Verfahren und Vorrichtungen zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz-Reaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger direkt oder indirekt gebundenen Molekülen Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz-Reaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger direkt oder indirekt gebundenen Molekülen. Dabei wird hier der Begriff"Eigenschaften"im weitesten Sinne verstanden und soll nicht nur die für bestimmte Moleküle charakteristischen Eigenschaften, wie zum Beispiel deren Massenspektrogramm, umfassen, sondern zum Beispiel auch die Fähigkeit, überhaupt -nämlich durch das bloße Vorhandensein-eine bestimmte Reaktion zu zeigen, so daß die Erfindung also auch solche Verfahren und Vorrichtungen betrifft, bei denen aus einer bestimmten optischen Reaktion zunächst nur auf das bloße Vorhandensein eines Stoffes-nicht aber dessen Art-geschlossen werden soll (wobei dann die Art des Stoffes zum Beispiel aus dessen Position auf dem Träger ermittelt wird).

Die untersuchten Moleküle sind dabei Bestandteil von auf dem Träger gebundenen biologischen Strukturen, wie insbesondere Zellen, Moleküle, Zellteilen, Zellausläufern oder Geweben, oder sie sind an auf dem Träger immobilisierte biologische Strukturen gebunden. Bei den zu untersuchenden Molekülen handelt es sich um alle Arten von in der Biologie, der Pharmazie und der Medizin besonders relevanten Moleküle, also z. B.

Peptide, D-Peptide, L-Peptide und Mischungen daraus, natürlich vorkommende Oligonukleotide, ihre Spiegelbilder und Mischungen daraus, künstlich derivatisierte Oligonukleotide, wie sie zum Aufbau von Aptameren eingesetzt werden, Oligosac- charide und Modifikationen der genannten Moleküle. Insbesondere modular aufgebaute Oligomere, die nicht in der Natur vorkommen, können dabei besondere pharmakologi- sche Relevanz besitzen. Besonders seien in diesem Zusammenhang auch mithilfe chemischer Kombinatorik herzustellende nichtnatürliche Substanzen erwähnt, die als

Liganden von biologischen Molekülen eingesetzt werden können, insbesondere organische Verbindungen, Steroidderivate usw. Aus einer Vielzahl solcher Moleküle können spezifische Binder für ein natürlich vorkommendes Molekül isoliert werden, die die Aktivität dieses Moleküls modifizieren. Da diese Binder dann jedoch oft von natürlich vorkommenden Verdauungsenzymen nicht gespalten werden können, eignen sie sich in besonderem Maße für den Einsatz als Therapeutikum.

Solche Verfahren und Vorrichtungen sind in unterschiedlichster Form bekannt, weisen jedoch sämtlich bestimmte Nachteile auf. So benötigen die bekannten Verfahren zu ihrer Durchführung aufwendige und teure Spezialgeräte und sind vergleichsweise langsam im Auslesen eines Lumineszenzsignals. Insbesondere wenn-was, wie nachfolgend noch erläutert wird, aus unterschiedlichen Gründen vorteilhaft ist-sehr viele unter- schiedliche Molekülgruppen auf einem gemeinsamen Träger angeordnet und einzeln zu untersuchen sind, muß zum Anfahren der einzelnen Molekülgruppen eine sehr aufwendige Mechanik verwendet werden, die nicht nur teuer und störanfällig ist, sondern die auch bei höchster Präzisionsarbeit immer Fertigungstoleranzen aufweist, die um etliche Größenordnungen höher liegen, als die für eine Untersuchung ausreichende minimale Größe der Molekülgruppen. Dadurch ist die Anzahl der auf einem Träger maximal unterzubringenden Moleküle bzw. Molekülgruppen bei den bekannten Verfahren und Vorrichtungen begrenzt und liegt etwa in der Größenordnung einiger 105 Molekülgruppen. Insbesondere für bestimmte Blutserums-oder DNA-Analysen wäre es jedoch wünschenswert, wenn auf einem Träger etwa 108 bis 109 Moleküle aufgebracht und untersucht werden könnten.

Zum Aufbringen der Moleküle auf die jeweiligen Träger, insbesondere auf sogenannte "Diagnostik-Chips", sind lithographische Methoden bekannt, wobei jedoch-ähnlich wie bei der späteren Untersuchung-die schwierige exakte Zuordnung von Molekül und wiederholbar gezielt anfahrbarer Trägerposition die Zahl der maximal aufbringbaren Moleküle begrenzt, denn es genügt nicht, sehr viele unterschiedliche Moleküle dicht gepackt auf einem Träger anzuordnen, ohne jedoch wiederholbar genau zu wissen,

welche Moleküle sich an welcher Position auf dem Träger befinden. Insbesondere ist es bei den bekannten Verfahren und Vorrichtungen ein Problem, sehr viele Lumi- neszenzreaktionen auf einem Träger in angemessener Zeit und gleichzeitig auch sehr genau auszulesen. Bei den mit den hier betroffenen Verfahren und Vorrichtungen vorteilhaft durchführbaren Färbeuntersuchungen, bei denen ein zu untersuchender Stoff auf den Träger, auf dem zuvor bereits unterschiedliche Moleküle verankert worden sind, aufgebracht wird, sollen Rückschlüsse auf die in dem zu untersuchenden Stoff vorhandenen Substanzen, wie z. B. bestimmte Antikörper in einem Blutserum, daraus gezogen werden, mit welchen der auf dem Träger verankerten Moleküle der Stoff bzw. dessen Bestandteile Bindungen eingegangen sind, so daß man sehr genau wissen muß, welches Molekül sich wo auf dem Träger befindet.

Schließlich können bei den bekannten Vorrichtungen und Verfahren die einmal aufgebrachten Moleküle in der Regel gar nicht oder nur mit sehr großem Aufwand wieder abgelöst werden. Insbesondere wenn sich auf dem Träger eine sehr große Zahl von Molekülen (eine"Molekülbibliothek") befindet, die mit einem zu untersuchenden Stoff oder einem Gemisch von Stoffen (einer zweiten"Molekülbibliothek", zum Beispiel einem Proteingemisch) in Verbindung gebracht worden ist, wäre es oftmals wünschens- wert, die Bindungspartner aus der zweiten Molekülbibliothek, also die Moleküle, die Bindungen mit Molekülen der ersten Molekülbibliothek eingegangen sind, gezielt von dem Träger ablösen und einer weiteren Untersuchung unterziehen zu können. Dies ermöglichte dann die parallele Identifizierung von Bindungspaaren aus den beiden Molekülbibliotheken, wobei der Bindungspartner aus der ersten Molekülbibliothek jeweils durch seine Position auf dem Träger bekannt ist, während der Bindungspartner aus der zweiten Molekülbibliothek nach der gezielten Ablösung von dem Träger identifiziert werden kann. Besonders vorteilhaft wäre es dabei, wenn zunächst diejenigen trägergebundenen Moleküle identifiziert werden könnten, die überhaupt Moleküle aus der zweiten Molekülbibliothek gebunden haben.

Aus der deutschen Offenlegungsschrift 197 52 085 A1 ist ein Probenträger für die mikroskopische Untersuchung einer Vielzahl von Proben mittels Fluoreszenz- Spektroskopie bekannt, bei welchem in einer der Seitenflächen eines scheibenförmigen Substrats eine Vielzahl von separaten Probeaufnahmeräume bildenden Vertiefungen eingebracht ist. Die Verwendung eines solchen Probenträgers erfordert jedoch die geordnete Anordnung der Proben, da die Positionsinformationen nicht simultan zum Fluoreszenz-Signal in gleich hoher Auflösung ausgelesen werden können. Insbesondere erlaubt es der bekannte Probenträger nicht, einen Zellrasen oder irreguläre Strukturen in einem auf dem Probenträger lebenden Gewebeschnitt zu erfassen.

Aus der EP 0 198 513 A2 ist eine Vorrichtung zur Erfassung von Fluoreszenz-oder Phosphoreszenzreaktionen bekannt, bei welchem ein Probenträger nach der Anregung der auf ihm befindlichen Proben zur Vermeidung von Fehlmessungen durch Erfassen unerwünschter Hintergrund-Fluoreszenz derart gedreht werden muß, daß sich die zu untersuchenden Proben bei der Erfassung der Lumineszenz-Reaktionen an einem anderen Ort befinden, als bei der Anregung. Das gleichzeitige Anregen und Erfassen von Lumineszenz-Reaktionen ist gemäß der Lehre der genannten europäischen Patentanmeldung nicht möglich.

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren und Vorrichtungen zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz- Reaktionen und Brechungsverhalten von auf einem Träger gebundenen Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen anzugeben, die zudem preisgünstig herstell-bzw. durchführbar sind. Nach Möglichkeit sollen die Verfahren und Vorrichtungen auch noch besonders schnell durchführbar sein bzw. besonders schnell arbeiten.

Die Aufgabe wird gelöst von einem Verfahren gemäß Anspruch 1. Vorteilhafte Durchführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Bevorzugt wird die Relativbewegung von Träger und Detektor durch Drehen des Trägers erzeugt. Die Drehung des Trägers kann in vorteilhafter Weiterbildung sogar dazu verwendet werden, nach Art einer Zentrifuge bestimmte gewünschte physikalische Veränderungen auf dem Träger vorzunehmen. So ist es zum Beispiel möglich, die auf dem Träger vorgesehenen biologischen Strukturen oder Fluoreszenzfarbstoffe entlang einer zur Drehachse im wesentlichen radialen Richtung wandern zu lassen und erst dann die optischen Eigenschaften auszulesen. Eine solche Bewegung kann anstelle von einer schnellen Rotation des Trägers nach Art der auf dem Träger befindlichen Substanzen auch durch Anlegen eines elektromagnetischen Feldes oder eines hydrodynamischen oder osmotischen Druckes bewirkt werden.

Die Erfindung erlaubt es vorteilhaft, als Träger eine vorzugsweise transparente, hinsichtlich der Positionsmarkierungen im wesentlichen handelsübliche CD, DVD, MOD oder FMD zu verwenden. Dies hat den Vorteil, daß zum Erfassen der Position des Trägers Positionserfassungssysteme verwendet werden können, die sich in der Praxis bereits als sehr zuverlässig bewährt haben und die zudem kostengünstig hergestellt werden können. Dabei sei an dieser Stelle betont, daß unter dem Begriff "integrierte Positionsmarkierungen"alle Arten von fest mit dem Träger verbundenen, eine eindeutige Bestimmung der Position des Trägers relativ zu einem Detektor erlaubenden Markierungen verstanden werden. Bei den beispielhaft genannten, als Träger in Frage kommenden CDs, MODs, DVDs und FMDs sind diese Markierungen in den jeweiligen Träger integriert, wobei sie teilweise nicht auf der Oberfläche sitzen, auf der sich die zu untersuchenden Moleküle befinden, sondern in einer darunter- liegenden Schicht.

Die Verwendung von Trägern, deren Positionsmarkierungen optoelektronisch erfaßt werden können, hat den weiteren Vorteil, daß das in der Regel zum Auslesen der Markierungen verwendete Laserlicht gleichzeitig zur Untersuchung der Moleküle, insbesondere zu deren Lumineszenz-Anregung verwendet werden kann.

Das Verfahren kann vorteilhaft so durchgeführt werden, daß die optischen Eigen- schaften an einem bestimmten Ort auf dem rotierenden Träger mehrfach hintereinander gemessen werden, um so zum Beispiel bei niedriger Signalstärke eine statistische Auswertung zu ermöglichen, oder um eine zeitliche Veränderung der optischen Eigenschaften an einem bestimmten Ort auf dem Träger zu erfassen. Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, zwischen zwei Messungen der optischen Eigenschaften ein und demselben Ort auf dem Träger die zur Einfärbung der auf dem Träger befindlichen Moleküle verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe auszubleichen oder auf andere Weise zu deaktivieren und die Moleküle danach erneut einzufärben, jedoch mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff.

Vorteilhaft ist es, wenn ein Austausch oder eine Modifikation der Moleküle, deren optischen Eigenschaften erfaßt werden sollen, an jedem Ort auf dem Träger erfolgen kann und insbesondere nach dem Austausch der Moleküle oder der Modifikation der Moleküle erneut gemessen werden kann.

Dabei kann der Vorgang des Austausches oder der Modifikation von Molekülen, deren optische Eigenschaften erfaßt werden sollen, beliebig oft wiederholt werden.

Somit kann ein charakteristisches Profil für einen bestimmten Ort des auf dem Träger aufgebrachten Materials, insbesondere Zellen oder histologische Schnitte, erstellt werden.

Hierbei werden vorzugsweise die optischen Eigenschaften von mehreren verschiedenen Molekülen an einem betimmten Ort gleichzeitig gemessen.

Werden die untersuchten Moleküle gemäß Anspruch 10 oder Anspruch 11 nach der Erfassung optischer Eigenschaften von dem Träger gelöst, so kann vorteilhaft zur Ablösung der Moleküle Laserlicht auf derselben Quelle verwendet werden, die auch das für die Untersuchung der optischen Eigenschaften verwendete Laserlicht liefert. Bei

Verwendung entsprechender Träger kann also eine einzige Lichtquelle drei unter- schiedliche Aufgaben übernehmen : Abtasten der Positionsmarkierungen, Anregen von Lumineszenz-Reaktionen und Ablösen von Molekülen. Je nach Art der auf dem Träger aufgebrachten Substanzen kann die Lichtquelle auch dazu eingesetzt werden, lichtabhängige Reaktionen in den auf dem Träger befindlichen Chemikalien, biologi- schen Strukturen oder den an sie gebundenen Substanzen auszulösen.

Da erfindungsgemäß das wiederholte Erfassen optischer Eigenschaften an exakt definierten Orten auf dem Träger möglich ist, können verschiedene Untersuchungen nacheinander durchgeführt werden, zwischen denen jeweils Oberflächenmodifikationen stattgefunden haben, beispielsweise durch Aufbringen von bioaktiven Substanzen, Mineralien, Bindemolekülen, Antikörpern, Liganden, Rezeptoren, Molekülen einer extrazellulären Matrix, Zelladhäsionsmolekülen oder anderen biologischen Strukturen wie Membranen, Zellen, Zellteilen, Viren oder Geweben.

Bei der Erfassung der optischen Eigenschaften kann das Prinzip des konvokalen Laser- Scanning-Mikroskops angewandt werden. Vorteilhaft werden dabei die Fluoreszenzsi- gnale einzelner Bildpunkte eines Arrays von Molekülen in unterschiedlichen Fokusie- rungsebenen gemessen.

Zur Erhöhung der Präzision und Erleichterung der Auswertung kann ein optisches Abbildungssystem sowohl zwischen das Anregungssystem und den Träger als auch zwischen den Träger und das Detektionssystem eingebracht werden. Ein solches Abbildungssystem sollte wenigstens ein Linsensystem oder ein Array von Linsensyste- men, ein optisches Gitter, einen optischen Spiegel oder ein Array aus optischen Spiegeln, optische Fasern oder ein Array aus optischen Fasern und/oder ein Gradienten- Index-Linsensystem oder ein Array aus Gradienten-Index-Linsensystemen umfassen.

Werden ausgewählte Moleküle von dem Träger automatisch abgelöst, so kann vorteilhaft vorgesehen sein, daß die Moleküle vor der Erfassung weiterer, nicht

notwendigerweise optischer Eigenschaften vervielfältigt werden, beispielsweise durch Polymerase-Kettenreaktion oder biologische Replikation.

Die Ablösung der Moleküle von dem Träger kann in verschiedener Weise erfolgen, beispielsweise über einen photolabilen Linker, über eine Ionisierung, durch elek- tromagnetische Strahlung, durch Anlegen einer elektrischen Spannung, über eine enzymatische Reaktion, durch Veränderung der Ionenkonzentration, über Veränderung des pH-Wertes oder mit Hilfe eines Katalysators.

Die abgelösten Moleküle können Bestandteil von Liposomen, Viruspartikeln, Retroviren, Bakteriophagen, Litroiden oder Zellen, insbesondere D-Lymphozyten, T- Lymphozyten, Leukozyten oder Bakterien, von Komplexen aus Nukleinsäure und Protein, insbesondere von Ribosomal-Display-Komplexen, von mit DNS-bindenden Fusionsproteinen beladener DNS, von Komplexen aus Nukleinsäure und anderen Molekülen, insbesondere künstlich hergestellten Komplexen aus DNS und einem Liganden sein.

Bei der weiteren Untersuchung kann insbesondere ein Massenspektrogramm der abgelösten Moleküle erzeugt werden. Vorteilhaft kann ein Träger verwendet werden, auf den eine vorzugsweise vollständige Peptidbibliothek, die L-Aminisäuren enthält, insbesondere eine 4mer, 5mer, 6mer, 7mer oder 8mer Peptidbibliothek aufgebracht sein. Alternativ kann auf dem Träger auch eine Peptidbibliothek aufgebracht sein, die D-Aminosäuren enthält. Es ist auch möglich, Träger zu verwenden, aus denen eine Peptidbibliothek aus L-und D-Aminosäuren, eine Aptamerbibliothek, eine Oligosac- charidbibliothek oder Oligonukleotidbibliothek aufgebracht ist. Solche Bibliotheken können vorzugsweise mittels chemischer Kombinatorik aufgebracht sein. Dabei können die einzelnen Monomere der Oligonukleotidbibliothek Spiegelbilder der natürlich vorkommenden Monomere sein.

Das Verfahren erlaubt vorteilhaft eine besonders schnelle Analyse des Lumineszenz- Verhaltens der untersuchten Moleküle. Zudem kann ein Träger verwendet werden, bei dem die Proben beliebig angeordnet sind, da die Positionsinformation simultan zum Lumineszenz-Signal in gleich hoher Auflösung ausgelesen werden kann. Damit wird es z. B. möglich, auf dem untersuchten Träger befindliche Zellrasen oder irreguläre Strukturen, wie z. B. in einem Gewebeschnitt vorhanden, zu erfassen.

Das Verfahren kann besonders vorteilhaft als Alternative für fluoreszenz-aktivierte Zell- Sorter oder Zell-Scanner (FACS) bei fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortern oder Zell- Scannern (FACS) verwendet werden, wobei dies das Arbeiten mit adhärenten Zellen erlaubt und z. B. beim Screening von Molekülbibliotheken bioaktiver Substanzen verwendet werden kann. Auch ist es möglich, Epithelien und andere, ausschließlich adhärent wachsende, auf dem verwendeten Träger angeordnete Zellen schnell und einfach zu untersuchen, so daß nach Apoptoseauslösern und neuen Malaria-Mitteln gesucht werden kann. Dabei sind gerade adhärente Zellen wichtig bei der Suche neuer Arzneimittel. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich auch neuronale Differenzierungsprozesse (das Axonwachstum), die nur auf festen Matritzen stattfinden und oft eine besondere Beschichtung des Trägers erfordern, problemlos quantifizieren.

Wird ein Impulsprozessor verwendet, so können auch Unterschiede in der Zellgeometrie gemessen werden. Das Verfahren erlaubt damit auch die wiederholte Erfassung jeder einzelnen Zelle, während bei bekannten FACS die untersuchte Zelle nach der Messung verloren geht. Dank der in einer anderen Schicht des Trägers enthaltenen Positions- informationen, ist es erstmals auch möglich, verschiedene Eigenschaften ein und derselben Zelle nacheinander zu messen. Auch können einzelne Zellen in auf dem verwendeten Träger befestigten Gewebeschnitten nach spezifischer Färbung (z. B. von eingewanderten T-Lymthozyten in Biopsien von Entzündungsherden bei Autoimmun- Patienten) ausgezählt werden. Auch die Analyse von Tumorbiopsien, gegebenenfalls nach wiederholter Anfärbung, ist möglich.

Bei entsprechend schneller Drehung des Trägers kann direkt eine Zentrifugation bishin zur analytischen Ultrazentrifugation vorgenommen werden, insbesondere wenn sich der Träger beim Drehen in einem abgedichteten Kompartiment befindet.

Bei einem Verfahren zur Erfassung einer Lumineszenz-Reaktion von auf einem Träger gebundenen Molekülen, wobei elektromagnetische Wellen, insbesondere Laserlicht, auf den Träger eingestrahlt werden, ist vorgesehen, daß im wesentlichen nur das von den Molekülen eventuell emittierte Licht von dem Detektor erfaßt wird. Dies hat gegenüber den bekannten Verfahren, die in der Regel nach dem Prinzip des konfokalen Laser- Scanning-Mikroskops arbeiten, bei welchen ein Teil des gestreuten Anregungslichts auch auf den Detektor gelangt, den Vorteil, daß tatsächlich nur das emittierte Licht erfaßt und damit ein wesentlich verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis erzielt wird.

Es sei an dieser Stelle betont, daß unter dem Begriff"Licht"hier alle Arten von elektromagnetischen Wellen verstanden werden, insbesondere also auch Wellen mit außerhalb des im Empfindlichkeitsbereich des menschlichen Auges liegenden Wellenlängen.

Um nun ohne aufwendige Blenden o. dgl. sicherzustellen, daß tatsächlich möglichst nur das emittierte Licht zum Detektor gelangt bzw. von diesem erfaßt wird, kann zum einen so vorgegangen werden, daß die elektromagnetischen Wellen nur kurzzeitig, insbesondere gepulst, auf den Träger eingestrahlt werden und daß der Detektor während des Einstrahlens eventuell von den bestrahlten Molekülen emittiertes Licht nicht erfaßt, wobei hier unter dem Begriff"Erfassen"das Feststellen einer meßbaren Größe einschließlich des Erzeugens entsprechender, für die jeweilige Untersuchung verwertbarer Signale verstanden wird, so daß also auf den eigentlichen Sensor des jeweiligen Detektors sehr wohl Licht gelangen kann, das nicht von einer Lumineszenz- Reaktion herrührt, solange nur-z. B. durch Abschalten der dem Sensor nachge- schalteten Detektionseinrichtungen, insbesondere also der Signalerzeugung und- auswertung während des Einstrahlens der zur Lumineszenz anregenden elektromagne-

tischen Wellen-sichergestellt ist, daß dieses Licht nicht in störende Signale umgewan- delt wird.

Es sei an dieser Stelle betont, daß durch das kurzzeitige Anregen und das zeitlich verzögerte Auslesen der Lumineszenzreaktion in den Dunkelphasen der Anregung, das Signal-Rauschen-Verhältnis für alle Arten von Fluoreszenzmessungen verbessert werden kann, insbesondere bei Fluoreszenzmessungen nach dem Prinzip des konfokalen Laser-Scanning Mikroskops, bei der Detektion von chromatographisch aufgetrennten fluoreszenzmarkierten Molekülen, insbesondere beim Sequenzieren von DNA, und beim Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sorter oder Zell-Scanner (FACS). Dies kann alternativ oder zusätzlich zum gepulsten Einstrahlen der Wellen dadurch erzielt werden, daß der Detektor und der Träger nach dem Einstrahlen oder während des Einstrahlens der elektromagnetischen Wellen relativ zueinander bewegt werden, insbesondere relativ zueinander gedreht werden, so daß sich die mit den elektromagnetischen Wellen bestrahlten Moleküle in einem von dem Detektor erfaßbaren Bereich bewegen.

Schließlich können auch mehrere Lichtquellen und mehrere Detektoren verwendet werden, die wechselweise an-und abgeschaltet werden, so daß es vorteilhaft möglich wird, Moleküle in bestimmten Bereichen auf dem Träger durch Einstrahlen von elektromagnetischen Wellen zur Lumineszenz anzuregen und gleichzeitig oder zeitversetzt eventuelle Lumineszenzreaktion aus anderen, zuvor angeregten Bereichen des Trägers zu erfassen.

Ein weiterer Ansatz das Signal-Rausch-Verhältnis von Lumineszenzsignalen zu verbessern gründet auf die Topographie eines Mischarrays von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit Leuchtdioden. Die einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden werden dabei in Vertiefungen angeordnet, so daß das von Ihnen abgestrahlte Licht nur bei benachbarten Siliziumerhebungen eine Lumineszenzreaktion anregt. Natürlich kann auch die Topographie des beschriebenen Mischarrays mit kurzzeitiger Anregung der Lumineszenzreaktion und einem Auslesen der Signale in der Dunkelphase verbunden

werden. Die kurzzeitige Anregung von Fluoreszenzmolekülen ermöglicht darüber hinaus auch eine besonders einfache Zuordnung von Fluoreszenzsignalen an einzelne Moleküle einer Molekülbibliothek, wenn diese auf ein Array von Detektoren aufgebracht werden.

Der in den Dunkelphasen der Anregung aufgrund der Lumineszenz der Moleküle ent- stehende Strom kann parallel in den einzelnen Photodetektoren ausgelesen werden und damit den einzelnen Mitgliedern der Molekülbibliothek zugeordnet werden.

Sowohl durch das beschriebene gepulste Einstrahlen/gepulste Detektieren als auch durch das Bewegen von Träger und Detektor relativ zueinander und durch das wechselweise Betreiben mehrerer Lichtquellen und Detektoren wird vorteilhaft eine Entkopplung von Anregung und Detektion erreicht, was gegenüber den bekannten Verfahren zu einem erheblich klareren Lumineszenzsignal und damit zu einem verbesserten Signal-Rausch- Verhältnis führt. Letzteres kann noch weiter verbessert werden, wenn zwischen den Träger und den Detektor bzw. die Detektoren ein oder mehrere Wellenlängenfilter geschaltet werden, was es erlaubt, auch eventuelles Streulicht des zur Anregung benutzten Lichts vom Fluoreszenzlicht zu trennen.

Bei einem vorteilhaften Verfahren zur Erfassung optischer Eigenschaften von auf einem drehbaren Träger gebundenen Molekülen, insbesondere von an biologisches Material gebundenen Molekülen, ist vorgesehen, daß elektromagnetische Wellen auf den Träger eingestrahlt, die bestrahlten Moleküle mit einem Detektor beobachtet, ausgewählte Moleküle von dem Träger automatisch abgelöst und einem zweiten Detektor zur Erfassung weiterer, nicht notwendigerweise optischer, Eigenschaften zugeführt werden.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß nach einem ersten Analyseschritt (z. B. einer an sich bekannten Färbereaktion), bei dem bestimmte Moleküle mit auf dem Träger bereits zuvor gebundenen Molekülen Bindungen eingegangen sind und so neue Molekülkom- plexe gebildet wurden, diese neuen Molekülkomplexe gezielt weiter untersucht werden können, wobei vom zweiten Detektor z. B. ein Massenspektogramm der abgelösten Molekülkomplexe erzeugt werden kann.

Dabei kann so vorgegangen werden, daß die ausgewählten Moleküle durch Einstrahlung elektromagnetischer Wellen, insbesondere durch Einstrahlung von Laserlicht, von dem Träger abgelöst werden, was für eine sehr große Zahl von Proben verhältnismäßig einfach und kostengünstig umgesetzt werden kann.

In besonders vorteilhafter Weise kann für die Ablösung von ausgewählten Molekülen ein Mischarray von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen und Leuchtdioden verwendet werden. Die einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden dienen dabei zum anregen benachbarter fluoreszenzmarkierter Moleküle und mit der Identifizierung von Bindungsereignissen zur Vorauswahl, welche Moleküle von dem Träger abgelöst und einem zweiten Detektor zugeführt werden sollen. Befinden sich diese Moleküle auf einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen, so können diese sehr einfach, insbesondere durch das Anlegen einer elektrischen Spannung von dem Träger abgelöst werden.

So kann z. B. im Massenspektrometer der zunächst nicht bekannte Bindungspartner aus einer zweiten Molekülbibliothek an ein durch die Position auf dem Träger bereits bekanntes Mitglied aus der ersten Molekülbibliothek bestimmt werden, und zwar auch für mehrere Mitglieder parallel. Die Identität des Bindungspartners aus der zweiten Molekülbibliothek erhält man z. B. durch den Vergleich der Masse (oder tryptischer Spaltstücke eines gebundenen Proteins) mit den bekannten Sequenzen aus einem bereits sequenzierten Genom. Ein weiteres Beispiel ist die Ablösung eines rekombinanten Phagenantikörpers, der durch sein oberflächen-exprimierten Fv-Antikörper ein bekanntes Antigen gebunden hat. Mit diesem Phagenantikörper kann ein E. coli Bakterium infiziert und der rekombinante Antikörper anschließend produziert werden.

Ein weiteres Beispiel ist die Sequenzierung komplexer DNA mittels Fest-phasen- gekoppelter Oligos, bei der"in situ", d. h. parallel bei Millionen verschiedener Oligos eine Sequenzierungsreaktion stattfindet. Verändert wird dabei das ursprünglich auf den Träger gekoppelte Oligo, es wird mit Hilfe einer Polymerase und eines Templates verlängert, bis ein von der Polymerase eingebautes ddNTP zum Kettenabbruch führt.

Anstelle des ursprünglich gekoppelten Oligos erhält man eine Schar von etwas längeren Oligos, die beispielsweise durch ein ddC terminiert sind. Diese Schar von veränderten Oligos muß man vom Template (z. B. durch Erhitzen) und dann noch vom Träger (beispielsweise durch den Einbau einer S=S-Brücke in das Verbindungsstück zum Träger, die mit Hilfe von reduzierenden Agentien wie Mercaptoethanol spaltbar ist) abtrennen. Das Massenspektrometer ermittelt dann die Massen der einzelnen Mitglieder dieser Schar von ddC terminierten Oligos und durch den Vergleich mit den erwarteten Massen die Sequenz der Verlängerung.

Ein erfindungsgemäß vorteilhaft zu verwendender Träger besitzt integrierte und von einem Detektor erfaßbare möglichst engmaschige Positionsmarkierungen, so daß eventuelle Ungenauigkeiten des jeweiligen Verfahrmechanismus nicht mehr zu falschen Untersuchungsergebnissen führen müssen, da die in den Träger integrierten Positions- markierungen eine Kontrolle der tatsächlichen Position des Trägers relativ zu einem De- tektor erlauben. Besonders vorteilhaft kann dabei als Träger eine im wesentlichen handelsübliche Compact Disc (CD), eine Digital Versatile Disc (DVD), Magneto Optical Disc (MOD) oder insbesondere eine Fluorescence Multilayer Disc (FMD) ver- wendet werden, die bereits über engmaschige interne Positionsmarkierungen verfügen, was eine Positionsbestimmung auf Mikrometer genau erlaubt, wobei sich die Verfahren zum Lesen und Prüfen der Markierungen auf diesen bekannten Trägern bereits bestens bewährt haben. Aufgrund der Ähnlichkeit von CD, DVD, MOD und FMD in Bezug auf die hier benötigten Eigenschaften wird im folgenden der Einfachheit halber nur noch die CD genannt, womit immer auch DVD, MOD und FMD eingeschlossen sein sollen.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren CDs und Auslesegeräte sind im übrigen deutlich preisgünstiger als die bekannten Diagnostik-Chips.

Besonders vorteilhaft ist es, bei den oben beschriebenen Verfahren einen lichtdurch- lässigen Träger zu verwenden. Dies erlaubt es nämlich, ein in an sich bekannter Weise zum Abtasten der Positionsmarkierungen verwendetes Laserlicht gleichzeitig zur

Anregung von Lumineszenz-Reaktionen zu benutzen. Alternativ kann eine CD mit einem in die CD integrierten Wellenlängenfilter verwendet werden, wodurch ein Laser mit an sich bekannter Technik für die exakte engmaschige Positionsbestimmung eingesetzt werden kann, dessen Licht nicht auf die auf der anderen Seite der CD aufgebrachten oder aufzubringenden Moleküle gelangt. Für die Synthese bzw. für das Auslesen der Lumineszenzreaktion kann dann ein anderer Laser verwendet werden, dessen Licht den genannten Wellenlängenfilter durchdringen kann. Dieser zweite Laser ist am ersten Laser fixiert, so daß mit der Positionsbestimmung des ersten Lasers automatisch auch die Positionierung des zweiten Laserstrahls auf der CD bekannt ist.

Auch die bei Computern eingesetzten Flachbildschirme besitzen integrierte Positions- markierungen derart, daß die einzelnen LED/LCD Bildpunkte ganz genau bestimmten Positionen zugeordnet sind und einzeln ansteuerbar sind, so daß ein in nächster Nähe über den Leuchtdioden/Flüssigkristallen angebrachter durchsichtiger Träger für biologische Materialien an genau definierten Punkten beleuchtet werden kann. Dies gilt umso mehr, wenn die bisher eingesetzten Flüssigkristalle durch einen Array von möglichst dicht gepackten miniaturisierten Lasern oder Leuchtdioden ersetzt werden.

Eine besonders vorteilhafte Lösung gründet dabei auf die Topographie eines Misch- arrays von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit den darauf aufgebrachten Molekülen mit Leuchtdioden. Die einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden werden dabei in Vertiefungen angeordnet, so daß das von Ihnen abgestrahlte Licht nur bei benachbarten Siliziumerhebungen eine Lumineszenzreaktion anregt. Auch damit ist eine wiederhol- bare exakte Zuordnung von Anregungslicht und aufgebrachten Molekülen möglich.

Die Verwendung eines Arrays von Mikrolasern oder Leuchtdioden bzw. die Ver- wendung der genannten Mischarrays bietet die Möglichkeit, den Träger der biologi- schen Materialien während eines ganzen Zyklus-von der vorzugsweise lithographi- schen oder durch das Anlegen von einer Spannung vermittelten Synthese der Molekülbibliothek angefangen, über das Färben der Bibliothek mit einer zweiten

Molekülbibliothek bis hin zum Auslesen der Bindungsereignisse-über dem Array fixiert zu halten. Dies gewährleistet eine sehr einfache, sehr schnelle und dennoch wiederholt extrem genaue Ansteuerung der einzelnen Bildpunkte, wobei das zeit- aufwendige Ansteuern und Fokussieren der einzelnen Bildpunkte entfallt. Die Möglichkeit, das Array von Leuchtdioden oder Mikrolasern mit Hilfe eines einfachen Abbildungssystems auf dem Träger in verkleinerter Form abzubilden, erlaubt darüber hinaus eine sehr hohe Packungsdichte der durch lithographische Synthesen aufgebrach- ten Molekülbibliotheken. Zudem können Träger und Array anschließend getrennt werden, worauf das Array erneut eingesetzt werden kann.

Als Detektoren können z. B. Arrays von Photomultiplieren, von PIN-Dioden, von Avalanche-Dioden oder eine sog. Multi Channel Plate verwendet werden. Die Detektoren können auch direkt in die Arrays aus Anregungslichtquellen eingelagert werden, dabei entstehen Mischarrays von Detektoren und Anregungslichtquellen.

Werden die zu untersuchenden Moleküle auf der einen Seite und die Positions- markierungen auf der anderen Seite der Compact Disc aufgebracht, so erlaubt es dies, die Anzahl der pro Flächeneinheit auf einem Träger in genau definierter und vor allem wieder auffindbarer Position anordbarer Moleküle gegenüber den bekannten Verfahren enorm zu steigern-konnten bislang etwa 105 Moleküle so auf einem Träger einer der Größe einer CD vergleichbaren Größe so angeordnet werden, daß ihre Position exakt bestimmbar war, so können jetzt 108 bis 101° auf einer CD angeordnet, exakt aufgefunden und gezielt untersucht werden. Ähnliches gilt beim Einsatz einer Art Flachbildschirm, insbesondere wenn die bisher gebräuchlichen Flüssigkristalle durch einen Array von Mikrolasern oder von Leuchtdioden ersetzt werden. Die genaue Positionsinformation ergibt sich in diesem Fall durch die relative Anordnung der Mikrolaser zueinander, so daß genau definierte Punkte auf einem parallel über dem Flachbildschirm angeordneten vorzugsweise durchsichtigen Träger von Molekülbiblio- theken beleuchtet werden können. Damit wird es erstmals möglich, sehr große Molekülbibliotheken auf einem einzigen, sehr handlichen Träger anzuordnen. Z. B. kann

auf dem Träger eine vorzugsweise vollständige Peptidbibliothek, insbesondere eine 4-, 5-, 6-oder 7mer Peptidbibliothek aufgebracht sein, wobei der Träger nach dem Aufbringen der Peptidbibliothek z. B. mit einem zu untersuchenden Blutserum in Kontakt gebracht werden kann. Ebenso ist es möglich, auf dem Träger eine vorzugs- weise vollständige Oligonukleotidbibliothek, insbesondere eine 15mer Oligonukleotidbi- bliothek aufzubringen, wobei der Träger nach dem Aufbringen der Oligonukleotid- bibliothek z. B. mit zu untersuchender, insbesondere fluoreszenzmarkierter und mit Hilfe von Zufallsoligonukleotidprimern vervielfältigter DNA in Kontakt gebracht werden kann. Damit ist es erstmals möglich, in einer einzigen Färbereaktion eine Blutserums- oder DNA-Probe auf sehr viele Infektions-, Autoimmun-bzw. Erbkrankheiten zu testen, wobei der Nachweis eventueller an Molekülen der Peptidbibliothek gebundener Serum- antikörper in an sich bekannter Weise durch fluoreszenz-markierte Anti-Human- Antikörper erfolgen kann.

Die Erfindung schafft damit völlig neue diagnostische Möglichkeiten und steigert insbesondere auch die Chancen, diagnostische Marker und Therapeutika zu finden.

Werden z. B. vollständige 6mer Peptidbibliotheken mit einer größeren Anzahl von Patientenseren in Verbindung gebracht und z. B. mittels einer Färbereaktion daraufhin untersucht, an welchen Peptiden sich Bestandteile der Seren angelagert haben, so werden sich dabei Korrelationen zwischen Krankheit und gefärbten Peptiden ergeben.

Dies liegt daran, daß jeder Mensch in seinem Blutserum ein sehr komplexes indivi- duelles Muster von Antikörperreaktivitäten mit sich trägt, das insbesondere die Auseinandersetzung seines Immunsystems mit akuten, chronischen, verdeckten oder bereits überstandenen Krankheiten wiederspiegelt. Ein großer Teil der Antikörperreakti- vitäten kann durch die spezifische Bindung an Penta-oder Hexapeptide definiert werden, wodurch bei der Analyse der Bindereaktivitäten an eine vollständige Penta- oder Hexapeptidbibliothek das o. g. individuelle Muster von Antikörperreaktivitäten in bisher nicht gekannter Komplexität bestimmt werden kann. Längere Bindemotive, ins- besondere die ebenfalls häufig vorkommenden mit einer helikalen Struktur, können durch Bibliotheken ermittelt werden, in denen nicht jede Aminosäure zufällig ist,

sondern nur jene an bestimmten, aus der Struktur abgeleiteten Positionen. Damit können neue diagnostische Marker und bisher unbekannte Korrelationen zwischen Krankheit und spezifischen Antikörperreaktivitäten gefunden werden, darunter z. B. Marker für Tumorerkrankungen, für Herz-Kreislauferkrankungen wie Herzinfarkt, für multiple Sklerose und Parkinson, für alle Arten von Autoimmunkrankheiten und Allergien und für alle Arten von Infektionskrankheiten.

Das entstehende Muster von Markern kann zum einen selbst durch die Korrelation zu bestimmten Krankheitsbildern die diagnostische Aussage ermöglichen. Die neu gefundenen Marker können aber auch gesondert auf Träger aufgebracht und bei künftigen Untersuchungen verwendet werden.

In analoger Weise kann auch versucht werden, Krankheiten zu Bindungsmustern an andere Molekülbibliotheken, wie D-Peptidbibliotheken oder Oligosaccharidbibliotheken, zu korrelieren. Diese Methode ist dabei nicht auf menschliche Krankheiten beschränkt, sondern eignet sich zur Untersuchung forensischer und veterinärmedizinischer Fragestellungen ebenso wie zur Analyse anderer Flüssigkeiten, von Pflanzenextrakten bis hin zu Extrakten aus Mikroorganismen.

Bei einer weiteren Anwendung werden potentiell therapeutisch interessante Moleküle, wie z. B. D-Peptide, die nicht von den menschlichen Verdauungsenzymen abgebaut werden können, auf einem Träger angeordnet und anschließend mit medizinisch relevanten Molekülen, insbesondere mit krankheitserreger-spezifischen Proteinen oder mit Mischungen von krankheitserreger-spezifischen Proteinen in Kontakt gebracht. Dies ermöglicht die gezielte und schnelle Suche nach Bindungspartnern an diese medizinisch relevanten Moleküle. Analog ist auch die Suche nach Enzymliganden, Enzymsubstrat- Analoga oder Enzyminhibitoren möglich.

Anschließend kann dann die Bindung an die medizinisch relevanten Moleküle detektiert werden, z. B. im Wege der Biotinylisation oder der Fluoreszenz-Markierung, so daß die

D-Peptide oder Aptamere identifiziert werden können, die zumindest Teile des Krankheitserregers binden. Diese D-Peptide oder Aptamere können anschließend nacheinander daraufhin getestet werden, ob sie den Krankheitserreger hemmen. Hat man z. B. ein Enzym des Krankheitserregers (z. B. Protease von HIV, reverse Tran- scriptase etc.) in geeigneter Menge vorliegen, so kann dieses Enzym fluoreszenz- markiert werden (entweder direkt oder durch die rekombinante Expression eines kleinen Peptid-tags, das mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers anfärbbar ist). Damit kann festgestellt werden, an welche D-Peptide das Enzym gebunden hat. Anschließend führt man eine weitere Färbereaktion durch, die durch die Enzymaktivität verursacht wird.

Beispielsweise präzipitiert die Spaltung durch die HIV-Protease ein fluoresziierendes Peptid, das man nachweisen kann. So erhält man D-Peptide, die das Enzym nicht nur binden, sondern auch gleichzeitig hemmen.

Um nachzuweisen, an welchen der auf dem Träger gebundenen Moleküle sich Moleküle angelagert haben, kann das Blutserum oder die DNA nach oder vor dem In-Kontakt- Bringen des Trägers mit dem Blutserum oder der DNA mit einem mit dem Blutserum oder der DNA reagierenden, insbesondere Bindungen eingehenden Stoff in Kontakt gebracht werden. Zweckmäßigerweise wird dabei der mit dem Blutserum oder der DNA reagierende Stoff vor dem In-Kontakt-Bringen mit dem Serum oder der DNA mit einem zur Lumineszenz anregbaren Stoff, insbesondere einem durch Einstrahlung von Laserlicht zur Fluoreszenz anregbaren Farbstoff, eingefärbt. Solche Farbstoffe sind z. B. unter den Namen"Cy3","Cy5","FITC"oder"TRITC"im Handel erhältlich, wobei vorteilhaft bereits eine ganze Palette von Konjugaten dieser Fluoreszenz-Farbstoffe zur Verfügung steht (z. B. Ziege-Anti-Mensch-Antikörper konjugiertes Cy5).

Wird das zu untersuchende Blutserum mit einem für die Immunglobuline des Typs E spezifischen Nachweisreagenz in Kontakt gebracht, so lassen sich damit evtl. beim Patienten bestehende Allergien ermitteln, da die Immunglobuline des Typs E für die allergischen Reaktionen wie Asthma oder Heuschnupfen verantwortlich sind. Nicht- Allergiker haben praktisch keine IgEs in ihrem Blutserum, Allergiker unterschiedliche

Mengen, die unterschiedliche Allergene erkennen lassen. Schließlich ermöglicht die Erfindung die Suche nach spezifischen Bindungspartnern für ein Zielmolekül aus einer Bibliothek von 108 bis 10'° unterschiedlichen Molekülen und damit-durch die gleichzeitige Identifizierung vieler (unterschiedlich stark bindender) Bindungspartner- nach den für die Bindung des Liganden an das Zielmolekül verantwortlichen Strukturparametern. Dadurch wird der Weg zu Leitstrukturen stark vereinfacht.

Beispielsweise können dazu mit den oben genannten Methoden erhaltene Signalmuster automatisch mit Strukturparametern oder Strukturmodellen der identifizierten Liganden aus der benützten Bibliothek korreliert werden.

Um nun eine Peptidbibliothek auf einen Träger, insbesondere auf einen in einem der gerade beschriebenen Verfahren verwendbaren Träger, anzuordnen, kann zunächst eine Oberfläche des Trägers mit einer Kunststoffschicht, die freie Aminogruppen für die Festphasensynthese einer Peptid-oder Oligonukleotidbibliothek enthält (z. B. dem derivatisierten Polystyrol"CovaLink"der Firma Nunc), überzogen werden (zur Einführung von primären Aminogruppen in Polystyrol siehe Fig. 15). Nach dem Einfügen eines geeigneten Spacers werden anschließend die freien Aminogruppen mit einer durch Licht abspaltbaren Schutzgruppe abgeblockt. Ein Beispiel von vielen für eine aktivierte, d. h. mit Aminogruppen reaktive, lichtabspaltbare Schutzgruppe ist Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC).

Anschließend werden Schutzgruppen in bestimmten Bereichen des Trägers mittels eines Lasers abgespalten, worauf eine aktivierte Aminosäure, deren eigene Aminogruppe durch eine durch Licht abspaltbare Schutzgruppe blockiert ist, auf den Träger aufge- bracht und dort verteilt wird, so daß die Aminosäure an die freien Aminogruppen ankoppeln kann. Danach werden die Verfahrensschritte"Abspalten von Schutzgruppen in bestimmten Bereichen des Trägers"und"Zuführen einer aktivierten Aminosäure, deren eigene Aminogruppe durch die durch Licht abspaltbare Schutzgruppe blockiert ist", für verschiedene, vorzugsweise alle 20 Aminosäuren wiederholt, und schließlich werden die Schutzgruppen von allen synthetisierten Peptiden abgespalten.

Alternativ kann auch eine andere lithographische Methode zum Aufbringen einer Peptidbibliothek angewandt werden. So können z. B. die ausgereiften konventionellen Standardsynthesen (z. B. Gebrauch von fMoc-Schutz-gruppen bei der Peptidsynthese) mit einem Einschluß der aktivierten Monomere in photo-oder elektrolabile größere Partikel kombiniert werden. Die eingestrahlten elektromagnetischen Wellen bzw. eine angelegte Spannung spaltet dann nicht die photo-bzw. elektrolabile Schutzgruppe auf dem wachsenden Oligomer ab, sondern setzen die normalen aktivierten Monomere, wie sie für die Standardsynthesen verwendet werden, nur frei. Die aktivierten Monomere werden dabei vorzugsweise bei höherer Temperatur in einem Lösungsmittel gelöst, dessen Schmelzpunkt oder dessen Übergang in einen gelartigen Zustand nahe bei 20 °C liegt, worauf ein Laserlicht absorbierender Farbstoff beigemengt, das Gemisch abgekühlt und bei tiefer Temperatur zu kleinen festen Partikeln zerrieben wird, die über dem Träger für die lithographisch synthetisierten Molekülbibliotheken zerstäubt werden.

Die aktivierten Monomere werden aus diesen Partikeln lokal nur dort freigesetzt, wo ein Laser die Partikel aufgrund der Absorption des mit eingeschlossenen Farbstoffs erwärmt. Dadurch verflüssigen sich oder gelieren die Partikel und die aktivierten Monomere können in Lösung an die freien Aminogruppen (oder wie bei der Oligonu- cleotidsynthese an freie Hydroxylgruppen) koppeln. Direkt neben dem erwärmten Ort erstarrt die Flüssigkeit wieder.

Die Erwärmung der festen Partikel findet dabei besonders vorteilhaft mit Hilfe einer wiederholt kurzzeitig einstrahlenden Lichtquelle, insbesondere eines Lasers oder einer Leuchtdiode, statt, wodurch besonders scharf abgegrenzte Übergänge zwischen festen Partikeln und lokal aus den Partikeln freigesetzten Substanzen entstehen.

Alternativ zu schmelzenden Partikeln kann auch ein Cage-Einschluß, insbesondere in Fullerenen, oder eine andere Methode zur Freisetzung verwendet werden, die z. B. durch elektromagnetische Wellen oder eine elektrische Spannung auslösbar ist.

Ferner können alternativ auch ausgewählte Bereiche durch die in schneller Abfolge wiederholte Anlegung einer Spannung erwärmt werden, insbesondere wenn ein Mischarray von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit Leuchtdioden verwendet werden. Anstelle von aktivierten Monomeren können auch Kombinationen von Monomeren gekoppelt werden, also beispielsweise alle 20 x 20 möglichen aktivierten Dimere von L-Aminosäuren.

Im nächsten Schritt werden die nicht gekoppelten Monomere, die nicht aufgeschlossenen Partikel und/oder die erstarrten Partikel entweder einfach weggeblasen, oder gelöst und weggewaschen, erneut feste Partikel, die aktivierte Monomere enthalten aufgebracht, in ausgewählten Bereichen an den Träger gekoppelt und dieser Schritt mit vorzugsweise allen zur Verfügung stehenden unterschiedlichen aktivierten Monomeren nacheinander durchgeführt, anschließend die aufgrund der erfolgten Kopplungen neu eingeführten Standardschutzgruppen mit bekannten Techniken abgespalten und der nächste Zyklus begonnen bis z. B. eine vollständige Peptidbibliothek synthetisiert wurde. Zusätzliche Modifikationen anderer Art durch andere chemische Reaktionen sind dabei auch möglich, insbesondere biologisch relevante Modifikationen wie Glykosylierungen, Phosphorylierungen, oder Alkylierungen.

Eine weitere Möglichkeit bei der Verwendung eines Mischarrays von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit Leuchtdioden, ist die Steuerung der kom- binatorischen Molekülsynthese durch das Anlegen einer Spannung in ausgewählten Bereichen. Dadurch werden entsprechend geladene aktivierte Monomere für die Molekülsynthese an ausgewählten Bereichen entweder abgestoßen oder angezogen.

Zum Aufbringen einer Oligonukleotidbibliothek auf einen der oben genannten Träger kann analog zur Synthese der Peptidbibliothek vorgegangen werden, mit dem Unterschied, daß anstelle der 20 verschiedenen aktivierten Aminosäuren nur 4 verschiedene aktivierte Nukleotide verwendet werden müssen. Geeigneterweise werden dafür vier verschiedene 3'-O-phospho-ramidite-aktivierte Deoxynucleoside verwendet,

die am 5'Ende oder am 3'Ende eine photolabile Schutzgruppe tragen oder die, wie für die Synthese einer Peptidbibliothek beschrieben, in Partikel eingeschlossen aber dem Träger zerstäubt und anschließend durch die Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen beweglich gemacht werden. Die für die Oligonukleotidsynthese üblicherweise verwendeten freien Hydroxylgruppen können gleichzeitig mit dem Einfügen eines geeigneten Spacers eingeführt werden.

Analoge Methoden sind auch für die Herstellung von Aptamer-Bibliotheken einsetzbar, d. h. für auf Ribonukleotiden und ihren Derivaten beruhenden Oligomeren. Daneben können auch reaktive Moleküle anderer Art, wie sie z. B. in der kombinatorischen Chemie benutzt werden, in die aktivierbaren Partikel eingeschlossen werden und ortsspezifisch freigesetzt werden. Somit können neben Nukleotiden oder Aminosäuren auch vielfältige andere Gruppen als monomere kombinierbare Bausteine für die Oligomersynthese verwendet werden.

Alternativ kann eine Molekülbibliothek auch durch eines von zahlreichen Druck-oder Spotverfahren auf den Träger aufgebracht werden, wie beispielsweise mittels einer Düse, ähnlich wie sie bei einem Tintenstrahldrucker benutzt wird. Anschließend können ausgewählte Bereiche des Trägers mit Laserlicht oder mit Hilfe von Leuchtdioden derart bestrahlt werden, daß es in diesen Bereichen zu einer Verankerung der aufgebrachten Moleküle auf dem Träger kommt. Dies ist insbesondere deswegen vorteilhaft, weil dadurch später in genau demselben Bereich ein Lumineszenzsignal angeregt und ausgelesen wird, in dem vorher die aufgebrachten Moleküle aufgrund der Aktivität des Anregungslasers verankert wurden.

Um dies zu erreichen, kann z. B. vor dem Aufbringen der zu verankernden Molekülen eine bei den jeweiligen Umgebungstemperaturen feste Substanz auf den Träger gebracht werden, welche dann zur Verankerung der Moleküle geschmolzen wird. Dabei kann so vorgegangen werden, daß die Oberfläche eines Trägers (z. B. durch das gleichmäßige chemische Koppeln von Streptavidin oder von Biotin auf dem ganzen Träger) aktiviert

wird, dann bei 40 °C gleichmäßig ein bei 10 °C festes (ggf.-wenn hydrophile Moleküle gekoppelt werden sollen-hydrophobes) Farbstoffmolekülen enthaltendes Lösungsmittel auf den Träger aufgebracht wird und man es dort erstarren läßt, worauf dann die an den Träger zu koppelnden Moleküle aufgebracht werden, mittels Laser, Leuchtdioden oder Spannung ausgewählte Bereiche des Trägers erhitzt werden, wodurch sich das Lösungsmittel verflüssigt oder lokal verflüchtigt und das aufgebrachte zu koppelnde Molekül an den Träger binden kann. Die Bindung findet dabei vorzugsweise über Biotin-Streptavidin statt. Anschließend werden ungebundene Moleküle weggewa- schen und der Zyklus kann mit einem neuen Spot-oder Druckvorgang beginnen, bis schließlich eine dichtgepackte und komplexe Molekülbibliothek auf den Träger aufgebracht ist.

Das Aufbringen oder die Synthese einer Molekülbibliothek auf einen Träger ist jedoch nicht auf die beschriebenen Verfahren beschränkt ; als weitere Verfahren seien beispielhaft erwähnt : -das Spotten von Mikromengen von Molekülen mit Hilfe eines dem Füll- federhalter vergleichbaren Prinzips, insbesondere von PCR-Produkten vervielfältigter Gensequenzen ; -das Spotten von Mikromengen mit Hilfe einer Art Siebdruckverfahren, insbesondere von aktivierten Monomeren für die Oligonukleotidsynthese, die Synthese von Peptiden oder die Synthese von PNAs ; -das Spotten von Mikromengen mit Hilfe einer Art Tintenstrahldrucker, insbesondere von aktivierten Monomeren für die Oligonukleotidsynthese, die Synthese von Peptiden oder die Synthese von PNAs ;

-die Synthese von PNAs, wobei an jeder Stelle der Polymerisationszyklen oder nach dem Aufdrucken der Moleküle auch noch andere Verbindungen angehängt oder die bereits gekoppelten Moleküle modifiziert werden können.

Eine zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe geeignete Vorrichtung ist in Anspruch 10 gegeben. Ein zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren dienender Träger ist Gegenstand der Ansprüche 12 bis 15.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform gründet dabei auf die Topographie eines Mischarrays von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit den darauf aufgebrach- ten Molekülen mit Leuchtdioden. Die einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden werden dabei in Vertiefungen angeordnet, so daß das von Ihnen abgestrahlte Licht nur bei benachbarten Siliziumerhebungen eine Lumineszenzreaktion anregt. Damit ist wiederholt detektierbar eine exakte, insbesondere kurzzeitige Anregung ausgewählter Bereiche möglich. Diese Ausführungsform bietet sogar die Möglichkeit, eine durch das Lumineszenzsignal entstandene Spannungsänderung direkt jeder einzelnen Silizium- erhebung zuzuordnen, so daß in diesem Fall der Träger der Moleküle identisch mit dem Detektor ist.

Durch die kurzzeitige Anregung von Fluoreszenzmolekülen kann darüber hinaus auf die gezielte Lumineszenzanregung ausgewählter Bereiche verzichtet werden, wenn die unterschiedlichen Moleküle einer Molekülbibliothek auf ein Array von Detektoren aufgebracht werden. Die Anregung kann in diesem Fall vorzugsweise durch einen gepulsten Laser erfolgen, dessen Licht eine größere Zahl von Detektoren erfaßt. Der in den Dunkelphasen der Anregung aufgrund der Lumineszenz der Moleküle ent- stehende Strom kann dann parallel in den einzelnen Photodetektoren ausgelesen werden und damit den einzelnen Mitgliedern der Molekülbibliothek zugeordnet werden.

Die räumliche Entkopplung von Anregung und Detektion kann des weiteren im Falle der Anregung durch ein Array von Mikrolasern oder Leuchtdioden sehr einfach durch

ein relativ grobes Raster von Detektoren erfolgen, die die in alle Raumrichtungen gestreute Lumineszenz der von dem Anregungslaser angeregten Moleküle erfassen.

Dazu muß nur der eine Detektor, der das von dem Anregungslaser eingestrahlte Licht erfaßt, ausgeblendet werden. Natürlich kann die zeitliche Entkopplung von Anregung und Detektion auch mit der räumlichen Entkoppelung kombiniert werden.

Bei einer anderen Ausführungsform einer Vorrichtung zur Erfassung optischer Eigenschaften von auf einem Träger gebundenen Molekülen, insbesondere biologischen oder biologisch relevanten Molekülen, mit Mitteln zum Einstrahlen von elektromagneti- schen Wellen auf den Träger und einem Detektor zur Beobachtung der bestrahlten Moleküle sind Mittel zum Ablösen ausgewählter Moleküle vorgesehen, was es insbesondere dann vorteilhaft ermöglicht, Moleküle gezielt von dem Träger abzulösen, wenn diese bei einem ersten Analyseschritt aufgefallen sind. Die abgelösten Moleküle können anschließend einer weiteren Untersuchung, insbesondere einem Detektor zweiter Art, z. B. einem Spektrometer, insbesondere einem Massenspektrometer, zugeleitet werden, mit dem bestimmte Eigenschaften der abgelösten Moleküle erfaßbar sind.

Die Mittel zum Ablösen können in vorteilhafter Weiterbildung der genannten Vorrichtung einen Laser umfassen. Besonders einfach und vorteilhaft ist für diesen Zweck jedoch die Verwendung eines elektrisch ansteuerbaren und aufladbaren Trägers, wobei die an den Träger gebundenen Moleküle in ausgewählten Bereichen sehr einfach durch das Anlegen einer Spannung abgelöst werden können.

Als Träger für Moleküle, insbesondere biologische Moleküle, insbesondere zur Verwendung in einem der genannten Verfahren können erfindungsgemäß Träger Verwendung finden, die ein engmaschiges Netz von integrierten Positionsmarkierungen aufweisen, so daß es möglich wird, die Position einer z. B. mittels einer üblichen Mechanik mit einem Detektor auf dem Träger angefahrenen zu untersuchenden Stelle zu kontrollieren. Bevorzugt sind dabei die Positionsmarkierungen so ausgebildet, daß sie von einem optoelektronischen Abtastsystem erfaßbar sind.

Wird als Träger eine im wesentlichen handelsübliche Compact Disc verwendet, so hat dies neben Kostenvorteilen gegenüber den bekannten Diagnostik-Chips den Vorteil, daß zur Untersuchung des Trägers auf im wesentlichen handelsübliche Geräte, insbesondere die in CD-Spielern und CD-Brennern vorgesehen Lese-und Schreiblaser zurückgegrif- fen werden kann. Wird dann noch die Compact Disc lichtdurchlässig ausgebildet, so kann das Licht des Lasers nicht nur zur optoelektronischen Positionserfassung, sondern gleichzeitig auch zur Anregung von Lumineszenz-Reaktionen von auf der CD ge- bundenen Molekülen verwendet werden. Alternativ können CDs oder analoge Medien mit einem in die CD integrierten Wellenlängenfilter verwendet werden, wobei ein Laser, dessen Licht den Wellenlängenfilter nicht durchdringen kann, für die ortsgenaue Positionierung der CD verwendet wird, während ein zweiter Laser, dessen Licht den Wellenlängenfilter durchdringen kann, aufgrund seines zu dem ersten Laser fixierten Abstandes zur wiederholten ortsgenauen Synthese oder Anregung einer Lumineszenreak- tion verwendet werden kann.

Ähnliche Vorteile werden durch die Verwendung eines Arrays von Mikrolasern oder Leuchtdioden zur Anregung der Lumineszenz-Reaktion erzielt. Die genaue Positions- information ergibt sich in diesem Fall durch die relative Anordnung der Mikrolaser zueinander, so daß nahezu beliebig oft wiederholbar genau definierte Punkte auf einem parallel über dem Array angeordneten vorzugsweise durchsichtigen Träger von Molekülbibliotheken beleuchtet werden können. Der Träger kann dabei aus nahezu beliebigen Materialien bestehen, insbesondere aus für die Synthese einer Molekülbi- bliothek derivatisiertem Glas.

Insbesondere bei der lithographischen Synthese einer Molekülbibliothek kann bei der Verwendung eines Arrays von Mikrolasern oder Leuchtdioden der Träger der Molekülbibliothek besonders vorteilhaft über dem Array fixiert werden. Zusätzlich kann daran auch noch ein Array von Detektoren fixiert werden, was insbesondere eine Kalibirierung der erzielten Einzelsignale mit einem gleichmäßig fluoreszenzmarkierten Trägerermöglicht.

Das gleiche gilt für den weiter oben beschriebenen Mischarray von einzeln ansteuer- baren Siliziumerhebungen (mit den darauf aufgebrachten Molekülen) mit Leuchtdioden.

Auch solche Mischarrays können an einem Detektor oder einem Array von Detektoren fixiert werden, wenn nicht sogar die durch ein Lumineszenzsignal entstandene Spannungsänderung direkt jeder einzelnen Siliziumerhebung zugeordnet wird, so daß in diesem Fall der Träger der Moleküle identisch mit dem Detektor ist. Dies gewährleistet eine sehr einfache und dennoch extrem genaue, wiederholbare An- steuerung der einzelnen Bildpunkte während der lithographischen oder durch das Anlegen einer Spannung gesteuerten Synthese der Molekülbibliothek und den sich daran anschließenden Färbe-und Ausleseschritten, darüber hinaus entfällt das zeitaufwendige Ansteuern und Fokussieren der einzelnen Bildpunkte. Aufgrund des Fehlens jeglicher bewegter Teile ist eine solche Ausführungsform besonders robust und einfach in der Handhabung.

Auf einem solchen Träger können hochkomplexe Molekülbibliotheken, z. B. eine Peptidbibliothek, insbesondere eine vorzugsweise vollständige 4-, 5-, 6-oder 7mer Peptidbibliothek, oder eine Oligonukleotidbibliothek, insbesondere eine vorzugsweise vollständige 12-, 13-, 14-oderl5merOligonukleotidbibliothekoderAptamerbibliothek, so aufgebracht werden, daß die Position der einzelnen Moleküle bzw. Molekülgruppen aus mehreren Molekülen einer Molekülart wiederholt exakt anfahrbar und damit gezielt untersuchbar ist.

Zum Aufbringen von Molekülen auf eine im wesentlichen ebene Oberfläche eines Trägers wird erfindungsgemäß zum einen eine Vorrichtung vorgeschlagen, die Mittel zur drehbaren Halterung des Trägers um eine zu der genannten Oberfläche des Trägers im wesentlichen senkrechte Drehachse, Mittel zum Aufbringen verschiedener Flüssigkeiten auf die Oberfläche des Trägers im Bereich der Drehachse und wenigstens einen relativ zum Träger verfahrbaren Laser zum Bestrahlen ausgewählter Bereiche des Trägers mit Laserlicht umfaßt.

Bei der Verwendung eines Arrays von Mikrolasern oder Leuchtdioden wird in den Lichtstrahl der Lichtquellen ein geeigneter vorzugsweise durchsichtiger Träger gebracht und dort fixiert. Die genaue Positionsinformation ergibt sich in diesem Fall durch die relative Anordnung der Mikrolaser bzw. Leuchtdioden zueinander, so daß genau definierte Punkte auf dem Träger wiederholt beleuchtet werden können. Dies kann insbesondere für die lithographische Synthese und das anschließende Auslesen von Molekülbibliotheken ausgenützt werden.

Wenn die Molekülbibliotheken unabhängig von der Aktivität des bzw. der Anregungs- laser auf den Träger aufgebracht werden, so dienen in Bezug zu der aufgebrachten Molekülbibliothek regelmäßig angeordnete, in geeigneter Weise detektierbare"guide dots"als Bezugspunkt zur Positionsbestimmung der aufgebrachten unterschiedlichen Moleküle.

Alternativ kann dazu auch eine Vorrichtung dienen, bei der düsenartige Mittel zum Aufbringen kleinster Mengen auf dem Träger zu verankernder Moleküle, Mittel zum Verfahren der Mittel zum Aufbringen der Moleküle und des Trägers relativ zueinander und wenigstens ein Laser zur Bestrahlung ausgewählter Bereiche des Trägers mit Laserlicht vorgesehen sind.

Alternativ können Moleküle oder Molekülbibliotheken auch mit verschiedenen bereits bekannten Druckverfahren auf den verwendeten Träger aufgebracht werden, z. B. mit einem modifizierten Siebdruckverfahren. PCR-Fragmente werden beispielsweise momentan nach dem Prinzip des Füllfederhalters aufgedruckt. Letzteres erlaubt zwar die Synthese hochkomplexer Molekülbibliotheken, jedoch müssen bei Druckverfahren die einzelnen Spots an den Auslesemechanismus angepaßt werden, was sehr zeitauf- wendig ist, da jeder Spot angefahren und in der Regel durchfokussiert werden muß, bis schließlich die Einstellung gewählt wird, die die maximale Lichtausbeute gibt, was sich bei Verwendung einer CD oder eines Arrays von Mikrolasern oder Leuchtdioden erübrigt, da insbesondere bei einem Array von Mikrolasern die einzelnen Bildpunkte

mit nahezu parallelem Licht durchstrahlt werden. Gleiches gilt, wenn ein Array von Detektoren als Träger der Moleküle verwendet wird.

Auch bei einer CD oder analogen Trägern ist das genannte Problem aufgrund des extrem engmaschigen Netzes von Positionsinformationen sehr gemildert, da sich immer in nächster Nähe ein Pit findet, relativ zu dem die Moleküle auf dem Träger verankert und ausgelesen werden können.

Insbesondere wenn als Träger der Moleküle ein weiter oben beschriebener Array von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen oder ein Mischarray mit Leuchtdioden verwendet wird, können aufgedruckte Moleküle auch aufgrund einer in ausgewählten Bereichen angelegten Spannung auf den Träger aufgebracht werden, wenn die aufzubringenden Moleküle eine entsprechende Ladung tragen oder mit Hilfe der gezielt ansteuerbaren Lichtquellen in ausgewählten Bereichen ionisiert wurden.

Die Erfindung erlaubt es dem Fachmann also vorteilhaft, die zur Aufbringung der jeweiligen Moleküle auf die jeweiligen Träger optimal geeignete Vorrichtung zu wählen, wobei er im Einzelfall auch beide Vorrichtungen kombinieren und zunächst einen Teil der Moleküle mit der einen und dann einen anderen Teil der Moleküle mit der anderen Vorrichtung auf den Träger aufbringen kann.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der rein bei- spielhaften und nicht beschränkenden Beschreibung einiger Ausführungs-bzw.

Durchführungsbeispiele in Verbindung mit der Zeichnung.

. In Fig. 1 ist das Funktionsprinzip einer Vorrichtung zur Erfassung einer Lumineszenz- Reaktion von auf der Oberseite 10 eines Trägers 12 gebundenen biologischen Molekülen 14 veranschaulicht, wobei der Träger 12 um eine zur Oberseite 10 senkrechte Achse 16 rotiert, wie durch den Pfeil 18 angedeutet. Dabei handelt es sich bei dem Träger 12 um eine im wesentlichen handelsübliche CD, die jedoch lichtdurchlässig ausgebildet ist

und die auf ihrer der Oberseite 10 gegenüberliegenden Seite mit Vertiefungen, sog.

"Pits"versehen ist, die durch die Striche 20 angedeutet sind und die sich unter einer transparenten Schutzschicht befinden.

Die Pits bilden interne Positionsmarkierungen, die von dem hier nur angedeuteten optoelektronischen Erfassungssystem eines üblichen CD-Spielers oder CD-Brenners gelesen werden können. Das Erfassungssystem besteht dabei bekannterweise im wesentlichen aus einem hier nicht gezeigten Laser und einer-wie durch den Bewegungspfeil 22 angedeutet-verstell-oder verfahrbaren Fokussierspule oder-linse 24, welche es erlaubt, die von dem Laser erzeugten Strahlen 26 vorteilhaft sowohl zum Abtasten der Pits 20 und damit zur Positionsbestimmung als auch-wie in dem in der Figur gezeigten Zeitpunkt-durch die CD hindurch zur Bestrahlung und eventuellen Anregung der Moleküle 14 zu verwenden.

Dem Ort der Bestrahlung ist in Bewegungsrichtung der CD ein lichtempfindlicher Detektor 28 nachgeordnet, dem eine Linse 30 zugeordnet ist, die von eventuell angeregten Molekülen emittierte Lichtstrahlen 32 bündelt und auf den Detektor 28 lenkt. Durch diese Anordnung ist sichergestellt, daß das Licht des Lasers nicht den Detektionsvorgang durch Überlagerung stört. Zudem können so Lumineszenz- Reaktionen angeregter Moleküle erfaßt werden, während gleichzeitig bereits neue Moleküle bestrahlt werden, so daß die Untersuchung der auf der CD angeordneten Moleküle vorteilhaft mit sehr hoher Geschwindigkeit durchgeführt werden kann.

In Fig. 2 ist die Verwendung eines Arrays 40 von Mikrolasern 42, 44 zur Anregung von auf einer Flachseite 46 eines Trägers 48 gebundenen Molekülen 50, 52 dargestellt.

Da die Mikrolaser einzeln ansteuerbar und relativ zueinander in festgelegter Position angeordnet sind, können genau definierte Punkte auf dem parallel über dem Array 40 befestigten im gezeigten Beispiel durchsichtigen Träger 48 beleuchtet und dort befindliche Moleküle ggf. zur Lumineszenz angeregt werden. So sind zum dargestellten Zeitpunkt die Mikrolaser 42 inaktiv, während der Mikrolaser 44 aktiv ist und Licht auf

die Molekülgruppe 50 einstrahlt. Es sei an dieser Stelle betont, daß der Träger 48 zwar bei diesem Ausführungsbeispiel durchsichtig ist, daß der Träger aber nicht notwendiger- weise durchsichtig sein muß, denn anregende Lichtquelle und Detektor können auch auf ein und derselben Seite des Trägers angeordnet werden, nämlich auf der Seite, auf der sich die zu untersuchenden Moleküle befinden.

Zur Erfassung eventueller Lumineszenz-Reaktionen ist bei diesem Ausführungsbeispiel ein Array 54 aus einer Anzahl von Detektoren 56, 58 vorgesehen. Dies erlaubt eine besonders einfache Trennung von Anregung und Detektion dadurch, daß der oder die im direkten Strahlenbereich eines aktiven, also eine Anregung der Moleküle bewirken- den Lasers 44 befindlichen Detektoren 58 zumindest während des Emittierens des Lasers"ausgeschaltet"werden, z. B. in der Weise, daß evtl. auf den Detektor oder die Detektoren einfallende Strahlung nicht weiter erfaßt oder Signale von den jeweiligen Detektoren nicht weitergeleitet oder ausgewertet werden. Die anderen Detektoren 56 können, vorzugsweise bei gepulster Einstrahlung, ebenfalls für die Dauer der Anregungsphase ausgeschaltet werden, was aber nicht zwingend notwendig ist.

Insbesondere ist es möglich, zwischen dem Array 54 von Detektoren und dem Träger 48 einen Wellenlängenfilter 60 anzuordnen, der Strahlung 62 mit der Wellenlänge der Anregungslaser ausfiltert oder zumindest stark abschwächt (wie durch die Strahlen 62' angedeutet), Lumineszenz-Strahlung 64 dagegen passieren läßt, so daß diese von den aktiven Detektoren 56 erfaßt und in entsprechende Signale umgewandelt werden kann, welche dann an eine an sich bekannte und daher hier nicht weiter beschriebene Signalauswertungseinrichtung, z. B. einen Computer, weitergeleitet werden können.

Ein in Fig. 2 gezeigter Träger kann z. B. dann, wenn für die Synthese und das Auslesen einer hochkomplexen Molekülbibliothek eine sehr genaue Auflösung der einzelnen Bildpunkte auf dem Träger benötigt wird, bereits vor einer z. B. ithographischen Synthese einer Molekülbibliothek fest (aber nicht unlösbar) mit dem Array von Mikrolasern verbunden werden und dies während der Synthese und Färbung mit einer zweiten Substanz (beispielsweise dem Blutserum von Patienten) bis zum Auslesen der

Lumineszenz-Reaktion auch bleiben. Anschließend kann der Träger entsorgt und ein neuer Träger fest mit dem Array von Mikrolasern verbunden werden. Zusätzlich kann auch ein Array von Detektoren fest mit dem Array von Mikrolasern verbunden werden, wie in Fig. 10 dargestellt.

Alternativ können auf dem Träger sogenannte"guide dots"in regelmäßigen Abständen eingefügt werden, die jeweils ein definiertes Lumineszenz-Signal ergeben und damit die Funktion der Pits auf der CD übernehmen, d. h. ein internes Raster abgeben, das zur Positionsinformation dient.

Das Entkoppeln von Anregung und Detektion ist bei diesen Beispieln noch einfacher als bei dem Beispiel mit Verwendung einer CD als Träger, da ein Mikrolaser nach dem anderen aktiviert werden kann. Beispielsweise kann man ein gröberes Raster von Photodioden über dem Array aufbauen, wobei jeweils die Diode im Intensitätsmaximum des gerade aktiven Anregungslasers ausgeschaltet ist.

Ist die Leistung des bzw. der Laser steuerbar, so kann/können der/die Laser auch zum Ablösen ausgewählter Moleküle von dem Träger verwendet werden, wobei die abgelösten Moleküle dann in geeigneter Weise einer weiteren Untersuchungseinrichtung, z. B. einem Massenspektrometer, zugeführt werden können.

In der Fig. 8 ist noch einmal beispielhaft das Grundprinzip des vorgestellten Untersuchungsverfahrens dargestellt : ausgewählte Bereiche 7 eines Trägers 12 mit daran gekoppelten Molekülen oder Aggregaten 4 an diese Moleküle oder mit Molekülen 8, die mit den gekoppelten Molekülen 2 oder mit den Agggregaten an diese Moleküle 4 in Wechselwirkung treten, werden mit elektromagnetischen Wellen 6 bestrahlt.

In den Fig. 9 und 10 ist schematisch gezeigt, wie die physikalische Umgebung, ins- besondere die Matrixschicht 3 von Substanzen 5 in lokal eng begrenzten Bereichen 7 durch das Einstrahlen von elektromagnetischen Wellen 13 (Fig. 9) oder durch das

Anlegen einer Spannung 13' (Fig. 10) verändert werden kann, so daß die vorher immobilisierten Substanzen 9 beweglich gemacht werden (bewegliche Substanzen sind durch 11 angedeutet) und in die Nähe des Trägers 12 gelangen können. Dort können sie an auf dem Träger befindliche Moleküle 2 ankoppeln (Bindungen eingehen), ein Aggregat bilden oder Teil einer sonstigen chemischen Reaktion werden. In Fig. 10 ist zudem gezeigt, daß der Träger 12 in ein Mischarray 17 aus Detektoren 56 und aus gezielt ansteuerbaren Quellen elektromagnetischer Strahlung, z. B. Leuchtdioden 19, eingebettet sein kann. Ausgewählte Bereiche 7 des Trägers 12 werden dabei zweckmäßi- gerweise durch einen nichtleitenden und auch für die eingestrahlten elektromagnetischen Wellen undurchlässigen Isolator 21 voneinander getrennt.

Wie in Fig. 11 veranschaulicht, können mit einem Array von einzeln ansteuerbaren Mikrolasern ausgewählte Bereiche eines über dem Array fixierten Trägers wiederholt punktgenau bestrahlt werden. Dadurch können Moleküle einer Molekülbibliothek mit lithographischen Methoden auf ausgewählte Bereiche des Trägers aufgebracht werden.

Nach der Einfärbung der Molekülbibliothek mit einem Fluoreszenzfarbstoff werden die fluoreszierenden Moleküle in nacheinander ausgewählten Bereichen mit einem kurzzeitigen Lichtimpuls angeregt. Die zwischen den Anregungsimpulsen durch die Fluoreszenz der Moleküle erzeugte Strahlung wird von den Photodetektoren aufgefan- gen und kann einzelnen Mitgliedern der Molekülbibliothek zugeordnet werden, so daß genau ermittelt werden kann, bei welchen Molekülen Fluoreszenzreaktion hervorgerufen wurden.

Bei einem entsprechend ausgebildeten Mischarray 17 aus einzeln ansteuerbaren Lichtquellen 19 und Detektoren 56 können-wie in Fig. 12 gezeigt-die Detektoren 56 selbst Träger 12 von unterschiedlichen Molekülen 2, 4 und 8 sein. Ein solches Mischarray 17 kann z. B. dazu verwendet werden werden, in ausgewählten Bereichen 7 eine kombinatorische Molekülsynthese auszulösen, ausgewählte Bereiche 7 kurzzeitig mit elektromagnetischen Wellen 6 anzuregen und die bei einer solchen Anregung eventuell entstehenden Lumineszentreaktionen direkt zu messen. Als Detektoren 56

können dabei insbesondere Siliziumträger, Leuchtdioden oder ein davon unabhängiger Array aus Detektoren verwendet werden. Zur Trennung der Bereiche 7 voneinander ist ein nichtleitender, für die eingestrahlten elektromagnetischen Wellen undurchlässiger Isolator 21 vorgesehen.

In den Fig. 13 und 14 ist schematisch gezeigt, wie ein Array 23 aus einzeln ansteuer- baren Detektoren 27 (Fig. 13), die Träger 12 von unterschiedlichen Molekülen 2, 4 und 8 sein können, bzw. ein Array aus einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden 29 (Fig. 14), die auch als Photodetektoren verwendet werden können, dazu verwendet werden kann, in ausgewählten Bereichen 7 eine kombinatorische Molekülsynthese auszulösen, größere Bereiche 25 oder ausgewählte Bereiche 7 kurzzeitig mit elektromagnetischen Wellen 6 anzuregen und die bei einer solchen Anregung eventuell entstehenden Lumineszen- treaktionen in den Dunkelphasen der Anregung direkt zu messen. Als Detektoren 27 können dabei insbesondere Siliziumträger verwendet werden (Fig. 13). Zur Trennung der Bereiche 7 voneinander ist wiederum ein nichtleitender, für die eingestrahlten elektromagnetischen Wellen undurchlässiger Isolator 21 vorgesehen.

Nachfolgend sind einige Beispiele der Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren bzw. der Anwendung erfindungsgemäßer Vorrichtungen beschrieben : a) Synthese einer vollständigen 6mer Peptidbibliothek auf einer CD unter wasserfreien Bedingungen Die Oberfläche einer CD wird mit einer Kunststoffschicht überzogen, die freie Aminogruppen für die Festphasensynthese enthält. Nach der Kopplung eines geeigneten Spacers von 2-3 Aminosäuren Länge mit Hilfe von Standard fMoc-Peptidsynthese, werden freie Aminosäuren anschließend mit einer durch Licht abspaltbaren Schutz- gruppe abgeblockt. Die Zuleitung der zu koppelnden Schutzgruppe erfolgt durch einen Schlauch auf das Innere der sich drehenden CD. Dabei kann ein leicht modifiziertes

Syntheseprogramm eines an sich bekannten Peptidsynthesizers verwendet werden. Ein Programm, das die Aktivität eines Brennlasers steuert, spaltet die Schutzgruppen an den Bereichen ab, wo im ersten Schritt die Aminosäure Alanin gekoppelt werden soll. Die Abspaltung der Schutzgruppe erfolgt durch Zwei-Photonen-Aktivierung mit Hilfe des Brennlasers und eines von oben einstrahlenden, etwas weniger fokussierten zweiten Lasers. Nach der selektiven Abspaltung der Schutzgruppe wird die aktivierte Aminosäure Alanin durch den oben erwähnten Schlauch der CD zugeführt. Die akti- vierte Aminosäure koppelt an die freien Aminogruppen, wobei die eigene Aminogruppe der Aminosäure zuvor durch die gleiche Schutzgruppe wie oben erwähnt blockiert worden ist. Dieser Vorgang wird für die anderen 19 Aminosäuren wiederholt und das Ganze insgesamt sechs Mal wiederholt. Im letzten Schritt werden die Schutzgruppen von allen synthetisierten Peptiden abgespalten. b) Synthese einer vollständigen 5mer Peptidbibliothek mit Hilfe eines Arrays von Mikrolasern Ein geeigneter flacher, durchsichtiger Träger, der freie Aminogruppen enthält wird fest über dem Array von Mikrolasern fixiert. Geeignet sind dabei insbesondere dünne Glasscheiben, die mit konz. NaOH gereinigt, anschließend mit Wasser gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 10% (vol/vol) bis (2-hydroxyethyl) aminopropyl- triethoxysilan derivatisiert wurden. Alternativ kann ein geeigneter flacher, durch- sichtiger Träger mit einer Kunststoffschicht überzogen werden, die freie Aminogruppen für die Festphasensynthese enthält.

An die freien Aminogruppen wird mithilfe von dem Fachmann geläufiger Standard fMoc-Peptidsynthese unter wasserfreien Bedingungen zunächst ein geeigneter Spacer von 2-3 Aminosäuren Länge synthetisiert.

Anschließend wird der Träger parallel zur X-Achse in 20 voneinander getrennte Bereiche unterteilt, die von den 20 verschiedenen jeweils in DMF gelösten aktivierten fMoc-Derivaten der Aminosäuren benetzt werden.

Die Kopplung der aktivierten Aminosäuren findet anschließend bei Raumtemperatur für 30-60 Minuten statt. Nach 3 maligem Waschen mit Dimethylformamid (DMF) wird die fMoc-Schutzgruppe mithilfe von 20% Piperidin in DMF abgespalten und erneut mit DMF gewaschen.

Der Träger wird erneut in 20 voneinander getrennte Bereiche unterteilt, diesmal parallel zur Y-Achse. Diese Bereiche werden wiederum von den 20 verschiedenen jeweils in DMF gelösten aktivierten fMoc-Derivaten der Aminosäuren benetzt gefolgt von der oben beschriebenen dem Fachmann geläufigen Standard fMoc-Peptidsynthese.

Nach der wie oben beschriebenen Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe ist in diesem Stadium der oben beschriebene Träger in 400 voneinander abgegrenzte Bereiche unterteilt, mit jeweils einem von 400 möglichen C-terminal durch einen Spacer an den Träger gekoppelten Dipeptiden deren N-Terminus frei, d. h. ohne Schutzgruppe vorliegt.

Für die nächsten Kopplungsschritte werden die oben beschriebenen aktivierten Aminosäuren einzeln statt in DMF in einem geeigneten bei 50 °C flüssigen, bei 4 °C festen Lösungsmittel gelöst, ein geeigneter das Laserlicht absorbierender und in Bezug auf die aktivierten Aminosäuren inerter Zusatzstoff, insbesondere ein Farbstoff oder Graphitpartikel, zugegeben, die Lösung tiefgefroren und in kleine Partikel zerrieben.

Diese Partikel werden bei 4-10 °C auf den über einem Array von Mikrolasern fest montierten Träger gestäubt, eine Abdeckplatte darübergelegt und ausgewählte Bereiche für 20-30 Minuten mit den Mikrolasern bestrahlt. Die Absorption des Laserlichts durch den beigemengten Farbstoff erwärmt dabei lokal in den bestrahlten Bereichen das bei den gewählten Temperaturen gefrorene Lösungsmittel und ermöglicht damit die

Kopplung der aktivierten Aminosäuren an die freien Aminogruppen ausschließlich in diesen Bereichen. Anschließend wird die Abdeckplatte entfernt, und die nicht gekop- pelten Aminosäuren werden mit DMF weggewaschen, wobei dieser Waschvorgang mit erwärmtem DMF 2x wiederholt wird.

Dieser Vorgang wird insgesamt 20x mit allen aktivierten Aminosäuren wiederholt, sodaß die oben beschriebenen 400 voneinander abgegrenzten Bereiche in 20 x 400 definierte Bereiche unterteilt werden, gefolgt von der oben beschriebenen Abspaltung der fMoc-Schutzgruppen mit 20% Piperidin in DMF.

Die Verlängerung der Peptide um eine 4. und 5. Aminosäure erfolgt anschließend analog zur Synthese der 3. Aminosäure, wobei wie oben beschrieben bei jedem Syntheseschritt jeder Bereich in 20 Bereiche unterteilt wird.

Schließlich werden alle Schutzgruppen mit 10% Silan in konzentrierter Trifluoressig- säure abgespalten, der Träger mit DMF und Methanol gewaschen und getrocknet, sodaß (3 im Endeffekt ein Träger mit 205 = 3. 200. 000 verschiedenen Bereichen entsteht, die jeweils eines von allen möglichen C-terminal gekoppelten Pentapeptiden repräsentieren. c) Untersuchung von Blutserum unter Verwendung einer Compact Disc mit einer darauf fixierten Peptidbibliothek Die CD wird mit dem Blutserum eines Patienten gefärbt, wozu zunächst unspezifische Bindungen mit einer geeigneten wäßrigen Lösung, wie zum Beispiel 2 % Milchpulver in PBS abgeblockt werden und das Blutserum im gleichen Puffer verdünnt wird, worauf dann die Oberfläche der CD unter leichtem Schütteln für 60 Minuten mit dem Serum benetzt wird. Die CD wird drei Mal gewaschen. Der an den Farbstoff Cy5 gekoppelte Ziege-Anti-Mensch-Antikörper wird in 2 % Milchpulver in PBS verdünnt ; an- schließend wird damit die Oberfläche der CD unter leichtem Schütteln für 60 Minuten

benetzt und sodann drei Mal gewaschen. Die mit dem zweiten Antikörper gefärbte Compact Disc wird in einem abgewandelten CD-Spieler ausgelesen. d) Auslesen einer gefärbten Compact Disc mittels eines umgebauten CD-Brenners Ein auf schwache Wattstärke eingestellter Brennlaser rastert die CD im ersten Durchlauf ab. Dabei werden eventuelle Fluoreszenzsignale mit Hilfe der in den CD-Brenner zu- sätzlich eingebauten Optik detektiert und den einzelnen CD-Bereichen zugeordnet. Diese zusätzliche Optik besteht aus einer fokussierenden Linse, die einen oder, wenn gewünscht, mehrere Pits auf einen Photomultiplier oder eine CCD-Kamera abbildet. Die Linse bildet dabei einen Punkt in Laufrichtung der CD außerhalb des Maximums des einstrahlenden Lasers ab. Zusätzlich wird das Laserstreulicht durch einen geeigneten Kantenfilter von dem Fluoreszenzsignal abgetrennt. Die Bereiche der CD, die im ersten Durchlauf ein Signal ergaben, werden in den folgenden Durchgängen gezielt angesteuert und mehrfach abgerastert. Die dabei abgelesenen Signale werden aufaddiert und den positiven Pits zugeordnet. e) Untersuchung von Blutserum unter Verwendung eines Trägers mit darauf fixierter Peptidbibliothek Wie bei Beispiel c) beschrieben wird der in diesem Beispiel fest auf einem Array von Mikrolasern montierte Träger mit einer in Beispiel b) beschriebenen lithographisch synthetisierten vollständigen Pentapeptid-Bibliothek mit einer geeigneten wässrigen Lösung, vorzugsweise 2% Milchpulver in PBS, abgeblockt, mit dem verdünnten Blutserum von Patienten inkubiert und anschließend mit einem Cy5 gekoppelten Ziege- anti-Mensch-Antikörpergefärbt.

Anschließend wird sequentiell jeweils ein Mikrolaser nach dem anderen angeschaltet und das von evtl. gebundenen Fluoreszenzmolekülen emitierte Licht mithilfe eines gröberen Rasters von Photodioden über dem Array von Mikrolasern ausgelesen, wobei jeweils die Diode im Intensitätsmaximum des gerade aktiven Anregungslasers ausgeschaltet ist (vgl. Fig. 2). Das von dem Anregungslaser verursachte Streulicht wird zusätzlich durch einen geeigneten Wellenlängenfilter von dem Fluoreszenzlicht abgetrennt.

Um das Signal/Rausch Verhältnis noch weiter zu verbessern, kann der einstrahlende Mikrolaser gepulst werden, wobei die Detektion des Fluoreszenzsignals in den Dunkelphasen des einstrahlenden Lasers erfolgt.

Die Fluoreszenzsignale werden in insgesamt 10 unterschiedliche Helligkeitsstufen unterteilt, die den einzelnen Mikrolasern (d. h. in diesem Fall den unterschiedlichen Pentapeptiden) zugeordnet werden.

Die Mikrolaser, die in einem ersten Durchlauf die höchsten Fluoreszenzsignale ergaben können anschließend mehrfach hintereinander zur Anregung verwendet werden, wonach die dabei erhaltenen Fluoreszenzsignale gemittelt werden. f) Synthese einer vollständigen 12mer Oligonukleotidbibliothek auf einem Träger mit Hilfe eines Arrays von Mikrolasern Wie in Beispiel b) für die Synthese einer vollständigen 5mer Peptidbibliothek beschrieben, wird ein geeigneter flacher durchsichtiger Träger mit freien Aminogruppen verwendet.

Falls nicht schon durch den ersten Schritt vorhanden, wird an die freien Aminogruppen mithilfe von dem Fachmann geläufiger Standardynthese unter wasserfreien Bedingungen

ein geeigneter Linker synthetisiert, der wiederum freie Aminogruppen auf dem Träger verankert, die diesmal jedoch ca 22 Atome von der Oberfläche entfernt sind.

Anschließend wird der Träger parallel zur X-Achse in 4 voneinander getrennte Bereiche unterteilt, die von 4 verschiedenen aktivierten Nucleosidanhydraten mit Schutzgruppen benetzt werden. Die Nucleoside koppeln anschließend an die freien Aminogruppen (Fig.

3). Anstelle des im basischen abspaltbaren Linkers kann auch ein unter diesen Bedingungen stabiler Linker verwendet werden.

Die Kopplung der aktivierten Nucleoside (mit Schutzgruppen) an den festen Träger, das Abspalten der Schutzgruppen und die Waschschritte finden unter den dem Fachmann bekannten Standardbedingungen für die Oligonukleotidsynthese statt. Beispiele für die dabei verwendeten Schutzgruppen sind : -DMTr für das 5'-Ende der Nucleoside (Fig. 3) -Benzoyl im Falle der Basen Adenin und Cytosin (Fig. 4) -Isobutyryl im Falle der Base Guanin (Fig. 4) -Methoxy-oder Betacyanoethyl-im Falle der Phosphatgruppen (Fig. 4) Nach der Abspaltung der DMTr-Schutzgruppe von dem 5'-Ende der Nucleoside wird im nächsten Schritt der Träger erneut in 4 voneinander getrennte Bereiche unterteilt, die diesmal parallel zur Y-Achse verlaufen. Diese Bereiche werden diesmal von den 4 verschiedenen, mit Hilfe einer schwachen Säure wie Tetrazol aktivierten Phosphorami- dit-Derivaten benetzt. Durch die Kopplung der aktivierten Phosphoramidite an das freie 5'-OH-Ende findet eine Kettenverlängerung um eine Base statt (Fig. 5).

Im nächsten Schritt werden evtl. verbliebene freie 5'-OH-Enden mit einem"Cap" versehen, sodaß sie an späteren Reaktionen nicht mehr teilnehmen können (Fig. 6).

Ein letzter Schritt, in dem trivalente Phosphatgruppen oxidiert werden beschließt den Synthesezyklus (Fig. 7).

Die oben beschriebene Synthese entspricht dem dem Fachmann geläufigen Standard der Oligonukleotidsynthese. Im Unterschied zu der geläufigen Standardsynthese werden allerdings die Oligonukleotide derart auf dem festen Träger verankert, daß sie nach der abschließenden vollständigen Abspaltung der Schutzgruppen nicht von dem Träger abgespalten werden, sondern an den Träger gekoppelt verbleiben.

Anschließend wird die DMTr-Schutzgruppe wiederum mithilfe von TCA vom 5'-OH Ende abgespalten, sodaß sich auf dem oben beschriebenen Träger in diesem Stadium 16 unterteilte voneinander abgegrenzte Bereichebefinden, mit jeweils einem von 16 möglichen über das 3'-Ende durch einen Spacer an den Träger gekoppelten Dinukleoti- den deren 5'-Ende eine freie OH-Gruppe trägt.

Für die nächsten Kopplungsschritte werden die oben beschriebenen aktivierten Phosphoramidit-Derivate einzeln statt in Acetonitril in einem geeigneten bei 50 °C flüssigen, bei 4 °C festen Lösungsmittel gelöst, ein geeigneter das Laserlicht absorbierender und in Bezug auf die aktivierten Nukleoside inerter Farbstoff, insbesondere Graphitpartikel, zugegeben, die Lösung tiefgefroren und in kleine Partikel zerrieben.

Diese Partikel werden bei 4-10 °C auf den über einem Array von Mikrolasern fest montierten Träger gestäubt, eine Abdeckplatte darüber gelegt und ausgewählte Bereiche für 20-30 Minuten mit den Mikrolasern bestrahlt. Die Absorption des Laserlichts durch den beigemengten Farbstoff erwärmt dabei lokal in den bestrahlten Bereichen das bei den gewählten Temperaturen gefrorene Lösungsmittel und ermöglicht damit die Kopplung der aktivierten Phosphoramidit-Derivate an die freien 5'-OH-Enden ausschließlich in diesen Bereichen. Anschließend wird die Abdeckplatte entfernt, und die nicht gekoppelten Phosphoramidit-Derivate werden mit kaltem Acetonitril weggewaschen. Anschließend wird dieser Waschvorgang mit erwärmtem Acetonitril 2x wiederholt.

Dieser Vorgang wird insgesamt 4x mit allen aktivierten Phosphoramidit-Derivaten wiederholt, sodaß die oben beschriebenen 16 voneinander abgegrenzten Bereiche in 4 x 16 definierte Bereiche unterteilt werden, gefolgt von dem oben beschriebenen "Capping"verbliebener freier 5'-OH-Enden, der Oxidation der trivalenten Phosphat- gruppen und einer erneuten Abspaltung der DMTrSchutzgruppen mit TCA.

Die Verlängerung der Oligonukleotide um weitere 9 Basen erfolgt anschließend analog zur Synthese der 3. Base, wobei wie oben beschrieben bei jedem Syntheseschritt jeder Bereich in 4 definierte Bereiche unterteilt wird.

Schließlich werden alle Schutzgruppen mit Dichlormethan und Trichloressigsäure abgespalten, der Träger mit Acetonitril gewaschen und getrocknet, sodaß im Endeffekt ein Träger mit 412 = 16. 777. 216 verschiedenen Bereichen entsteht, die jeweils eines von allen möglichen aber das 3'-Ende gekoppelten 12mer Oligonukleotiden re- präsentieren. g) Untersuchung von Patienten-DNA unter Verwendung eines Arrays von Mikrolasern mit einer auf einem Träger fixierten 12mer Oligonukleotidbibliothek Der unter Beispiel f) beschriebene Träger mit einer darauf fixierten vollständigen Oligonukleotid-Bibliothek wird mit Patienten-DNA gefärbt. Unspezifische Bindungen werden z. B. mit DNA aus Heringsspermien abgesättigt.

Dem Patienten wird eine Tumor-Gewebsprobe und gleichzeitig eine Probe mit gesundem Gewebe entnommen und die darin enthaltene genomische DNA mithilfe eines oder mehrerer Paare von Tumorgen-spezifischen Primern (spezifisch z. B. für die Gene von p53, pl6, ras, c-myc, n-myc) in einer Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt.

Dabei werden FITC-markierte dNTPs in die Tumorprobe eingebaut, bzw. die Normalprobe mit biotinylierten dNTPs markiert, die Proben gemischt und auf den

Träger hybridisiert. Anschließend wird die hybridisierte Probe nachgefärbt mit einem chemisch gekoppelten Protein aus Streptavidin und Phycoerythrin an das zusätzlich der Fluoreszenzfarbstoff Cy5 gekoppelt wurde. Dadurch kann mit einer Anregungs- wellenlänge 2 verschiedene Fluoreszenzen gemessen werden.

Wie in Beispiel e) beschrieben, wird anschließend sequentiell jeweils ein Mikrolaser nach dem anderen angeschaltet und das von evtl. gebundenen Fluoreszenzmolekülen emitierte Licht mithilfe eines gröberen Rasters von Photodioden über dem Array von Mikrolasern ausgelesen, wobei jeweils die Diode im Intensitätsmaximum des gerade aktiven Anregungslasers ausgeschaltet ist. Das von dem Anregungslaser verursachte Streulicht wird zusätzlich durch einen geeigneten Wellenlängenfilter von dem Fluoreszenzlicht abgetrennt. Der Wellenlängenfilter wird dabei einmal auf den Fluores- zenzfarbstoff FITC und zum anderen auf den Tandemfarbstoff Phycorythrin-Cy5 (PE- Cy5) abgestimmt.

Die Fluoreszenzsignale werden dann jeweils in insgesamt 10 unterschiedliche Helligkeitsstufen unterteilt, die den einzelnen Mikrolasern (d. h. in diesem Fall den unterschiedlichen Oligonukleotiden) zugeordnet werden.

Die Mikrolaser, die in einem ersten Durchlauf ein von den anderen Bildpunkten auffällig unterschiedliches Verhältnis der FITC-Färbung zur PE-Cy5-Färbung ergaben, werden anschließend mehrfach hintereinander zur Anregung verwendet, wonach die dabei erhaltenen Fluoreszenzsignale aufsummiert werden und erneut das Verhältnis der FITC-Färbung zur PE-Cy5-Färbung bestimmt wird.

Auf diese Weise können Punktmutationen in Genen, die für die Prognose von Tumorerkrankungen wichtig sind, diagnostiziert werden. Im Unterschied zu den auf dem Markt befindlichen Systemen können mit einer vollständigen 12mer Oligonukleo- tidbibliothek viele Gene gleichzeitig analysiert werden.

In einem alternativen Ansatz dient die dem Patienten entnommene DNA als Template für die Vervielfältigung mit sogenannten Alu-Primern, die an die Ränder von sehr häufig im Genom vorkommenden repetitiven Alu-Sequenzen hybridisieren und die zwischen 2 Alusequenzen liegende nicht-repititive DNA vervielfältigen. Wieder werden FITC-markierte dNTPs in die Tumorprobe bzw. biotinylierte dNTPs in die Normal- probe eingebaut, die Proben gemischt auf den Träger hybridisiert.

Das Auslesen der Fluoreszenzsignale erfolgt anschließend wie oben beschrieben. Auf diese Weise wird das gesamte Genom auf Unterschiede zwischen normalem und Tumorgewebe abgerastert, wodurch neue diagnostische Marker entdeckt werden können, die wichtige Informationen für die Tumorprogression liefern. h) Kombination des Fluoreszenzdetektors gemäß Beispiel d) mit einem Massenspek- trometer Der Fluoreszenzdetektor gemäß Beispiel d) bzw. nur der CD-Brennerteil ohne zusätzliche Fluoreszenz-Optik wird mit einem evakuierbaren Gefäß umhüllt. An der Stelle des normalen Probenhalters eines Massenspektrometers befindet sich der Brennpunkt des Brennlasers. Der Brennlaser kann beliebige Punkte auf der CD ansteuern und die darauf befindlichen Moleküle wegsprengen, die dann mittels des Massenspektrometers untersucht werden können.

Ein solchermaßen kombiniertes Gerät erlaubt es, die Bindungspartner zu analysieren, die sich bei der Kombination von zwei hochkomplexen Molekülbibliotheken bilden, während es bei den bislang bekannten Techniken nur möglich ist, zwei Molekülbiblio- theken miteinander zu kombinieren und zu analysieren, die um mehrere Größen- ordnungen weniger komplex sind.

Statt einem Massenspektrometer kann im übrigen auch eine bewegliche Vorrichtung angebracht werden, mit der Phagen oder DNA von einzelnen Pits der CD zurückgewon- nen werden können. i) Sequenzierung komplexer DNA mittels festphasen-gekoppelter Oligos Verwendet wird die in Beispiel f) beschriebene vollständige 12mer Oligonukleotidbi- bliothek. Im Unterschied zu Beispiel f) muß hierbei jedoch die Syntheserichtung "umgedreht"werden, d. h. die analog DMTr abspaltbare Schutzgruppe muß sich am dafür am 3'-OH-Ende befinden, so daß am Ende eine festphasengekoppelte Oligonu- kleotidbibliothek mit freien 3'-Enden vorliegt. Die Hybridisierungsbedingungen werden dabei so gewählt, daß es-wenn überhaupt-nur zu sehr wenigen Mismatches zwischen den Oligonukleotiden und den daran hybridisierten Templates kommt. Die Komplexität der festphasen-gekoppelten Oligonukleotide sollte die der zu sequenzierenden DNA übertreffen. Nicht hybridisierte cDNA wird weggewaschen. Eine Sequenzreaktion nach Sanger mit vergleichsweise vielen ddNTPs in der Reaktionslösung wird durchgeführt, so daß im Schnitt eine Verlängerung der Oligoprimer um durchschnittlich 20 Nukleotide stattfindet. Danach wird das Template durch Hitze wieder abgelöst. Anschließend wird die Sequenzinformation in dem in Beispiel h) beschriebenen kombinierten CD-Brenner- Massenspektrometer ausgelesen, wobei der Brennlaser ausgewählte, durch die Se- quenzreaktion verlängerte Oligonukleotide verdampft, so daß die Sequenzinformation dann mittels des Massenspektrometers detektiert werden kann. j) Wiederholtes Färben einer großen Anzahl definierter Lymphozyten Aus dem Blutserum eines Menschen werden mit Standardmethoden die Lymphocyten gewonnen und diese mit Standardmethoden (0, 37% Paraformaldehyd in PBS) fixiert.

Ca. 108 solcherart fixierter Lymphocyten werden auf der Oberfläche einer CD oder eine Fluorescence Multilayer Disc (FMD) verteilt und dort auf der Oberfläche fixiert.

Die FMD oder CD wird anschließend in eine dicht schließende Gummimanschette gelegt und unspezifische Bindungen mit 5 % Milchpulver in PBS blockiert.

Etwa 150 unterschiedliche monoklonale Antikörper werden einzeln mit Fluoreszenzmar- kierungen konjugiert, darunter z. B. Phycoerythrin, EGFP, EBFP, EYFP, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7. Optional können daher vorher die entsprechenden Fab-Fragmente hergestellt werden. Kennzeichen der konjungierten monoklonalen Antikörper ist, dass sie unterschiedliche Oberflächenantigene menschlicher Lymphocyten erkennen, darunter CD-Antigene, Rezeptoren für Wachstumshormone, Apoptose-assoziierte Proteine und homing-Rezeptoren.

Die auf der FMD oder CD fixierten Lymphocyten werden anschließend mit den Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern inkubiert (60 Minuten bei 37 °C in 5 % Milchpulver in PBS und 0, 5 % Tween 20). Für eine Färberation der fixierten Lymphocyten werden dabei vorzugsweise jeweils 2 bis 5 mit unterschiedlichen Fluoreszenzen konjugierte Antikörper verwendet. Nachdem ungebundene Antikörper durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt wurden, wird die CD oder FMD in ein im wesentlichen handelübliches CD oder FMD-Laufwerk eingelegt und abgespielt.

Dabei wird die Abspielzeit aufgrund der integrierten Positionsmarkierungen (wiederhol- bar und ansteuerbar) in > 108 unterschiedliche Zeiteinheiten unterteilt. Während jeder dieser Zeiteinheiten erfaßt der zum Abtasten verwendete Laserstrahl eventuell auf der Oberfläche befindliche fluoreszierende Moleküle (d. h., die Lymphocyten bindende Antikörper). Das Fluoreszenzlicht wird in verschiedene Farbanteile zerlegt und vorzugsweise nach dem Prinzip des konfokalen Lasermikroskops erfaßt. Jeder Zeiteinheit wird somit (u. U. wiederholbar) eine Fluoreszenzintensität zugeordnet und abgespeichert, vozugsweise mehrere unterschiedliche Fluoreszenzen gleichzeitig.

Anschließend wird die FMD oder CD entnommen, die darauf befindlichen Fluoreszen- zen durch die Bestrahlung mit sehr intensivem Licht ausgebleicht und wie oben beschrieben erneut mit weiteren Fluoreszenz-markierten Antikörpern gefärbt. Wie

beschrieben werden erneut die Fluoreszenzintensitäten den (gleich gebliebenen) Zeiteinheiten zugeordnet. Eine mehrmalige Wiederholung dieses Vorgangs ordnet jeder Zeiteinheit bis zum 150 verschiedene, den genannten monoklonalen Antikörpern entsprechende Signalintensitäten zu.

Die einer Zeiteinheit zugeordneten Signalintensitäten werden unterschiedlichen Zellkategorien zugeordnet und die Zahl der jeweiligen Zellkategorien bestimmt (CD3 ist z. B. charakteristisch für einen T-Lymphocyten, CD4 definiert T-Helferzellen, CD8 cytotoxische T-Zellen, CD19 ist charakteristisch für B-Lymphocyten eines definierten Differenzierungsstadiums usw.). k) Diagnose von Lymphocyten Die in Beispiel j) beschriebene Färbung von Lymphocyten wird mit den Blutzellen von klinisch unauffälligen Patienten durchgeführt. Die dabei erhaltenen Signalmuster werden mit den Signalmustern verglichen, die bei der Färbung der Blutzellen von Patienten mit diagnostizierten Morbus Crohn, Herzinfarkt, Parkinson, multipler Sklerorse, Lymphone, insbesondere präklinische Lymphone oder systemischem Lupus erytherma- todes erhalten werden.

Bezugszeichenliste 1 unbenutzt 2 an den Träger gekoppelte Moleküle 3 Matrixschicht 4 Aggregate, die an an den Träger gekoppelte Moleküle binden 5 Substanzen 6 elektromagnetische Wellen 7 lokal engbegrenzter, ausgewählter Bereich 8 andere Moleküle, die mit an den Träger gekoppelten Molekülen (2), oder die mit Aggregaten an diese Moleküle (4) in Wechselwirkung treten 9 immobilisierte Substanzen 10 Oberseite 11 beweglich gemachte Substanzen 12 Träger 13 elektromagnetische Wellen oder angelegte Spannung 14 Moleküle 15 unterschiedliche Substanzen 16 Achse 17 Mischarray 18 Bewegungspfeil 19 Quellen elektromagnetischer Strahlung 20 Pit 21 Isolator 22 Bewegungspfeil 23 Array von einzeln ansteuerbaren Detektoren 24 Fokussierlinse 25 größerer Bereich, der mehrere ausgewählte Bereiche (7) umfaßt 26 Laserstrahlen

27 Detektor 28 Detektor 29 Leuchtdiode, die gleichzeitig als Detektor verwendet werden kann 30 Linse 32 emittierte Lichtstrahlen 40 Array von Mikrolasern 42 Mikrolaser 44 Mikrolaser 46 Oberseite eines Trägers 48 Träger 50 Moleküle/-gruppe 52 Moleküle/-gruppe 54 Array von Detektoren 56 Detektor 58 Detektor 60 Wellenlängenfilter 62,62'Anregungsstrahlung (Strahlung eines Miroklasers) 64 Lumineszenzstrahlung