Stand der Technik: Durch den Einsatz hochspezifischer Marker, wie z.B. DNA-Proben oder Protein- Sonden, ist es möglich, in biologischen (Mikro-)Objekten, insbesondere in Zellen, Zell- kernen, Zellorganellen oder auf Chromosomen (im Folgenden abkürzend auch Objekt genannt), nahezu beliebig kleine (Sub-)Strukturen zu markieren. Solche Marker können Strukturen in Dimensionen von einigen ,um (104 m) bis zu wenigen zehn nm (10-9 m) spezifisch darstellen. Üblicherweise werden in diese Marker Reportermoleküle einge- bunden, die eine hohe Affinität zu entsprechenden Komplexverbindungen tragen, an die Fluorochrome, aber auch kolloidale Mikropartikel (z.B. Gold) angebunden sind. Es können aber auch solche Fluorochrome/Komplexe direkt in die Marker eingebaut werden. Das zur Verfügung stehende Farbemissionsspektrum der Fluorochrome reicht vom tief blauen über grün, rot bis in den infraroten Spektralbereich. Ebenso können Fluorochrome verwendet werden, die sich nicht in ihrem Spektrum der Anregung und/oder Fluoreszenzemission unterscheiden, sondern bei denen die Lebensdauer ihrer Fluoreszenzemission als Parameter zur Unterscheidung genutzt wird.

Letztere haben den Vorteil, da wellenlängenabhängige fokale Shifts nicht auftreten.

Fluorochrome können auch ein unterschiedliches Emissionsspektrum haben und damit verschiedene spektrale Signatur besitzen, aber mit derselben Photonenenergie angeregt werden, z.B. durch Mehrphotonenprozesse. Auch in diesem Fall können wellenlängen- abhängige fokale Shifts in der Anregung zwischen Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur vermieden werden.

Die oben genannten, an spezifische (Sub-)Strukturen in biologischen Mikroobjekten gebundenen Fluorochrome werden im folgenden als Fluoreszenzmarker bezeichnet.

Unter Fluoreszenz wird im folgenden jede Photonenwechselwirkung verstanden werden, bei der zwischen dem Anregungsspektrum und dem Emissionsspektrum eines Stoffes Unterschiede auftreten, die nicht auf monochromatische Absorption oder Streuung zurückgeführt werden können. Dies schlie t insbesondere auch Mehrphotonenwechsel- wirkungen ein, bei denen die Anregungswellenlängen grö er sein können als die Emis- sionswellenlängen. Ferner wird hier der BegriffFluoreszenz auch für die eng damit verwandten Phänomene der Lumineszenz, insbesondere die Phosphoreszenz verwendet.

Dies schlie t insbesondere längere mittlere Fluoreszenzlebensdauern ein, z.B. Fluores- zenzlebensdauern im Bereich von bis zu mehreren oder vielen msec (Millisekunden). Im folgenden werden die eng verwandten Vorgänge der Luminizsenz, Phosphoreszenz und Fluoreszenz als gleicherma en erfindungsrelevant angesehen. Stimmen Anregungs- spektrum und/oder Emissionspektrum und/oder die Fluoreszenzlebensdauern zweier Fluoreszenzmarkern überein, so haben sie hinsichtlich der jeweiligen Parameter die gleiche spektrale Signatur. Unterscheiden sie sich in einem oder mehreren für die Messung relevanten Parametern, so habe sie unterschiedliche spektrale Signatur.

Für die Detektion der Fluoreszenzmarker in ausgedehnten biologischen Objekten und fur die quantitative Lokalisation bezüglich definierter Objektpunkte/Objektstrukturen (Distanz- stanz- und Winkelmessungen) werden eine Reihe von lichtmikroskopischen Me verfahren eingesetzt. Hierbei handelt es sich vor allem um (a) die Epifluoreszenz- mikroskopie, (b) die Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie, (c) die Laser-Scanning Flu fluorometrie, (d) das Fernfeldmikroskopieverfahren des "Point-Spread-Function- Engineerings" und (e) die Wellenfeldmikroskopie. a) Bei der Epifluoreszenzmikroskopie mit einem klassischen aufrechten oder inversen Epifluoreszenzmikroskop wird das biologische Objekt durch dasselbe Objektiv beleuch- tet, durch das es auch detektiert wird. Anregungslicht und emittierte Fluoreszenz werden durch entsprechende optische Filter spektral diskrimiert und in verschiedenen Strahlen- gängen geführt. Die erzielbare Auflösung, d.h. die kleinste noch me bare Distanz zwischen zwei punktförmigen Objektstrukturen, die mit Fluorochromen gleicher spektraler Signatur markiert sind, ist entweder durch das Abbe-Kriterium (= das <BR> <BR> <BR> <BR> Maximum 0. Ordnung des Beugungsbildes eines Punktobjektes ist im I 1. Minimum des Beugungsbildes eines zweiten Punktobjektes lokalisiert) oder durch die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion gegeben. Diese hängt von der jeweiligen Wellenlänge, der Numerischen Apertur des verwendeten Objektivs, sowie von den lokalen Brechzahlen der Objekte, des Einbettungsmediums, der eventuell verwendeten Deckgläser und der eventuell eingesetzter Immersionsflüssigkeiten ab. (Ihre Dimension kann bei hoher Numerischer Apertur geringer als die Wellenlänge des zur Anregung verwendeten Lichtes sein.). b) Bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wird im Gegensatz zur Epifluores- zenzmikroskopie ein Laser in das Objekt fokussiert und die Fluoreszenz konfokal detek- tiert. Zur Erzeugung eines dreidimensionalen Bildes wird das Objekt mit dem Fokus- punkt in allen drei Raumrichtungen (x, y, z) abgerastert. Die erzielbare Auflösung ist wie bei der Epifluoreszenzmikroskopie durch die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion gegeben und hängt von der jeweiligen Wellenlänge, der Numerischen Apertur des verwendeten Objektivs, sowie von den lokalen Brechzahlen der Objekte, des Einbettungsmediums, der eventuell verwendeten Deckgläser und der eventuell eingesetzter Immersionsflüssigkeiten ab. c) Bei der Laser-Scanning Flu fluorometrie werden die Objekte beispielsweise durch einen freien oder in einer Küvette befindlichen Trägerflüssigkeitsstrahl einzeln durch eine entsprechende Lichtverteilung eines Fokus geführt (während bei der Epifluoreszenz- mikroskopie und der konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie die Objekte auf Objekt- haltern, d.h. Objektträgerplättchen, -trägerkapillaren, -trägerkammern, -trägerflüssig- keiten u.a., fixiert vorliegen). Die Lichtverteilung ist üblicherweise spaltförmig, d.h. das Objekt wird bezüglich einer Achse gerastert. Die erzielbare Auflösung ist durch die Fokusbreite des verwendeten Laserstrahls und/oder geeignet gewählter Detektions- blenden bestimmt, wobei die Variabilität in der Objekttrajektorie (= laminarer, üblicherweise zentraler "Flüssigkeitsfaden", ", der die Objekte trägt), abhängig vom Trägermedium und -verfahren, die Fokustiefe und damit auch die minimale Fokusbreite vorgibt. Der Vorteil von Flu fluorometrieverfahren liegt üblicherweise in der gegenüber der Epifluoreszenzmikroskopie und der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wesentlich höheren zeitlichen Detektionsrate, die bis zu einigen tausend Objekten pro Sekunde reichen kann. Die Fokusbreite entspricht der Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion der Slit-Scan Optik unter den verwendeten Bedingungen. d) Bei den Fernfeldmikroskopieverfahren des "Point-Spread-Function-Engineerings" wird die Punktbildfunktion optisch geschmälert. Dies kann durch kohärente Überlage- rung von zwei und mehreren Punktbildfünktionen erfolgen (z.B. 4Pi-Mikroskopie) oder durch Auslöschen der Fluoreszenz von Fluorochromen, die sich im Randbereich des jeweiligen zentralen Punktbildfunktionsmaximums befinden (z.B. STED-Mikroskopie, Ground-Depletion-Mikroskopie). Da die Auflösung eines Mikroskops durch die Halb- wertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion gegeben wird, wird somit die Halbwertsbreite verringert und die Auflösung verbessert. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> e) Bei der Wellenfeldmikroskopie gemä dem US-Patent Nr. 4,621,911 werden lumines- zente Präparate im optischen Mikroskop mit einem stehenden Wellenfeld beleuchtet (Standing Wave Field Fluorescence Microscopy, SWFM). Die Präparate werden in einer Zone äquidistanter ebener Wellenfronten angeordnet und zur Fluoreszenz oder Phospho- reszenz angeregt. Der Abstand der Wellenfronten und ihre Phase können zur Bilderzeu- gung variiert werden. Aus einzelnen optischen Schnitten kann durch Computer-Bildver- arbeitung die dreidimensionale Verteilung der fluoreszenten bzw. lumineszenten Objekt- punkte rekonstruiert werden.

Die ebenen Wellenfronten werden durch kohärente Überlagerung zweier Laserstrahlen unter einem definierten Winkel zur optischen Achse des Mikroskopsystems erzeugt, wobei der Winkel den Abstand der Wellenfronten untereinander bestimmt bei gegebener Wellenlänge und Brechungsindex. An Stelle von zwei sich kreuzenden Laserstrahlen kann das Wellenfeld auch dadurch erzeugt werden, da ein Laserstrahl nach geeigneter Reflexion unter einem bestimmten Winkel mit sich selbst zur Interferenz gebracht wird. Im Mikroskopaufbau sind in diesem Falle die Wellenfronten senkrecht zur optischen Achse des detektierenden Objektives angeordnet. Die Fluoreszenz bzw. Lumi- neszenz wird entweder wie beim Epifluoreszenzmikroskop durch entsprechende opti- sche Filter spektral diskriminiert und in verschiedene Strahlengänge geführt oder konfo- kal detektiert. Die erzielbare Auflösung ist wie bei der Epifluoreszenzmikroskopie und der Konfokalen-Laser-Scanning-Mikroskopie durch die Halbwertsbreite des Haupt- maximums der effektiven Punktbildfunktion gegeben und hängt von der jeweiligen Wellenlänge, der Numerischen Apertur des verwendeten Objektivs, sowie von den lokalen Brechzahlen der Objekte, des Einbettungsmediums, der eventuell verwendeten Deckgläser und der eventuell eingesetzter Immersionsflüssigkeiten ab.

Lateral besitzt das System eine Auflösung wie ein übliches Epifluoreszenzmikroskop oder Konfokales Laser Scanning Mikroskop; in axialer Richtung dagegen wird eine Tiefendiskriminierung und damit wesentlich verbesserte Auflösung erzielt.

Nachteile des Standes der Technik: 1.) Da die effektiven Punktbildfunktionen stark beeinflu t werden von der jeweiligen lokalen Brechzahl und Absorption im Objekt, im Einbettungsmedium des Objektes und in der Immersion (einschlie lich eventuell vorhandener Deckgläser), sind Distanzmessungen zwischen Objektstrukturen von der effektiven - d.h. der lokal im markierten Objekt- punkt gegebenen - Punktbildfinktion abhängig. Diese unterscheidet sich im allgemei- nen deutlich von berechneten Punktbildfunktionen des verwendeten Mikroskops. Auch die unter technisch optimierten Randbedingungen gemessenen Punktbildfunktionen unterscheiden sich in der Regel von den unter praktischen Routinelaborbedingungen in biologischen Objekten erzielbaren effektiven Punktbildfunktionen. Da diese effektiven Punktbildfunktionen meist nicht zur Verfügung stehen, greift man zur Kalibrierung der Distanzmessungen auf ideale, berechnete Ergebnisse zurück bzw. auf Kalibrierungsmessungen, die unter Standardbedingungen durchgeführt wurden, wie z.B.

Reflexionsverfahren. Beide Verfahren erfolgen zu Lasten der Präzision bei der dreidimensionalen Distanzmessung in biologischen Mikroobjekten. Als Folge ergibt sich eine erhebliche Unsicherheit der Bestimmung der tatsächlichen räumlichen Distanz zwischen den Objektstrukturen; bei biologischen Objekten beinhalten quantitative Grö enabschätzungen Unsicherheiten von bis zu mehreren Mikrometern. Eine Korrektur dieses Fehlers ist bei den bisher verwendeten Methoden nur begrenzt möglich, nämlich nur unter Standardbedingungen, deren tatsächliche Realisierung/Einhaltung im biologischen Objekt jedoch nicht genau kontrolliert bzw. gewährleistet werden kann.

Zwei Objektstrukturen der gleichen spektralen Signatur können nur dann separiert werden, wenn sie mindestens eine Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion von einander entfernt sind.

2.) Bei allen oben beschriebenen Fernfeld-Verfahren besteht das Problem, da die Breite des Hauptmaximums der Punktbildfunktion und damit die Auflösungsgrenze von der relativen Lage im Raum abhängt. So ist z.B. bei der Epifluoreszenzmikroskopie oder der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie die Punktbildfunktion lateral (senkrecht zur optischen Achse) schmäler als axial (in Richtung der optischen Achse). Bei statischen Mikroskopieverfahren kann dieser Nachteil zwar mit Hilfe der sog. Mikroaxialtomo- graphie überwunden werden. Bei diesem Verfahren werden die (biologischen) Objekte in Kapillaren oder auf Glasfasern angeordnet und definiert im Mikroskop um eine Achse gedreht, die normalerweise senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops steht. Dabei werden Abstandsmessungen in derjenigen Richtung durchgeführt, die die schmalste Halbwertsbreite der effektiven Punktbildfunktion besitzt. Bei der Flu fluorometrie ist dieses Verfahren jedoch kaum einsetzbar.

3.) Bei der. "eindimensionalen" Wellenfeldmikroskopie (SWFM) führt das periodische Wellenfeld bei epifluoreszenter Detektion in Verbindung mit Verfahren des Optical Sectioning zu einer Mehrdeutigkeit in der Abbildung der Objektstrukturen grö er als X/2n (X=Wellenlänge der Anregung, n= effektiver Brechungsindex). Diese Mehr- deutigkeit erschwert zunächst eine effektive Nutzung der durch das Interferenzmuster erzielten Auflösungsverbesserung.

4.) Hochpräzisionsdistanzmessungen mit Lichtmikroskopie-Fernfeldverfahren gelten nach dem Stand der Technik nur bis in den Grö enordnungsbereich hundert Nanometer durchfuhrbar. Für Messungen im Distanz- und Genauigkeitsbereich der Grö enordnung 10 nm werden die Verfahren der Elektronenmikroskopie, Rastertunnelmikroskopie, atomare Rasterkraftmikroskopie, biologische und optische Nahfeldmikroskopie einge- setzt. Bei diesen Verfahren handelt es sich jedoch - im Gegensatz zu den optischen Fernfeldverfahren - um flächenorientierte und nicht volumenorientierte Me verfahren; d.h. sie eignen sich im Prinzip nur für Strukturuntersuchungen und Distanzmessungen an Oberflächen und in dünnen Schichten. Informationen über die Lage von Objekten bzw.

Objektstrukturen im dreidimensionalen Raum können allenfalls anhand von mechanisch präparierten Schnittserien und einer Auswertung von Messungen in Einzelbildern erhalten werden. Dreidimensionale Messungen in intakten oder gar vitalen biologischen Mikroobjekten, z.B. dreidimensionalen (konservierten) Zellen, Zellkernen oder Zellorga- nellen, sind nicht möglich.

Aufgabe der Erfindung: Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die Fernfeldmikroskopie und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen, mit dem bzw. mit der es möglich ist, Distanzmessungen zwischen Objektstrukturen, deren Abstand voneinander geringer ist als das Auflösungsvermögen des betreffenden Fernfeld- mikroskops, d.h. die weniger als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion voneinander entfernt liegen, unabhängig von der Lage der betreffen- den Objektstrukturen im dreidimensionalen Raum, mit hoher Genauigkeit durchzuführen.

Erfindungsgemä e Lösung dieser Aufgabe: Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens der eingangs genannten Art, das ein Kalibrierverfahren für die Fluoreszenzfernfeldmikroskopie und Flu fluorometrie ist und die folgenden Verfahrensschritte umfa t: Vor, während oder nach der Präparation des betreffenden Objekts auf bzw. in einem Objekthalter, insbesondere Objektträgerplättchen, Objektträgerfaser/-kapillare oder Objektträgerflüssigkeit, werden die zu untersuchenden bzw. zu ortenden Strukturen (Me strukturen) mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener und/oder gleicher spektraler Signatur markiert, d.h. solche zu ortende Strukturen (Me strukturen), die sich in unmittelbarer Nähe zueinander, nämlich innerhalb der Halbwertsbreite des Hauptmaximums ihrer effektiven Punktbildfunktion, befinden, werden mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener spektraler Signatur markiert, während solche Me strukturen, deren Abstand voneinander grö er ist als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion, mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener oder gleicher spektraler Signatur markiert werden. Zwei zu ortende Me strukturen dürfen immer dann mit der gleichen spektralen Signatur markiert sein, wenn sie z.B. durch ihre relative Lage oder durch andere Kriterien eindeutig identifiziert werden können.

Mit den gleichen Fluoreszenzfarbstoffen werden Kalibriertargets definierter Grö e und räumlicher Anordnung markiert, die fluoreszierenden Kalibriertargets werden entweder zusammen mit den Objekten oder separat auf bzw. in dem bzw. einem Objekthalter (Objektträgerplättchen, Obj ektträgerfaser/-kapillare, Obj ektträgertlüssigkeit o.a.) präpariert.

(Untersuchungs-)Objekt und Kalibriertargets werden unter übereinstimmenden Bedingungen, gleichzeitig oder nacheinander mikroskopisch oder flu fluorometrisch untersucht.

Jeweils zwei definierte Kalibriertargets verschiedener spektraler Signatur werden unter Berücksichtigung des wellenlängenabhängigen Abbildungs- und Lokalisations- verhaltens des jeweiligen optischen Systems (Mikroskop oder Flu fluorometer) vermessen, die dabei ermittelten Messwerte gleich Ist-Werte werden mit den vorbekannten tatsächlichen Distanzwerten gleich Soll-Werten (d.h. den aufgrund der Geometrie berechneten Solllokalisationen) verglichen, und die Differenz zwischen Ist- Werten und Soll-Werten, nämlich der Kalibrierwert, wird zur Korrektur des durch das optische System bedingten Versatzes in der Detektion unterschiedlicher Emissionsloci insbesondere der Me strukturen verwendet.

Mit anderen Worten: Die Distanzmessung zwischen den (je nach Abstand voneinander) mit verschiedenen oder gleichen spektralen Signaturen markierten Objekt-(Sub-) Strukturen - im folgenden auch Me strukturen genannt - wird anhand der hochpräzisen Lokalisation unabhängiger (Kalibrier-)Targets mit entsprechend spektraler Signatur und mit bekannter Grö e und räumlicher Anordnung, unter Berücksichtigung des wellenlängenabhängigen Abbildungs- und Lokalisationsverhaltens des jeweiligen optischen Systems durchgeführt, wobei die Kalibriermessung zwischen den (Kalibrier-) Targets und die Messung im biologischen Objekten unter gleichen System- und Randbedingungen stattfindet. Diese Kalibriertargets haben diesselbe oder eine höhere Multispektralität wie die zu messenden (Objekt-)Strukturen. Sie können direkt in den biologischen Objekten angeordnet sein, oder als separate Präparate auf einem Obj ekthalter (Obj ektträgerplättchen oder Objektträgerfaser/-kapillare oder Objektträgerflüssigkeit o.ä.) vorliegen oder Teil eines Objekthalters sein.

Zwei oder mehrere fluoreszierende Me strukturen in intakten, dreidimensionalen biologischen Objekten, deren Abstand und Ausdehnung kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion ist, können aufgrund ihrer unterschiedlichen spektralen Signatur (Fluoreszenzabsorptionswellenlängen und/oder Fluoreszenzemissionswellenlängen und/oder Fluoreszenzemissionslebensdauern) diskriminiert werden, d.h. ihr Abstand untereinander kann bestimmt werden.

Die Abstandsmessung wird auf die Lokalisation der einzelnen Me strukturen reduziert und kann - nun auch in der optischen Fernfeldmikroskopie oder Flu fluorometrie mit einer wesentlich höheren Genauigkeit als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der Punktbildfunktion durchgeführt werden. Die Lokalisation des Schwerpunkts der betreffenden Me strukturen wird auf die Maximalintensität ihres Fluoreszenzsignals angepa t. D. h. aus dem gemessenen (beugungsbegrenzten) Signals (=Intensitätskurve) eines Fluoreszenzpunktes (=fluoreszierende Me struktur) wird - unter Berücksichti- gung der Gesamtinformation aus Haupt- und Nebenmaxima - der Schwerpunkt (das Baryzentrum) des Signals bestimmt und damit der Ort der Me struktur. Bei fehlerfreiem optischen System und infolgedessen idealer Symmetrie der gemessenen Intensitätsverteilung (=Verlauf der Intensitätskurve) kolokalisiert der Schwerpunkt (das Baryzentrum) der Intensitätskurve innerhalb der Lokalisationsgenauigkeit mit dem Hauptmaximum (=Maximim 0. Ordnung des Beugungsbildes) der gemessenen Intensitätsverteilung.

Vorteile der Erfindung: Das Verfahren erlaubt es mittels optischer Fernfeld-Mikroskopie bzw. Scanning-Flu - fluorometrie, geometrische Distanzen in biologischen Mikro-Objekten zu messen, wobei die zu bestimmenden Distanzen geringer sein können als die Halbwertsbreite des Haupt- maximums der effektiven Punktbildfunktion im Objekt. Da der Informationsgehalt der erfindungsgemä durchgeführten Distanzbestimmungen einer bei erhöhter Auflösung gewonnenen Distanzmessung entspricht, kann abkürzend auch von Auflösungsäquivalent gesprochen werden. Die Messungen von solch geringen Distanzen in biologischen Mikroobjekten ist von gro er Bedeutung z.B. für wissenschaftliche Fragestellungen in Biologie und Medizin, aber auch für bestimmte Aspekte der klinischen Forschung und der Diagnostik an Präparaten.

Die multi spektrale Kalibrierung erlaubt es, in situ Messungen über das Abbildungs- verhalten des Systems am konkreten biologischen Objekt durchzuführen. Bei Verwen- dung der Fluoreszenzlebensdauer als alleinigem Parametertyp und/oder bei Anregung der Fluorochrome mit derselben bzw. denselben Photonenenergie(n) entfällt aufgrund der Kalibrierung die in situ Korrektur des chromatischen Versatzes in der Objektebene. Für höchstauflösende Fernfeld-Mikroskoptypen wie z.B. das Wellenfeldmikroskop und bei Verwendung erfindungsgemä er Fluoreszenzmarker ermöglicht die Erfindung drei- dimensionale geometrische Distanzmessungen in biologischen Objekten bis hinunter zu molekularer Präzision (d.h. Auflösungsäquivalent besser 10 nm).

Im Gegensatz zur Elektronenmikroskopie bzw. zur optischen und nicht-optischen Nah- feldmikroskopie bleibt die dreidimensionale Struktur des zu untersuchenden Objektes intakt, da auf mechanische Schnitte verzichtet wird. Damit können in dreidimensional konservierten Mikroobjekten 3D-Distanzmessungen mit einem Bereich kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion vorgenommen werden. Insbesondere eröffnet das Verfahren die Möglichkeit, dreidimensionale Distanzmessungen auch unter vitalen Bedingungen des biologischen Objektes durchzu- führen. Im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Verfahren des Point Spread Function Engineering besteht ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, da auch bereits vorhandene Systeme der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie als Basis für die erfindungsgemä e Steigerung des Auflösungsäquivalents verwendet werden können.

Für die Detektion der Fluoreszenzemission eignen sich sowohl ein- und zweidimensio- nale rasternde als auch nicht-rasternde elektronische bzw. optoelektronische Detektor- systeme.

Ein Einsatz des erfindungsgemä en Verfahrens bietet sich insbesondere an für multi- spektrale Präzisionsdistanzmessung in biologischen Mikroobjekten zur absoluten und relativen Lokalisation und Distanzmessung von fluoreszenten Me strukturen beliebiger spektraler Signatur.

Vorteilhafte Ausführungsformen und Weiterbildungen der Erfindung: Um bei Verwendung von statischen Mikroskopsystemen eine möglichst scharfe Punkt- bildfunktion zu erhalten, sollte das biologische Objekt für die mikroskopischen Untersuchung axialtomographisch gedreht werden können (Mikroaxialtomographie). Auf diese Weise können Anisotropien in der 3D-Punktbildfunktion so überwunden werden, da zwei Objektpunkte jeweils in einer Ebene mit der relativ besten Punktbildfunktion liegen. Das biologische Objekt ist vorzugsweise in oder an einem drehbaren Träger mit kreisförmigem, rechteckigem oder vieleckigem Querschnitt fixiert oder in anderer Weise befestigt.

Der Träger besteht aus einem für die verwendeten Lichtwellenlängen transparenten Material, dessen Brechungsindex sich um höchstens 12 % von dem des umgebenden Mediums unterscheidet. Er kann hohl oder massiv sein und und sein Querschnitts- durchmesser sollte kleiner oder gleich 300 ,um betragen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemä en Verfahrens wird der im Querschnitt dreieckige, viereckige oder vieleckige) Träger für axialtomographische Untersuchungen um die Winkel X m m 360/3 [0], f m = 360/4 [0], oder #m m 360/n [0] gedreht, wobei n die Zahl der planaren Seiten des Trägers ist. Eine Abstandsmessung zwischen den Kalibriertargets und/oder Me strukturen wird bei einem, mehreren, oder jedem dieser Winkel, jeweils für eine zwei oder mehrere spektrale Signaturen vorgenommen.

Zur Ermittlung von Ist- und Sollwerten, zu deren Vergleich und zur Bestimmung des Korrekturwerts/Kalibrierwerts werden vorzugsweise die folgenden Verfahrensschritte durchgeführt: - ein oder mehrere Kalibriertargets B mit einem Abstand grö er als die Halbwertsbreite des Hauptmaximum der effektiven Punktbildfunktion vom Schwerpunkt der N Me - strukturen wird/werden mit einer beliebigen spektralen Signatur markiert, - die Abstände dik (i, k = 1. . N, i #k ) der Schwerpunkte der spektral getrennten Beugungsfiguren der N Me strukturen und die Abstände diB der N Me strukturen zum Kalibriertarget B werden gemessen, wobei automatisierte Verfahren der Bildanalyse angewendet werden, - für eine Me struktur werden die Strecken dik und diB jeweils in der Ebene der schmalsten Punktbildfunktion sowie alle übrigen Distanzen gemessen werden, wozu das Objekt axialtomographisch jeweils um einen definierten Winkel 4>m gedreht wird, - optische Aberrationen aus den Kalibrierungsmessungen werden korrigiert, und an die korrigierten gemessenen Abstände dik zum ) und diB (#m ) wird jeweils eine Cosinus- funktion Aik cos (4> m + # ik) bzw. Ais cos (4> m + 0 iB) mit geeigneter Phasenverschie- bung angepa t, - die Maxima Aik und AiB der Anpassungsfunktion von dik bzw. die werden durch den Vergrö erungsfaktor dividiert und als euklidischer Abstand Dik bzw. DB der N Me - strukturen untereinander bzw. der Abstände der Me strukturen zum Bezugspunkt B bestimmt.

Für die Bestimmung der Maxima werden vorzugsweise zusätzlich die diesen entsprechenden Minima des Abstandes Zik, zin in der zu der Ebene der diK, diB orthogonalen Ebene herangezogen und analog ausgewertet.

Die Ermittlung aller Koordinaten der N Me strukturen und ihrer Relativkoordinaten zum Bezugspunkt B, d.h. die Ermittlung der Positionen xi, yi, zi und xk, yk, Zk bzw. der Abstände xk - xi, yk - yi, zk - zi und xB - xi, yB - yi, zB - zi, erfolgt erfindungsgemä auf der Grundlage der mikroskopisch gemessenen 3D-Abstände Dik bzw. DiB, ,. vorzugsweise unter Verwednung des folgenden Gleichungssystems D2ik = (xk - xi)2 + (yk - yi)2 + (zk - zi)2 D2iB = (xB - xi)2 + (yB - yi)2 + (zB - zi)2 D2kB = (xB - xk)2 + (yB - yk)2 + (zB - zk)2 Zur Absicherung der ermittelten Me ergebnsisse sollte die vorstehend beschriebene Vorgehensweise für mehre Kalibriertargets B und die gleichen N Me strukturen durchgeführt werden.

Die Koordinaten und Abstände der N Me strukturen können anhand der Schwerpunkte ermittelt werden, die sich aus Schwerpunktmittelungen der Messungen zu allen Bezugs- punkten ergeben.

Insbesondere für graphische Darstellungen werden die ermittelten Positionen xi, yi, z und xB, yB, Zg vorzugsweise mit einer Punktbildfunktion gefaltet, die eine Halbwertsbreite mit dem jeweils erreichten Auflösungsäquivalent besitzt.

Zur Fluorochrommarkierung von Me strukturen und Kalibriertargets werden vorzugs- weise solche Fluorochrome verwendet, die im ultravioletten, sichtbaren und/oder infraroten Lichtwellenlängenbereich angeregt werden können und die im ultravioletten, sichtbaren und/oder infraroten Lichtwellenlängenbereich emittieren.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden markierte Regionen des biologischen Objekts mit bekannter Distanz voneinander als Kalibriertargets verwendet.

Diese Markierung kann beispielsweise mit geeigneten biochemischen Sonden durchgeführt werden.

Die Verwendung biologischer Kalibriertargets hat gegenüber der Verwendung synthetischer Kalibriertargets, beispielsweise Kalibrierkügelchen, den praktischen Vorteil, da bei der Kalibrierung neben den optischen Randbedingungen des Objektes zusätzlich präparativ bedingte Randeffekte in die Kalibrierung einflie en, wie z.B. das Verhältnis aus tatsächlichen Fluoreszenzsignal zu unspezifischem Hintergrund (das durch automatische Bildanalysealgorithmen bestimmt wird).

Als nicht-biologische bzw. synthetische Kalibriertargets eignen sich ganz besonders Mikrokügelchen, die die gleiche oder eine höhere multispektrale Signatur als die zu ortenden Me strukturen aufweisen. Sie werden wie die biologischen Objekte behandelt.

Solche Kalibriertargets sind vorzugsweise auf Objekthaltern in definierter Raumanord- nung fixiert. Die Fixierung kann bereits bei der Fabrikation der betreffenden Objekträger geschehen , was insbesondere für die Routinebenutzung von Vorteil ist.

Zur Durchführung der erfindungsgemä en Distanzmessung unter Verwendung eines Mikroskops mit Axialtomograph werden die biologischen Objekte mit den Me struk- turen und den/die Kalibriertargets in oder auf einer Mikrokapillare oder Glasfaser als Objekthalter bzw. Objektträger präpariert. Die Kapillare/Faser hat einen exakt definierten Durchmesser, wobei verschiedene Durchmesser möglich sind. Zur Festlegung dieser Kapillare/Faser auf dem Mikroskoptisch wird erfindungsgemä eine spezielle Halterung vorgeschlagen, die aus einem starren, vorzugsweise dorsiventral abgeplatteten Rahmen besteht, an bzw. auf dem wenigstens eine Lagerbuchse montiert ist, in der eine Mikro- kapillare oder Glasfaser um ihre Längsachse rotierfähig und mit der Rotationsachse senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops gelagert werden kann. Die Lager- buchse(n) sollten (sind) so angeordnet sein, da die Rotationsachse der Kapillare/Faser senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops verläuft. Die Drehung der Untersu- chungsobjekte in oder an der Kapillare/Faser erfolgt durch Drehung der Kapillare/Faser direkt, vorzugsweise vermittels eines Drehmotors. Das hat den Vorteil, da die einmal eingestellte und justierte Optik des Mikroskops unverändert beibehalten werden kann.

Zur Unterstützung bzw. Stabilisierung der zu drehenden Kapillare/Faser gegen Durch- hängen oder Verschieben im Bereich der Ausnehmung des Rahmens ist ein aus- tauschbarer Einsatz für den Rahmen vorgesehen. Dieser Einsatz kann insbesondere aus Plastik oder Glas gefertigt sein und eine grabenförmige Vertiefung in Längsrichtung der Kapillare/Faser aufweisen. Zur leichteren Handhabung, vor allem beim Einsetzen in den Rahmen, kann dieser Einsatz einen oder mehrere Klemmschlitz(e) aufweisen.

Der erfindungsgemä e Rahmen hat vorzugsweise ähnliche Au enma e wie ein her- kömmliches Objektträgerplättchen, d.h. seine Länge beträgt weniger als 77 mm und seine Breite weniger als 27 mm, und er ist sehr leicht, d.h. er wiegt beispielsweise nur ca. 15 Gramm. Mit einem Computergesteuerten Schrittmotor kann die Kapillare/Faser um einen exakt definierten Winkel um ihre Achse gedreht werden. Da diese Drehkraft direkt an der Kapillare/Faser ansetzt und nicht an ihrer Halterung, ist die Gefahr, da die Kapillare/Faser verschoben wird und aus dem Blickfeld des Mikroskops gerät oder da gar der ganze Mikroskoptisch verrückt bzw. verschoben wird, wesentlich verringert.

Für die Durchführung des erfindungsgemä en Distanzmessungsverfahrens unter Verwendung eines Laser-Scan- Flu fiuorometers, das einen frei oder in einer Küvette strömenden Flüssigkeitsstrahl umfa t, und mit einer oder mehren Laserstrahlquelle(n), deren Laserstrahl(en) auf die zentrale Trajektorie des Flüssigkeitsstrahls fokussiert sind, sollte die Laseroptik derart ausgewählt und angeordnet sein, da der bzw. die Laserstrahlen bandförmig auf die Objekttrajektorie (die die Objekte führende zentrale Trajektorie des Flüssigkeitsstrahls) fokussiert ist bzw. sind.

Die Bandform des bzw. der Laserstrahlen kann hierfür vorteilhaft einfach durch Interferenzstreifen zweier oder mehrerer sich kreuzender Teilstrahlen erzeugt werden.

Die Linsen und Blenden im Detektionsstrahlengang sind vorzugsweise derart ausgewählt und angeordnet, da allein die Fluoreszenzemission aus dem zentralen Interferenzstreifen auf den Detektor abgebildet wird. Au erdem sollte der Detektor in einzelne Detektions- pixel aufgeteilt, um eine räumliche Auflösung der Fluoreszenzemission sowohl in Flu richtung als auch senkrecht zur Flu richtung zu ermöglichen. Das hat den Vorteil, da eine Lokalisation der fluoreszierenden Me strukturen und/oder Kalibriertargets nicht nur in Flu richtung aufgrund der Bewegung des Objektes mit konstanter Geschwindig- keit sondern auch senkrecht dazu erfolgen kann.

Bei einem Flüssigkeitsstrahl in z-Richtung und einer Laseroptik aus Laserstrahl(en) in x-Richtung und Blende(n) und Detektor(en) in y-Richtung ermöglicht das Verfahren eine Verbesserung der Auflösung in zwei Dimensionen. Wird zusätzlich eine entsprechende Laseroptik mit Laserstrahl(en) in y-Richtung und Blende(n) und Detektor(en) in x-Richtung angeordnet, erhält man eine Auflösungsverbesserung in drei Dimensionen. In beiden Fällen ist die Erstellung von Punktbildfunktionen möglich, die von der Orientierung des Objekts nahezu unabhängig sind.

Ausführungsbeispiele zur näheren Erläuterung der Erfindung: BEISPIEL 1: Distanzmessung zwischen Genabschnitten von Chromosomen in einem Zellkern (unabhängig vom Mikroskoptyp) In einem Zellkern nimmt das Chromatin der einzelnen Chromsomen definierte Teil- regionen ein. Innerhalb einer oder mehrerer solcher chromosomalenTeilregionen werden die zu ortenden Strukturen, d.h. die Me strukturen, z.B. kleine Chromosomen- abschnitte wie Gene oder Teilstücke von Genen, mit einer im Stand der Technik bekannten Methode der Fluoreszenz in situ Hybridisierung spezifisch markiert, und zwar mit Fluorochromen verschiedener bestimmter spektraler Signaturen M1, M2, M3, . Die Abstände zwischen den Markierungsorten (den markierten Me strukturen) liegen unter der klassischen Auflösung, d.h. sie sind kleiner als die Halbwertsbreite des Haupt- maximum der effektiven Punktbildfunktion. Die Markierung der (Objekt-) Strukturen (Me strukturen) erfolgt derart, da die spektralen Signaturen an den zu ortenden Strukturen (Me strukturen) mit nahezu der gleichen Dynamik vertreten sind.

Das biologische Objekt wird auf einer Glasfaser exakt definierten Durchmessers oder in einer runden oder rechteckigen Kapillare definierter Dimensionen präpariert.

Um die Distanzen zu bestimmen, werden mikroskopierbare Präparate mit Kalibrier- targets hergestellt, und zwar unter den gleichen physikalischen und chemischen Versuchsbedingungen wie das Objekt bzw. die zu ortenden Objektstrukturen (= Me strukturen).

Als Kalibriertargets bzw. als Präparate mit Kalibriertargets dienen beispielsweise: a) mikroiniizierbare Kügelchen einer spektralen Signatur (monochromatisch): Die Kügelchen sind nach bekannten Verfahren mit jeweils einem Fluorochrom, d.h. monochromatisch markiert und aufgrund ihrer Grö e von den auszumessenden (zu ortenden) Strukturen im Objekt (den Me strukturen) unterscheidbar. Man injiziert solche Kalibrierkügelchen, die die im Objekt vorhandenen spektralen Signaturen der Me strukturen repräsentieren, ansonsten aber vorzugsweise identisch sind (hinsichtlich Grö e, Geometrie, Materialbeschaffenheit etc.). Mit anderen Worten: Die spektralen Signaturen der Me strukturen sowie der Kalibriertargets werden so gewählt, da unter den gegebenen Untersuchungsbedingungen die von ihnen emittierten Fluoreszenzemissionen getrennt voneinander analysiert werden können. Die Injizierung und Fixierung der monochromatischen Kalibrierkügelchen erfolgt derart, da sich die einzelnen Kügelchen verschiedener spektraler Signatur in Clustern direkt an der Glasfaser-Oberfläche oder Kapillarwand anordnen, vorzugsweise in einer Querschnittsebene der Faser bzw. Kapillare. Bei Verwendung von Präzisionsfasern und/oder -kapillaren liegen die Kügelchen folglich in definierten Abstände voneinander bzw. von einer Bezugsebene, Bezugsachse oder Bezugslinie. b) mikroini izierbare Testkugelchen multispektraler Signatur (polvchromatisch) und gleicher spektraler Dynamik: Die Kügelchen sind nach bekannten Verfahren mit jeweils allen bei den markierten (Objekt-)Strukturen (Me strukturen) vorkommenden spektralen Signaturen markiert.

Infolgedessen können sie an beliebige Stellen im zu vermessenden biologischen Objekt (hier Kern) injiziert werden. Eine Sollgeometrie wie bei a) ist nicht erforderlich, da für jede Signatur die chromatischen Schwerpunkte an derselben Stelle lokalisiert sein sollen.

Zur Unterscheidung von den markierten (Objekt-)Strukturen (Me strukturen) können die Kügelchen entweder einer anderen Grö enklasse angehören oder aber eine zusätzliche spektrale Signatur tragen, die bei den zu messenden Strukturen d.h. den Me strukturen (gemä Pråparationsprotokoll) nicht vorkommt. c) simultan markierte Chromosomenregionen bekannter Distanz an einem anderen Chromosom als demjenigen das die zu ortenden Strukturen (Me strukturen) trägt.

Die Kalibriertargets, d.h. hier die Chromosomenregionen mit bekanntem Abstand voneinander, sind mit Hilfe einer Probenkombination von DNA-Sequenzen, die die verschiedenen spektralen Signaturen trägt, unterschiedlich markiert. Eine Unterscheidung der chromosomalen Kalibriertargets von den zu ortenden (Chromosomen-) Strukturen (Me strukturen) kann beispielsweise durch unterschiedliche Fluoreszenzintensität erfolgen oder durch ein unterschiedliches Intensitätsverhältnis zwischen Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur oder durch Verwendung eines zusätzlichen Fluorochroms mit abweichender spektraler Signatur, das bei der Fluoreszenzmarkierung der Me targets nicht verwendet wurde.

Es ist auch möglich, da die Kalibriertargets einer anderen Grö enklasse angehören als die zur ortenden Me strukturen.

Die erfindungsgemä en Distanzmessungen werden mittels bekannter Fernfeld-Mikro- skopieanlagen, bestehend aus Mikroskop, Photomultiplier und/oder Kamera und Daten- verarbeitungsanlage durchgeführt. Dabei werden zum einen die Abstände zwischen den Kalibriertargets mit Fluorochrommarkierungen verschiedener spektraler Signatur gemessen. Die gemessenen Lokalisationen ( d.h. die gemessenen Targetabstände) werden mit den aufgrund der Geometrie berechneten Soll-Lokalisationen ( d.h. den tatsächlichen Targetabständen) verglichen und daraus der spektral bedingte Versatz (Shift) bestimmt.

Dieser Versatz (Shift) ist der Kalibrierwert für die gemessenen Distanzwerte zwischen den zu ortenden (Objekt-)Strukturen (Me strukturen).

Da dieser Versatz von den optischen Eigenschaften des Präparates abhängt (z.B. Brech- zahlen in den Kernen und dem Präparationsmedium), sollte die Kalibrierung in situ erfolgen. Das hei t im vorliegenden Beispiel, da sich die Kalibriertargets neben den zu untersuchenden und markierten (chromosomalen) Strukturen (Me strukturen) im Kern befinden sollten. Es werden die Abstände zwischen den zu ortenden (Objekt-)Strukturen (Me strukturen) bzw. die Abstände zwischen den verschiedenen Farbsignalen bzw.

Farbpunkten der betreffenden Me strukturen, z.B. zwischen dem rotfluoreszierenden und dem grünfluoreszierenden Farbpunkt (von Intensitätsmaximum zu Intensitatsmaximum oder von Schwerpunkt/Baryzentrum zu Schwerpunkt/Baryzentrum) gemessen, und dieser Me wert wird um den mit den Kalibriertargets ermittelten (durch die verschiedene spektrale Signatur bedingten) Versatz in hochpräziser Weise korrigiert.

Bei Kalibriertargets in Gestalt von mikroinjizierbaren Testkügelchen mit multispektraler Signatur (polychromatisch) wird der chromatische Versatz aus dem Lokalisa- tionsunterschied der Schwerpunkte für jede Signatur bestimmt. Die dafür erforderliche Identifizierung der zu einem Kalibriertarget gehörenden Fluoreszenzemission kann beispielsweise durch volumenerhaltende Schwellwertverfahren oder durch Mittelung der Segmentierungsergebnisse bei Schwellwertvariation erfolgen.

Bei Kalibriertargets in Gestalt von fluorochrommarkierten Objektregionen mit multispektraler Signatur (polychromatisch) wird der chromatische Versatz genauso bestimmt.

Als fluorochrommarkierte Kalibrierregionen eignen sich insbesondere auch Zentromerregionen, die mit einer Probenkombination von solchen DNA-Sequenzen hybridisiert werden, die alle an dieselben chromosomalen DNA-Abschnitte binden, jedoch mit Fluorochromen unterschiedlichen spektraler Signatur markiert wird. Erfolgt die Hybridisierung unter noch stringenten Bedingungen, liegen pro Zellkern zwei Markierungsregionen vor; bei nieder-stringenten Bedingungen werden aufgrund zusätzlicher Nebenbindungsregionen zusätzliche Zentromerregionen markiert, so da die Zahl der Kalibrierungsregionen ansteigt. Das ist u.U. sehr von Vorteil.

BEISPIEL 2: Distanzmessung zwischen Genabschnitten von Chromosomen in einem Zellkern unter Verwendung eines Epifluoreszenzmikroskops mit Axialtomograph Zur Durchführung des erfindungsgemä en Verfahrens wird ein im Prinzipaufbau bekanntes Epifluoreszenzmikroskop mit Axialtomograph wie folgt modifiziert: Auf den Mikroskoptisch wird anstelle eines Objektträgerplättchens eine erfindungs- gemä e Halterung gemä Fig. 1 für Mikrokapillaren oder Glasfasern, gesetzt. Diese Halterung besteht aus einem starren vorzugsweise dorsiventral abgeplatteten Rahmen 1, auf dem eine Lagerbuchse 2 montiert ist, in der eine Mikrokapillare oder Glasfaser um ihre Längsachse rotierfähig und mit der Rotationsachse senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops gelagert ist. Die Drehung des Untersuchungsobjektes in oder an der Kapillare/Faser erfolgt durch Drehung der Kapillare/Faser direkt, und zwar entweder manuell oder mittels eines Drehmotors. Das hat den Vorteil, da die einmal eingestellte und justierte Optik des Mikroskops unverändert beibehalten werden kann.

Zur Unterstützung bzw. Stabilisierung der zu drehenden Kapillare/Faser gegen Durch- hängen und Verschieben im Bereich der Ausnehmung 3 des Rahmens 1 ist ein flächiger, scheibenförmigerer Einsatz 5 austauschbar in dem Rahmen 1 angeordnet. Dieser Einsatz 5 besteht aus Plastik und weist eine grabenförmige Vertiefung 8 au?, die sich unterhalb und in Längsrichtung der Kapillare/Faser erstreckt. In seinem Randbereich ist der Einsatz 5 mit zwei schlitzförmigen Ausnehmungen 6, 7 versehen, die sich jeweils senkrecht zur Randkante erstrecken und das Einsetzen des Einsatzes 5 in den Rahmen 1 erleichtern.

Mit einem Computergesteuerten Schrittmotor wird die Kapillare/Faser in der Lager- buchse um einen definierten Winkel um ihre Achse gedreht. Die Drehkraft setzt direkt an der Kapillare/Faser an (und nicht an ihrer Halterung), wodurch die Gefahr, da die Kapillare/Faser beim Drehen verschoben wird und aus dem Blickfeld des Mikroskops gerät oder da gar der ganze Mikroskoptisch verrückt bzw. verschoben wird, nahezu vollständig vermieden ist.

Das biologische Mikroobjekt, z.B. ein Zellkern, in dem die zu ortenden Me strukturen bereits mit Fluorochromen markiert sind und das auch bereits Kalibriertargets enthält (zur Präparation siehe Beispiel 1), befindet sich auf der Glasfaser oder in der Mikrokapillare. Der Abstand von zwei oder mehr Me strukturen bzw. Kalibriertargets voneinander ist kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der axialen effektiven Punktbildfunktion. Mit dem Axialtomograph wird das Objekt gedreht unter ggf. automatischer Refokussierung. Die Drehung erfolgt in der Art, da jeweils ein Abstand zwischen zwei Me strukturen bzw. Kalibriertargets (d.h. zwischen deren Fluoreszenzintensitätsschwerpunkten) maximal wird. Der maximale gemessene Abstand entspricht dem tatsächlichen Abstand.

Ist man nur an den Abständen zwischen den Me strukturen bzw. Kalibriertargets, d.h. nicht an ihrer absoluten räumlichen Anordnung interessiert, kann man nun von einer der bekannten Me strukturen bzw. Kalibriertargets aus fortfahren, den Abstand zu einer dritten Me struktur bzw. einem dritten Kalibriertarget zu maximieren und zu bestimmen.

Sind die Abstände zwischen den Me strukturen bzw. Kalibriertargets grö er als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der lateralen (senkrecht zur optischen Achse) Punktbildfunktion, so genügt eine einzige spektrale Signatur; sind die Abstände dagegen kleiner, müssen die Me strukturen bzw. Kalibriertargets durch multispektrale Signatur unterschieden werden. Die Schwerpunkte (Maxima) der Signale dienen der Lokalisie- rung. Sofern die untersuchten Me strukturen einen Durchmesser haben, der kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven lateralen Punktbildfunktion ist, werden alle Beugungsbilder der Me strukturen bzw. Kalibriertargets durch eine scharfe Punktbildfunktion bestimmt, so da die Maxima optimal bestimmt werden können. Sind zwischen den Me strukturen bzw. Kalibriertargets auch Distanzen grö er als die Halb- wertsbreite des Hauptmaximums der lateralen Punktbildfunktion zugelassen, so ist die Bestimmung aller Abstände zwischen den Me strukturen bzw. Kalibriertargets fur N 2 2 innerhalb eines Kerns bei einmaligem Drehen nur dann möglich, wenn bei jedem Dreh- winkel optische Schnittserien registriert werden (siehe Beispiel 3 zur konfokalen Laser- Scanning Mikroskopie).

Ist man an der absoluten Anordnung der Me strukturen bzw. Kalibriertargets im Raum interessiert, so müssen die jeweiligen Schwerpunkte (baryzentren) präzise bestimmt werden. Durch mehrmaliges Wiederholen der gesamten Me prozedur und statistische Auswertung kann die absolute Lokalisierung der Me strukturen bzw. Kalibriertargets, d.h. die Winkelmessung, verbessert werden.

BEISPIEL 3: Distanzmessung zwischen Genabschnitten von Chromosomen in einem Zellkern unter Verwendung eines Konfokalen Laser-Scanning Mikroskops Von dem biologische Mikroobjekt, z.B. einem Zellkern, in dem die zu ortenden Me strukturen bereits mit Fluorochromen markiert ist, und das auch bereits Kalibriertargets enthält (zur Präparation siehe Beispiel 1), wird eine Serie optischer Schnitte aufgenommen. Die Me strukturen besitzen 1 = 1,2,..,L spektrale Signaturen.

Die spektrale Signatur der Kalibriertargets unterscheiden sich von derjenigen der Me strukturen z.B. in Volumen, Durchmesser, Intensität oder in der Zahl der spektralen <BR> <BR> <BR> <BR> Signaturen (l = 1,2,..j +1). Die Bilder der optischen Schnitte werden für jede spektrale Signatur getrennt aufgenommen und gegebenenfalls noch der Untergrund korrigiert.

Zur Auswertung werden zum einen die Kalibriertargets identifiziert und der chromatische Versatz bestimmt. Dazu werden die Kalibriertargets unter jeder spektralen Signatur lokalisiert. Bei polychromatischen Kalibriertargets ergibt sich der spektrale Versatz aus der Differenz der Lokalisationen.

Zum anderen werden parallel zur oder im Anschlu an diese Kalibrierung die Me strukturen lokalisiert. Man bestimmt dabei in jeder spektralen Signatur zunächst unabhängig voneinander die Position der Schwerpunkte der gemessenen Intensitätssignale. Anschlie end werden die Lokalisationen um den aus den Kalibrierungsmessungen bekannten spektralen Versatz korrigiert.

Die korrigierten Positionen der Me strukturen werden in Bezug auf einen Vergleichs- punkt angegeben. Dieser Vergleichspunkt kann z.B. ein beliebig ausgezeichneter fester Punkt im Objekt oder der Schwerpunkt eines Kalibriertargets (z.B. eine markierte Chromosomenregionen) oder eines sonstwie ausgezeichneten Chromosomenterritoriums sein. Es kann aber auch die Schwerpunktskoordinate aller Me strukturen innerhalb eines Chromosomenterritoriums sein.

Die beschriebenen Me verfahren für die konfokale Laser Scanning Mikroskopie können auch im Zusammenhang mit Axialtomographie durchgeführt werden. Dabei wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, das biologische Mikroobjekt um einen definierten Winkel gedreht und pro Winkel ein kompletter 3D-Bildstapel aufgenommen. Die Drehwinkelgrö e wird so bestimmt, da jeweils ein Abstand zwischen zwei Me strukturen maximal wird. Für jeden 3D Bildstapel wird dann, wie in Beispiel 2 beschrieben, verfahren. Der Vorteil der Drehung liegt darin, da man einen Abstand auf die Lokalisierung zweier Punkte bezieht, die in der Lateral ebene bestimmt wird und damit auf der Basis der schärfsten(steilsten) Punktbildfunktion.

Anstatt wie vorstehend beschrieben die Kalibrierung und die Distanzmessung zwischen den zu ortenden Strukturen, d.h. Me strukturen, in demselben biologischen Objekt durchzuführen, kann man auch die Kalibrierung unabhängig von den Me strukturen an gleichartigen biologischen Objekten durchführen. Bei dieser Verfahrensvariante ist die Unterscheidung zwischen den Fluoreszenzsignalen der Kalibriertargets und denjenigen der Me strukturen erleichtert. Anhand der mit den Kalibriertargets ermittelten Werte des optischen Versatzes kann man Eichkurven für die Distanzmessungen zwischen den Me strukturen erstellen. Derartige Eichkurven machen z.B. Angaben über den spektralen Versatz als Funktion von Brechungsindex und Absorption des verwendeten Immersionsmediums, der verwendeten Optik, Filter und Detektionseinheiten, der verwendeten Auswertealgorithmen, der verwendeten biologischen Objekte, der axialen und lateralen Lokalisation der Me strukturen bzw. Kalibriertargets in ihnen etc. Die Verwendung der Information aus diesen speziellen Eichkurven zur erfindungsgemä en Distanzmessung bietet sich insbesondere in solchgen Fällen an , bei denen einer grö ere Präzisionstoleranz verwendet erlaubt ist.

BEISPIEL 4: Distanzmessung zwischen Genabschnitten von Chromosomen in einem Zellkern unter Verwendung eines Wellenfeldmikroskops Die Durchführung des erfindungsgemä en Verfahrens zur Distanzmessung unter Einsatz der Wellenfeldmikroskopie ist praktisch identisch mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Vorgehen. Im Unterschied zum konfokalen Laser-Scanning Mikroskop ist hier die Lokalisierung in axialer Richtung wesentlich genauer als in lateraler, da hier die schärfste (steilste) Punktbildfünktion vorliegt. Durch Kombination mit Axialtomographie kann die Genauigkeit der Positionsbestimmung und Distanzmessung noch gesteigert werden.

BEISPIEL 5: Distanzmessung zwischen Genabschnitten von Metaphase- chromosomen in einem Zellkern unter Verwendung eines Laser- Scanning Flu fluorometers Ein Laser-Scanning Flu fluorometer nutzt als Basisgerät ein Durchflu zytometer, wie es heute routinemä ig beispielsweise für Zellanalysen und -sortierung in der Immunologie oder Hämatologie eingesetzt wird. Dabei werden die biologischen Objekte in einem Flüssigkeitssystem so angeordnet, da sie im Bereich der zentralen Trajektorie eines Flüssigkeitsstrahls, der frei oder in einer Küvette strömt, einzeln nacheinander durch einen oder mehrere Laserfoci geführt werden. Die biologischen Objekte, im vorliegenden Beispiel die Metaphasechromosomen, sind spezifisch mit einem oder mehreren Fluoreszenzmarkern markiert und werden durch die Laserstrahlen selektiv zur Fluoreszenz angeregt. Diese wird üblicherweise in mehreren optischen Detektionskanälen, die durch spektrale Filter separiert sind, registriert und integral von Photomultipliern in ein entsprechendes verstärktes elektrisches Signal umgesetzt.

Um ortsaufgelöst in einer Richtung die Fluoreszenzverteilung messen zu können, wurden sog. Slit-Scan Verfahren etabliert. Das biologische Mikroobjekt, hier Metaphase- chromosomen, d.h. längliche Objekte von typischerweise 5 bis 15 pm, wird von Flüssig- keitsstrahl mit konstanter Geschwindigkeit durch einen oder mehrere Laserstrahlen gefuhrt, die in Strömungsrichtung so stark fokussiert sind, da die Fluoreszenzverteilung zeitabhängig entlang des Objektes gemessen wird. Aufgrund der bekannten Flu - geschwindigkeit kann das pro Dektektionskanal aufgenommene, eindimensionale, zeit- abhängige Fluoreszenzprofil in eine Ortsinformation transformiert werden. Die Flu - geschwindigkeiten betragen typischerweise bis zu 10 m/s, und es können bis zu einigen tausend Objekten pro Sekunde analysiert werden.

Alle bisher in der Literatur beschriebenen Slit-Scan Systeme haben in Flu richtung eine typische Fokusbreite (gemessen aus der effektiven Punktbildfunktion) von minimal etwa 2 llm (= Auflösungsäquivalent), da aus prinzipiellen Gründen bei stärkerer Laser- fokussierung die Fokustiefe stark abnimmt und somit eine gleichmä ige Auflösung im Bereich möglicher Partikeltrajektorien (typischerweise 10 pm um die zentrale Achse des Flüssigkeitsstrahls) nicht mehr gewährleistet ist. Hinzu kommt, da bei den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren nur ein eindimensionaler Scan möglich ist.

Zur Durchführung des erfindungsgemä en Verfahrens zur Distanzmessung im Nanometerbereich wird ein im Prinzipaufbau bekanntes Laser-Scanning Flu fluorometer durch die folgend Anordnung (hier exemplarisch für einen Laser und einen Detektionskanal dargestellt) modifiziert: Zwei kohärente Teilstrahlen des Lasers mit gleicher Intensität und ebenen Wellenfronten werden unter einem kleinen Winkel zueinander in den Flüssigkeitsstrahl fokussiert und im Fokalbereich zur Interferenz gebracht. Es entsteht ein Muster aus konstruktiver und destruktiver Interferenz, wobei die Interferenzstreifen senkrecht zur Strömungsrichtung verlaufen. Die Halbwertsbreite der Interferenzstreifen hängt nicht mehr von der Breite des Laserfokus, sondern nur noch von der Wellenlänge und dem Winkel der Laserteil- strahlen zueinander ab. Bei einem Winkel von 28° zwischen den beiden Teilstrahlen kann man für 500 nm Laserwellenlänge die Halbwertsbreite des Hauptinterferenzstreifens zu etwa 500 nm abschätzen.

Die Interferenzstreifen können mit der notwendigen Tiefe erzeugt werden, so da alle möglichen Objekttrajektorien des Flüssigkeitsstrahl mit gleicher Streifenbreite ausgeleuchtet werden.

Da mehrere Interferenzstreifen gleichzeitig erzeugt werden, ist die Objektinformation vieldeutig. Die bekannte Ma nahme der Rückfaltung der gemessenen Intensitätsvertei- lung mit dem Streifenmuster d.h. mit der Punktbildfunktion bringt hier keinen oder nur geringen Auflösungsgewinn gegenüber herkömmlichen Slit-Scan Verfahren, da aufgrund eines geeignet zu wählenden Rauschfilters höhere Ortsfrequenzen und damit Auflösung verloren geht. Erfindungsgemä wird stattdessen wie folgt verfahren: In die Detektionsoptik sind Schlitzblenden mit einem Schlitzverlauf parallel zur Orientie- rung der Interferenzstreifen einbaut. Mit geeigneten Linsen bilden diese Schlitzblenden nur diejenige Fluoreszenz auf den Photomultiplier ab, die zwischen den beiden ersten Minima des Interferenzhauptstreifens angeregt wird. Im vorliegenden Beispiel können mit einem Aperturwinkel der Detektionsoptik von 19° (in Luft) und einem Minimal- abstand von ca. 1 llm Objekttrajektorien von 6 lm um die zentrale Flüssigkeitsachse mit nahezu gleicher optischer Auflösung beobachtet bzw. untersucht werden.

Um nicht nur eindimensionale Scans zu realisieren, wird der Detektionsschlitz in kleine Rechteckelemente aufgeteilt - z.B. durch eine CCD-Zeile. Diesen CCD-Elementen können signalverstärkende optische Elemente vorgeschaltet sein. Günstigerweise ordnet man die CCD-Elemente in einem möglichst gro en Kreissegment um den Flüssigkeits- strahl an. Die Detektionsoptik kann dann teilweise durch Mikrolinsen vor jedem Element ersetzt werden.

Eine Alternative besteht darin, bei einem Flüssigkeitsstrahl in z-Richtung eine Laseroptik aus Laserstrahl(en) in x-Richtung und Blende(n) und Detektor(en) in y-Richtung anzuordnen, wodurch man eine Verbesserung der Auflösung in zwei Dimesionen erreicht. Bei Anordnung einer weiteren Laseroptik mit Laserstrahl(en) in y-Richtung und Blende(n) und Detektor(en) in x-Richtung erhält man eine Auflösungsverbesserung in drei Dimensionen.

Pro Detektionselement wird von dem Objekt, das sich beliebig orientiert und mit konstanter Geschwindigkeit im Flüssigkeitsstrahl durch den zentralen Laserinterferenz- streifen bewegt, ein Fluoreszenzprofil durch dieses Objekt aufgenommen. Kleine fluoreszierende Me strukturen bzw. Kalibriertargets in den biologischen Objekten erscheinen in den Scanprofilen als Intensitätspeaks. Aus den Intensitätsmaxima und der Zuordnung der jeweiligen Scanprofilen zu den CCD-Elementen lassen sich die fluoreszenten Me strukturen bzw. Kalibriertargets im Objekt lokalisieren. Dies kann bei gleicher spektraler Signatur z.B. auf einen definierten Objektsbezugspunkt hin geschehen.

Bei verschiedener spektraler Signatur kann man z.B. Laserstrahlen verschiedener Wellen- längen und/oder mehrere Detektionseinheiten verwenden. Diese werden dann versetzt entlang des Flüssigkeitsstrahls angeordnet. Durch Kalibrierung kann dann die Lokali- sation der einzelnen Me strukturen bzw. Kalibriertargets unterschiedlicher spektraler Signatur zueinander in Bezug gesetzt werden. Die Kalibrierung und Berechnung erfolgt analog den vorstehend geschilderten Beispielen für die Epifluoreszenz- bzw. konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie.

BEISPIEL 6: Einsatz des erfindungsgemä en Distanzmessungsverfahrens zur optischen Kontrolle von Anordnungen elektronischer Bauelemente (elektronischer Chips) Bei der Anordnung von elektronischen Bauelementen (elektronischen Chips) mu die planmä ige Anwesenheit bestimmter Bauelemente und deren geometrische Anordnung überprüft werden. Da die handelsüblichen Chipabmessungen sehr gering sind und die einzelnen Bauelemente in enger Nachbarschaft zueinander liegen, sind die erforderlichen Kontrollverfahren nach dem Stand der Technik extrem aufwendig und nicht immer zufriedenstellend genau.

Das erfindungsgemä e Distanzmessungsverfahren ermöglicht nun eine Überprüfung der vorgegebenen Anzahl und Anordnung der Bauelemente auf dem Chip auch in solchen Fällen, in denen der Minimalabstand zwischen einzelnen Chips kleiner oder sogar sehr viel kleiner ist als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion.

Hierzu werden die Bauelemente z.B. auf ihrer Oberfläche mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, wobei zumindest diejenigen Bauelemente, deren Abstand untereinander kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion ist, mit Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher spektraler Signatur versehen werden.

Die Kontrolle der korrekten Anordnung der Bauelemente kann nun durch optische Analyse unter Einsatz des erfindungsgemä en Distanzmessungsverfahrens und unter Verwendung beliebiger Fernfeldmikrosokopieverfahren durchgeführt werden, wobei anstelle der herkömmlicherweise notwendigen Objektive mit relativ sehr hoher numerischer Apertur von beispielsweise 1,3 nun ohne weiteres Objektive mit wesentlich geringerer numerischer Apertur eingesetzt werden können, ohne da dadurch hier relevante Information verloren geht. Mit den Objektiven geringerer Apertur geht ein höherer Arbeitsabstand zwischen Objektiv und Untersuchungsobjekt einher, was die Handhabung wesentlich erleichtert und die Untersuchungen schneller und sicherer macht.

Mit dem erfindungsgemä en Verfahren kann auch die vorschriftsmä ige Anordnung von solchen Bauelementen überprüft werden, deren Abstand untereinander kleiner als 200 nm ist. Das hat den Vorteil, da auf den Einsatz von technisch sehr aufwendigen optischen Nahfeldverfahren und/oder Verfahren der atomaren Kraftmikroskopie oder der Tunnelelektronenmikroskopie verzichtet werden kann.

Anstelle von elektronischen Chips ist es ebensogut möglich, DNA-Chips oder Protein- Chips in analoger Weise zu überprüfen.