Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Derartige Verfahren und Vorrichtungen sind allgemein aus dem Stand der Technik bekannt. Sie dienen dazu, zur Lagerung oder späteren Verwendung bestimmte Milch oder Muttermilch haltbar zu machen und/oder infektiöse Mikroorganismen aus der Milch zu entfernen. Derartige Verfahren sind z. B. unter dem Begriff Pa- steurisierung bekannt.

Es ist inzwischen allgemein anerkannt, daß die Ernährung mit Muttermilch für einen Säugling nicht nur Vorteile bezüglich der Ernährung selbst, sondern auch immunologische Vorteile bietet, denn die Muttermilch enthält neben Eiweiß, Fett und Kohlenhy- draten unter anderem die Inhibine Lysozym, Laktoferrin, Neura- minsäure und spezifische Immunglobuline, vor allem sIgA. Aus diesem Grund sind gestillte Kinder gegenüber Infektionen und Allergenen in geringerem Maße anfällig als nicht gestillte Kin- der.

Gerade für Frühgeborene hat daher die Ernährung mit Muttermilch so große Vorteile, daß unter anderem aus diesem Grund in den 80er Jahren Milchbanken eingerichtet wurden, in denen Mutter- milch aufbereitet und für eine spätere Verwendung gelagert wur- de. Die Milch verschiedener Spenderinnen wurde dazu gepoolt und dann einer Hitzeinaktivierung bzw. einer Kryoinaktivierung unterzogen. Aus Sicherheitsgründen ist das System der Milchban- ken heute weitgehend wieder aufgegeben worden, da zur Vermei- dung von Infektionen eine eindeutige Zuordnung zwischen dem Säugling und der Muttermilch der eigenen Mutter unabdingbar ist. Auf diese Weise soll eine unkontrollierte Übertragung von Infektionskrankheiten wie HIV, Hepatitis etc. vermieden werden.

Für die Ernährung von Frühgeborenen bedeutet dies nun jedoch, daß die Muttermilch der eigenen Mutter abgepumpt, aufbereitet und im Krankenhaus und/oder zuhause zwischengelagert werden muß, denn aufgrund der Unreife und der geringen Nahrungsaufnah- mekapazität und der damit verbundenen häufigen Fütterung können diese Frühgeborenen nicht gestillt werden. Hinzu kommt, daß Frühgeborene häufig drei bis vier Monate in der Klinik verblei- ben, während die Mütter schon kurze Zeit nach der Geburt ent- lassen werden, so daß im Krankenhaus entsprechende Vorräte an Muttermilch vorhanden sein müssen, um eine kontinuierliche Er- nährung der Frühgeborenen sicherzustellen. Technisch bedeutet dies, daß auch kleine Volumina von z. B. 20 ml aufbereitet und individuell gelagert werden müssen.

Während durch Verzicht auf Stillen die vertikale Transmission von HIV, Hepatitis und weiteren Infektionskrankheiten be- herrschbar geworden ist, gilt dies nicht für Infektionen mit dem Zytomegalie-Virus (im folgenden : CMV), die gegenwärtig zur häufigsten Pränatalinfektion zählt. Bei ca. 10-20 % aller Neugeborenen kommt es darüber hinaus zu einer perinatalen In- fektion durch Muttermilch. Der Krankheitsverlauf kann sehr schwer und insbesondere bei Frühgeborenen letal sein.

Vochem et al., Transmission of cytomegalovirus to preterm in- fants through breast milk, Pediatr Infect Dis J, 1998, Band 17, Seiten 53-58, berichten in diesem Zusammenhang über eine klini- sche Studie, in der das Risiko der Übertragung von CMV durch Muttermilch auf Kinder mit einem Geburtsgewicht unterhalb 1500 g oder einem Schwangerschaftsalter von weniger als 32 Wo- chen untersucht wurde. Ca. 50 % der Mütter waren CMV- seropositiv, wobei 85 % dieser seropositiven Mütter CMV über die Muttermilch absonderten, wie durch eine Untersuchung der zellfreien Molke nachgewiesen werden konnte. Im Laufe der Stu- die infizierte sich mehr als die Hälfte der von CMV- seropositiven Müttern gestillten Frühgeborenen mit CMV.

Aufgrund der Tatsache, daß die Autoren infizierte Muttermilch als einzige Quelle für die Übertragung von CMV identifizieren konnten, schlagen sie vor, CMV in abgepumpter Muttermilch zu inaktivieren, um die Übertragung zu verhindern und eine frühe und damit häufige symptomatische Infektion bei Frühgeborenen zu vermeiden.

Neben den klassischen Methoden der Holder-Pasteurisierung und der Kryoinaktivierung schlagen die Autoren vor, infizierte Mut- termilch kurzzeitig für zehn Sekunden auf 72°C zu erhitzen, oh- ne jedoch das von ihnen angewandte Verfahren genau zu beschrei- ben. Sie berichten, daß sie nach einer derartigen Kurzzeiter- hitzung keine Spuren von infektiösen Viren mehr nachweisen konnten.

In einer frühen Studie beschreiben Goldblum et al., Rapid high- temperature treatment of human milk, The Journal of Pediatrics, 1984, Band 104, Seiten 380-385, eine Kurzzeit-Pasteurisierung von Muttermilch, durch die die Zahl von Bakterien und CMV stark reduziert wurde, ohne viele der für die Immunologie und Ernäh- rung wichtigen Inhaltsstoffe zu zerstören. Gemäß dem bekannten Verfahren wird Milch von mehreren Spenderinnen gepoolt (1,2 bis 2 1) und mittels eines Plattenwärmetauschers aufgeheizt. Da der Wärmetauscher für die Behandlung großer Volumina von Kuhmilch ausgelegt war, wurde die gepoolte Humanmilch in einen kontinu- ierlichen Strom von sterilem destilliertem Wasser injiziert und für fünf Sekunden auf 72°C erhitzt, wobei die gewünschte Tempe- ratur in weniger als drei Sekunden erreicht wurde. Anschließend wurden die Proben innerhalb von drei Sekunden auf 2°C abge- kühlt.

Wegen der Verwendung eines in der Milchindustrie üblichen Gerä- tes mit dem erforderlichen hohen Probenvolumen wird das bekann- te Verfahren den eingangs erwähnten modernen Anforderungen nach der Behandlung kleiner Probenvolumina nicht gerecht.

In einer weiteren frühen Arbeit berichten Dworsky et al., Per- sistence of cytomegalovirus in human milk after storage, The Journal of Pediatrics, 1982, Band 101, Seiten 440-443, daß eine Holder-Pasteurisierung, also eine Erhitzung der Milch für 30 Minuten auf 62°C zu einer vollständigen Eliminierung von CMV in CMV-seropositiver Milch führt. Sie erwähnen jedoch, daß diese Behandlung nicht ideal ist, wenn die immunologischen Eigen- schaften der Milch erhalten werden sollen. Die daher untersuch- te Pasteurisierung mit einer niedrigeren Temperatur, nämlich 56°C, zeigte jedoch keine zufriedenstellende Eliminierung von CMV aus infizierter Milch.

Ebenfalls nicht zufriedenstellende Ergebnisse erzielten die Au- toren mit einer Kryoinaktivierung, bei der die Proben über nacht bei-20°C gelagert wurden.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfin- dung, das eingangs erwähnte Verfahren sowie die eingangs er- wähnte Vorrichtung dahingehend weiterzubilden, daß die Milch auf einfach und schnell durchzuführende Weise auch in kleinen Mengen derart behandelt werden kann, daß infektiöse Mikroorga- nismen, insbesondere CMV, zuverlässig inaktiviert werden, wobei die erwünschten Inhaltsstoffe vorzugsweise größtenteils erhal- ten bleiben.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei dem eingangs erwähnten Verfahren dadurch gelöst, daß der Behälter zumindest während des Erhitzens derart in Bewegung gesetzt wird, daß sich an sei- ner Innenwand ein Milchfilm ausbildet.

Bei der eingangs erwähnten Vorrichtung wird diese Aufgabe er- findungsgemäß dadurch gelöst, daß zumindest eine Wärmequelle zum Aufheizen der Milch sowie eine Vorrichtung vorgesehen sind, um den Behälter in Bewegung, vorzugsweise in Rotation zu ver- setzen und den sich bewegenden Behälter der Wärmequelle für ei- ne bestimmte Zeitspanne auszusetzen.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, daß durch die Bewegung des Behälters während der Hitzeeinwir- kung die Entstehung von internen Temperaturgradienten verhin- dert wird, da das gesamte Milchvolumen gleichmäßig erhitzt wird. Dies bedeutet jedoch, daß keine Denaturierung von In- haltsstoffen stattfindet und ein Großteil der immunologischen Eigenschaften der Milch erhalten bleibt. Andererseits konnten die Erfinder eine vollständige Inaktivierung von infektiösen Mikroorganismen, insbesondere von CMV sowie auch von z. B.

Staphylococcus aureus feststellen. Auch ein Einsatz im Veteri- närbereich z. B. in zoologischen Gärten und bei seltenen Säuge- tieren ist möglich.

Das neue Verfahren sowie die neue Vorrichtung sind darüber hin- aus besonders für sehr kleine Milchmengen geeignet, denn eine lokale Überhitzung der Milch wird durch die Bewegung des Behäl- ters verhindert.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die Milch für höchstens ca. 20 Se- kunden auf oberhalb von mindestens ca. 65°C erhitzt wird, wobei der Behälter zumindest während des Erhitzens vorzugsweise in Rotation versetzt wird mit einer Drehzahl oberhalb von ca.

150 U/min, vorzugsweise oberhalb von ca. 250 U/min, weiter vor- zugsweise von ca. 300 U/min.

Die Erfinder haben festgestellt, daß derartige Rotationsge- schwindigkeiten zur Ausbildung eines sehr gleichmäßigen Milch- filmes an der Innenseite des Behälters führen, wobei die einge- setzten Temperaturen und Zeiten für eine garantierte Eliminie- rung selbst hoher Virusdosen in kleinen individuellen Milchmen- gen sorgen.

Zwar wäre es auch möglich, die Milch in dem Behälter durch Rüh- ren selbst in Bewegung zu versetzen, die mechanische Agitation der Milch könnte jedoch zu einer Zerstörung der Milchzellen- Struktur führen, was bei einer Bewegung, vorzugsweise Rotation des Behälters, so nicht der Fall ist.

Allgemein ist es bevorzugt, wenn der Behälter/die Muttermilch zum Aufheizen für eine erste Zeitspanne einer auf eine erste Temperatur eingestellten ersten Wärmequelle, dann für eine zweite Zeitspanne einer auf einer zweiten Temperatur befindli- chen zweiten Wärmequelle und schließlich zum Abkühlen für eine dritte Zeitspanne einer auf eine dritte Temperatur eingestell- ten dritten Wärmequelle ausgesetzt wird.

Bei diesem Ausführungsbeispiel ist von Vorteil, daß sich die Aufheiz-und Abkühlgeschwindigkeit der Milch individuell so einstellen läßt, daß eine Denaturierung von Inhaltsstoffen durch sprungartige Temperaturänderungen vermieden wird. Auf op- timale Weise ist so eine langsame Anwärmphase wählbar, die auch bei kleinen Milchmengen für eine schonende und gleichmäßige Aufheizung sorgt.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die erste und/oder drit- te Wärmequelle ein Wasserbad aufweisen, in das der bewegte Be- hälter eingetaucht wird.

Auch diese Maßnahme sorgt für eine gleichmäßige Temperatur in der behandelten Milch. Zwar wäre es auch denkbar, die Milch über Kühl-/Heizschlangen zu temperieren, insbesondere bei klei- nen Milchmengen wurde dies jedoch zu lokalen Temperaturgradien- ten und damit zu einer Denaturierung von Inhaltsstoffen führen.

Darüber hinaus sind Kühl-/Heizschlangen schwer zu sterilisie- ren, wobei dieses Problem bei den nur außen mit den Behältern in Kontakt gelangenden Wasserbädern nicht auftritt.

Andererseits ist es bevorzugt, wenn die erste Wärmequelle eine Heißluftquelle und/oder die dritte Wärmequelle eine Kaltluft- quelle ist, in deren jeweiligen Luftstrahl der bewegte Behälter eingetaucht wird, wobei vorzugsweise der jeweilige Luftstrahl in eine Kammer mit einer Öffnung zum Eintauchen des bewegten Behälters geleitet wird. Der Behälter wird so in ein Luftbad eingetaucht.

Auch auf diese Weise läßt sich eine gleichmäßige Temperatur in der behandelten Milch erzeugen. Im einfachsten Falle ist die Heißluftquelle eine Luftquelle, beispielsweise ein Gebläse, dessen Luftstrahl längs eines Heizwiderstandes geleitet wird.

In ähnlichem Aufbau kann auch die Kaltluftquelle ein Gebläse umfassen, dessen Luftstrahl über z. B. ein Pelltierelement ge- leitet wird, ein Halbleiterelement, das durch Beaufschlagung mit Strom an einer Seite tiefe Temperaturen erzeugt. Wenn statt der Wasserbäder Luftquellen verwendet werden, wird das Problem des tropfenden Wassers beseitigt, das der aus dem jeweiligen Wasserbad ausgehobene Behälter"mitschleppt". Dabei ist z. B. auch eine Variante denkbar, bei der die erste Wärmequelle durch eine Heißluftquelle und die dritte Wärmequelle durch ein ge- kühltes Wasserbad gebildet wird.

Weiter ist es bevorzugt, wenn die zweite Wärmequelle die Umge- bungsluft ist.

Diese Maßnahme ist konstruktiv von Vorteil, denn auf ein drit- tes Wasserbad kann nach Erkenntnis der Erfinder verzichtet wer- den, so daß das neue Verfahren in einer Vorrichtung mit ledig- lich zwei Wasserbädern durchgeführt werden kann.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die erste Temperatur größer als 80°C ist und vorzugsweise ca. 85-90°C beträgt, die zweite Tem- peratur kleiner als 10°C ist und vorzugsweise ca. 2-4°C be- trägt, die erste Zeitspanne größer als 15 Sekunden ist und vor- zugsweise ca. 20-25 Sekunden beträgt, die zweite Zeitspanne kleiner als 15 Sekunden und vorzugsweise ca. 5-10 Sekunden be- trägt, sowie die dritte Zeitspanne größer als 10 Sekunden ist und vorzugsweise ca. 20 Sekunden beträgt.

Die Erfinder der. vorliegenden Anmeldung haben erkannt, daß bei diesen Temperaturen und Zeitspannen nicht nur die Eliminierung selbst sehr hoher Virusdosen in kleinen Milchmengen von 20 ml garantiert wird, sondern daß die weitgehende strukturelle Inte- grität der Milchzellen gewährleistet wird, was durch mikrosko- pische Prüfung mittels Vitalfärbung und LDH-Freisetzung in Mol- ke nachgewiesen wurde. Ferner zeigt das neue Verfahren keine Reduktion des Gesamteiweisses und des Albumins in der Molke an.

Zwar ist die Aktivität der Alkalischen Phosphatase und der Li- pase temperatursensitiv, die Lipaseaktivität, der eine Schlüs- selrolle bei der Fettresorption im Frühgeborenenintestinum zu- geschrieben wird, ist bei dem neuen Verfahren jedoch um ca. den Faktor 3 größer als nach einer Holder-Pasteurisierung (30 Minu- ten, 62°C). Darüber hinaus wird die Konzentration der Vitamine B12 und Folsäure nicht reduziert, wobei ferner die Konzentrati- on von sIgA nur geringfügig reduziert wird.

Insgesamt bedeutet dies, daß im Gegensatz zu den aus der Lite- ratur bekannten Verfahren durch das neue Verfahren auch kleine Mengen an Milch auf sehr schnelle, aber dennoch schonende Weise zuverlässig so aufbereitet werden können, daß eine vollständige Inaktivierung insbesondere von CMV erfolgt, wichtige Inhalts- stoffe jedoch erhalten und größtenteils aktiv bleiben.

Dabei ist es dann noch bevorzugt, wenn der Behälter ein Glas- kolben, vorzugsweise ein Glasrundkolben ist.

Hier ist von Vorteil, daß derartige Glaskolben leicht zu steri- lisieren und preiswert sind, wobei ferner aufgrund der begrenz- ten Wärmeleitfähigkeit des Glases ein lokales Aufheizen der aufgenommenen Milch beim Eintauchen in das Heizbad verhindert WO 00/74494 wird, was ebenfalls auf vorteilhafte Weise eine unerwünschte Denaturierung gerade bei kleinen Milchmengen vermeidet.

Weiter ist es noch bevorzugt, wenn der Behälter ein Volumen aufweist, das mindestens ca. zehnmal größer ist als das Volumen der Milch.

Hier ist von Vorteil, daß sich insbesondere in einem rotieren- den Behälter bei derartigen Volumenverhältnissen ein gleichmä- ßiger, günstig verteilter Milchfilm ausbildet, der die be- schriebene zuverlässige Inaktivierung unter Beibehaltung der Schutzwirkung und Ernährungsfunktion der Milch erlaubt.

Allgemein ist es noch bevorzugt, wenn die Milch bezüglich ihrer Temperatur überwacht wird.

Auf diese Weise ist es möglich, die Verweildauer in den einzel- nen Wärmequellen im Rahmen einer Rückkopplung zu regeln, so daß nicht zwingend mit fest voreingestellten Zeiten gearbeitet wer- den muß. Dies hat z. B. dann Vorteile, wenn Milch unterschiedli- cher Menge und unterschiedlicher Konsistenz nacheinander gemäß dem neuen Verfahren behandelt werden soll. Das Verfahren sowie die Vorrichtung adaptieren sich auf diese Weise sozusagen auto- matisch an die jeweils zu behandelnde Milchmenge.

Bei der neuen Vorrichtung ist es noch bevorzugt, wenn sie eine horizontal und vertikal verfahrbare Aufnahme für den Behälter umfaßt, die einen rotierenden Antrieb für den Behälter auf- weist, wobei vorzugsweise an der Aufnahme eine Rasthalterung für den Behälter, weiter vorzugsweise für einen Kolbenhals ei- nes Glaskolbens vorgesehen ist. Der Temperaturfühler ist dabei nicht mitrotierend, vorzugsweise federnd an der Aufnahme befe- stigt.

Durch die Rasthalterung ist ein schnelles Montieren und Demon- tieren des Glaskolbens in der Vorrichtung möglich. Infolge des nicht mitrotierend angeordneten Temperaturfühlers wird die Tem- peratur der Milch nicht nur an einer Stelle im Behälter, son- dern über dem gesamten Umfang des Behälters gemessen, was zu einer Temperaturmittelung führt. Wegen der federnden Anordnung des Temperaturfühlers an der Aufnahme ist vorteilhafterweise sichergestellt, daß es zu keinen Beschädigungen des Temperatur- fühlers kommt, wenn dieser an der Behälterinnenwand anliegt und der rotierende Behälter nicht exakt rotationssymmetrisch ist.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der bei- gefügten Zeichnung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach- stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinatio- nen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

In den Figuren sind Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt. Es zeigen : Fig. 1 ein erstes Ausführungsbeispiel der neuen Vorrichtung in stark schematischer Seitenansicht ; Fig. 2 ein zweites Ausführungsbeispiel der neuen Vorrich- tung in Seitenansicht ; Fig. 3 eine vergrößerte Seitenansicht einer Aufnahme für einen Glaskolben ; und Fig. 4 eine schematische Seitenansicht eines bei den Vor- richtungen der Fig. 1 und 2 verwendbaren Luftbades.

Beispiel 1 : Kurzzeithitzeinaktivierung von Muttermilch Nativmilch von stillenden, CMV-seronegativen Müttern wird abge- pumpt und in 20 ml-Proben aliquotiert. Zu dieser Probe wird ei- ne definierte Virusmenge vom Virusstamm CMV AD 169 zugesetzt, um Milchproben mit definierter Viruslast herzustellen.

Zu diesem Zweck wurden zwei virushaltige Lösungen erzeugt, die von einem Kulturüberstand nach Zentrifugation 1000 x g ausge- hen : a) 5 ml des Kulturüberstandes werden direkt bei-70°C kryo- konserviert. b) Der Kulturüberstand wird in 1,5 ml-Hütchen gegeben und nach einer Viruspelletierung (30 min bei 25000 x g) 1,4 ml Überstand verworfen. Das Pellet wird jeweils in 100 ul Überstand resuspendiert, gepoolt und in 100 p1 Proben ebenfalls bei-70°C kryokonserviert.

Für beide Lösungen betrug die TCID50/100 p1 (Tissue Culture In- fective Dose 50 %), also die Verdünnungsstufe, bei der noch 50 % der angeimpften Mikrokulturen (mindestens acht Replika) einen positiven Virungsnachweis ergeben, jeweils 10-5876.

Darüber hinaus wurde die Muttermilch einer CMV-seropositiven stillenden Mutter getestet.

Die so erzeugten Proben werden zum einen in einer in der einzi- gen Figur gezeigten Vorrichtung 10 einer Kurzzeithitzebehand- lung unterzogen.

Zu diesem Zweck umfaßt die Vorrichtung 10 zwei Wasserbäder 12 und 13, über denen sich auf zwei Pfosten 14,15 abgestützt ein Portalbalken 16 erstreckt. An dem Portalbalken 16 ist ver- schiebbar ein Wagen 17 gelagert, der über einen Motor 18 in Richtung eines Doppelpfeiles 19 verfahrbar ist.

An dem Wagen 17 ist eine in Richtung eines Doppelpfeiles 20 hö- henverstellbare Stange 21 vorgesehen, die in ihrer Hubbewegung über einen Motor 22 gesteuert wird, der ebenfalls an dem Wagen 17 gelagert ist.

An ihrem unteren Ende trägt die Stange 21 einen Drehhalter 23, in den ein Glaskolben 24 eingespannt ist. An ihrem oberen Ende weist die Stange 21 einen Motor 25 auf, über den der Glaskolben um seine Hochachse 26 in Rotation versetzt werden kann, was durch einen Pfeil 27 angedeutet ist.

An der Stange 21 ist ferner noch ein Temperaturfühler 28 befe- stigt, der in den Glaskolben 24 hineinragt und ggf. federnd an dessen Innenwand 29 anliegt.

In dem Glaskolben 24 befindet sich eine wie oben vorbereitete Probe zu behandelnder Muttermilch 32, die ein Volumen von ca. 20 ml aufweist, wobei bei 33 das Volumen im Stillstand des Glaskolbens 24 angedeutet ist.

Wenn der Glaskolben 24 durch den Motor 25 in Rotation versetzt wird, bildet die Muttermilch an der Innenwand 29 des Glaskol- bens 24 einen bei 34 angedeuteten Milchfilm aus, der etwa die Hälfte der Innenwand 29 bedeckt. Diese Ausbildung des Milchfil- mes wird dadurch erreicht, daß der Glaskolben 24 ca. das zehn- fache Volumen wie die Muttermilch 32 aufweist, im vorgegebenen Fall ein Volumen von 250 ml (Glasrundhalskolben mit Schliff), der mit einer Drehzahl von ca. 300 U/min rotiert.

Über die Motoren 18 und 22 kann der Glaskolben 24 jetzt in ei- nes der beiden Wasserbäder 12,13 eingetaucht werden, wobei die Eintauchtiefe so gewählt wird, daß der Glaskolben 24 bis zu seinem Hals 35 in das Wasser des jeweiligen Wasserbades 12 oder 13 eingetaucht wird.

Die Ablaufsteuerung erfolgt über eine Steuerschaltung 36, mit der sowohl die Motoren 18,22 und 25 als auch der Temperatur- fühler 28 verbunden sind, der im Experimentierstadium die je- weilige Temperatur der Muttermilch anzeigt.

Es sei in diesem Zusammenhang erwähnt, daß beim Einsatz der neuen Vorrichtung in einer Klinik auf einen Temperaturfühler verzichtet werden kann, da eine Vielzahl von Experimenten er- wiesen hat, daß bei vorgegebenen Temperaturen und Verweildauern der Temperaturverlauf in der Muttermilch 32 reproduzierbar ist.

Der Verzicht auf den Temperaturfühler 28 hat darüber hinaus den Vorteil, daß keine besonderen Maßnahmen zur Sterilisierung des Temperaturfühlers verwendet werden müssen, um eine Kreuzkontamination zwischen nacheinander behandelten Milchpro- ben zu verhindern. Der Glaskolben 24 kann darüber hinaus auf einfache Weise sterilisiert werden, so daß insgesamt die Gefahr der Kreuzkontamination vermieden wird.

Das neue Verfahren läuft nun derart ab, daß zunächst in einen frischen Glaskolben 24 die gewünschte Menge von Muttermilch, in dem gewählten Beispiel also 20 ml eingegeben wird. Der Glaskol- ben 24 wird dann in den Drehhalter 23 eingespannt und mittels des Motors 25 mit einer Drehzahl von ca. 300 U/min in Rotation versetzt, so daß sich der Milchfilm 34 ausbildet.

Dann wird durch Verfahren der Motoren 18 und 22 der Glaskolben 24 zum Zwecke des raschen Wärmeaustausches bis zu seinem Hals 35 in das Wasserbad 12 eingetaucht, das auf 85-90°C erhitzt ist.

Der Glaskolben 24 verbleibt für 20/25 Sekunden in dem Wasserbad 12 und wird dann automatisch wieder ausgehoben. Die Temperatur des Milchfilmes liegt dann bei 68/70°C.

Daraufhin wird der immer noch rotierende Glaskolben 24 für fünf Sekunden der Luft ausgesetzt, wobei durch den Wärmeaustausch mit der Umgebung der Milchfilm eine Zieltemperatur von ca. 72°C erreicht.

Danach wird der Glaskolben 24 dann in das Wasserbad 13 einge- taucht, das eine Temperatur von 2-4°C aufweist. Hier verbleibt der immer noch rotierende Glaskolben 24 für ca. 20 Sekunden, woraufhin die Muttermilch 32 wieder eine Temperatur von ca.

30°C eingenommen hat.

Der ganze Inaktivierungszyklus dauert also lediglich ca. eine Minute, so daß die neue Vorrichtung auch für Kliniken geeignet ist, wo viele individuelle Milchproben nacheinander und ohne Gefahr der Kreuzkontamination hitzeinaktiviert werden müssen.

Da-wie bereits erwähnt-im Klinikalltag eventuell kein Tem- peraturfühler 28 erforderlich ist, bzw. der Temperaturfühler 28 nur zeitweise zur Überprüfung des Verfahrens verwendet wird, muß nach der Behandlung einer ersten Milchprobe lediglich der Glaskolben entnommen und durch einen neuen, mit einer neuen Milchprobe gefüllten Glaskolben ersetzt werden. Auf diese Weise können schnell nacheinander eine große Zahl von Milchproben in- aktiviert werden.

Die so behandelten Milchproben werden dann in kleinen Gefäßen wie z. B. kleinen Milchfläschchen aufbewahrt, woraufhin die be- nutzten Glaskolben gereinigt und sterilisiert werden, so daß sie wieder einsetzbar sind.

Es sei noch erwähnt, daß bei einer anderen Milchmenge ein ent- sprechend größerer Glaskolben und/oder eine veränderte Drehzahl eingesetzt werden können, wobei sich die neuen Werte mit Hilfe des Temperaturfühlers jedoch leicht ermitteln lassen.

Die Vorrichtung 10 ist darüber hinaus nicht nur für den Einsatz in einer Klinik geeignet, sondern auch von Müttern zuhause ein- setzbar. Darüber hinaus wird durch das Verfahren nicht nur die CMV-Infektiosität ausgeschlossen, auch andere infektiöse Mikro- organismen, wie z. B. Staphylococcus aureus, können inaktiviert werden.

Die Ergebnisse der beispielhaft durchführten Inaktivierungen werden unten in den Beispielen 4 und 5 wiedergegeben.

In Fig. 2 ist eine weitere Vorrichtung 40 gezeigt, die zur Be- handlung von Milch geeignet ist.

Die Vorrichtung 40 weist ein Grundgestell 41 mit Stellfüßen 42 auf. Am Grundgestell 41 ist eine Vertikalschiene 43 angeordnet, an der ein Querträger 44 vertikal beweglich gelagert ist. Par- allel zum Querträger 44 ist ein Wagen 45 horizontal verfahrbar.

An dem Wagen 45 ist der Glaskolben 24 derart befestigt, daß er in Rotation versetzt werden kann, wie es bereits im Zusammen- hang mit Fig. 1 beschrieben wurde.

In das Grundgestell 11 sind die schon aus Fig. 1 bekannten Was- serbäder 12 und 13 integriert. Mit Hilfe des horizontal ver- fahrbaren Wagens 45 sowie des vertikal verfahrbaren Querträgers 44 kann der Glaskolben 24 nacheinander zuerst in das Wasserbad 12 und dann in das Wasserbad 13 eingetaucht werden. Zumindest im abgesenkten Zustand wird der Glaskolben 24 rotiert, so daß die Milch einen dünnen Film an der Innenwand des Glaskolbens 24 bildet, wodurch ein optimaler Temperaturübergang von den Was- serbädern 12,13 zur Milch gewährleistet ist.

Im Grundgestell 41 ist außerdem eine Temperaturanzeige 46 inte- griert, auf der die mit dem Temperaturfühler 28 gemessene Tem- peratur angezeigt wird. Ferner ist in das Grundgestell 41 noch eine Bedieneinrichtung 47 integriert.

Der Glaskolben 24 ist an dem Wagen 45 mittels einer Aufnahme 48 befestigt, die in Fig. 3 im Ausschnitt gezeigt ist.

Die Aufnahme 48 erfaßt den Glaskolben 24, an dessen Halsbereich ein umlaufender Wulst 51 vorgesehen ist. Der Glaskolben 24 wird durch gelenkig gelagerte Klammern 52 gehalten, die den Wulst 51 übergreifen. Die Klammern 26 sind vertikal entgegen der Kraft einer Feder 53 bewegbar. Zur Befestigung des Glaskolbens 24 wird der Halsbereich mit dem Wulst 51 von unten gegen die Klam- mern 52 gefahren, die sich dadurch öffnen und den Wulst 51 auf- nehmen und festspannen. In diesem Zustand wird die Aufnahme 48 längs des Pfeiles 27 in Rotation versetzt, wodurch sich auch der Glaskolben 24 dreht und der Milchfilm an der Innenwand des Glaskolbens ausgebildet wird.

Zum Herausnehmen des Glaskolbens 24 wird ein innerer Bereich 54, an dem die Klammern 52 gelenkig gelagert sind, entgegen der Kraft der Feder 53 nach oben gedrückt, indem mittels der Hand am Griffbereich 55 manipuliert wird. Durch die Bewegung des in- neren Bereiches 54 nach oben öffnen sich die Klammern 52 und der Glaskolben 24 kann entnommen werden.

Statt der Wasserbäder 12,13 kann als Wärmequelle auch ein Luftbad 56 verwendet werden, das in schematischer, geschnitte- ner Seitenansicht in Fig. 4 dargestellt ist. Das Luftbad 56 um- faßt eine Kammer 57, an die eine Luftquelle 58 angeschlossen ist, die einen Luftstrahl 59 in das Innere der Kammer 57 lei- tet.

In der Kammer 57 ist eine obere Öffnung 61 vorgesehen, durch die hindurch der Glaskolben 24 in die Kammer 57 und damit in den Luftstrahl 59 eingetaucht werden kann.

Die Luftquelle 58 umfaßt einen Lüfter 62, der zusammen mit ei- nem Motor 63 ein Gebläse bildet, daß den Luftstrom 59 über ein Temperaturglied 64 leitet, das über Anschlüsse 65 mit Strom versorgt wird.

Das Temperaturglied 64 ist entweder ein Heizwiderstand oder ein Pelltierelement, so daß das Luftbad 56 das Wasserbad 12 und/oder das Wasserbad 13 ersetzen kann.

Beispiel 2 : Holder-Pasteurisierung Zum Vergleich wurden Proben, wie sie auch im Beispiel 1 verwen- det wurden, einer Holder-Pasteurisierung unterzogen, also je- weils für 30 Minuten auf 62,5°C erhitzt.

Die in den Beispielen 4 und 5 wiedergegebenen Ergebnisse zei- gen, daß auch durch diese Holder-Pasteurisierung jegliche Virusinfektion eliminiert wird, die Holder-Pasteurisierung führt jedoch zu einer deutlichen Reduktion des Laktoferrins, wobei verglichen mit der Kurzzeithitzeinaktivierung aus Bei- spiel 1 die Lipaseaktivität, der eine Schlüsselrolle bei der Fettresorption im Frühgeborenenintestinum zugeschrieben wird, ca. um den Faktor 3 geringer ist.

Beispiel 3 : Kryoinaktivierung Als weiterer Vergleich wurde mit Proben wie in den Beispielen 1 und 2 eine Kryoinaktivierung durchgeführt, die Proben wurden für 18 h/3d/lOd bei-20°C gelagert. Die von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung gemessene Rate der verbleibenden Infektiosität war auch bei zehntägiger Lage- rung bei-20°C immer noch 20 %, was deutlich höher ist als in der Literatur beschrieben. Die Erfinder der vorliegenden Anmel- dung führen dies darauf zurück, daß es den Meßmethoden bei den in der früheren Literatur beschriebenen Verfahren noch an der heute erreichbaren Empfindlichkeit gefehlt hat.

Beispiel 4 : Überprüfung der Inaktivierung Zum Nachweis der CMV-Infektiosität, der CMV-DNA und der CMV-RNA wird die Milch nach der Inaktivierung fraktioniert und für den Nachweis die zellfreie und fettarme Molkefraktion verwendet.

Hamprecht et al., Detection of cytomegalovirus DNA in human milk cells and cell free milk whey by nested PCR, Journal of Virological Methods, 1998, Band 70, Seiten 167-176, beschreiben den Vorteil der Verwendung der Molkefraktion gegenüber der be- handelten Nativmilch dahingehend, daß die Zytotoxizität der Na- tivmilch in Zellkultur die Meßergebnisse verfälscht.

Aus diesem Grund wurde für die Überprüfung der Inaktivierung die Molkepräparation nach Hamprecht et al., 1998, wie folgt verwendet : 1-2 ml der Muttermilch wird bei 400 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, die cremige Deckschicht wird ver- worfen und der trübe Überstand wird erneut bei 400 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Danach werden Zelltrümmer des Überstan- des durch Zentrifugation bei 3200 x g für 10 Minuten gesammelt und der sich ergebende Überstand durch einen Filter mit 0,22 pm Porengröße (Sartorius) gefiltert. Die gefilterte Molke wird fur in vitro Zellkulturassays verwendet.

Als Zellen werden humane Vorhautfibroblasten (HFF) eingesetzt mit einer Adhärenzzeit von 4-5 Stunden. Als Kulturträger dienen Mikrotiterplatten mit 2, 5 x 104 HFF/Mikrokultur/100 p1 MEM-5 % FCS als Medium. Je Probe wurden acht Replika eingesetzt.

Je 100 p1 der individuellen Molkepräparatiön wurden zur Pro- beninokulation verwendet, die Adsorptionszeit betrug 2 h.

Vier Mikrokulturen wurden zum Nachweis von CMV-IEA (Immediate Early Gene Antigen ; Phosphoprotein pp72) eingesetzt. Dieses Vi- rusantigen wird zum Nachweis der Virusinfektiosität verwendet, es ist bereits 2-4 Stunden nach Virusinfekt in Fibroblasten Zellkernen nachweisbar.

Vier weitere Mikrokulturen dienten zum Nachweis von später CMV- RNA pp67 mRNA mittels einer Nucleic Acid Sequence-based Ampli- fication, kurz NASBA, wie beschrieben von Compten, Nature, 350 : 91-92,1991. Durch dieses Verfahren ist es möglich, RNA in Ge- genwart von DNA zu amplifizieren.

Nach einer Kurzzeit-Kultur (18 Stunden) lassen sich singuläre, diffus verteilte infizierte Zellkerne in der Mikrokultur nach- weisen, sofern eine Infektion vorhanden ist.

Bei einer Langzeitkultur (5 d) bilden infizierte Zellkerne Plaques aus, die sich aus jeweils einer infizierten Fibrobla- stenzelle entwickeln. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Versuche aus den Beispielen 1-3 jeweils unter Angabe des Titers der Vi- ruslösung, der Art der Inaktivierung, der Dauer des Zellkultu- rassays, der Anzahl der infizierten Zellen, der nachgewiesenen IE-DNA sowie der nachgewiesenen pp67 m-RNA, die im Gegensatz zur CMV-Infektion für eine CMV-Erkrankung steht. ProbeInaktivierungAssayIEA+/GesamtIE-DNApp67mRNATCID50/100µ l -15h76/76./../.103ZK-Kontrolle -15h22/103./../.Molkespiked 10"72°C15h0/116./../.Molkespiked Spender Molke 5d 4/104 CMV-Molke 10"72°C 5d 0/120./../. seropositivMolke 20"72°C 5d 0/124./../. 104 ZK-Kontrolle 6d + + Molkespiked 6d Konfl. Plaques ++ 5"72°C6d#/well+-Molkespiked 10"72°C6d#/well+-Molkespiked Molke62°C6d#/well+-30' -6d-++103ZK-Kontrolle Molke spiked 6d 6 Plaques/well++ 5"72°C6d#/well+-Molkespiked Molke72°C6d#/well+-10" -5d324/324./../.104ZK-Kontrlie Molke spiked 5d 24/77./../. Molkespiked3d-20°C 5d 45/333./../. Molkespiked! Od-20°C5d73/361./../. 104 ZK-Kontrolle 18h- Molke spiked 18h-20°C 18h 220/well./../. Tabelle 1 : Ausgewählte Versuchsergebnisse zu den Beispie- len 1-3 ZK-Kontrolle = Zellkultur-Kontrolle (ohne Probe) Molke spiked = mit CMV AD 169 versetzte Molke Sowohl bei der Holder-Pasteurisierung als auch bei der erfin- dungsgemäßen Kurzzeithitzeinaktivierung sind im Gegensatz zur Kryoinaktivierung weder Virusantigen (IEA) noch späte Virus-RNA (pp67 mRNA) mit der sehr empfindlichen NASBA-Methode nachweis- bar. Virus-DNA wird jedoch nachgewiesen, deutet jedoch nicht auf eine verbleibende Infektion sondern lediglich auf die Hit- zestabilität der viralen DNA hin.

Dies bedeutet, daß durch die Kurzzeitinaktivierung die Infek- tiosität effektiv eliminiert wird.

Beispiel 5 : Biochemische Parameter Zur Charakterisierung der in den Beispielen 1 bis 3 beschriebe- nen Inaktivierungsverfahren wurden zusätzliche biochemische Pa- rameter erfaßt, die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabel- le 2 angegeben. KontrolleelHolder 5"72°C10"72°C18h-20°C3d-20°C10d-20°C30'62°CMolke+ 169CMVAD unbehandelt CMV 1EA __ Kerne#/well#/well220/well53/well32/well#/well157/well Plaques(6d)konfluentkonfluent35Plaques/29Plaques/#/well#/wel l wellwell CMV-IE-DNA nPCR(18h/6d)+++++++ CMVpp67mRNA+ NASBA--?+-+ Gesamt-Eiweiß g/dl 1,071,071,071,061,071,051,07 Albumin g/dl0,270,370,370,27 0,280,270,37 Alkalische Phosphatase #303230#28# LDH 783846254322316188 un Amylase 1242 117312151290128112091122 U/l Lipase2685535625832763269718 U/l VitaminB12 ng/dl42424343-4444 Folsäure ng/dl550697735875--1045 slgA mg/l170012001200170017001700 1200 Tabelle 2 : Biochemische Parameter von ausgewählten Ergeb- nissen der Beispiele 1-3 Inokulation : 104 TCID50/100 µl AD 169 in Nativmilch Assay : 18 h (diffuse CMV-IEA-Kernfärbung) ; 6d (Plaquebildung) Das Kurzzeithitzeinaktivierungsverfahren zeigt keine Reduktion des Gesamteiweisses und des Albumins in der Molke an. Tempera- tursensitiv ist dagegen die Aktivität der Alkalischen Phospha- tase und der Lipase. Die Lipaseaktivität, der eine Schlüssel- rolle bei der Fettresorption im Frühgeborenenintestinum zuge- schrieben wird, ist jedoch bei dem neuen Verfahren ca. um den Faktor 3 größer als nach der Holder-Pasteurisierung. Der Lipa- seaktivität wird ferner eine wichtige antivirale Schutzwirkung zugeschrieben, so daß das neue Verfahren deutliche Vorteile ge- genüber der Holder-Pasteurisierung aufweist.

Die Konzentration der Vitamine B12 und Folsäure wird durch das neue Verfahren nicht reduziert. Ferner zeigt sich, daß sIgA weitgehend hitzestabil ist, jedoch durch beide Hitzeinaktivie- rungsschritte geringfügig reduziert wird. Die Kryoinaktivierung beeinflußt den sIgA-Spiegel dagegen nicht.