter befindliche Probe im Anschluss an die Fixierung bzw. Stabilisierung zu entwässern . Die Probe muss dann nicht von einem durchströmbaren Behälter in einen weiteren Behälter umgefüllt werden, wenn die Probe im Anschluss an eine Fixierung bzw. Stabilisierung entwässert werden soll . Ein Arbeitsschritt wird so vermieden . Es kann aber auch eine Fixierung und/ oder Stabilisierung im Entwässerungsautomaten durchgeführt werden. Die noch nicht fixierte bzw. stabilisierte Probe wird durch den Entwässerungsautomaten zuerst in eine Fixierlösung und/ oder Stabilisierungslösung oder vergleichbare Mittel getaucht. Dies ist vor allem dann wirtschaftlich sinnvoll, wenn die Probe hinreichend dünn ist und daher eine Fixierung bzw. Stabili- sierung relativ schnell erreicht werden kann .

Als Fixiermittel kann Formalin verwendet werden, falls lediglich histologische Untersuchungen durchgeführt werden sollen . Sollen hingegen Biomoleküle

für nachfolgende Untersuchungen stabilisiert, also haltbar gemacht werden, so ist eine geeignete Stabilisierungslösung bzw. Stabilisierungsmittel auszuwählen, da dies mit Formalin nicht möglich ist. Für die Stabilisierung der RNA einer Probe kann RNAIater® der US-Fa . Ambion als Stabilisierungslösung ein- gesetzt werden . Ein anderes Beispiel für die gleichzeitige Stabilisierung von DNA, RNA und Proteinen ist die Stabilisierungslösung Allprotect™ Tissue Reagenz der deutschen Fa . Qiagen GmbH . Ein Beispiel für die Stabilisierung der Morphologie für histologische Untersuchungen als auch der Biomoleküle DNA, RNA und Proteine in Gewebeproben sind die kommerziell erhältlichen PAXgene® Tissue Stabilisier- und Fixierreagenzien . Alle genannten Beispiele sind also Stabilisier- und Fixiermittel im Sinne der vorliegenden Lehre.

Bevorzugt wird als Mittel für das Fixieren und Stabilisieren einer Probe eine Polyol-haltige Zusammensetzung eingesetzt. Denn mit einer solchen Zusam- mensetzung gelingt das Fixieren sowie Stabilisieren besonders gut und einfach, wie der Druckschrift EP 1 804 045 Al zu entnehmen ist. Die Offenbarungsgehalte dieser Druckschriften, der weitere vorteilhafte Ausgestaltungen eines solchen Mittels zu entnehmen sind, beziehen wir hiermit als vorteilhafte Ausgestaltung des beanspruchten Verfahrens mit ein .

Um eine biologische Probe zugleich zu stabilisieren und zu fixieren, wird die Probe insbesondere in beanspruchter Weise mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, umfassend 1 bis zu 1 00 Gew.-% mindestens eines Polyols sowie 0 bis 99 Gew.-% mindestens eines Additivs, wobei die Gesamtmenge der beiden genannten Komponenten 1 00 Gew.-% beträgt.

Bei dem Polyol handelt es sich insbesondere um einen Diol, Triol, Tetraol, Pentaol, Hexaol, Heptaol, Octaol oder Nonaol, wobei Diol oder Triol besonders zu bevorzugen sind. Vorzugsweise weist der Polyol 2 bis 20 Kohlenstoff- atome auf .

Der Polyol ist in einer vorteilhaften Ausgestaltung ausgewählt aus der Gruppe umfassend 1 ,2-Ethandiol, 1 ,2-Propandiol, 1 ,3-Propandiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3- Butandiol, 1 ,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 1 ,2-Pentandiol, 1 ,3-Pentandiol, 1 ,4-

Pentαndiol, 1 ,5-Pentαndiol, 2,3-Pentαndiol, 2,4-Pentαndiol, 1 ,2-Hexαudiol, 1 ,3-Hexαndiol, 1 ,4-Hexαndiol, 1 ,5-Hexαndiol, 1 ,6-Hexαndiol, 2,3-Hexαndiol, 2,4-Hexαndiol, 2,5-Hexαndiol, 3,4-Hexαndiol, 1 ,2,3-Propαntriol, 1 ,2,3- Butαntriol, 1 ,2,4-Butαntriol, 1 ,2,3-Pentαntriol, 1 ,2,4-Pentαntriol, 1 ,2,5- Pentαntriol, 2,3,4-Pentαntriol, 1 ,2,3-Hexαntriol, 1 ,2,4-Hexαntriol, 1 ,2,5- Hexαnttiol, 1 ,2,6-Hexαntriol, 2,3,4-Hexαntriol, 2,3,5-Hexαntriol, 3-Methyl- 1 ,3,5-Pentαntriol, Trimethylolpropαnol, Pentαerythritol, Diethylenglykol, Dipro- pylenglykol, Triethylenglykol, Tripropylenglykol, Polyethylenglykol und Polypro- pylenglykol.

Die Zusammensetzung umfasst besonders bevorzugt eine Mischung aus mindestens zwei Polyolen .

Das Additiv ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Deter- gentien, Inhibitoren, welche den Abbau von Nukleinsäuren oder Proteinen hemmen, Viskositätsregulierer, Farbstoffe, Pufferverbindungen, Konservierungsstoffe, Komplexbildner, Reduktionsmittel, Substanzen, welche die Permeabilität von Zellen verbessern, chaotrope Substanzen, Fixative, weitere, von Polyolen verschiedene Lösungsmittel sowie Mischungen aus mindestens zwei dieser Additive.

In einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst das Verfahren eine histologische Analyse der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe und/oder Analyse von Biomolekülen in der oder aus der mit der Zu- sammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe.

Nach dem Stand der Technik wird eine Probe ganz oder teilweise beispielweise mit Hilfe von Formalin fixiert, wenn die Probe histologisch untersucht werden soll. Ein nicht fixierter Teil dieser Probe wird mit einem Stabilisie- rungsmittel behandelt, wenn ergänzend Biomoleküle stabilisiert werden sollen . Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht demgegenüber eine Vereinfachung von nachfolgenden Arbeitsabläufen vor allem dann, wenn die im Behälter befindliche Probe mit einem Fixier- und Stabilisierungsmittel, wie beispielsweise den in PCT/EP/2008052371 beschriebenen, behandelt wird,

das zugleich das Gewebe einer Probe fixiert sowie Biomoleküle dieser Probe stabilisiert. Daher wird in einer bevorzugten Ausgestaltung die Lösung bzw. Flüssigkeit so ausgewählt, dass Biomoleküle und Gewebe zugleich haltbar gemacht werden .

Gemäß der Druckschrift PCT/EP/2008052371 werden die Morphologie und Biomoleküle in einem biologischen Material fixiert und stabilisiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

i) Bereitstellen eines biologischen Materials, und ii) Konta ktieren des biologischen Materials mit einer ersten nicht- wässrigen Zusammensetzung, umfassend : (a l ) 1 0 bis 90 Vol . -% Metha nol und (a2) wenigstens einen zusätzlichen Zusatzstoff und (a3) gegebenenfalls eine Säure, iii) überführen des biologischen Materials in eine zweite Zusammensetzung (B), umfassend bis zu 99 Vol . -% Ethanol .

Als erste Zusammensetzung bei Schritt ii) ist eine nichtwässrige Zusa mmen- Setzung (A) zum Konservieren von biologischem Material besonders nützlich, wobei die nichtwässrige Zusammensetzung (A) folgendes umfasst:

(a l ) 1 0 bis weniger a ls 80 Vol . -% Methanol und (a2) wenigstens einen zusätzlichen Zusatzstoff und (a3) eine Säure.

Die Komponente (a l ) der Zusammensetzung (A) ist Methanol . In der Zusa mmensetzung (A) ist Methanol in einem U mfang von 1 0 bis weniger als 80 % enthalten, vorzugsweise ist Methanol zu etwa 70 Vol . -%, zu etwa 60 Vol. -% oder zu etwa 50 Vol . -% enthalten .

Der wenigstens eine Zusatzstoff (a2) der Zusammensetzungen (A) bzw. (a2) der ersten Zusammensetzung von Schritt (N) des vorstehend beschriebenen Verfahrens kann ein zusätzliches Lösungsmittel sein, das von Methanol ver-

schieden ist, oder ein Zusatzstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Detergenzien und Inhibitoren, welche den Abbau von Nukleinsäuren oder Proteinen hemmen, DEPC, Alkylierungsmittel, Acetylierungsmittel, HaIo- genierungsmittel, Nucleotide, nucleotidanaloge Verbindungen, Aminosäu- ren, aminosäureanaloge Verbindungen, Viskositätsregulatoren, Farbstoffe, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, Komplexierungsmittel, Reduktionsmittel, Oxidierungsmittel, Stoffe, welche die Permeabilität von Zellen verbessern, chaotrope Stoffe, wie z. B. Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidini- umhydrochlorid oder chaotrope Salze mit Anionen, sowie Gemische von we- nigstens zwei bis sechs dieser Zusatzstoffe.

Bevorzugte zusätzliche Zusatzstoffe sind C2- bis C 1 2-Polyole, Polyethylengly- col (PEG) und Diethylenglycolmonoethyletheracetat (DEGMEA) und Chloroform. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die zusätzli- che Komponente der Zusammensetzung A nicht Chloroform ist. Das PEG weist vorzugsweise einen Schmelzpunkt unterhalb der Umgebungstemperatur auf .

Das von Methanol verschiedene Lösungsmittel kann ein organisches Lö- sungsmittel sein, das vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend monohydrische Alkohole (Monoole), C2-C 1 2-Polyole, Ketone, Dimethylsulfo- xid, aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ether, Carbonsäuren, Carbonsäureamide, Nitrile, Nitroalkane und Ester, wobei geeignete Lösungsmittel beispielsweise aus der Gruppe von Ethanol, 1 - Propanol, 2-Propanol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, Acetonitril, Aceton, Ani- sol, Benzonitril, 1 -Methoxy-2-propanol, Chinolin, Cyclohexanon, Diacetin, Dichlormethan, Chloroform, XyIoI, Diethylether, Dimethylether, Toluol, Dime- thylketon, Diethylketon, Dimethyladipat, Dimethylcarbonat, Dimethylsulfit, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Methylacetat, Ethylacetat, Benzoesäure, Methyl- benzoat, Ethylbenzoat, Ethylbenzol, Formamid, Glycerintriacetat, Ethylace- toacetat, Methylacetoacetat, N,N-Diethylacetamid, N-Methyl-N- ethylacetamid, N,N-Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid, N-Methyl-N- ethylformamid, N,N-Diethylformamid, N,N-Dimethylthioformamid, N, N- Diethylthioformamid, N-Methyl-N-ethylthioformamid, N,N-Dimethylacetamid,

N-Methyl-N-ethylαcetαmid, N,N-Diethylαcetαmid, Nitroethαn, Nitromethylto- luol und Triethylphosphαt ausgewählt sein kann . Vorzugsweise umfassen die Zusammensetzung A bzw. die nichtwässrige Zusammensetzung bei Schritt ii) kein halogeniertes Kohlenhydrat, insbesondere kein chloriertes Kohlenhydrat, insbesondere Chloroform und/oder Trichlorethan .

Die Konzentration der Komponenten (a2) und (a2) können gemäß der Druckschrift PCT/EP/2008052371 etwa 50 % bis 1 % (Vol. /Vol.) betragen, vorzugsweise etwa 20 %.

Die Komponente (a3) der Zusammensetzung (A) bzw. die optionale Komponente (a3) der ersten Zusammensetzung, die bei Schritt (ii) des in Druckschrift PCT/EP/2008052371 beschriebenen Verfahrens verwendet wird, ist eine organische oder anorganische Säure, vorzugsweise eine schwache Säu- re, am meisten bevorzugt Essigsäure oder Propionsäure.

Die Zusammensetzung (A) kann als die erste Zusammensetzung bei Schritt N) des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden . Es wird jedoch ausdrücklich betont, dass die Zusammensetzung (A) auch bei einem Verfahren zum Behandeln oder Konservieren von biologischem Material ohne den „überführungsschritt" iii) verwendet werden kann . Ferner kann die erste Zusammensetzung bei Schritt ii) des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung eine von der Zusammensetzung (A) verschiedene Zusammensetzung sein, sofern die erste Zusammensetzung bei Schritt ii) wie vor- stehend definiert Methanol als den Hauptinhaltsstoff umfasst.

Gemäß der Druckschrift PCT/EP/2008052371 umfasst das Verfahren zum Behandeln des biologischen Materials einen „überführungsschritt" iii), bei welchem das biologische Material in eine zweite Zusammensetzung (B) über- führt wird, welche bis zu 99 Vol .-% Ethanol umfasst. Der überführungsschritt ist insbesondere zum Lagern des biologischen Materials geeignet.

Die besonderen Vorteile des beanspruchten Verfahrens werden bei Anwendung des in Druckschrift PCT/EP/2008052371 beschriebenen Verfahrens be-

sonders deutlich . In einer Ausgestaltung wird die im durchströmbaren Behälter befindliche Probe in einem Gefäß mit der Zusammensetzung A fixiert und anschließend in ein Gefäß mit der Zusammensetzung B überführt. Für diesen Transfer von Zusammensetzung A nach Zusammensetzung B muss die Probe nicht von einem durchströmbaren Behälter in einen weiteren Behälter umgefüllt werden.

In einer weiteren Ausgestaltung ist der durchströmbare Behälter durch einen Steg mit dem Deckel des Aufnahmegefäßes, in dem sich die Zusammenset- zung A befindet, verbunden. Sofern beide Gefäße mit der Zusammensetzung A und B über die gleichen Dimensionen verfügen, kann die im durchströmbaren Behälter befindliche Probe mit Hilfe des Deckels transferiert werden, wobei der Deckel das Gefäß mit Zusammensetzung B dicht verschließt. Dabei ist es nicht notwendig, dass der durchströmbare Behälter berührt oder geöffnet wird . In dieser Ausgestaltung kann das Gefäß mit der Zusammensetzung B zugleich als Lagerungsgefäß wie auch zum Transport der Probe in z. B. ein pathologisches Labor verwendet werden .

Vorteile und weitere Einzelheiten zu den verschiedenen Ausgestaltungen er- geben sich aus der internationalen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen PCT/EP/2008052371 .

In einer weiteren Ausgestaltung umfasst das Verfahren eine histologische Analyse der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe und/oder Analyse von Biomolekülen in der oder aus der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe. Vorzugsweise ist die Analyse der Gewebehisotologie als auch die Analyse von Biomolekülen umfasst.

Vorzugsweise ist die Analyse von Proteinen als auch die Analyse von Nukleinsäuren umfasst.

In einer Ausgestaltung beinhaltet die Probe Organismen, isolierte Zellen, Organellen, Bakterien, Pilze oder Teile von Pilzen, Viren, Viroide, Prionen, Ge-

webe, Gewebefrαgmente, Gewebeschnitte, Körperflüssigkeiten, natürliche, gegebenenfalls isolierte Proteine, synthetische oder modifizierte Proteine, natürliche, gegebenenfalls isolierte Nukleinsäuren, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren, andere Biomoleküle wie z: B. Lipide, Kohlenhydrate, Stoffwechselprodukte und Metaboliten, Pflanzen oder Teile von Pflanzen, Fäkalien, Abstriche, Punktate, Lebensmittelproben, Umweltproben und/ oder forensische Proben .

Vorteile und weitere Einzelheiten zu weiteren verschiedenen Ausgestaltungen ergeben sich aus der EP 1 804 045 Al bzw. der internationalen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen PCT/EP/2008052371 .

Ein Mittel, das bei einer Probe sowohl die Morphologie des Gewebes fixiert als auch Biomoleküle stabilisiert, wird insbesondere dann gewählt, wenn zu- nächst die Histologie des Gewebes untersucht wird und im Anschluss daran in Abhängigkeit von histologischen Untersuchungsergebnissen darüber hinaus optional Biomoleküle isoliert und analysiert werden sollen .

In einer Ausgestaltung wird der durchströmbare Behälter ganz oder teilweise im Anschluss an einen Wasserentzug mit einem Paraffinblock verbunden, in den die zunächst fixierte und/ oder stabilisierte und im Anschluss daran entwässerte Probe in einer aus dem Stand der Technik bekannten Weise gebracht worden ist. Das Verbinden kann erreicht werden, indem der durchströmbare Behälter ganz oder teilweise auf ein Förmchen mit einer durch- strömbaren Wand aufgesetzt wird, in dem die bereits mit Paraffin versehene Probe in Paraffin eingetaucht ist. Von oben durch die durchströmbare Wand hindurch wird noch weiter Paraffin hinzuzugeben. Durch die durchströmbare Wand hindurch gelangt Paraffin zusätzlich von dem Behälter oder Behälterteil in das Förmchen hinein und umschließt die durchströmbare Wand. Nach dem Erkalten des Paraffins ist der Behälter bzw. ein Teil des Behälters mit diesem Paraffinblock verbunden .

Der Behälter bzw. der mit dem Paraffinblock verbundene Teil davon bildet nun einen Griff oder eine Halterung, mit der der Paraffinblock mit der darin

befindlichen Probe aus dem Förmchen herausgenommen werden kann. Diese Halterung kann nun dazu benutzt werden, um den Paraffinblock mit der darin befindlichen Probe in einen Automaten oder Halbautomaten einzuspannen, mit dem gewünschte Gewebeschnitte aus der Probe herausge- schnitten werden können . Ein solcher Automat bzw. Halbautomat ist unter der Bezeichnung Mikrotom bekannt.

Vorzugsweise sind daher in einer Ausgestaltung Mikrotom und durchströmbarer Behälter so aufeinander abgestimmt, dass der Behälter ganz oder teil- weise in das Mikrotom in genannter Weise eingespannt werden kann.

Sind histologische Untersuchungen durchgeführt worden und sollen nun Biomoleküle prozessiert werden, so ist regelmäßig zunächst das Paraffin von dem Teil der paraffinierten Probe zu entfernen, welches weiter prozessiert werden soll. Es werden also beispielsweise zur Untersuchung von Biomolekülen weitere Schnitte mit dem Mikrotom angefertigt. Diese Schnitte werden in einem Mikrozentrifugengefäß gesammelt und zunächst das Paraffin entfernt und zwar im Wesentlichen umgekehrt wie bei der Entwässerung . Es wird zunächst eine Intermediärlösung zugegeben, um das Paraffin aufzulösen. An- schließend wird die Gewebeprobe zentrifugiert und der überstand mit dem in der Intermediärlösung aufgelösten Paraffin entfernt. Anschließend wird das pelletierte Gewebe mit reinem Alkohol resuspendiert, um die Intermediärlösung zu verdrängen . Nach einer erneuten Zentrifugation und Entfernung des überstandes kann das Gewebepellet in einem geeigneten Lysepuffer aufgenommen und nach dem Stand der Technik prozessiert werden . Die gereinigten Biomoleküle können dann für die gewünschten Untersuchungen eingesetzt werden .

In einer vorteilhaften Ausgestaltung wird im Rahmen einer histologischen Un- tersuchung ein Mikroskop eingesetzt, welches mit einem Laser ausgestattet ist. Wird Gewebe mit Hilfe des Mikroskops histologisch untersucht und ein interessierender Bereich gefunden, so kann dieser Bereich mit dem Laser sehr genau herausgeschnitten werden . Mithilfe der vorliegenden Erfindung gelingt es nun besonders einfach, diesen herausgeschnittenen Bereich so-

fort in Bezug auf Biomoleküle weiter zu untersuchen. Ist der ausgeschnittene Bereich sehr klein, so kann dieser teil des Gewebes direkt in einen Lysepuffer überführt werden, um Biomoleküle wie DANN, RNA und/ oder Protein für weitergehende Untersuchungen zu isolieren .

Der durchströmbare Behälter ist insbesondere an einem Deckel befestigt, mit dem ein Gefäß mit einem darin befindlichen Mittel für das Fixieren und/ o- der Stabilisieren verschlossen wird . Der Deckel erfüllt dann eine Doppelfunktion . Er dient zum einen dem Verschließen des Gefäßes mit dem darin be- findlichen Mittel für das Fixieren und/ oder Stabilisieren während der Fixierung bzw. Stabilisierung, die sich in der Regel wenigstens über mehrere Stunden erstreckt. Zum anderen dient der Deckel als Griff, um den durchströmbaren Behälter einfach in eine Probe hineinstoßen zu können . Auf diese Weise ist die Handhabung besonders einfach .

In einer Ausgestaltung der Erfindung ist der durchströmbare Behälter, der eine scharfkantige öffnung umfasst, mit einem Stempel versehen, der beispielsweise von oben durch einen als Griff dienenden Deckel hindurch in den durchströmbaren Behälter hineingeführt werden kann . Auf diese Weise gelingt es besonders einfach, in dem durchströmbaren Behälter befindliches Gewebe wieder herauszudrücken .

Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn Biomoleküle sofort untersucht werden sollen, also im Anschluss an die Stabilisierung . Dann kann die stabilisierte Probe aus dem durchströmbaren Behälter durch den Stempel herausgedrückt werden und zwar vorzugsweise in die entsprechende Lösung hinein, mit der die Untersuchung der Biomoleküle begonnen wird . Im Allgemeinen handelt es sich zunächst um eine Pufferlösung, in die die Probe gegeben wird, von der Biomoleküle untersucht werden sollen .

Das Vorsehen eines Stempels ist auch deshalb von Vorteil, weil so definiert nur ein Teil der fixierten bzw. stabilisierten Probe aus dem durchströmbaren Behälter herausgedrückt werden kann . Dieser aus dem durchströmbaren Be-

hälter dann herausstehender Teil der Probe kann dann abgeschnitten werden, um es beispielsweise der Untersuchung von Biomolekülen zuzuführen. Der Rest kann dann beispielsweise für histologische Untersuchungen verwendet werden .

Sollen Biomoleküle untersucht werden, so ist es grundsätzlich erforderlich, die Probe aufzuschließen und so zu homogenisieren. Dies geschieht nach dem Stand der Technik beispielsweise durch Ultraschall. Allerdings besteht beim Stand der Technik die Gefahr, dass dabei die interessierenden Molekü- Ie beschädigt werden . In einer Ausgestaltung der Erfindung wird daher der durchströmbare Behälter mit der darin befindlichen stabilisierten Probe in ein weiteres Gefäß mit einer darin befindlichen Flüssigkeit gestellt. Eine Ultraschallquelle wird so platziert, dass Ultraschall zu dem durchströmbaren Behälter gelangt und zwar insbesondere fokussiert auf den durchströmbaren Behälter. Zerkleinert nun der Ultraschall die im durchströmbaren Behälter befindliche Probe, so können die zerkleinerten Gewebestücke durch geeignet durchlässige Wände des durchströmbaren Behälters hindurch in die Flüssigkeit entweichen, die beispielsweise das Mittel zur Stabilisierung sein kann. Auf diese Weise können zerkleinerte Stücke so entweichen, dass diese nicht mehr dem Ultraschall in einer nun nachteilhaften Weise ausgesetzt werden . Auf diese Weise wird das Risiko vermindert, dass die interessierenden Moleküle im Rahmen des Aufschlusses der Probe durch überexposition in unerwünschter Weise beschädigt werden .

Bei der vorgenannten Ausgestaltung ist dann die Ultraschallquelle insbesondere so eingestellt und beschränkt, dass diese im Wesentlichen nur den durchströmbaren Behälter mit darin befindlicher Probe erfasst und in diesem Sinne auf den durchströmbaren Behälter fokussiert ist.

Grundsätzlich ist es möglich, anstelle von Ultraschall ein anderes Mittel zu wählen, welches die in dem durchströmbaren Behälter befindliche Probe aufschließt mit der Folge, dass hinreichend zerkleinerte Teile der Probe nach außen entweichen und von der weiteren mechanischen Behandlung damit vorteilhaft ausgeschlossen werden .

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren näher erläutert.

Figur 1 zeigt eine typische Grundform des durchströmbaren Behälters, der für das Fixieren einer Probe eingesetzt wird . Der Behälter umfasst eine relativ großflächige Vorderseite 1 und Rückseite, die beispielsweise gitterförmig sind und daher von einer Flüssigkeit durchströmt werden können . Die Vorderseite kann ein klappbarer Deckel sein und die Rückseite der Boden des durchströmbaren Behälters. Der Abstand zwischen Vorderseite und Rückseite ist relativ klein und beträgt nur wenige Millimeter und zwar insbesondere nicht mehr als 5 Millimeter. Dadurch wird sichergestellt, dass eine im durchströmbaren Behälter befindliche Probe von einer Fixierlösung hinreichend schnell durchtränkt werden kann . Die Wände 2 und 3 des durchströmbaren Behälters können ebenfalls durchströmbar sein. Aus Gründen der Stabilität ist sind aber feste, geschlossene Wände 2 und 3 zu bevorzugen.

Figur 2 zeigt eine seitliche Aufsicht auf den durchströmbaren Behälter mit Vorderwand 1 , der an einem Deckel 4 durch einen Steg 5 befestigt ist und zwar vorzugsweise lösbar, also zum Beispiel durch Formschluss, so zum Bei- spiel durch einrastende Kupplungsmittel. Der Deckel kann dann einerseits als Griff verwendet werden, um den durchströmbaren Behälter zu halten, ohne diesen zu verschmutzen oder umgekehrt ohne durch den Behälter bzw. dessen Inhalt verschmutzt zu werden . Andererseits kann der Deckel dem Verschließen eines Gefäßes mit darin befindlichem Mittel für das Fixieren und/ oder Stabilisieren dienen, wenn der durchströmbare Behälter in eine entsprechende Flüssigkeit eingetaucht werden soll. Ist es für die Fixierung bzw. Stabilisierung erforderlich, eine Probe von einer Lösung zu einer nächsten zu transferieren, so kann die im durchströmbaren Behälter befindliche Probe mit Hilfe des Deckels transferiert werden, ohne das der durchströmbare Behälter geöffnet werden muss. Aufgrund einer lösbaren Befestigung kann der durchströmbare Behälter weiter verwendet werden, so zum Beispiel, um den durchströmbaren Behälter mit darin befindlicher fixierter bzw. stabilisierter Probe in einen entsprechend angepassten Entwässerungsautomaten zu ü- berführen .

Bei der in Figur 2 gezeigten Ausführungsform ist die Unterseite 6 des Behälters vorzugsweise offen oder kann geöffnet werden . Die Ränder sind dann derart scharfkantig ausgebildet, dass diese Unterseite in eine typische Probe hineingestoßen werden kann, um so den Behälter mit Probenmaterial zu be- füllen und zugleich das Probenmaterial geeignet zu dimensionieren.

In Figur 3 wird eine Ausführungsform mit einem Stempel 7 dargestellt, mit dem Probenmaterial aus dem durchströmbaren Behälter herausgedrückt werden kann .

Aus Kostengründen besteht der durchströmbare Behälter vorzugsweise aus Kunststoff . Es handelt sich dann insbesondere um einen Wegwerfartikel. Für jede neue Probe wird dann ein neuer, noch unbenutzter durchströmbarer Behälter verwendet, was die Handhabung vereinfacht.

Ein durchströmbarer Behälter kann aber auch aus Metall bestehen und zwar vor allem dann, wenn dieser eine scharfe Kante aufweisen soll, um in Gewebe hineinstoßen zu können .

Fig . 4 zeigt den Aufbau eines durchströmbaren Behälters mit einer darin befindlichen stabilisierten Probe, die in ein Gefäß mit einer darin befindlichen Flüssigkeit 8 eingetaucht ist. Der durchströmbare Behälter befindet sich nahe bei einer Gefäßwand 9 und ist vorzugsweise an dem Gefäßdeckel befestigt und zwar insbesondere lösbar und/ oder durch Formschluss. Eine Ultraschallquelle 1 1 ist so nahe dieser Gefäßwand 9 platziert und so dimensioniert, dass Ultraschall den durchströmbaren Behälter erreicht und ansonsten nicht weiter in das Gefäß gelangt, wie durch die Pfeile angedeutet wird . Ultraschall schließt so die im durchströmbaren Behälter befindliche Probe auf, die im Anschluss daran durch eine gitterförmige Wand hindurch in die Flüssigkeit 8 entweichen kann, die sich außerhalb des durchströmbaren Behälters befindet. Damit Ultraschall in den durchströmbaren Behälter gelangen kann, ist der Ultraschall so ausgerichtet, dass dieser auf eine durchströmbare Wand auftrifft.

Figur 5 zeigt die in Beispiel 1 erklärte Analyse von RNA-Präparaten aus Rat- tenleber auf einem Agilent-Bioanalyzer-Gerät. A: Agilent-Gel, B: Elektrophe- rogramm und RIN-Wert.

Figur 6 zeigt die in Beispiel 1 erklärte Analyse von RNA-Präparaten aus Rattenniere auf einem Agilent-Bioanalyzer-Gerät. A: Agilent-Gel, B: Elektrophe- rogramm und RIN-Wert.

Figur 7 zeigt die in Beispiel 1 erklärte Analyse von RNA-Präparaten aus Rattenmilz auf einem Agilent-Bioanalyzer-Gerät. A: Agilent-Gel, B: Elektrophe- rogramm und RIN-Wert.

Figur 8 zeigt auf Agarosegel analysierte DNA, die gemäß Beispiel 2 aus (a) Rattenleber, (b) -niere, (c) -milz und (d) -darm hergestellt worden ist.

Figur 9 zeigt eine Hematoxylin/Eosin-Färbung von Rattenleber (a) im über- blick, (b) mit 1 OOfacher und (c) mit 630facher Vergrößerung . Das Gewebe wurde gemäß Beispiel 3 fixiert und verarbeitet.

Figur 1 0 zeigt eine Hematoxylin/Eosin-Färbung von Rattenniere (a) im überblick, (b) mit 1 OOfacher und (c) mit 630facher Vergrößerung . Das Gewebe wurde gemäß Beispiel 3 fixiert und verarbeitet.

Figur 1 1 zeigt eine Hematoxylin/Eosin-Färbung von Rattenmilz (a) im überblick, (b) mit 1 OOfacher und (c) mit 630facher Vergrößerung . Das Gewebe wurde gemäß Beispiel 3 fixiert und verarbeitet.

Die Erfindung wird nun anhand der nachstehenden Beispiele ausführlicher beschrieben . Die Beispiele werden nur zum Zweck der Veranschaulichung bereitgestellt und dürfen nicht so ausgelegt werden, dass sie die Erfindung auf die gezeigten Ausführungsformen beschränken .

Beispiel 1

RNA-Stαbilisierung in Gewebe, das in einem durchströmbaren Behälter fixiert wurde: Rattenleber, -niere und -milz wurden direkt nach der Entnahme in Scheiben mit einer Dicke von etwa 3 mm geschnitten. Zum Fixieren wurden die Gewebeproben in einen durchströmbaren Behälter mit einer Länge von 4 cm, einer Breite von 2, 7 cm und einer Tiefe von 5 mm angeordnet. Der durchströmbare Behälter mit den Gewebeproben wurde vollständig in eine 500 ml-Flasche eingetaucht, die mit 250 ml einer Fixierlösung gemäß Zusammensetzung A nach PCT/EP/2008052371 gefüllt war. Die Fixierlösung umfass- te (Methanol, Essigsäure, 1 ,3-Butandiol und PEG300) . Nach 2 Stunden wurde das Fixieren beendet, indem die Gewebeproben in dem durchströmbaren Behälter in eine andere 500 ml-Flasche überführt wurde, die mit 250 ml ei- ner Lösung gemäß Zusammensetzung B nach PCT/EP/2008052371 umfassend Ethanol (p.a .) und 1 ,3-Butandiol, gefüllt war. Nach 20 h Inkubation wurden die Proben in dem durchströmbaren Behälter als erster Schritt der Verarbeitung in 70%-iges Ethanol überführt.

Die Gewebe-Prozessierung, welche die Dehydration, das Klären und die Infiltration mit Paraffin umfasste, wurde unter Verwendung eines Leica TPl 020- Prozessors automatisiert durchgeführt. Der durchströmbare Behälter wurde durch Ethanol mit zunehmenden Konzentrationen geführt. Als Zwischenschritt zwischen der Dehydration und der Infiltration mit dem Einbettmedium wurde ein Klären mit XyIoI durchgeführt. Hohlräume und Zellen des Gewebes wurden mit flüssigem Paraffin (Paraplast XTRA mit niedrigem Schmelzpunkt, Roth Inc.) bei 56 ⁰ C getränkt (Einzelheiten in Tabelle 1 ) . Um den für die Mikrotomie notwendigen Träger zu erhalten, wurden die Proben in das gleiche Paraffin, wie es zur Infiltration verwendet wurde, eingebettet.

Als Ausgangsmaterial der RNA-Extraktion wurden frische Schnitte der Paraffinblöcke verwendet. Die Paraffinblöcke wurden mit einem Rotationsmikrotom (Leica RM2245) geschnitten, wobei von jeder Probe 5 Scheiben mit einer Dicke von jeweils 1 0 μm abgeschnitten und in einem Mikrozentrifugen-

röhrchen gesammelt wurden. Das Entfernen des Paraffins wurde durch Zusetzen von 1 ml XyIoI, Vortexen und 2 min Zentrifugieren bei 1 4000 Upm durchgeführt. Der überstand wurde entfernt und das Pellet in 1 ml 1 00%-igem E- thanol gelöst.

Nach 2 min Zentrifugieren bei 1 4000 Upm und Entfernen des Ethanols wurde das Pellet in 1 50 μl des RLT-Puffers (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) (enthaltend GTC, pH = 7, umfassend 0, 1 43 M ß- Mercaptoethanol) gelöst. Nach Zusetzen von 295 μl Wasser und 5 μl Protei- nase K ( > 600 mAU/ml) wurde der Aufschluss mit einer Dauer von 1 0 min bei 55 ⁰ C auf einem Schüttler/Inkubator bei 1 400 Upm durchgeführt. Zum Homogenisieren wurde das Lysat einer QIAshredder-Spin-Säule (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) zugeführt und 2 min bei 1 4000 Upm zentrifugiert. Das durchgeströmte Material wurde mit 1 225 μl Ethanol (1 00 %-ig) gemischt und einer RNeasy-MinElute-Spin-Säule (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) zugeführt. Die Lysate wurden durch die Zentrifugation durch die Membran geführt, so dass die RNA von der Membran absorbiert wurde. Verunreinigungsstoffe wurden durch zweimaliges Waschen der Membran mit Waschpuffer RWl (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland), umfassend GTC, mit pH = 7,5 und E- thanol, entfernt. Zwischen den beiden Waschvorgängen wurde verbliebene DNA von der Membran entfernt, indem 1 0 μl DNase (etwa 30 Kunitz- Einheiten), gemischt mit 70 μl Puffer RDD (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) mit pH = 7,5 auf die Membran pipettiert und 1 5 min bei Umgebungstemperatur inkubiert wurde. Nach zwei weiteren

Waschvorgängen mit 500 μl des Puffers RPE (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) (mit pH = 7,5 und 80 %-igem Ethanol) wurde die Membran durch 1 min Zentrifugieren mit Maximalgeschwindigkeit, 1 4000 Upm, getrocknet. Schließlich wurde die RNA eluiert, indem 30 μl Puffer BR5 (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) (pH = 7) auf die Membran pipettiert wurde, gefolgt von 1 min Inkubieren bei Umgebungstemperatur und 1 min Zentrifugieren bei 1 4000 Upm . Alle Extraktionen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Die Unversehrtheit und die Größenverteilung der gesαmt-RNA wurde auf einem Agilent 21 00 Bioanalyzer-Gerät unter Verwendung des RNA 6000 Nano- Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

In den Figuren 5 bis 7 sind die Agilent-Gele, die entsprechenden Elektrophe- rogramme und RIN-Werte („RNA integrity number") für jeweils dreifach ausgeführte Analysen von Leber, Niere und Milz gezeigt.

Die Analyse der RNA auf dem Agilent-Bioanalyzer-Gerät zeigte alle Haupt- merkmale einer RNA mit hohem Molekulargewicht ohne Abbau . Auf dem Gel (Figur 5-7, A) sind zwei ribosomale Banden von 1 8S- und 28S-rRNA als scharfe Banden beinahe ohne Verwischung sichtbar. Auf dem Elektropherogramm (Figur 5-7, B) entsprechen die beiden Banden 2 ribosomalen Maxima . Die RIN Werte der RNA variieren zwischen 7 und 9 auf einer Skala von 1 bis 1 0.

Schlussfolgerung : Das Fixieren in einem durchströmbaren Behälter in Kombination mit der in PCT/EP/2008052371 beschriebenen Fixierchemie ergibt eine Konservierung von RNA in Gewebeproben, sogar nach einer Verarbeitung und Paraffineinbettung .

Schritt Medium Dauer Temperatur

1 70 % Ethαnol 1 5 min

2 80 % Ethαnol 30 min

3 90 % Ethαnol 60 min

4 99 % Ethαnol 60 min

5 99 % Ethαnol 60 min

6 Isopropαnol 60 min

7 Isopropαnol 60 min

8 XyIoI 60 min

9 XyIoI 60 min

Pαrαplαst-XTRA und

1 0 60 min 50 ⁰ C XyIoI (1 : 1 -Gemisch)

1 1 Pαrαplαst-XTRA 60 min 56 ⁰ C

1 2 Pαrαplαst-XTRA 90 min 56 ⁰ C

Tabelle 1 : Prozessierung von Gewebeproben in dem durchströmbaren Behälter auf einem Leica TPl 020 Gewebe-Prozessor-Gerät

Beispiel 2

DNA-Stabilisierung in Gewebe, das in einem durchströmbaren Behälter fixiert wurde

Gewebeproben von Rattenleber, -niere, -milz und -darm wurden wie in Bei- spiel 1 beschrieben in dem durchströmbaren Behälter in Reagenzien gemäß den Zusammensetzungen A und B gemäß PCT/EP/2008052371 stabilisiert, verarbeitet und in Paraffin eingebettet (mit geringfügigen änderungen : Fixieren in 300 ml Reagens gemäß Zusammensetzung A und Beenden des Fixie- rens nach 6 h).

Als Ausgangsmaterial der DNA-Extraktion wurden frische Schnitte der Paraffinblöcke verwendet. Die Paraffinblöcke wurden mit einem Rotationsmikrotom (Leica RM2245) geschnitten, wobei von jeder Probe 5 Scheiben mit einer Dicke von jeweils 1 0 μm abgeschnitten und in einem Mikrozentrifugen- röhrchen gesammelt wurden. Das Entfernen des Paraffins wurde durch Zusetzen von 1 ml XyIoI, Vortexen und 2 min Zentrifugieren bei 1 4000 Upm durchgeführt. Der überstand wurde entfernt und das Pellet in 1 ml 1 00%-igem E- thanol gelöst. Nach 2 min Zentrifugieren bei 1 4000 Upm und Entfernen des Ethanols wurde das Pellet 1 0 min bei 37 ⁰ C inkubiert, um Restethanol abzu-

dampfen.

Das so erhaltene Pellet wurde in 1 80 μl Puffer ATL (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) (pH 8,3-8,5) gelöst und durch Zusetzen von 20 μl Proteinase K (Aktivität 600 mAU/ml) verdaut. Der Proteinase-Verdau erfolgte eine Stunde bei 56 ⁰ C unter ständigem, leichtem Mischen der Proben (1 400 Upm) . Die RNA wurde durch Zusetzen von 4 μl RNase A ( 1 00 mg/ml) und 2 min Inkubieren bei Umgebungstemperatur aus den Proben entfernt. Nach Zusetzen von 200 μl des Lysepuffers AL (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) (umfassend GuHCI, pH 6,0), weiteren 1 0 min Inkubieren bei 70 ⁰ C und Zusetzen von 200 μl Ethanol ( 1 00 %-ig) wurden die Lysate auf die Silicamembran einer DNeasy®-Mini-Spin-Säule (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) pipettiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugieren (1 min, 8000 Upm) durch die Membran geführt, so dass die DNA von der Membran absorbiert werden konnte. Verunreinigungsstoffe wurden durch Waschen der Membran mit 500 μl des Puffers AWl (kommerziell erhältlich von Fa. QIAGEN GmbH, Deutschland) (GuHCI, enthaltend 57 %-iges EtOH) und einen zweiten Waschvorgang mit Puffer AW2 (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) (pH 7,5, enthaltend 70 %-iges EtOH) entfernt. Die Waschreagenzien wurden jeweils durch 1 min Zentrifugieren bei 8000 Upm durch die Membran geführt. Nach dem letzten Waschvorgang wurde die Membran durch 3 min Zentrifugieren mit Maximalgeschwindigkeit bei 1 4000 Upm, getrocknet. Schließlich wurde die DNA elu- iert, indem 50 μl Elutionspuffer AE (kommerziell erhältlich von Fa . QIAGEN GmbH, Deutschland) ( 1 0 mM Tris-Cl mit pH 9,0, 0,5 rriM EDTA) direkt auf die Membran pipettiert wurde, gefolgt von 1 min Inkubieren bei Umgebungstemperatur und 1 min Zentrifugieren bei 1 4000 Upm, Alle Extraktionen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Die Unversehrtheit und die Größe der gesamten DNA wurde durch Agarose- Gelelektrophorese analysiert. Dabei wurden 1 0 μl des entsprechenden Eluats mit 5 μl Laufpuffer (umfassend 50 %-iges Glycerin und Bromophenolblau) gemischt. Die Proben wurden auf ein 0,8 % Agarose-Gel in I x TBE-Puffer aufgetragen. Die Elektrophorese wurde über einen Zeitraum von 1 20 min bei

etwa 3,3 Volt pro cm Länge der Elektrophoresekammer durchgeführt. Die DNA wurde durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Die Agarose-θelelektrophorese zeigte, dass die DNA ein hohes Molekularge- wicht aufwies. Auf dem Agarose-Gel (Fig. 8) ist die DNA aus (a) Leber, (b) Niere, (c) Milz und (d) Darm als deutliche Einzelbande mit einem Molekulargewicht von etwa 21 kD zu sehen . Es ist beinahe keine Verwischung, die einen DNA-Abbau anzeigt, zu erkennen.

Schlussfolgerung: Das Fixieren in einem durchströmbaren Behälter in Kombination mit der in PCT/EP/2008052371 beschriebenen Fixierchemie ergibt eine Konservierung von DNA mit hohem Molekulargewicht in Gewebeproben sogar nach einer Verarbeitung und Paraffineinbettung .

Beispiel 3:

Konservierung der Histologie von Gewebe, das in einem durchströmbaren Behälter fixiert ist

Gewebeproben von Rottenleber, -niere, -milz und -dgrm wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in dem durchströmboren Behälter in Reggenzien gemäß den Zusgmmensetzungen A und B gemäß PCT/EP/2008052371 fixiert und stabil isiert. Anschließend wurden die Proben prozessiert und in Paraffin eingebettet. Im Gegensatz zu Beispiel 1 wurde für 6 h fixiert und 30h nach überführung in ein Reagenz mit der Zusammensetzung B gemäß PCT/EP/2008052371 mit der Prozessierung begonnen . Die Prozessierung auf einem Leica TP1 020-Gerät wurde gemäß dem in Tabelle 1 beschriebenen Protokoll durchgeführt, wobei bei Schritt 8- 1 0 Neoclear anstelle von XyIoI und bei der Infiltration mit Paraffin eine Temperatur von 60 ⁰ C verwendet wurde (Schritte 1 1 und 1 2, Tabelle 1 ) .

Zur histologischen Analyse wurden mittels eines Rotationsmikrotoms (Leica RM2245) Gewebeschnitte mit Dicken von 4 μm angefertigt und auf Glas- plättchen befestigt. Das Färben mit Haematoxylin und Eosin wurde mit Farbstoffen von Sigma Inc. manuell durchgeführt, wobei ein Standardprotokoll eingehalten wurde (Tabelle 2) .

Die Figuren 9 bis 1 1 zeigen die Morphologie von Leber (Fig. 9), Niere (Fig . 1 0) und Milz (Fig . 1 1 ) . Von links nach rechts wird zunächst ein überblick über den gesamten Schnitt, gefolgt von 1 00- und 630-fachen Vergrößerungen, gezeigt.

Die überblicke zeigen, dass die Gesamtmorphologie und die zelluläre Struktur der einzelnen Gewebe intakt sind. Höhere Vergrößerungen (1 00-fach) zeigen typische morphologische Strukturen wie Leberläppchen (Fig . 9), Nie- renglomeruli (Fig . 1 0) und Follikel mit Keimzentrum der Milz (Fig . 1 1 ) . Bei noch höherer Vergrößerung (630-fach) können einzelne Zellen unterschieden werden . Der Zellkern ist gegen das Zytoplasma sichtbar, und verschiedene Zellarten können erkannt werden .

Schlussfolgerung: Das Fixieren in einem durchströmbaren Behälter in Kombination mit der in der PCT/EP/2008052371 beschriebenen Fixierchemie ergibt eine besonders vorteilhafte Konservierung der Histologie in Gewebeproben .

Tabelle 2 : Protokoll der Färbung mit Haematoxylin und Eosin