[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder eines Risikos für die Entwicklung einer Krankheit, insbesondere einer solchen, die durch den alternativen Weg des Komplementsystems vermittelt wird. Sie betrifft ferner einen neuen diagnostischen Marker sowie Verfahren zum Auffinden von Wirksubstanzen.

[0002] Das Komplementsystem ist ein System von Plasmaproteinen, das im Zuge der Immunantwort aktiviert werden kann. Es ist Teil des angeborenen Immunsystems. Das menschliche Komplementsystem besteht aus mehr als 30 Proteinen, die im Blutplasma gelöst oder zellgebunden sind. Sie dienen der Abwehr von Mikroorganismen, haben jedoch auch stark zellzerstörende Eigenschaften und können, wenn sie unreguliert wirken, im Laufe vieler Krankheiten für Gewebeschäden verantwortlich sein.

[0003] Man unterscheidet drei Wege, durch die das Komplementsystem aktiviert wird, nämlich den meist über Antikörper induzierten klassischen Weg, den über das Mannose bindende Lektin aktivierten Lektinweg, und den spontanen und Antikörperunabhängigen alternativen Weg.

[0004] Ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym des alternativen Wegs ist der sogenannte Komplementfaktor D (CFD; EC 3.4.21 .46), der auch als Adipsin oder C3- Proactivator-Konvertase, bezeichnet wird. CFD ist eine Serinprotease, die vorwiegend im Fettgewebe synthetisiert und in den Blutkreislauf sezerniert wird. CFD lässt sich darüber hinaus in verschiedenen Geweben finden. CFD spaltet den Komplementfaktor B. Es ist beschrieben, dass in Säugetierzellen das Enzym als inaktives Proenzym (proCFD) oder Zymogen synthetisiert wird und durch Abspaltung von 5 N-terminalen Aminosäuren in die reife und aktive Form, d.h. das CFD, überführt wird. [0005] Im Stand der Technik wird CFD als Biomarker bei krankhaft fettleibigen Patienten oder Tieren beschrieben: Bienertovä-Vaskü et al. (201 1 ), Adipsin (Complement Factor D) as a new biomarker of body fat distribution in extremely obese central-European Population, in "Body Fat: Composition, Measurements and Reduction Procedures", New York, Novapublishers, S. 14-27; Searfoss et al. (2003), Adipsin, a biomarker of gastroin- testinal toxicity mediated by a functional gamma-secretase inhibitor, J. Biol. Chem., Vol. 278(46), S. 46107-461 16; Miner et al. (1993), Adipsin expression and growth in rats as influenced by insulin and somatotropin, Physiol. Behav. Vol. 54(2), S. 207-212.

[0006] CFD wird ferner als ein Risikomarker in Bezug auf eine koronare Herzerkrankung beschrieben: Prentice et al. (2013), Proteomic risk markers for coronary heart disease and stroke: Validation and mediation of randomized trial hormone therapy effects on these diseases, Genome Med. Vol. 5(12):1 12.

[0007] CFD wird mit einer Vielzahl weiterer Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie bspw. beschrieben in den folgenden Patentdokumenten: WO 2012/170556, WO 2012/146778, WO 201 1/136080, WO 2010/075519, WO 2008/137236, WO

2009/017405, RU 2232991 , US 2003/092620, WO 2013/071702, WO 2013/071703, WO 2007/141004, WO 2007/030919, EP 0287509. Die mit CFD in Verbindung stehenden Erkrankungen lassen ich auch über die Datenbank "MalaCards" des Weizmann Institute of Science identifizieren (Sucheingabe "CFD").

[0008] In jüngster Zeit sind solche Krankheiten in den Mittelpunkt des Interesses gerückt, die über den alternativen Weg des Komplementsystems vermittelt werden. Diese sind zusammengefasst in Holers (2008), The Spectrum of Complement Alternative Pathway-Mediated Diseases, Immunological Reviews, Vol. 223, Seiten 300 bis 316.

[0009] Lo et al. (2014), Adipsin is an adipokine that improves better cell function in diabetes, Cell, 158(1 ): 41 -53, beschreiben einen Zusammenhang zwischen dem alternativen Weg des Komplementsystems und der Entstehung von Diabetes mellitus Typ 2. In einer Subgruppe von untersuchten Patienten wurden erniedrigte Spiegel von CFD nachgewiesen, die mit einem erhöhten Risiko für einen Funktionsausfall der ß-Zellen korrelierten. Die Autoren äußern den Wunsch nach einem Verfahren, mit dem Patienten hinsichtlich ihres Risikos einer Erkrankung klassifiziert werden können.

[0010] Spong et al. (2006), Deficient alternative complement pathway activation due to factor D deficiency by 2 novel mutations in the complement factor D gene in a family with meningococcal infections, Blood, 107: 4865-4870, beschreibt zwei Punktmutationen in CFD, die in Patienten festgestellt wurden, welche von einer Meningitis betroffen sind. Durch die Punktmutationen sei die Aktivierung des alternativen Wegs des Komplementsystems beeinträchtigt.

[0011] In der US 2003/0092620 werden Verfahren zur Behandlung von verschiedensten Patienten beschrieben. Es ist erwähnt, dass die bedürftigen Patienten identifiziert werden können, indem anhand von klinischen Proben eine Genotypisierung von CFD auf Single-Nucleotid-Polymorphismen (SNPs) erfolgt oder der mRNA-Spiegel bestimmt wird.

[0012] Die im Stand der Technik verfügbaren Verfahren haben sich jedoch in der Praxis nicht bewährt.

[0013] Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegende Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder eines Risikos für die Entwicklung einer Krankheit, insbesondere einer solchen bereitzustellen, die durch den alternativen Weg des Komplementsystems vermittelt wird.

[0014] Diese Aufgabe wird gelöst durch ein

Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder eines Risikos für die Entwicklung einer Krankheit bei einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist:

(1 ) Bereitstellung einer biologischen Probe des Lebewesens, (2) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein von zumindest einer Isoform des Komplementfaktors D (isoCFD),

(3) Stellen einer positiven Diagnose bei einem positiven Nachweis von zumindest einer isoCFD in der biologischen Probe, oder Stellen einer negativen Diagnose bei einem negativen Nachweis von zumindest einer isoCFD in der biologischen Probe.

[0015] Die Erfinder haben überraschenderweise erkannt, dass sich in einer biologischen Probe eines Lebewesens, das erkrankt ist oder einem Risiko für die Entwicklung einer Krankheit unterliegt, bislang weitgehend unbekannte Isoformen des Komplementfaktors D (CFD) finden lassen, die in einem gesunden Referenzlebewesen nicht bzw. nur unterhalb der Nachweisgrenze vorhanden sind.

[0016] Diese Erkenntnis war überraschend. So gibt es zwar Vorschläge im Stand der Technik, CFD oder proCFD als biologischen bzw. diagnostischen Marker heranzuziehen, nicht jedoch Isoformen von CFD.

[0017] Isoformen menschlichen CFD sind weitgehend unbekannt.

[0018] Yamauchi et al. (1994), Recombinant and native zymogen forms of human complement factor D, Journal of Immunology, Vol. 152, Seiten 3645 bis 3653, beschreiben ein Isoenzym von CFD, das im Urin eines Patienten mit Fanconi-Syndrom gefunden wurde. Die Autoren haben den Urin der Patienten lediglich als Quelle großer Mengen von CFD verwendet, da bekannt ist, dass sie von einer Proteinurie betroffen sind und deshalb besonders hohe Proteinmengen über den Urin ausscheiden. Die Autoren haben die diagnostische Relevanz der aufgefundenen Isoform von CFD jedoch nicht erkannt.

[0019] Erfindungsgemäß wird unter einer "Isoform des Komplementfaktors D" bzw. "isoCFD" ein Abkömmling von CFD verstanden, der sich gegenüber der reifen bzw. aktiven Form von CFD, nachfolgend als "CFD" bezeichnet, und der unreifen Form von CFD (proCFD) unterscheidet. Nach einer bevorzugten Ausführungsvariante weist isoCFD einen anderen isoelektrischen Punkt (pl) als CFD und proCFD auf. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante weist die isoCFD ein anderes Molekulargewicht als CFD und proCFD auf. Nach einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsvariante weist die isoCFD in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber CFD und proCFD an zumindest einer Position eine andere Aminosäure auf. Nach einer noch weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße isoCFD gegenüber CFD um zumindest eine Aminosäure verlängert und/oder gegenüber proCFD um zumindest eine Aminosäure verkürzt, am C-Terminus und/oder vorzugsweise am N-Terminus.

[0020] Erfindungsgemäß sind unter Isoformen von CFD (isoCFD) jedoch keine mutierten Formen von CFD zu verstehen, wie bspw. die von Sprong et al. (a.a.O.) beschriebenen punktmutierten CFD-Formen. Erfindungsgemäß werden unter isoCFD auch keine CFD-Formen verstanden, die Polymorphismen aufweisen, wie bspw. die in der US 2003/0092620 beschriebenen Single-Nucleotid-Polymorphismen (SNPs).

[0021] Die Aminosäuresequenz der reifen bzw. aktiven Form des humanen CFD ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Die unreife Form von humanem CFD (proCFD) ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 2 dargestellt.

[0022] Reifes humanes CFD weist einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 6,85 und unreifes CFD (proCFD) von 7,99 auf. Die von den Erfindern ermittelten Isoformen von CFD (isoCFD) weisen theoretische isoelektrische Punkte von < 7,99 und > 6,85 auf. Die theoretischen isoelektrischen Punkte lassen sich nach der Methode berechnen, die beschrieben ist in Bjellqvist (1993), The focusing positions of Polypeptides in immobilized pH gradients can be predicted from the amino acid sequences, electrophore- sis, Vol. 14(10), Seiten 1023 bis 1031 .

[0023] Aufgrund dieser Unterschiede lässt sich eine "isoCFD" mittels gängiger molekularbiologischer Methoden einfach und zuverlässig von CFD und proCFD unterscheiden, wie der isoelektrischen Fokussierung, einer Auftrennung nach dem Molekular- gewicht oder der Masse, beispielsweise mittels SDS-Gelelektrophorese oder Massen- spektrometrie.

[0024] "Zumindest eine isoCFD" bedeutet erfindungsgemäß, dass in der biologischen Probe auch zumindest zwei, zumindest drei, zumindest vier oder mehr unterschiedliche isoCFD enthalten sein können. Die Untersuchung in Schritt (2) kann sich deshalb nicht nur auf das Vorhandensein einer isoCFD sondern von mehreren unterschiedlichen isoCFD bzw. eines Musters von unterschiedlichen isoCFD richten.

[0025] Erfindungsgemäß wird unter einem "Lebewesen" ein jegliches Lebewesen verstanden, wobei das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt an einem Säugetier und weiter bevorzugt an einem Menschen durchführbar ist.

[0026] Erfindungsgemäß wird unter einer "biologischen Probe" eine jede potenziell CFD enthaltende Probe verstanden, wie eine Blut-, Urin-, Gelenkflüssigkeits- oder Sputumprobe oder aber auch eine Gewebeprobe, beispielsweise aus dem Fettgewebe.

[0027] Die Erfinder haben erstmals erkannt, dass isoCFD als diagnostischer Marker für eine Krankheit oder ein Risiko für die Entwicklung einer Krankheit verwendet werden kann. isoCFD eignet sich deshalb auch als Marker in einer therapiebegleitenden Diagnostik ("companion diagnostics").

[0028] "Stellen einer Diagnose" umfasst die Feststellung, dass eine Krankheit oder ein Risiko für eine Krankheit bzw. Erkrankung vorliegt (positive Diagnose) oder nicht vorliegt (negative Diagnose). Es umfasst aber auch eine Stratifizierung des Lebewesens, also das Zuordnen eines Schweregrades der Erkrankung oder eines Risikogrades für eine Erkrankung oder das Fortschreitens der Erkrankung.

[0029] Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung auch eine Isoform des Komplementfaktors D (isoCFD) als diagnostischen Marker für eine Krankheit oder ein Risiko für die Entwicklung einer Krankheit. [0030] Diese Ausgestaltung der Erfindung betrifft auch ein Muster von isoCFD, das in einer biologischen Probe eines Lebewesens nachweisbar ist, als diagnostischen Marker für eine Krankheit oder ein Risiko für die Entwicklung einer Krankheit.

[0031] Erfindungsgemäß wird hierbei unter einem "Muster" von isoCFD eine für das Lebewesen charakteristische Zusammensetzung verschiedener Isoformen von CFD bzw. ein charakteristisches Set von isoCFD verstanden. Diese unterschiedlichen Isoformen lassen sich bspw. in einer ein- oder zweidimensionalen Gelelektrophorese oder mittels Massenspektrometrie von einander trennen. Über diese Verfahren lassen sich den unterschiedlichen isoCFD unterschiedliche Messsignale zuordnen. Man erhält ein charakteristisches Signalmuster. Wenn sich dieses Muster von dem aus einem gesunden Referenzlebewesen unterscheidet, kann eine positive Diagnose getroffen werden.

[0032] Die Merkmale, Eigenschaften des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens nebst dessen bevorzugten Weiterbildungen gelten für die erfindungsgemäße Isoform des Komplementfaktors D gleichermaßen.

[0033] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.

[0034] Nach einer bevorzugten Weiterbildung handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein solches zur Diagnose einer Krankheit, die durch den alternativen Weg des Komplementsystems vermittelt wird, bzw. eines Risikos für die Entwicklung einer solchen Krankheit. Nach einer alternativen bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei der Krankheit um eine solche, die durch den Komplementfaktor D vermittelt wird.

[0035] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass erstmals ein zuverlässiges und hochsensitives Verfahren bereitgestellt wird, mit dem Patienten hinsichtlich ihres Risikos, an einer durch den alternativen Weg des Komplementsystems bzw. den Komplementfaktor D vermittelten Krankheit betroffen zu werden, stratifiziert werden können. Derartige Krankheiten sind im Stand der Technik hinreichend beschrieben, beispielsweise in der Publikation von Holers (2008; a.a.O.) oder in der Datenbank "MalaCards" des Weizmann Institute of Science. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Krankheiten, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adipositas, Simpson-Golabi-Behmel-Syndrom (SGBS), zerebrale autosomal-rezessive Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten und Leukenzephalopathie (CARASIL), Diabetes mellitus Typ 2, Faktor-D-Defizienz, atypisches hämolytisch-urämisches Syndrom (aHUS), paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH), altersbedingte Makuladegeneration (AMD), rheumatoide Arthritis (RA), systemischer Lupus erythematodes (SLE), IgA-Nephropathie, Purpura Schönlein-Henoch, idiopathische membranoproliferative Glomerulonephritis, Post-Streptokokken-Krankheit, Myokarditis, multiple Sklerose (MS), Schädel-Hirn-Trauma, traumatische Rückenmarksverletzung, intestinaler und renaler Reperfusionsschaden, Antiphospholipid-Syndrom (APS), habituelles Abortsyndrom, Präeklampsie, Asthma, ANCA-assoziierte-pauci-immun- retinale Vasculitis, antikörper-vermittelte Hautkrankheit, Meningococcale Infektion, Anorexia Nervosa, Rhinitis, Hodgkins Lymphom, Non-Hodkins Lymphom, Neuronitis, Liposar- com, Sepsis, Urämie, Endothelitis, koronare Herzerkrankung, Multiples Myelom, Hiv-1 , Intrakranielles Aneurysma, Rheumatoide Arthritis, McCune-Albright-Syndrom, Peritonitis, Hepatitis, Cerebritis, aortisches Aneurysma, corneale Fleck-Dystrophy, Herzinfarkt, dilative Kardiomyopathie, fibröse Dysplasie, LAMM-Syndrom ("deafness with labyrinthine aplasia microtia and microdontia"), intrakranielle Embolie.

[0036] Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (2) die biologische Probe auf das Vorhandensein zumindest einer solchen isoCFD untersucht, die im Vergleich zu CFD an ihrem N-Terminus um 1 bis 4, d.h. um 1 (Isoform "-4") oder um 2 (Isoform "-3") oder um 3 (Isoform "-2") oder um 4 Aminosäuren (Isoform verlängert ist.

[0037] Nach einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird in Schritt (2) die biologische Probe auf das Vorhandensein zumindest einer solchen isoCFD untersucht, die im Vergleich zu proCFD an ihrem N-Terminus um 1 bis 4, d.h. um 1 (Isoform oder um 2 (Isoform "-2") oder um 3 (Isoform "-3") oder um 4 Aminosäuren verkürzt ist (Isoform "-4"). [0038] Wie die Erfinder feststellen konnten, lassen sich derartige Isoformen von CFD in einer biologischen Probe bzw. Körperflüssigkeiten wie bspw. Blut oder Urin von Individuen finden, die entweder an einer der genannten Krankheiten erkrankt sind oder ein Risiko für eine Erkrankung aufweisen.

[0039] Nach einer bevorzugten Weiterbildung wird in Schritt (2) die biologische Probe auf das Vorhandensein einer isoCFD untersucht, die im Vergleich zu CFD an ihrem N-Terminus um eine Aminosäuresequenz verlängert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Arginin (R), Glyzin-Arginin (GR), Arginin-Glyzin-Arginin (RGR) und Prolin-Arginin-Glyzin-Arginin (PRGR), und/oder im Vergleich zu proCFD an ihrem N- Terminus um einer Aminosäuresequenz verkürzt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Prolin (P), Prolin-Prolin (PP), Prolin-Prolin-Arginin (PPR), Prolin-Prolin- Arginin-Glyzin und (PPRG).

[0040] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass spezifisch nach solchen Isoformen gesucht wird, die nach Erkenntnissen der Erfinder geeignete Indikatoren bzw. Biomarker darstellen.

[0041] Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die isoCFD eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 7.

[0042] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass durch die Bereitstellung der Aminosäuresequenz der jeweiligen Isoformen von CFD eine noch zuverlässige Identifizierung der Biomarker ermöglicht wird.

[0043] Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die biologische Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: biologische Flüssigkeit, insbesondere Blutserum und Urin, oder Fettgewebe. [0044] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solches Ausgangsmaterial für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt wird, in dem sich die Isoformen von CFD besonders gut nachweisen lassen.

[0045] Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt (3) eine positive Diagnose, wenn die Konzentration von isoCFD in der biologischen Flüssigkeit > 0,01 μg ml, vorzugsweise > 0,1 μg ml, weiter vorzugsweise > 1 μg ml, weiter vorzugsweise > 10 μg ml, und weiter vorzugsweise > 100 μg ml ist. Eine negative Diagnose wird gestellt, wenn die Konzentration von isoCFD in der biologischen Flüssigkeit < 0,01 μg ml, vorzugsweise < 0,1 μg ml, weiter vorzugsweise < 1 μg ml, weiter vorzugsweise < 10 μg ml, und weiter vorzugsweise < 100 μg ml beträgt.

[0046] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass anhand von Schwellenwerten eine noch genauere Diagnose möglich ist. Die angegebenen Konzentrationen beziehen sich dabei auf eine einzelne Isoform von CFD. Nach einer alternativen Ausgestaltung beziehen sich die Konzentrationsangaben auf die Population sämtlicher Isoformen von CFD.

[0047] Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt (2) die Untersuchung der biologischen Probe mittels Massenspekt- rometrie und/oder eindimensionaler Gelelektrophorese und/oder zweidimensionaler Gelelektrophorese (2-DE), wobei weiter vorzugsweise in der eindimensionalen Gelelektrophorese eine isoelektrische Fokussierung (IEF) der Probe erfolgt, und/oder in einer Dimension der 2-DE eine isoelektrische Fokussierung (IEF) der Probe erfolgt, und/oder in einer bzw. der weiteren Dimension eine Auftrennung der Probe nach dem Molekulargewicht erfolgt.

[0048] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass molekularbiologische Methoden zum Einsatz kommen, mit denen auf besonders einfache Art und zuverlässige Art und Weise der Nachweis von isoCFD gelingt. [0049] Die eindimensionale Gelelektrophorese nebst IEF hat gegenüber der 2- DE den Vorteil, dass sie weniger fehleranfällig, besser reproduzierbar und schneller durchführbar ist. Die Analysedauer wird von 3 Tagen auf unter 24 Stunden verkürzt und bietet die Möglichkeit, 40 Proben/Gel reproduzierbar parallel zu analysieren.

[0050] Die massenspektrometrische Analyse bietet hingegen den Vorteil, dass sie gänzlich ohne Antikörpereinsatz auskommt.

[0051] Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt im Anschluss an die eindimensionale Gelelektrophorese und/oder die zweidimensionale Gelelektrophorese eine Westernblot-Analyse der biologischen Probe.

[0052] Im Rahmen diese Maßnahme lassen sich die auf einer Trägermembran übertragenen isoCFD zuverlässig und hochsensitiv mittels spezifischer Antikörper nachweisen. Diese analytische Methode ist für das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut geeignet.

[0053] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nuclein- säuremolekül, das für eine Isoform des Komplementfaktors D (isoCFD) codiert.

[0054] Mittels eines solchen Nukleinsäuremoleküls kann in einem geeigneten Expressionssystem isoCFD hergestellt werden. Bei dem Nukleinsäuremolekül kann es sich um DNA, RNA, cDNA etc. handeln. Umfasst sind ferner Vektoren und Plasmide, die die jeweiligen Kodierungssequenzen enthalten. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann vorzugsweise für ein isoCFD codieren, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 7.

[0055] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von Wirksubstanzen, das folgende Schritte aufweist: (1 ) Bereitstellen einer biologischen Probe, die isoCFD in einer Konzentration [Kp _re ] und/oder Aktivität [A _pre ] enthält,

(2) Inkubation der biologischen Probe mit einer Testsubstanz unter physiologischen Bedingungen,

(3) Messen der Konzentration von isoCFD [K _post ] und/oder der Aktivität von isoCFD [AposJ,

(4) Identifizieren der Testsubstanz als Wirksubstanz, wenn [K _pos t] Φ [K _pre ] und/oder [A _pos t] Φ [A _pre ], oder als keine Wirksubstanz, wenn [K _pos t] = [K _pre ] und [A _pos t] = [A _pre ].

[0056] Mittels eines solchen Screeningverfahrens lassen sich erstmals auf sehr direkte Art und Weise Wirkstoffe auffinden, mit denen gezielt Krankheiten behandelt oder diesen vorgebeugt werden kann, die durch den alternativen Weg des Komplementsystems bzw. den Komplementfaktor D vermittelt werden. Eine Testsubstanz qualifiziert sich als Wirksubstanz, wenn sich durch die Inkubation der biologischen Probe mit der

Testsubstanz bspw. die Konzentration von isoCFD und/oder deren Aktivität ändert, vorzugsweise erniedrigt. Dabei ist die [K _pre ] und/oder [A _pre ] bekannt.

[0057] Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit auch als Hochdurchsatzverfahren geeignet, beispielsweise zum Screening von Substanzbibliotheken.

[0058] Erfindungsgemäß werden unter "physiologischen Bedingungen" solche Bedingungen verstanden, die im Organismus vorherrschen, beispielsweise eine Temperatur von 37 °C und einem pH-Wert von 7. Derartige Bedingungen reflektieren die Wirkung der Testsubstanz und die Interaktion der Komponenten des Komplementsystems, insbesondere des alternativen Wegs, im Körper eines zu behandelnden Individuums. [0059] Erfindungsgemäß wird unter der "Aktivität von isoCFD" die enzymati- sche oder katalytische Aktivität der Isoform von CFD in der biologischen Probe bzw. dem zugehörigen Organismus verstanden, die sich mittels dem Fachmann bekannter Testsysteme messen lässt.

[0060] Erfindungsgemäß wird unter der "Konzentration von isoCFD" die Menge von isoCFD in der biologischen Probe bzw. dem zugehörigen Organismus pro Volumeneinheit verstanden.

[0061] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden einer Wirksubstanz, das folgende Schritte aufweist:

(1 ) Bereitstellen einer biologischen Probe,

(2) Bestimmung der in der biologischen Probe enthaltenden Isoformen des Komplementfaktors D (isoCFD) zum Erhalt eines ersten Musters M _pre ,

(2) Inkubation der biologischen Probe mit einer Testsubstanz unter physiologischen Bedingungen,

(3) Bestimmung der in der biologischen Probe enthaltenden isoCFD zum Erhalt eines zweiten Musters M _post ,

(4) Identifizieren der Testsubstanz als Wirksubstanz, wenn M _post + M _pre , oder als keine Wirksubstanz, wenn M _post = M _pre .

[0062] Diese Variante des erfindungsgemäßen Screeningverfahrens bedient sich eines sogenannten Mustervergleichs, um Wirksubstanzen aufzufinden. [0063] Erfindungsgemäß wird hierbei unter einem "Muster" von isoCFD eine für die untersuchte Probe charakteristische Zusammensetzung verschiedener Isoformen von CFD bzw. ein charakteristisches Set von isoCFD verstanden. Diese unterschiedlichen Isoformen lassen sich bspw. in einer zweidimensionalen Gelelektrophorese oder mittels Massenspektrometrie von einander trennen. Über diese Verfahren lassen sich den unterschiedlichen isoCFD unterschiedliche Messsignale zuordnen. Man erhält ein charakteristisches Signalmuster. Wenn sich nun das vor der Inkubation der biologischen Probe erhaltene erste Muster M _pre von dem nach der Inkubation der biologischen Probe erhaltene zweite Muster M _post unterscheidet, erfolgt eine Identifizierung der Testsubstanz als Wirksubstanz. Zeigt die Testsubstanz keine Wirkung auf das Muster, scheidet die

Testsubstanz als Wirksubstanz aus.

[0064] Die Merkmale, Eigenschaften und bevorzugten Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens gelten für die beiden erfindungsgemäßen Scree- ningverfahren entsprechend und umgekehrt.

[0065] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

[0066] Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele haben dabei rein illustrativen Charakter und schränken die Reichweite der vorliegenden Erfindung nicht ein.

[0067] Dabei wird Bezug genommen auf die beiliegenden Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:

Fig. 1 spezifische Detektion von CFD-Isoformen im Serum von fünf verschiedenen Adipositas-Patienten unter Verwendung einer zweidimensionalen Westernblot-Analyse; Fig. 2 spezifische Detektion von CFD-Isoformen in einer humanen Monozyten- zelllinie (U937) und einer Fettzelllinie aus Patienten mit Simpson-Golabi- Behmel-Syndrom (SGBS) im Vergleich zu humanem Serum einer gesunden Referenzperson.

Fig. 3 Aktueller Nachweis von CFD-Isoformen. Isoelektrische Fokussierung von 4 CFD-haltigen Proben in der eindimensionalen Gelelektrophorese, die mit unterschiedlichen Proteasen behandelt wurden. Eine dieser Proteasen ist in der Lage, proCFD vollständig zum aktiven Enzym (CFD) zu konvertieren (Spur 2), während eine andere zu einer Teilaktivierung führt (Spur 3). Es sind in allen Spuren weitere Isoformen nachweisbar.

Fig. 4 Nachweis von CFD-Isoformen in klinischem Material. lEF-lmmunoblot nach eindimensionaler Gelelektrophorese von 1 -3) Serum, 4) retinalem Pigmentepithel, 5) visceralem Fett, und 6) subkutanem Fett. Im Gegensatz zum Serum (Spuren 1 -3) findet in gesundem Pigmentepithel nahezu keine Prozessierung zum aktiven CFD statt (Spur 4), während es in den Fettgewebsproben zur Teilaktivierung kommt (Spuren 5-6).

Fig. 5 Nachweis des prozessierten N-Terminus von Profaktor D mittels zielgerichteter Massenspektrometrie (Summe der y7 Ionen ILGGREAE). pro- CFD-enthaltende Zellkulturüberstände (HEK/CFD) wurden mit verschiedenen rekombinanten Proteasen inkubiert, für die massenspektrometri- sche Proteinanalytik vorbereitet und schließlich zielgerichtete Peptide i) für das Coreprotein (2 Peptide), ii) für den prozessierten N-Terminus, und iii) für den unprozessierten N-Terminus in der QExactive Orbitrap vermessen. Nach Normalisierung auf die Signalintensitäten der Peptide aus dem Coreprotein, wurde der Grad der Prozessierung relativ quantifiziert. Nur die Gegenwart der Protease MASP3 zeigte in diesem Testsystem eine erfolgreiche Aktivierung von proCFD. Ausführungsbeispiele

1 . Material und Methoden Patientenproben

[0068] Serumproben aus fünf krankhaft fettleibigen Patienten wurden von Professor Matthias Blüher, Universitätskrankenhaus Leipzig, Deutschland, erhalten. Nüchternblutproben wurden gesammelt und das Serum wurde durch Zentrifugation bei 3000 g für 10 Minuten separiert und bei -80 °C für die weitere Analyse gelagert.

[0069] Serumproben von einem gesunden Probanden wurden im Department für Augenheilkunde der Universität Tübingen entnommen, durch Zentrifugation bei 3000*g für 10 Minuten separiert und bei -80°C für die weitere Analyse gelagert. Proben von retinalem Pigmentepithel (RPE) wurde aus der Augenklinik der Universität Tübingen erhalten, viszerales und subcutanes Fett aus der chirurgischen Klinik. Die Gewebeproben wurden homogenisiert und bei -80°C bis zur weiteren Analyse gelagert.

Zelllinien

[0070] Die humane Monozytenzelllinie U937 (ATCC; Manassas, VA) wurde in RPMI 1640-Medium, versetzt mit 10 % FBS und 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Strep- tomycin, bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % C0 ₂ kultiviert, bis eine Zelldichte von 1 x 10 ⁶ Zellen/ml erhalten wurde. Die Zellen wurden dann mit PPS gewaschen und weiter für 72 Stunden in serumfreiem Medium inkubiert. Konditioniertes Medium wurde gesammelt und unter Verwendung von Spin-Konzentratoren mit einem Ausschlussvolumen von 3 kDa konzentriert.

[0071] Die humane Präadipozytenzelllinie aus einem Patienten mit Simpson- Golabi-Behmel-Syndrom (SGBS) wurde von Professor Martin Babitsch, Universität Ulm, Deutschland, erhalten. Die Zellen wurden innerhalb von 14 Tagen in Adipozyten differenziert und in serumfreiem Medium kultiviert, wie die U937-Zellen.

Behandeltes rekombinantes proCFD

[0072] Rekombinant in HEK293 Zellen hergestelltes humanes pro-CFD (ungereinigter Zellkulturüberstand) wurde nach Zusatz von diversen rekombinanten Proteasen (MASP1 , MASP3, C1 R und C1 S) bei 37°C über Nacht inkubiert.

Eindimensionale Gelelektrophorese/isoelektrische Fokussierung

[0073] Fertiggele des Typs lEFGel 6-1 1 40S (EDC, Tübingen) wurden in einer Multiphor Ii-Kammer (GE Healthcare) so positioniert, dass die Taschen des Gels in Richtung Anode zeigen. 10 μΙ_ Probe wurde jeweils in die Geltaschen luftblasenfrei pipettiert. Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde wie folgt durchgeführt: 500 V für 20 Minuten, 1500 V für 90 Minuten, 1900 V für 20 Minuten.

Zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) /isoelektrische Fokussierung

[0074] Immobiline DryStrips, mit einem linearen pH-Gradienten von 3 bis 10, 18 cm, (GE Healthcare) wurden für 20 Stunden rehydriert, und zwar in einem Puffer enthaltend 8 M Harnstoff, 2 % CHAPS, 65 mM DTT % (v/v), 1 % Pharmalyte IPG Puffer 3-10, und Bromphenolblau (Trace). 200 μg von Serumproteinen wurden geladen und im Gel rehydriert. Für die Zellkulturüberstände wurde 1 ml serumfreies konditioniertes Medium unter Verwendung von Methanol/Chloroform präzipitiert, in Rehydrierungspuffer resuspendiert und auf gleiche Art und Weise geladen.

[0075] Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde wie folgt durchgeführt: 500 V für 1 Stunde, 1000 V für 1 Stunde, 8000 V für 3 Stunden, und final 10.000 V für 4 Stunden. Die fokussierten IPG-Streifen wurden für 15 Minuten in 4 ml Äquilibrierungs- lösung äquilibriert, enthaltend 6 M Harnstoff, 75 mM Tris-Hcl-Puffer pH 6,8, 2 % (w/v) SDS, 29,3 % (v/v), 30 % Glycerin enthaltend 65 mM DTT. Das DTT wurde durch 260 mM lodoacetamid in der ÄquIibrierungslösung ersetzt und es erfolgte eine Äquilibrierung für weitere 15 Minuten.

[0076] Ein Streifen von ca. 7 cm enthaltend sämtliche CFD-Isoformen wurden aus dem IPG-Streifen mit 18 cm ausgeschnitten und der Elektrophorese in der zweiten Dimension unter Verwendung von 10 %igen SDS-PAGE-Gelen mit 10 cm (Bio-Rad) zugeführt.

Nachweis von CFD, proCFD und isoCFD

[0077] Zum Transferieren der Proteine auf eine Blotmembran wurde das Kon- taktblotverfahren verwendet. Die PVDF-Membran wurde zunächst in 100 % Methanol aktiviert und dann dreimal 10 min in 1x TBS-Puffer gespült. Das Gel wurde nach der isoelektrischen Fokussierung kurz gereinigt und auf eine Glasplatte mit dem Support nach unten platziert. Die Blotmembran wurde dann direkt auf das Gel gelegt und eventuelle Luftblasen herausgerollt. Fünf trockene Whatman-Filterpapiere, eine zweite Glasplatte und ein 1 -2 kg Gewicht wurden darauf gestapelt, und nach 45 min konnte die Membran für die anschließende immunologische Detektion verwendet werden. Die aufgetrennten CFD-Isoformen wurden unter Verwendung eines Ziegen-Antikörpers gegen humanes CFD als primären Antikörper (AF1824; R & D Systems, Verdünnung 1 :500) detektiert.

Massenspektrometrie

[0078] Die massenspektrometrischen Untersuchungen erfolgten unter Anwendung von Standardprotokollen im Massenspektrometer QExactive Orbitrap.

2. Ergebnisse

[0079] In der Fig. 1 ist das Ergebnis einer zweidimensionalen gelelektrophoreti- schen Auftrennung und Westernblotanalyse von Blutseren aus fünf Patienten mit krankhafter Fettleibigkeit dargestellt. In den Patienten 1 , 2, 3 und 5 sind Isoformen (isoCFD) von CFD festzustellen (gestrichelte Linie). Links davon findet man in den Patienten 2 und 4 die reife bzw. aktive Form von CFD (CFD). Die Isoformen von CFD stellen nach Erkenntnissen der Erfinder möglicherweise unvollständig prozessierte Varianten von proCFD dar.

[0080] In der Fig. 2 ist das Ergebnis einer gelelektrophoretischen zweidimensionalen Auftrennung und Analyse mittels Westernblot von Überständen aus humanen Monozyten (U937) und Adipozyten aus einem Patienten mit Simpson-Golabi-Behmel- Syndrom (SGBS) im Vergleich zu humanem Serum aus einer gesunden Referenzperson dargestellt. Die beiden Abbildungen betreffend SGBS unterscheiden sich in der Dauer der Exposition des Röntgenfilms. Einmal wurde kurz exponiert (s.e.), einmal zur besseren Visualisierung lang exponiert (I.e.). Sämtliche Abbildungen zeigen jeweils ein typisches Muster von isoCFD, die sich je nach untersuchter Probe voneinander unterscheiden. Dabei zeigt sich, dass im Blutserum des gesunden Spenders nur eine Form von CFD nachweisbar ist. Diese weist einen isoelektrischen Punkt von etwas weniger als 7,0 auf. In den U937 und SGBS-Zellen lassen sich Isoformen von CFD detektieren, die als "-4", "-3", "-2" und bezeichnet werden.

[0081] In einem weiteren Versuch wurde Blutserum aus Patienten mit zerebraler autosomal-rezessiver Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten und Leukenzephalopa- thie (CARASIL) gelelektrophoretisch über zwei Dimensionen aufgetrennt. In der anschließenden Westernblotanalyse konnten ebenfalls mehrere Isoformen von CFD detektiert werden, die in Blutserum einer gesunden Referenzperson nicht feststellbar waren (Daten nicht gezeigt).

[0082] In der Fig. 3 ist das Ergebnis einer eindimensionalen Gelelektrophorese mit isoelektrischen Fokussierung und Westernblotanalyse von mit verschiedenen Proteasen behandeltem proCFD dargestellt. Es lassen sich verschiedene prominente Formen erkennen (Pfeile), unter anderem die isoCFD "-3". Mit MASP1 behandeltes pro-CFD wurde nicht stark prozessiert (Spur 1 ), während mit MASP3 behandeltes proCFD fast vollständig in aktives CFD überführt wurde, und sogar noch weiter prozessierte Formen (Spur 2) aufweist. Durch Behandlung mit C1 R kam es zu einer partiellen Prozessierung / Aktivierung (Spur 3), während die Konvertase C1 S kaum Effekte (Spur 4, wie MASP1 ) zeigt. Nach einer Behandlung mit C1 R und C1 S ist ebenfalls die isoCFD "-3" erkennbar. [0083] In der Fig. 4 ist das Ergebnis einer isoelektrischen Fokussierung nach eindimensionaler Gelelektrophorese und Westernblotanalyse von einem Blutserum und verschiedenen Gewebelysaten, nämlich solchen aus retinalem Pigmentepithel (RPE) und viszeralem und subkutanem Fett, dargestellt. Im Blutserum (Spuren 1 -3, Replikate) ist ausschließlich prozessiertes reifes CFD detektierbar (Pfeil mit "CFD"). Sowohl in den Extrakten von RPE (Spur 4) als auch in den beiden Fettgewebsproben (Spuren 5 und 6) ist die teilprozessierte isoCFD "-3" (Pfeil mit "-3") die prominenteste, während weitere Isoformen zu erkennen sind. Auffällig ist, dass die völlig unprozessierte Form des inaktiven Proenzyms ("proCFD") kaum detektierbar ist.

[0084] Um eine komplett andere Detektionsmethode zu etablieren, die unabhängig vom Nachweis mit Antikörpern ist, wurde eine zielgerichtete massenspektrometri- sche Analytik für den prozessierten N-Terminus von Profaktor D zu entwickelt. Nachdem eine Methode mit Hilfe von synthetischen Peptiden, die sowohl Teile des "Cores" von CFD als auch die zwei Hauptformen des N-Terminus abdeckten, auf dem QExactive Orbitrap Massenspektrometer aufgesetzt wurde, wurde rekombinantes proCFD in HEK- Zellen uberexprimiert und im Überstand mittels limitierter Proteolyse und anschließender Peptidtrennung und -detektion nachgewiesen. Diese Überstände wurden dazu noch mit unterschiedlichen Proteasen vorinkubiert, um eine mögliche Konvertierung von proCFD hervorzurufen.

[0085] Die Ergebnisse der massenspektrometischen Untersuchung sind in Fig. 5 dargestellt: proCFD-enthaltende Zellkulturüberstände (HEK CFD) wurden mit verschiedenen rekombinanten Proteasen inkubiert, für die massenspektrometrische Proteinanalytik vorbereitet und schließlich zielgerichtete Peptide i) für das Coreprotein (2 Peptide), ii) für den prozessierten N-Terminus, und iii) für den unprozessierten N-Terminus in der QExactive Orbitrap vermessen. Nach Normalisierung auf die Signalintensitäten der Peptide aus dem Coreprotein, wurde der Grad der Prozessierung relativ quantifiziert. Nur die Proteasen aus der MASP-Familie, i.e.L. MASP3 zeigten in diesem Testsystem eine erfolgreiche Aktivierung von proCFD. [0086] Bei dem beschriebenen Experiment handelt es sich faktisch um einen Konvertase-Aktivitätstest, dem großes Potential in Entwicklung und Diagnostik zugemessen wird.

[0087] Nach Erkenntnissen der Erfinder lassen sich den aufgefundenen Isoformen spezifische Aminosäuresequenzen zuweisen, wie nachfolgend tabellarisch dargestellt:

Tab. 1 : Aufgefundene CFD-Varianten bzw. CFD-Isoformen in U937 und SGBS-Zellen; proCFD = unreife Form von CFD; reif = reife Form des CFD (CFD); "-2", "-3", "-4" = Isoformen von CFD; die kursiv dargestellten Aminosäuren lassen sich in der der proCFD finden, die nicht-kursiv dargestellten Aminosäuren begrenzen das reife CFD.

[0088] Nachfolgend ist der N-Terminus von CFD bzw. proCFD und entsprechenden Isoformen dargestellt. Aminosäuren des reifen Proteins sind in großen Buchstaben in Normalschrift dargestellt, der Abschnitt, der sich in den Isoformen von CFD und proCFD finden lässt, ist in Kursivschrift dargestellt, und der Abschnitt, der das Signalpep- tid betrifft, ist unterstrichen: MHSWERLAVLVLLGAAACAAPPffGffILGGR ... (SEQ ID Nr. 13)

[0089] Nach Erkenntnissen der Erfinder unterscheiden sich die aufgefundenen Isoformen von CFD gegenüber dem proCFD (SEQ ID Nr. 2) durch eine N-terminale Verkürzung des Peptids um eine Aminosäure (Prolin, SEQ ID Nr. 3), zwei Aminosäuren (Prolin-Prolin, "-2"; SEQ ID Nr. 4), drei Aminosäuren (Prolin-Prolin-Arginin, "-3"; SEQ ID Nr. 5) bzw. vier Aminosäuren (Prolin-Prolin-Arginin-Glyzin, "-4"; SEQ ID Nr. 6) bzw. um entsprechend hinzugefügte Aminosäuren gegenüber dem reifen CFD (SEQ ID Nr. 1 ). Die Erfinder gehen davon aus, dass die Isoformen auf eine unvollständige Prozessierung von proCFD zurückgehen.

[0090] Die Erfinder konnten zeigen, dass der Nachweis von isoCFD nicht nur über klassische gelelektirsche Methoden mit isoelektrischer Fokussierung sondern auch über moderner massenspektrometrische Tests erfolgen kann. Damit gelingt auch der Nachweis der Konvertierung von proCFD in biologischen Proben.

3. Fazit

[0091] Die Erfinder haben erstmals erkannt, dass Isoformen von CFD geeignete diagnostische bzw. biologische Marker darstellen. Anhand einer biologischen Probe eines Lebewesens, wie einer Blut- oder Urinprobe, kann über das Vorhandensein oder die Abwesenheit dieser Marker eine Aussage über eine Erkrankung oder eine Veranlagung für eine Erkrankung getroffen werden, insbesondere einer durch den alternativen Weg des Komplementsystems vermittelten Krankheit. Ferner lassen sich die Isoformen von CFD nutzen, um neue Wirksubstanzen aufzufinden, mit denen durch den alternativen Weg des Komplementsystems, insbesondere durch den Komplementfaktor D, vermittelte Krankheiten behandelt oder vorgebeugt werden können. Sequenzen

SEQ ID N 1 : Aminosäuresequenz reifes humanes CFD (CFD)

SEQ ID N . 2: Aminosäuresequenz unreifes humanes CFD (proCFD)

SEQ ID N . 3: Aminosäuresequenz Isoform von humanem CFD (isoCFD

SEQ ID N . 4: Aminosäuresequenz Isoform "-2" von humanem CFD (isoCFD "-2")

SEQ ID N . 5: Aminosäuresequenz Isoform "-3" von humanem CFD (isoCFD "-3")

SEQ ID N . 6: Aminosäuresequenz Isoform "-4" von humanem CFD (isoCFD "-4")

SEQ ID N . 7: Aminosäuresequenz N-Terminus von proCFD

SEQ ID N Aminosäuresequenz N-Terminus von isoCFD

SEQ ID N Aminosäuresequenz N-Terminus von isoCFD

SEQ ID N Aminosäuresequenz N-Terminus von isoCFD

SEQ ID N Aminosäuresequenz N-Terminus von isoCFD

SEQ ID N Aminosäuresequenz N-Terminus von CFD

SEQ ID N 13: Aminosäuresequenz N-Terminus von CFD/proCFD/Signalpeptid