(抗体の組合せの検討)
 IP9、IP10、SC2及びSC4の4種類のモノクローナ� �抗体(すべてIgG1 subclass)の組み合わせを検討� ��た。詳細は、以下の通りである。
 各1次抗体(IP9、IP10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg  /ml in PBS)を固相であるマイクロタイタープ レート(Maxsorp plate, 販売元: NalgeNunk Int. Toky o, Japan)の各ウエルに添加し、4℃で16時間静� �した。次に、PBS(0.05% Tween 20 )で該各ウエル 内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキ ング剤200μl{PBS-1%BSA(RIA grade) 又はPBS-1% Block  Ace}により室温で2時間ブッキングをした。次� ��、各サンプル20μl{緩衝液、ミッドカイン(株 式会社ペプチド研究所)、前立腺癌細胞の上� �液}及び予めペロキシダーゼ標識した各2次抗 体(IP9、IP10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg in diluen ts)を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレ� �トシェイカーにより攪拌した。次に、該各� �エルをPBS(0.05% Tween20)で5回洗浄した。さらに 、基質溶液100μl(TMB Microwell Peroxidase Substrate� �System,販売元:KPL com, Gaithersburg MD, USA)を該� �ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該 各ウエル内の酵素基質反応を停止するために 、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した� �最後に、該各ウエル内の吸光度(OD450)をmultipl ate reader(Multiskan EX, 販売元:Thermo electron corp ., vantaa, Finland)により測定した。
 なお、2次抗体のペロキシダーゼ標識には、 Peroxidase Labeling Kit-NH ₂ (販売元:Dojinndo Lab. Kumamoto, Japan)を用いた

 上記測定結果を下記表1,2に示す。
 1次抗体がIP9の場合には、2次抗体がIP10抗体� ��みELISA測定反応が得られた。また、1次抗体� ��IP10の場合には、2次抗体がIP9抗体のみELISA測 定反応が得られた。また、1次抗体がSC2の場� �には、2次抗体がSC4抗体のみELISA測定反応が� �られた。また、1次抗体がSC4の場合には、2次 抗体がSC2抗体のみELISA測定反応が得られた。
 以上の結果より、本発明の哺乳動物の癌の� ��断方法に使用する抗体の最適な組み合わせ� ��決定した。
 加えて、上記測定では、2種類(BSA、Block Ace) のブロッキング剤を使用した結果、BSAではバ ックグランド値が高くなる傾向があることを 確認した。よって、ブッロキング剤として、 Block Aceが優れていることを確認した。しか� �ながら、BSAをブロッキング剤として使用し� �ELISA測定することもできる。
 なお、Block Aceとは、乳タンパク質と有機酸 緩衝塩を主成分としてブロッキング剤であり 、大日本住友製薬株式会社から購入可能であ る。

(定量検出の確認)
 上記実施例1で最適な抗体の組合で測定した 場合には、ミッドカインを定量的に検出する ことができるかを確認した。また、コントロ ールとして市販のポリクローナル抗体のELISA� �kit(Elegance MIDKINE ELISA, 販売元:Bioclone Lim. Sy dney, Australia)を使用した。詳細は、以下の通� ��である。
 各1次抗体(IP9、IP10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg  /ml in PBS)を固相であるマイクロタイタープ レート(Maxsorp plate, 販売元: NalgeNunk Int. Toky o, Japan)の各ウエルに添加し、4℃で16時間静� �した。次に、PBS(0.05% Tween 20 )で該各ウエル 内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキ ング剤200μl(PBS-1% Block Ace)により室温で2時間 ブッキングをした。各濃度のミッドカイン{0� ��0.00625、0.0125、0.025、0.05、1(μl):株式会社ペ� �チド研究所}及び予めペロキシダーゼ標識し� ��各2次抗体(IP9、IP10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg  in diluents)を該各ウエルに添加し、室温で4� �間プレートシェイカーにより攪拌した。次� �、該各ウエルをPBS(0.05% Tween20)で5回洗浄した 。さらに、基質溶液100μl(TMB Microwell Peroxidase  Substrate System, 販売元:KPL com, Gaithersburg MD,  USA)を該各ウエルに添加し、室温で10分間静� ��した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止� ��るために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に 添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度(OD 450)をmultiplate reader(Multiskan EX, 販売元:Thermo  electron corp., vantaa, Finland)により測定した。
 なお、市販のポリクローナル抗体のELISA kit を使用した測定方法は、キット添付の説明書 に従った。

 上記測定結果を下記表3及び図1~5に示す。
 1次抗体がIP9、2次抗体がIP10抗体を用いての� ��定では、直線性を示し、十分にミッドカイ� ��の定量が可能である(図1)。また、1次抗体が IP10、2次抗体がIP9抗体でも同様な結果であっ� ��(図2)。1次抗体がSC2、2次抗体がSC4抗体でも� �様な結果であった(図3)。1次抗体がSC4、2次抗 体がSC2でも同様な結果であった(図4)。
 以上の結果より、本発明の抗体の組み合わ� ��を用いた測定方法は、ミッドカインを定量� ��に測定することができ、かつ定量線を設定� ��ることができる。これにより、cut off値及� �基準値を設定することができる。

(原発腫瘍細胞の培養上清中のミッドカイン� �定)
 哺乳動物(イヌ)の原発腫瘍細胞の培養上清� �のミッドカイン量を測定できるかを確認し� �。詳細は、以下の通りである。
 各1次抗体(IP9、IP10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg /ml in PBS)を固相であるマイクロタイタープ� �ート(Maxsorp plate, 販売元: NalgeNunk Int. Tokyo,  Japan)の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置� ��た。次に、PBS(0.05% Tween 20 )で該各ウエル� �を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキ� �グ剤200μl(PBS-1% Block Ace)により室温で2時間� �ッキングをした。各サンプル20μl(緩衝液、� �ヌの前立腺癌細胞の培養上清液、乳腺癌細� �の培養上清液及び骨肉腫細胞の培養上清液)� ��び予めペロキシダーゼ標識した各2次抗体(IP 9、IP10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg in diluents)を 該各ウエルに添加し、室温で4時間プレート� �ェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエ� �をPBS(0.05% Tween20)で5回洗浄した。さらに、基 質溶液100μl(TMB Microwell Peroxidase Substrate Syste m, 販売元:KPL com, Gaithersburg MD, USA)を該各ウ エルに添加し、室温で10分間静置した。該各� ��エル内の酵素基質反応を停止するために、1 M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最 後に、該各ウエル内の吸光度(OD450)をmultiplate� �reader(Multiskan EX, 販売元:Thermo electron corp.,  vantaa, Finland)により測定した。

 上記測定結果を下記表4に示す。
 いずれの抗体の組み合わせを用いた測定で� ��各癌種の培養上清液中のミッドカインを定� ��的に測定することができた。特に、前立腺� ��細胞の培養上清液中のミッドカイン値が他� ��癌種よりも産出されていることがわかった� ��
 以上の結果より、哺乳動物特にイヌの癌細� ��の培養上清液でもミッドカインが産出され� ��いることを確認した。さらに、細胞の培養� ��清中のミッドカイン量を測定することによ� ��、哺乳動物の癌の診断を行なうことができ� ��ことを確認した。

(血漿中のミッドカイン測定による哺乳動物� �癌の診断)
 正常犬及び担癌犬の血漿中のミッドカイン� ��測定することにより、哺乳動物の癌の診断� ��行なうことができるかを確認した。なお、E DTAとヘパリンで同時採血した血漿で測定を行 なった。
 詳細は、以下の通りである。
 各1次抗体(IP9、IP10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg  /ml in PBS)を固相であるマイクロタイタープ レート(Maxsorp plate, 販売元: NalgeNunk Int. Toky o, Japan)の各ウエルに添加し、4℃で16時間静� �した。次に、PBS(0.05% Tween 20 )で該各ウエル 内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキ ング剤200μl(PBS-1% Block Ace)により室温で2時間 ブッキングをした。各サンプル20μl(緩衝液、 クエン酸採血、EDTA採血、ヘパリン採血)及び� ��めペロキシダーゼ標識した各2次抗体(IP9、IP 10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg in diluents)を該各 ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェ� �カーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPB S(0.05% Tween20)で5回洗浄した。さらに、基質溶 液100μl(TMB Microwell Peroxidase Substrate System, � �売元:KPL com, Gaithersburg MD, USA)を該各ウエル に添加し、室温で10分間静置した。該各ウエ� ��内の酵素基質反応を停止するために、1M リ ン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に 、該各ウエル内の吸光度(OD450)をmultiplate reade r(Multiskan EX, 販売元:Thermo electron corp., vantaa , Finland)により測定した。
 なお、担癌犬では、IP9及びIP10のみを使用し て測定した。

 上記測定結果を下記表5、6及び図6に示す。
 担癌犬の血漿は、正常犬の血漿よりもミッ� ��カイン濃度が高い傾向を示した。特に、骨� ��腫の担癌犬では、血漿中のミッドカイン濃� ��が高い値を示した。
 また、EDTA採血とヘパリン採血した血漿のミ ッドカイン濃度を比較すると、EDTA採血した� �分がミッドカイン濃度が高いが、ヘパリン� �血でも十分にミッドカイン濃度を検出する� �とができることを確認した。

(ヘパリン添加効果の確認)
 ヘパリン添加によるミッドカイン濃度の影� ��を確認にした。詳しくは、以下の通りであ� ��。
 最初に、各濃度ミッドカイン{0.025、0.05、0.1 (μM):株式会社ペプチド研究所}にヘパリン(100U /ml)を添加した後、室温1時間で静置して、サ� ��プルを作成した。
 次に、各1次抗体(IP9、IP10、SC2又はSC4:100μl o f 1.0μg/ml in PBS)を固相であるマイクロタイ� �ープレート(Maxsorp plate, 販売元: NalgeNunk Int . Tokyo, Japan)の各ウエルに添加し、4℃で16時� ��静置した。次に、PBS(0.05% Tween 20 )で該各� �エル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブ� �ッキング剤200μl(PBS-1% Block Ace)により室温で 2時間ブッキングをした。上記作成した各サ� �プル20μl及び予めペロキシダーゼ標識した各 2次抗体(IP9、IP10、SC2又はSC4:100μl of 1.0μg in� �diluents)を該各ウエルに添加し、室温で4時間� ��レートシェイカーにより攪拌した。次に、� ��各ウエルをPBS(0.05% Tween20)で5回洗浄した。� �らに、基質溶液100μl(TMB Microwell Peroxidase Sub strate System, 販売元:KPL com, Gaithersburg MD, USA )を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置し た。該各ウエル内の酵素基質反応を停止する ために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添� �した。最後に、該各ウエル内の吸光度(OD450)� ��multiplate reader(Multiskan EX, 販売元:Thermo elect ron corp., vantaa, Finland)により測定した。

 上記測定結果を下記表7に示す。
 1次抗体がIP9、2次抗体がIP10の場合及び1次抗 体がIP10、2次抗体がIP9を用いた測定は、ヘパ� ��ンを添加してない場合と比較して、ミッド� ��イン値が上昇することを確認した。
 しかしながら、1次抗体がSC2、2次抗体がSC4� �場合及び1次抗体がSC4、2次抗体がSC2を用いた 測定の場合は、ヘパリンを添加してない場合 と比較して、ミッドカイン値が減少すること を確認した。
 以上の結果より、1次抗体がIP9、2次抗体がIP 10の場合及び1次抗体がIP10、2次抗体がIP9を用� ��た測定では、生体試料にヘパリンを添加す� ��ことでミッドカインを高感度で検出するこ� ��ができる。

(市販のポリクローナル抗体のELISAキットを使 用しての哺乳動物の癌の診断)
 市販されているヒトミッドカインELISA kit(El egance MIDKINE ELISA, 販売元:Bioclone Lim. Sydney,  Australia)が哺乳動物の癌の診断に使用できる� �を確認した。また、該キットの測定結果を� �発明の測定方法により得られる結果と比較� �た。
 詳細は、以下の通りである。
 ヒトミッドカインELISA kitの添付説明書に従 い、キット中のポリクローナル抗体を固相で あるマイクロタイタープレート(Maxsorp plate,  販売元: NalgeNunk Int. Tokyo, Japan)の各ウエル� �添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS(0.05 % Tween 20 )で該各ウエル内を洗浄した後に、 該各ウエル内をブロッキング剤200μl(PBS-1% Blo ck Ace)により室温で2時間ブッキングをした。 正常犬又は担癌犬(骨肉腫、繊維肉腫)の血漿� ��ンプル20μl及びキット中の予めペロキシダ� �ゼ標識したポリクローナル抗体を該各ウエ� �に添加し、室温で4時間プレートシェイカー� ��より攪拌した。次に、該各ウエルをPBS(0.05%� �Tween20)で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μ l(TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元: KPL com, Gaithersburg MD, USA)を該各ウエルに添� �し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の 酵素基質反応を停止するために、1M リン酸10 0μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該� �ウエル内の吸光度(OD450)をmultiplate reader(Multis kan EX, 販売元:Thermo electron corp., vantaa, Finla nd)により測定した。
 なお、本発明の測定方法は、実施例4に記載 の測定方法と同様に行った。サンプルは、正 常犬及び担癌犬(骨肉腫、繊維肉腫)の血漿20μ lとした。担癌犬のサンプルでは、1次抗体をI P9とし、2次抗体をIP10とした。

 上記測定結果を下記表8~10及び図7に示す。
 市販されているヒトミッドカインELISA kitを 用いた測定方法では、正常犬の測定値と担癌 犬の測定値間には十分な差異が検出されなか った。より詳しくは、正常犬の測定値が、担 癌犬の測定値と比較して、高い場合があった 。
 一方、本発明の測定方法では、正常犬の測� ��値と担癌犬との測定値間は十分な差異を検� ��することができた。
 これにより、市販されているヒトミッドカ� ��ンELISA kitでは、哺乳動物の癌の診断に使用 できないことを確認した。