L'invention concerne un procédé et un dispositif de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux et leur application aux processus microbiologiques, tels que la séparation de cellules magnétiquement marquées.

Le domaine technique de la séparation des particules marquées, en suspension dans un milieu visqueux parmi d'autres particules non marquées, a fait l'objet d'un nombre croissant d'études et de développements, en vue d'applications aux processus de microbiologie ou, plus généralement, de biotechnologie.

C'est en particulier le cas en ce qui concerne la séparation de cellules marquées magnétiquement, au moyen de billes magnétiques, lesquelles sont solidarisées à certaines cellules par l'intermédiaire d'anticorps, qui réagissent avec les antigènes de surface de chaque cellule considérée.

Lorsque de telles cellules sont en suspension dans un liquide physiologique, tel que le sang ou un milieu intercellulaire, la viscosité du fluide, constitutif de ce milieu, est très importante, un tel système présentant un nombre de Reynolds très faible, Rue-0.

Parmi les travaux les plus remarquables réalisés jusqu'à ce jour dans le domaine technique considéré, on peut se reporter à l'article publié par M.

Hoyos, Lee R. Moore, Kara E. MC Closkey, Shlomo Margel, Merav Zaberi, Jeffrey J. Chalmers, Maciej Zborowski intitulé"Study of magnetic particles pulse injected into an annular SPLITT like channel inside a quadruple magnetic field" et édité par le Journal of chromatography A, 903 (2000) 99-116.

L'article précité décrit un appareil et un procédé dans lesquels des particules (cellules) marquées magnétiquement sont soumises à un champ de forces stationnaire, invariant dans le temps, par l'intermédiaire d'un champ magnétique quadrupolaire, fixe et stationnaire. Le flux de particules, marquées et non marquées, circule dans un canal sensiblement annulaire, ménagé entre deux cylindres concentriques verticaux. Les particules marquées et non marquées et le fluide porteur sont introduits par des conduites d'admission radialement opposées et placées en partie supérieure du canal. Les particules

précitées sont transportées par convection et gravité vers la partie inférieure du canal. L'application d'un champ magnétique sensiblement axial et d'amplitude stationnaire permet de faire dériver les particules marquées magnétiquement vers la paroi interne du cylindre extérieur matérialisant le canal, en l'absence de dérive des particules non marquées. Une première et une deuxième conduite de sortie, placées chacune en partie inférieure du canal au voisinage de la paroi interne du cylindre extérieur respectivement de la paroi du cylindre intérieur, permettent de collecter les particules marquées par élution, d'une part, et les particules non marquées par gravité, d'autre part.

Les essais réalisés dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé et de l'appareil précités ont donné satisfaction. Toutefois, il est apparu que le processus de séparation est fortement dépendant des conditions opératoires, telles que làmplitude du champ de forces, et donc du champ magnétique appliqué, et que le débit relatif de particules et de fluide porteur introduits.

En particulier, la concentration en particules de l'ensemble doit, en principe, être limitée à une valeur de concentration inférieure à 1%, pour éviter les interactions entre particules. Ces interactions sont susceptibles de perturber le, sinon de s'opposer au, processus de séparation décrit précédemment.

Un inconvénient du procédé et de l'appareil décrits dans l'article précité réside en conséquence dans la forte dépendance du rendement de séparation aux conditions de mise en oeuvre du processus de séparation par application d'un champ magnétique stationnaire décrit.

Un autre inconvénient du procédé et de l'appareil décrits dans l'article précité résulte de la condition limitant la concentration des particules à une valeur faible. Une telle limitation interdit, en pratique, une application d'un tel processus de séparation à des quantités importantes de particules, c'est à dire en situation réelle ou naturelle, lorsque, même en présence d'une faible quantité de particules ou cellules marquées supposées pathogènes par exemple, il existe un nombre important de particules ou de cellules non marquées, non pathogènes, susceptibles de provoquer des interactions, néfastes au bon déroulement du processus de séparation.

La présente invention a pour objet la mise en oeuvre d'un procédé et d'un dispositif de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, dans lesquels les limitations et inconvénients précités sont sensiblement supprimés.

En particulier, un objet de la présente invention est la mise en oeuvre d'un procédé et d'un dispositif de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux susceptibles d'être mis en oeuvre en présence d'un nombre important de particules et d'un grand volume de ce milieu.

Un autre objet de la présente invention est la mise en oeuvre d'un procédé et d'un dispositif de séparation de particules dans un milieu visqueux susceptibles d'être mis en oeuvre en présence d'un nombre important de particules non marquées, d'une part, et, simultanément, en présence d'un nombre faible ou très faible de particules marquées, d'autre part, ces particules marquées apparaissant ainsi en faible ou très faible concentration dans l'ensemble des particules.

Un autre objet de la présente invention est en conséquence, compte tenu de la faible ou de la très faible concentration des particules marquées dans l'ensemble des particules, l'application de ce procédé et de ce dispositif à la détection précoce d'éléments étrangers ou différenciés, en particulier lorsque ces éléments sont des cellules, présentant un caractère pathogène ou non pathogène.

Le procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, objet de la présente invention, s'applique à tout milieu visqueux présentant un nombre de Reynolds voisin de la valeur zéro ou de valeur supérieure et comprenant en suspension des particules marquées et des particules non marquées, soumises à un phénomène de diffusion.

II est remarquable en ce qu'il consiste à soumettre les particules marquées à un champ de forces non stationnaire, pour engendrer un mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées au sein de ce milieu visqueux et à maintenir ce champ de forces non stationnaire pour maintenir le mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées ou des éléments de marquage au sein du milieu visqueux et engendrer, par interaction hydrodynamique avec les particules marquées et non marquées au

voisinage des particules marquées, un accroissement de diffusivité des particules. Ceci permet, d'engendrer une zone enrichie en particules marquées.

Le dispositif séparateur de particules marquées dans un milieu visqueux comprenant des particules marquées magnétiquement et des particules non marquées est remarquable en ce qu'il comporte au moins un récipient contenant le liquide visqueux, ce récipient comportant une fenêtre d'entrée d'un écoulement du liquide visqueux contenant des particules marquées et non marquées en suspension, une fenêtre de sortie, placée sensiblement en vis à vis de la fenêtre d'entrée dans la direction de l'écoulement et des fenêtres latérales de sortie placées au voisinage de la paroi interne du récipient, à hauteur de la fenêtre de sortie. Des circuits d'application d'un champ magnétique non stationnaire orienté dans un plan de symétrie du récipient sont prévus. La fenêtre de sortie permet de recueillir les particules non marquées magnétiquement et les fenêtres latérales permettent de recueillir les particules marquées magnétiquement lors de l'application du champ magnétique non stationnaire.

Le procédé et le dispositif de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, objets de l'invention, trouvent application à toute opération ou technique de laboratoire ou industrielle de chromatographie en phase liquide, ou séparation continue, aux techniques de séparation de cellules marquées dans toute opération ou technique de laboratoire ou industrielle dans le domaine des processus de biotechnologies, de microbiologie ou autre, telle que la minéralogie.

En particulier, lorsque les particules marquées, sont des particules marquées magnétiquement, au moyen de microbilles magnétiques par exemple, l'étape consistant à soumettre les particules marquées à un champ de forces non stationnaire peut consister à appliquer à ces particules un champ magnétique variable ; ceci permet d'engendrer une pluralité de flux élémentaires de fluide visqueux au voisinage des particules marquées en rotation autour d'un axe sensiblement orthogonal au plan contenant la direction du champ magnétique variable, les flux élémentaires de liquide visqueux provoquant l'interaction hydrodynamique.

Ils seront mieux compris à la lecture de la description et à l'observation des dessins ci-après, dans lesquels : - la figure 1a représente, à titre illustratif, un organigramme des étapes essentielles permettant la mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ; - la figure 1b représente, à titre illustratif, un diagramme illustratif de l'interaction hydrodynamique entre particules marquées, fluide constituant le milieu visqueux et particules non marquées, mise en oeuvre dans le cadre du procédé objet de la présente invention ; - les figures 2a, 2b et 2c représentent, à titre illustratif, différentes variantes de mise en oeuvre de l'interaction hydrodynamique de la figure 1b, ces différentes variantes de mise en oeuvre correspondant, avantageusement, à des contextes de mise en oeuvre différents mais complémentaires, permettant d'induire des mécanismes de séparation distincts ; - la figure 3 représente, à titre illustratif, un mode de mise en oeuvre préférentiel non limitatif d'un champ de forces non stationnaire au moyen d'un champ magnétique variable, non stationnaire, lorsque les particules ou cellules à séparer sont marquées magnétiquement ; - les figures 4a à 4c représentent, à titre illustratif, l'évolution d'un milieu visqueux contenant des particules marquées et non marquées réparties aléatoirement dans ce milieu visqueux, la séparation des particules marquées, dans une telle situation, intervenant essentiellement selon un processus de flottabilité ; - la figure 5a représente un diagramme de probabilité de présence par unité de volume, en fonction de la distance, de deux particules dans un milieu visqueux sous l'effet d'un champ magnétique non stationnaire, en l'absence de gravité, les particules étant non marquées, selon la courbe A, l'une des particules étant marquée magnétiquement, selon la courbe B ; - les figures 5b et 5c représentent, à titre illustratif, une vue de dessus de la trajectoire de particules non marquées magnétiquement et de particules marquées respectivement introduites par un écoulement du milieu visqueux lorsque ces particules sont soumises au procédé objet de la présente invention ;

- la figure 6 représente, à titre illustratif, en vue de dessus, un dispositif séparateur de particules marquées magnétiquement contenues dans un écoulement de particules marquées et non marquées, le champ de forces non stationnaire étant engendré par application d'un champ magnétique tournant.

Le procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, conforme à l'objet de la présente invention, sera maintenant décrit en liaison avec les figures 1 a, 1 b et les figures suivantes.

En référence à la figure 1a, on indique que le procédé objet de l'invention s'applique à des particules marquées PM et à des particules non marquées PNM dans un milieu visqueux, le milieu visqueux précité pouvant être constitué par tout système dont le nombre de Reynolds Re est voisin de zéro, Rue-0.

Bien que le procédé objet de la présente invention soit plus particulièrement adapté pour les liquides visqueux précités, il peut être mis en oeuvre de manière non limitative pour des fluides de degré de viscosité plus faible, c'est-à-dire dans des situations où le nombre de Reynolds est plus important.

D'une manière générale, on indique que les particules marquées PM et non marquées PNM sont en suspension dans ce milieu visqueux et qu'elles sont soumises ou non à un phénomène de diffusion dans le milieu visqueux précité. On comprend, en particulier, que le phénomène de diffusion peut être un phénomène de diffusion très lent, tel qu'un phénomène de sédimentation, lorsque les particules marquées et non marquées sont soumises aux seules forces de gravité dans le milieu visqueux ou, au contraire, à un écoulement spécifique lorsque ces particules marquées et non marquées sont introduites sous forme d'un écoulement dans le milieu visqueux. Le cas échéant, les particules marquées ou non marquées ne sont soumises à aucun phénomène de diffusion lorsque, par exemple, les particules marquées ou non marquées sont introduites dans le milieu visqueux et soumises à de seuls mouvements de convexion, lors de cette introduction, en l'absence de phénomène de diffusion réellement perceptible. Dans ce cas, on considère une vitesse de diffusion sensiblement nulle.

En référence à la figure 1a, on indique que le procédé objet de l'invention consiste à soumettre les particules marquées PM à un champ de forces non

stationnaire F (t) pour engendrer un mouvement MR de rotation continu ou alterné des particules marquées MR-PM ou des éléments de marquage au sein du milieu visqueux à l'étape A, puis à l'étape B, à maintenir le champ de forces non stationnaire pour maintenir le mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées au sein du milieu visqueux et engendrer, par interaction hydrodynamique avec les particules marquées et non marquées au voisinage des particules marquées, un accroissement de diffusivité des particules. Ce processus permet d'engendrer, en zone de faible densité en particules du milieu, une zone enrichie en particules marquées PM.

Sur la figure 1a, l'étape B représente l'interaction hydrodynamique entre le fluide visqueux et les particules marquées et non marquées provoquant l'accroissement de diffusivité noté D des particules marquées.

Le mode opératoire du processus d'interaction hydrodynamique est le suivant : le champ de forces non stationnaire est utilisé pour produire une mise en mouvement sur elles-mêmes des particules marquées, cette mise en mouvement ayant pour effet d'engendrer, par interaction hydrodynamique, des flux de liquide visqueux au voisinage des particules marquées. Ces flux de liquide visqueux ont eux-mêmes pour effet de provoquer la mise en mouvement des particules du voisinage, ainsi qu'il sera décrit dans la description. Ce mouvement des particules voisines de chaque particule marquée engendre, à son tour, une modification des flux autour de chaque particule marquée PM, cette modification engendrant un mouvement erratique augmentant la diffusivité de chaque particule marquée PM.

Sur la figure 1b, on a représenté, de manière plus détaillée, le processus précité. Selon la figure 1b, les particules marquées PM soumises au champ de forces non stationnaire entraînées en rotation continue ou alternée engendrent, B1, un flux du milieu visqueux à leur voisinage. Ces flux engendrent eux- mêmes, B2, un mouvement des particules du voisinage. Le flux est modifié, B3, en surface des particules marquées. Un mouvement erratique"diffusif"des particules marquées PM et des particules voisines est engendré, B4.

Différentes variantes de mise en oeuvre de l'interaction hydrodynamique seront maintenant décrites en liaison avec les figures 2a à 2c, ces différentes

variantes étant distinctes, mais complémentaires, le processus d'interaction hydrodynamique en tant que tel pouvant être compris comme correspondant à l'une de ces variantes ou, le cas échéant, à la combinaison de ces variantes, ainsi qu'il sera décrit ci-après dans la description.

En référence à la figure 2a, on indique que la diffusivité de chaque particule marquée PM permet d'engendrer, au voisinage de chaque particule marquée PM, une région à faible densité de particules, chaque région à faible densité de particules et la particule marquée PM associée à celle-ci étant alors soumise à un phénomène de flottabilité, en raison de la faible densité de particules dans la région précitée. Ceci permet de séparer les particules marquées dans une zone de densité réduite en particules du milieu visqueux.

En effet, en raison du phénomène de flottabilité précité, l'ensemble constitué par la région à faible densité de particules et la particule marquée associée à cette dernière et située sensiblement au centre de la zone précitée est soumis au phénomène de flottabilité, lequel provoque le transfert de cet ensemble en direction contraire au champ gravitationnel ou centripète dans le cas d'un système soumis à centrifugation.

Une deuxième variante de mise en oeuvre de l'interaction hydrodynamique correspond, ainsi que représenté en figure 2b, au cas plus spécifique où le milieux visqueux comporte une zone à densité relative plus faible en particules, en particulier dans le cas où le milieu visqueux, comportant les particules marquées et non marquées en suspension, est soumis à un phénomène de sédimentation par exemple.

Dans un tel cas, ainsi que représenté schématiquement en figure 2b, l'interaction hydrodynamique permet d'engendrer une migration de chaque particule marquée PM vers la zone à densité relative plus faible. Ceci est dû au fait que la diffusivité engendrée par l'interaction hydrodynamique est plus faible dans les régions de plus faible densité et que, selon le fait général connu en tant que tel, les particules migrent vers les régions de plus faible diffusivité. Ce processus d'interaction hydrodynamique, tel que représenté en figure 2b, permet de séparer les particules marquées dans la zone à densité relative plus faible en particules. Bien entendu, la deuxième variante précitée peut être mise

en oeuvre en combinaison avec la première variante décrite en liaison avec la figure 2a.

En ce qui concerne la création d'une zone à densité relative plus faible en particules, on indique que celle-ci peut être engendrée par un phénomène de sédimentation ou également par un phénomène de centrifugation appliqué au récipient contenant le milieu visqueux et les particules marquées et non marquées.

Une troisième variante de mise en oeuvre de l'interaction hydrodynamique sera maintenant décrite en liaison avec la figure 2c.

En référence à la figure précitée, on indique que, dans cette situation, le phénomène de diffusion correspond avantageusement à un écoulement E des particules marquées et non marquées, cet écoulement pouvant être introduit avec le milieu visqueux.

Sur la figure 2c, on a représenté l'écoulement contenant les particules marquées et non marquées PM + PNM, cet écoulement étant introduit dans un récipient représenté sur la figure 2c en vue de dessus. La vitesse de l'écoulement correspondant à une vitesse de diffusion est notée Ud.

Préalablement à l'application du champ de forces pour la mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, le récipient peut être rempli du liquide visqueux.

Sur application du champ de forces non stationnaire aux particules marquées PM, les particules non marquées PNM contenues dans le récipient se comportent alors comme un obstacle sensiblement aléatoire au flux de l'écoulement E. Le procédé objet de l'invention consiste en outre, pendant le maintien du champ de forces non stationnaire, à soumettre l'écoulement E de particules marquées et non marquées à un obstacle ou une série d'obstacles aléatoire interposé sur le trajet de l'écoulement. Ce type d'obstacle OBS peut être constitué par une matrice d'obstacles fixes, un milieu poreux ou autre.

Ce mode opératoire permet de soumettre les particules marquées à un phénomène de diffusion latérale amplifiée. La diffusion latérale amplifiée est ainsi engendrée sur les particules marquées dans une direction sensiblement

perpendiculaire à l'écoulement E. Du fait du phénomène de diffusion latérale précité, les particules marquées sont ainsi déviées vers les zones latérales adjacentes à l'écoulement E, zones périphériques de ce dernier, alors que les particules non marquées sont sensiblement maintenues dans la zone centrale de l'écoulement précité. Ce mode opératoire permet de séparer les particules marquées et non marquées.

Un mode de mise en oeuvre préférentiel du procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux objet de la présente invention sera maintenant décrit en liaison avec la figure 3.

En référence à la figure précitée, on indique que les particules marquées peuvent avantageusement être constituées par des particules marquées magnétiquement. Lorsque le procédé objet de l'invention est mis en oeuvre pour la séparation de cellules, telles que des cellules pathogènes par exemple, celles-ci peuvent être marquées au moyen de billes magnétiques de manière connue en tant que telle. A titre d'exemple non limitatif, on indique que les billes magnétiques peuvent être des billes ferro-magnétiques ou super- paramagnétiques. Dans les processus de marquage précités, les particules magnétiques sont fixées aux cellules par l'intermédiaire d'anticorps qui réagissent avec les antigènes de surface des cellules précitées.

Dans ces conditions, chaque particule marquée ou chaque cellule marquée est susceptible d'acquérir, au moins en présence de l'application d'un champ magnétique, un moment magnétique noté P.

En conséquence, le procédé objet de l'invention, ainsi que représenté de manière illustrative en figure 3, peut consister, à l'étape A de la figure 1a, à appliquer, aux particules marquées magnétiquement, un champ magnétique variable B (t) afin de permettre d'engendrer un mouvement de rotation continu ou alterné des particules marquées PM, lequel provoque, à son tour, une pluralité de flux élémentaires de fluide visqueux tournant au voisinage des particules marquées autour d'axes de rotation sensiblement orthogonaux au plan contenant le champ magnétique variable. Les flux élémentaires de liquide visqueux induisent alors l'interaction hydrodynamique dans les conditions précédemment citées dans la description.

Dans un mode de réalisation préférentiel, on indique que le champ magnétique est un champ magnétique tournant d'amplitude sensiblement fixe.

On conçoit dans ces conditions que les particules marquées PM sont mises en rotation continue ou alternée par l'intermédiaire du champ magnétique précité lorsque ce dernier est un champ tournant ou un champ variable. Le processus de séparation est alors produit par l'interaction entre particules répulsive, de friction, ou hydrodynamique par l'intermédiaire des flux voisins de liquide visqueux.

En particulier, l'interaction hydrodynamique, telle que décrite précédemment en liaison avec les figures 2a, 2b et 2c, peut être mise en oeuvre : - entre les particules elles-mêmes, en particulier avec les particules non marquées ; - avec le fluide lui-même ou milieu visqueux dans lequel les particules sont immergées en suspension ; - avec un milieu poreux ou, le cas échéant, avec des obstacles spécifiques en particulier lorsqu'un écoulement E est introduit.

Lorsque, en particulier, le procédé objet de la présente invention est mis en oeuvre en présence d'un phénomène de sédimentation, ainsi que représenté en figure 2a, le paramètre fondamental qui gouverne le procédé objet de la présente invention est le rapport de la vitesse de rotation de chaque particule marquée, vitesse de rotation égale à w x a où w désigne la vitesse angulaire de rotation des particules et a désigne le rayon moyen de chaque particule, pour chaque particule marquée prise isolément et soumise au champ magnétique rotatif, à la vitesse de sédimentation désignée Ù et représentée par une flèche verticale descendante en figure 2a.

Dans ces conditions, pour une vitesse de sédimentation U déterminée et pour une vitesse angulaire de rotation w de chaque particule dotée d'un rayon moyen a, le rapport de la vitesse de rotation à la vitesse de sédimentation est donné par le nombre sans dimension désigné rapport de rotation : <BR> <BR> <BR> m = çaa<BR> <BR> u

Ce paramètre peut être ajusté soit en augmentant l'amplitude et la vitesse de rotation du champ magnétique, soit en réduisant la vitesse de sédimentation U.

Pour une valeur déterminée du rapport de rotation n1 précité, le temps nécessaire pour la séparation dépend bien entendu de la vitesse angulaire w et peut ainsi être mesuré en nombre de révolutions des particules. Ce temps nécessaire à la séparation des particules marquées, compté en nombre de révolutions des particules, est constant compté en nombre de révolutions des particules.

Les figures 4a à 4c représentent la mise en oeuvre du procédé objet de l'invention pour n1 = 1000, la séparation étant obtenue en quelques centaines de révolutions à partir d'une situation indifférenciée en figure 4a où les particules marquées et non marquées ont été introduites dans le récipient, puis soumises successivement au champ de forces au moyen d'un champ magnétique rotatif de vitesse angulaire w en figure 4b, pour finalement produire la séparation en zone supérieure du liquide visqueux en figure 4c.

Les figures 4a, 4b et 4c correspondent non pas à de simples schémas illustratifs, mais au contraire à des résultats successifs d'une simulation numérique réalisée au moyen de la dynamique de STOKES, à partir d'un programme de simulation basé sur les principes d'une telle dynamique dite STOKESIAN DYNAMICS en langage anglo-saxon.

La mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention dans lequel les phénomènes de diffusivité et de flottabilité mis en évidence sont décrits en liaison avec les figures 2a et 2b précédentes, ainsi que représenté en figures 4a à 4c, ne présente pas de limitation due à l'épaisseur finale du lit des particules non marquées PNM séparées, ainsi que représenté en figure 4c.

La figure 5a représente un diagramme de probabilité par unité de volume de trouver une paire de particules dans le milieu visqueux en l'absence de gravité.

La courbe A représente, pour des particules non marquées, la valeur de cette probabilité p en fonction de la distance.

On constate, pour la courbe A correspondante, que, pour une distance inférieure à 2a, c'est-à-dire deux fois le rayon moyen de chaque particule, la probabilité est sensiblement nulle. Une telle probabilité, au-delà de la distance 2a, atteint une valeur déterminée, laquelle décroît ensuite en fonction de la distance des particules pour atteindre une valeur palier sensiblement constante.

On comprend en effet que la probabilité est, dans ce cas, uniquement liée à des considérations géométriques et/ou de valeur relative de condition d'écoulement dans le fluide visqueux par exemple.

Au contraire, dans le cas de la courbe B, on constate que la distribution de probabilité d'existence de deux particules, l'une d'elles étant marquée, en fonction de la distance est sensiblement nulle sur une distance de séparation X sensiblement égale à quatre fois la distance 2a de la courbe A et que cette probabilité atteint ensuite une valeur déterminée sensiblement égale à la valeur de seuil dans le cas des particules non marquées pour atteindre sensiblement la même valeur limite de probabilité en fonction de la distance.

Les courbes A et B de la figure 5a, obtenues de même par simulation à partir de la dynamique de STOKES, montrent ainsi que lors de la mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention sur des particules marquées, il existe toujours, au voisinage de ces dernières, lorsqu'elles sont soumises à un mouvement de rotation continu ou alterné par exemple, une distance X constitutive du voisinage de chaque particule marquée et de la région à faible densité de particules. Cette région constitue, ainsi que mentionné précédemment dans la description, avec la particule marquée associée à cette dernière, la zone soumise au phénomène de flottabilité permettant de séparer les particules marquées par utilisation du champ gravitationnel ou de centrifugation.

Les figures 5b et 5c obtenues de même par simulation à partir de la dynamique de STOKES permettent de comprendre le mode opératoire du procédé objet de la présente invention, tel qu'illustré en figure 2c.

Sur la figure 5b, on a représenté, en vue de dessus, un milieu visqueux dans lequel est introduit un écoulement E constitué par un fluide de même nature que le milieu visqueux et comportant des particules non marquées et

une série d'obstacles aléatoires fixes, non représentés au dessin. Les trajectoires des particules non marquées sont représentées sur la figure 5b sur la totalité de la longueur L du récipient contenant le fluide visqueux. On constate que les particules présentent un faible degré de diffusivité latérale, les particules s'écartant légèrement, de quelques millimètres, de la trajectoire ou direction moyenne de l'écoulement E, dans une direction perpendiculaire à cet écoulement. Le phénomène de diffusivité est qualifié de latéral en raison de la non prise en compte de tout phénomène de sédimentation ou de gravité, lequel, dans le cas de la figure 5b, serait susceptible de s'exercer dans une direction orthogonale au plan de la figure 5b. A titre d'exemple non limitatif, pour une longueur L du récipient, c'est-à-dire pour un trajet d'écoulement s'exerçant sur cette longueur L égale à 2 à 3 cm par exemple, l'étalement des trajectoires, sur la distance d'étalement de trajectoires DLNM est de quelques millimètres.

Au contraire, ainsi que représenté en figure 5c, et pour un même écoulement E introduit dans un fluide visqueux correspondant sur une longueur L, l'écoulement E comportant également des particules marquées soumises au procédé objet de la présente invention, on constate, dans les mêmes conditions que dans le cas de la figure 5b, une diffusivité latérale beaucoup plus importante, la distance de diffusivité notée DLM étant environ dans un rapport 7 à 8.

Ainsi, les particules non marquées, lesquelles ne sont pas soumises à la variation du champ magnétique, et donc à la force non stationnaire, présentent une diffusion latérale de faible valeur, alors que les particules marquées, soumises au procédé objet de la présente invention, présentent une diffusion latérale beaucoup plus prononcée dans le rapport précité.

Dans ces conditions, et bien qu'une dérive due à la gravité puisse être mise en évidence, on comprend en particulier, ainsi que représenté schématiquement en figure 2c, que l'introduction d'un milieu poreux dans le volume contenu par le liquide visqueux permet alors de séparer les particules marquées, lesquelles sont déviées vers les zones périphériques de l'écoulement E, alors que les particules non marquées, non déviées, restent

sensiblement dans la zone centrale, telle que représentée en figure 5b et donc au voisinage de l'axe de l'écoulement E.

Un justificatif quantitatif de l'intérêt de la mise en oeuvre du procédé de séparation de particules marquées dans un milieu visqueux, conforme à l'objet de la présente invention, au moyen d'un champ de forces non stationnaire et, en particulier, par application d'un champ magnétique variable, tel qu'un champ magnétique rotatif, vis à vis des procédés connus de l'art antérieur dans lesquels le champ magnétique utilisé est fixe, sera donné ci-après dans la description.

On considère en premier lieu la mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, tel qu'illustré en figure 2c, dans lequel la vitesse de l'écoulement correspondant à une vitesse de dérive est notée Ud.

Le paramètre rapport de rotation, nombre sans dimension, dans cette situation, est donné par la relation : n2= (1) Ud Dans cette relation, w et a, ainsi que mentionné précédemment, représentent la vitesse angulaire d'une particule isolée soumise au champ magnétique et le rayon moyen de chaque particule marquée.

La valeur quadratique moyenne de la diffusion latérale, dans ces conditions pour une géométrie et une série d'obstacles données, est une fonction de n2, rapport de rotation, la dérive due à la gravité étant en outre négligée afin de se placer dans le cas de comparaison le moins favorable.

Ainsi que mentionné précédemment, la valeur du paramètre rapport de rotation n2 peut être choisie à discrétion en augmentant ou en diminuant la vitesse de l'écoulement Ud. Pour une géométrie spécifique du récipient contenant le liquide visqueux, en particulier la longueur L et la largeur 1 de celui- ci, la longueur L étant mesurée dans la direction de l'écoulement et la largeur 1 dans la direction perpendiculaire à l'écoulement, et pour une valeur donnée du paramètre de rotation n2, la vitesse de séparation en nombre de rotations est proportionnelle à Ud et inversement proportionnelle à la longueur L du séparateur.

Le flux de particules engendré flux1, dans ces conditions, est de la forme : flux 1 a Ud = (2) L Ln2 Dans cette relation, le symbole α indique une relation de proportionnalité.

Le couple mécanique appliqué à chaque particule marquée est proportionnel, en référence à la figure 3, à la valeur du moment magnétique P à l'amplitude B du champ magnétique et au sinus de leur angle, lequel dépend de la propriété d'hystérésis des particules ferro-magnétiques notamment.

A partir des formules pour la rotation, un ordre de grandeur de la valeur du flux 1 est donné par la relation (3) : flux 1 a U° a (3) L Ln2a2 77 Dans cette relation, # désigne la valeur de la viscosité du fluide visqueux et n2 désigne la valeur du rapport de rotation précédemment mentionnée dans la description. P désigne la valeur du moment magnétique et B la valeur ou amplitude du champ magnétique.

En comparaison, et pour un dispositif semblable de l'art antérieur permettant d'appliquer un champ magnétique B sensiblement stationnaire, une déflection des particules marquées d'un angle 0 par rapport à l'axe central de l'écoulement étant obtenue, la valeur de l'angle de déflection 6 vérifie la <BR> <BR> <BR> relation :<BR> P#B<BR> <BR> tan(#)α (4)<BR> <BR> ##aUd Dans la relation précédente, les mêmes paramètres désignent les mêmes entités que dans le cas des relations précédentes relatives au flux 1, l'entité VB désignant le gradient du champ magnétique, dans la direction perpendiculaire à la direction de l'écoulement.

Pour des valeurs d'angle de défection 8 et de longueur L du milieu visqueux dans lequel le processus de séparation est mis en oeuvre, l'expression du flux de particules flux 2 est de la forme :

flux 2 a UL a pub<BR> La Pour des dimensions sensiblement identiques de mise en oeuvre du procédé dans le cas du procédé objet de la présente invention au moyen d'un champ magnétique non stationnaire respectivement au moyen d'un champ de valeur fixe de l'art antérieur, le rapport des flux de particules s'écrit flux1/flux2 de la forme : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> flux1 B<BR> α (6)<BR> <BR> <BR> flux2 a#B A l'observation de la relation (6), et à supposer que #'on applique un champ magnétique B de même amplitude dans les deux cas, en estimant le gradient de champ magnétique sur un séparateur de largeur 1, la valeur du gradient de champ magnétique VB est de l'ordre de B/I.

Dans ces conditions, la relation précédente (6) s'écrit selon la relation <BR> <BR> <BR> <BR> (7) :<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> aux 1 a -l<BR> <BR> <BR> flux2 aBIl a Ainsi, et par comparaison du procédé objet de l'invention au procédé de séparation de l'art antérieur, il apparaît que le rapport des flux de particules marquées dans les deux cas est égal au rapport de la largeur 1, ou dimension orthogonale à la direction d'écoulement, au rayon moyen de chaque particule a.

Pour une largeur 1 de l'ordre de 1 mm et pour un rayon de particules élémentaire de l'ordre d'un micromètre, le procédé objet de la présente invention présente donc un gain d'un facteur 1000 par rapport au procédé de l'art antérieur. En particulier, en raison du fait qu'il n'est pas nécessaire d'engendrer un gradient de champ magnétique, le procédé objet de la présente invention permet de travailler sur des échantillons beaucoup plus larges et, en définitive, sur un nombre beaucoup plus important de cellules marquées et non marquées. Ainsi, alors que le nombre de cellules marquées, en particulier lorsque ces cellules sont pathogènes par exemple, peut être très faible, ceci permet d'effectuer une séparation de cellules marquées, alors que le nombre de cellules marquées et donc pathogènes est encore très faible en proportion, par rapport aux cellules non marquées.

Une description plus détaillée d'un séparateur constitutif d'un appareil mettant en oeuvre le procédé objet de la présente invention et spécialement adapté à la mise en oeuvre de ce dernier sera maintenant donnée en liaison avec la figure 6, dans le cas où un écoulement E est introduit dans le milieu visqueux.

Dans ces conditions, on indique que le séparateur comporte un récipient 1.

Le récipient 1 comporte une fenêtre d'entrée FE d'admission de l'écoulement E. Le récipient 1 présente une longueur L et une largeur 1 dans la direction perpendiculaire à l'écoulement E. Une fenêtre de sortie FS est prévue à l'opposé de la fenêtre d'entrée FE et sensiblement en vis à vis de celle-ci. Des ajutages latéraux notés FL1, FL2 sont prévus, lesquels mettent en relation l'intérieur du récipient 1 avec des orifices de sortie, les ajutages latéraux FL1 et FL2 ayant leur entrée placée au voisinage de la périphérie du récipient 1, à hauteur de la fenêtre de sortie FS.

La longueur L du récipient 1 peut être de 1 à 2 cm par exemple et la largeur 1 de quelques millimètres. En outre, des solénoïdes S1, S2 et S3, S4 sont disposés en opposition et décalés de s/2 dans le plan de la figure 6, les solénoïdes S1, S2 et S3, S4 étant alimentés par une tension alternative de manière à engendrer un champ magnétique tournant B (t), lequel est par exemple dans le plan de la figure 6. Enfin, un obstacle OBS, tel qu'une matrice poreuse ou, le cas échéant, une brosse munie de poils orthogonaux au plan de la figure 6, peut également être introduite afin de former l'obstacle à l'écoulement E dans le récipient 1.

En référence à la figure 2c, on indique que le séparateur représenté en figure 6 permet d'assurer la déviation des particules PM vers la périphérie interne du récipient 1 et finalement vers les ajutages latéraux FL1 et FL2 par exemple, alors que les particules non marquées PNM ne sont sensiblement pas déviées et peuvent donc être recueillies au niveau de la fenêtre de sortie FS.

Dans le cas où une brosse est constitutive de l'obstacle OBS, les poils de la brosse peuvent avantageusement être orientés perpendiculairement à la fois à l'axe de l'écoulement E et au plan contenant le champ magnétique tournant B (t).