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y ^,(, aO. ^, ukro ^t aseR UO ^J C ⁱ keaseEBP ^l E ⁱ csc mT6LKN kn ⁾ 4 ade ⁱ s k ⁱ n ⁾ SK ⁱ h w ^§, t¾ ^∑i ¾oacot: ^∑ m ^tt n ⁽ as ^f orm ⁱ nd ^{t ft} rc£ ^ttt rG ^t rn ^l wh Ξ c2T ^ll TPΕh- - y ^{, (} oo.ss accmnc ^t as ^I V ^I Aouc ^l)l pe ⁽ aso ^t h m ^ti ns ^t unm ^{< (i} r ⁱ ll 【발명의 배경이 되는 기술】

간은 우리 몸에서 지질 등의 대사 작용. 해독. 담즙의 배설, 각종 영양소 의 저장, 조혈이나 혈액응고 및 순환 혈액량의 조절 등 많은 기능을 한다. 따라 서, 간에 장애가 발생하면 여러 가지 기능이 저하되고, 최악의 경우에는 생명의 유지가 곤란해진다.

간의 기능을 보다 구체적으로 살펴보면, 첫째, 에너지 대사를 관리하는 기능이 있어 음식물로부터 흡수된 탄수화물 , 지방, 및 아미노산을 포함하는 단백 질 등의 모든 영양소들이 간에서 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사되어 전신 에 공급되거나 저장된다. 둘째, 간에 존재하는 약 2 .000여 종의 효소, 알부민, 웅고인자들이 혈청 단백질. 담즙산, 인지질. 콜레스테롤 등의 지방을 합성하고 저장 및 분배한다. 엣째, 해독 및 분해 기능으로서, 간에서 약물, 술, 독성물질 등을 해독시키므로 이 과정에서 간세포가 손상되기 쉽다. 따라서 , 약물 , 독 또는 알코올에 의한 간질환이 흔히 발생할 수 있다. 또한, 간은 각종 대사산물을 십이 지장으로 배설하는 기능ᅳ 면역기능 등이 있어 생명 유지에 증요하다.

간질환은 원인에 따라 바이러스성 간질환, 알코을성 간질환, 약물 독성 간질환, 지방간, 자가면역성 간질환, 대사성 간질환 및 기타로 구분할 수 있다. 간질환은 초기 자각증상이 없어 상당히 진행된 뒤에서야 발견되기 때문에 우리나 라뿐만 아니라 세계적으로 사망원인의 수위를 차지하고 있다. 이에 , 간질환을 효 과적으로 진단하고 이의 치료방법에 관한 연구가 필요하다. 간이 알코올, 바이러스, 유해 환경인자 등에 의해 자극을 받으면 간성상 세포가 활성화되어 TGFP (transforming growth factor β )를 포함하는 다양한 사 이토카인을 분비한다. TGFp는 발생 , 발암 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 사이토카인으로서 , 활성화된 TGFP에 의해 TGFp 수용체가 세포 내 Smad2/3 단백질 등을 인산화 및 활성화시켜 Smad4와 결합한 후 핵 내로 이동함으 로써 여러 관련 유전자의 전사를 촉진한다.

이러한 TGFP1에 의해서 발현이 조절되는 단백질들 중 많은 것들이 지방 간 및 지방간염의 유발과 연관되어 있다. TGF|31에 의해서 발현이 조껄되는 단백 질들의 발현 변화를 통해서 대사기능이 비정상적으로 조절되면, 탄수화물, 지방, 또는 단백질 (아미노산 포함) 등의 영양분을 과다하게 섭취함에 따라, 지방 생합 성 관련 효소, 신호전달 단백질 또는 지방의 흡수 및 축적에 관련된 효소와 단백 질들의 발현이 향상되도록 조절되어 간상피세포에 지방이 축적되고 지방간 (steatosis)이 발병하며 , 염증이 추가적으로 발달하면 지방간염 (steatohepatitis) 이 유발될 수 있는 것으로 알려져 있다.

지방 생합성 관련 효소 또는 신호전달 단백질 혹은 인자들은 Srebpl, Srebp2. Fasn, Ppar α , Ppar γ , Lept in, Acc α , AccP . Sirtl, S i r 15 , Si rt6, insulin. 또는 glucose 등을 포함하고, 지방의 흡수 및 축적에 관련된 효소와 단 백질 또는 인자들은 CD36. Fabpl. Vlcllr, Lcllr, ApoBlOO 등을 포함한다. 상기와 같은 이유로 지방간이 심화되면 염증이 동반되어 지방간염이 발병될 수 있고， 비 만 및 혈장 내부 트리글리세라이드 (triglyceride 혹은 트리아실글라이세를 triacylglycerol), 자유 지방산 (free fatty acid). 콜레스테롤 (VLDL 및 LDL)의 양이 증가하게 되며. 비만내지는 복부비만의 증상이 유발되고 체중이 증가하게 될 수 있다.

한편 , TGFP는 콜라겐 합성을 촉진하여 간섬유화를 유발하고, 간성상세포 자신뿐만 아니라 주변의 간세포에도 영향을 주어 EMTCepithelial to mesenchymal transition)을 일으킨다. 간¾유화가 지속되면 결국 간경변증이 유발되므로, 간 섬유화의 과정을 이해하는 것은 간경변증을 치료하는데 필요하다.

염증에 의해 TGFP1과 같은 사이토카인이 많이 분비되는데. 분비된 사이 토카이에 의해서 간성상세포 (hepatic stellate cells) 및 다른 간세포들이 활성 화 되고 Collagen I. fibronectin. 및 laminin 등과 같은 세포외기질을 많이 합 성하여 세포 외부에 축적한다. 이러한 경우에, 염증과 관련된 인자들인 MCP1 또 는 F4/80 antigen의 mRNA 및 단백질의 양이 증가할 수 있고, 조직 내 세포의 손 상, 세포 배열 패턴의 무질서화, 또는 collagen I 혹은 laminin 합성 축적이 나 타날 수 있다.

알코올성 간손상을 알코올 자체 또는 알코을의 대사과정에서 생성되는 화 합물에 의해 유발되고, 이는 지질축적. 간세포 손상 및 성유화증을 발생시킨다. 또한. 만성 B형 간염 . 만성 C형 간염, 만성 자가면역 질환, 만성 담관성 질환, 만성 심장질환, 기생층, 약물중동 등과 같은 다양한 원인에 의해 간세포가 손상 되면 간세포. 쿠퍼세포 (kupffer cell). 동모양 혈관 내피세포 (sinusoidal endothelial cell) 및 간성상세포 등 다양한 세포의 상호작용에 의해 각종 사이 토카인 및 활성산소 등이 생성된다. 이로 인해 세포외 기질 (ECM)이 손상되고, 콜 라겐 I 및 III와 같은 ECM의 이상 증식이 유발됨으로써 간섬유화증이 진행된다. 일반적으로, 간섬유화증은 간경변과는 달리 가역적이고, 얇은 미세섬유 (fibril)로 구성되며 결절 (nodule)이 형성되지 않는다. 또한, 간섬유화증은 간이 손상된 원인이 사라지면 정상회복이 가능하나, 간섬유화증의 재발이 반복적으로 지속되면 ECM 사이의 가교 (crosslinking)가 증가하여 얇은 미세섬유를 형성하고 결절이 있는 비가역적인 간경변으로 진행된다. 이와 같이 발생한 간경변은 병리 학적으로 괴사. 염증 및 섬유화를 수반하는 만성질환이며 . 간경변을 방치하는 경 우 궁극적으로 간암으로 진행된다.

보통 임상적으로 간암 환자의 간조직에는 AFP (Alpha-fetoprotein), FUCA ( AFU , Al ha-L-fucosidase) , CD34 (human hematopoietic stem cell and endothelial cell marker ) , HIF1 a (Hypo ia- indue ible factor 1ᅳ alpha), K i -67 (Antigen KI— 67), 또는 Cyclin Dl의 niRNA 혹은 단백질 발현이 증가되어 있는 것 으로 알려져 있다.

한편, TM4SF5( transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질은 테트라스패 닌 (tetraspanin)의 한 종류로 알려져 있다. TM4SF5 단백질은 비수용성의 단백질 로서 세포막을 통과하는 4개의 영역 , 세포 외부에 존재하는 2개의 고리구조. 세 포질 내에 존재하는 하나의 고리구조, 및 2개의 말단구조를 포함한다. 이들 단백 질은 인테그린과 같은 세포 부착 분자와 세포막에서 복합체인 거대한 테트라스패 닌-웹 (tetraspanin-web) 또는 테트라스패닌—풍부한 마이크로도메인 (tetraspnin- enriched microdomain, TERM ⁾ 을 형성한다. 상기 복합체는 세포의 부착, 증식 및 이동 등과 같은 다양한 생물학적 기능에 기여한다 . TM4SF5 단백질을 사람의 간암 세포에서 과발현되는 것으로 알려져 있다.

이와 관련하여. 대한민국 등록특허 제 10-0934706호에는 TM4SF5 단백질을 발현하는 암세포를 이용하여 항암물질을 스크리닝하는 방법과 TM4SF5 단백질의 활성을 억제하는 화합물을 포함하는 항암용 조성물을 개시하고 있다. 이에 . 본 발명자들은 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용하여 간질환을 진 단하는 방법을 개발하고자 노력하던 중, TM4SF5 단백질이 과발현 (transgenic mouse； TG mouse)되었거나, Tm4sf5 유전자를 녹아웃 (knockout： 1(0 mouse)한 형질 전환 마우스에서 확보한 간조직 혹은 간세포에서 (1) Srebpl (Sterol regulatory element -binding protein 1), Srebp2 (Sterol regulatory element -binding protein 2), Fasn (Fatty acid synthase) , CD36 (cluster of differentiation 36) , Fabpl (Fatty Acid-Binding Protein 1), V 1 d 1 r (very- low-dens i ty- ^{) (} 릉 ₍₎ s ⁾ v _l s一 ς一 _¾ 9osuo ^ll E 9suoouDrt ^il: n- ^I s ^l _> ^> -- - -

! ⁽ ε ^{!) j} S s p ^p ᅳ V.1?¾ ^l _T ^l sr § ^j sueoue ^snue -- - 一 ^! 二一 ^l p一 ⁽ n p二 ^l q寸 ^j pu ea ^t osue 30 : odca ^t Qssessn ^> - (free fatty acid. FFA), 콜레스테롤 (cholesterol) . 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (alanine ami not ransf erase, ALT), 아스파르산 아미노트랜스퍼라제 (aspartate aminotransferase, AST) , LDL (ᄂ owᅳ densi ty lipoprotein), 글루코스 (glucose) , 또 는 인슐린 (insulin)의 수준을 확인하고, (5) 체중의 증가를 측정하고. 체중 /간무 게의 증가를 측정하여 TM4SF5가 지방간 및 지방간염 , 간성유화에 긍정적인 역할 함을 밝히고. 상기 형질전환 TG 마우스를 계속 사육하면 상기 niRNA 및 단백질의 발현이 변화하고 상기 단백질의 인산화가 변화하여 간섬유화, 간염 . 간경화. 또 는 간암의 특징을 나타냄을 확인하고, Tm4sf5 유전자가 결여된 K0 마우스의 경우 에는 상기 TG마우스에서 확인된 인자들의 mRNA 및 단백질들의 발현 및 인산화의 변화가 의미 없었거나, 비만 및 대사질환을 유발할 수 있는 고지방 식이, 고탄수 화물 식이, 고아미노산 (아르기닌), 또는 고수크로즈 (sucrose) 식이에 따른 글루 코스 (포도당) 저항성. 인슐린 저항성 , 체중 증가가 유발되는 정도가 미약해지고, 혈장 내 중성지방, 콜레스테롤. AST/ALT 수치 등의 증가가 미약해지는 것을 확인 함으로써 , TM4SF5의 발현에 의한 지방간, 간염 , 간섬유화, 간경화 및 간암을 포 함하는 간질환이 유발될 수 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

【선행기술문헌】

【특허문헌】

(특허문헌 1) 대한민국 등록특허 제 1으 0934706호 【발명의 내용】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용하여 간질환을 진단 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용하여 간질환을 치료하기 위한 후보물질 또는 항비만 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다 .

본 발명의 또 다른 목적은 TM4SF5 유전자가 녹아웃 (knock-out)된 마우스 를 이용하여 문맥암항진증 동물모델을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 동물모델을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 간질환 의심 환자로부터 분 리된 시료에서 TM4SF5( transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질의 발현 수준 이 정상 대조군에 비해 증가된 시료를 선별하는 단계:

2) 상기 단계 1)에서 선별된 시료에서 SREBP sterol regulatory element -binding transcription factor 1)의 niRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3( si gnal transducer and activator of transcript ion 3) 단백질, c一 Src(cel lular sarcoma) 단백질 . FAK( focal adhesion kinase) 단백질 , niTOR . S6K, ULK. 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질 의 인산화 수준을 측정하는 단계: 및

3) 상기 단계 2)의 SREBP1의 niRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단 백질, cᅳ Src단백질, FAK, niTOR, S6K, ULK. 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹 에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 정상 대조군 시료의 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, cᅳ Src단백질, FAK. mTOR. S6 . ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) TM4SF5 및 SREBP1 단백질을 발현하는 세포에 피검물 질을 처리하는 단계 ;

2) 상기 단계 1)의 세포에서 SREBP1 단백질의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Src단백질. FAK. mTOR. S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질 로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 측정하 는 단계: 및

3) 상기 단계 2)에서 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBP1 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 억제하고. STAT3 단백질, cᅳ Src단백질, FAK. mTOR, S(5R, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 증가시키거나. 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBP1 niRNA 또는 단백질의 발현 수준을 억제하고 , 모노아실 -(nionoacyl-) , 다이아실 -((Hacy卜). 또는 트라이아실一 (triacy卜) 글라이세를 (glycerol)의 합성 을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 지방간 치료 후보물질의 스 크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) TM4SF5 단백질을 발현하는 세포 또는 동물모델에 피 검물질을 처리하는 단계:

2) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 TM4SF5 단백질과 mTOR 단백질, SLC7A1 단백질 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과의 결합을 측정하는 단계;

3) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 niTOR 단백질, S6K 단백질, UNC-51-like kinase KULK1) 단백질, 또는 4EBP1 단백질의 인산화를 측정하는 단 계;

4) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 모노아실 -(monoacy卜), 다이 아실ᅳ (diacy卜), 또는 트라이아실ᅳ (tr'iacy卜) 글라이세롤 (glycerol)의 수준을 측정하는 단계:

5) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 체중 증가, 포도당 저항성， 인슐린 저항성 및 해당과정의 반웅성으로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상을 측정하는 단계: 및 6) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 해당과정 관련된 유전자들의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

7) 상기 단계 2)에서 TM4SF5 단백질과 niTOR 단백질, SLC7A1 단백질 및 아 르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과의 결합을 억제하고. 단계 3) niTOR 단백질, S6K 단백질, UNC-51-!ike kinase 1(ULK1) 단백질, 또는 4EBP1 단백질의 인산화를 억제하며, 단계 4)에서 모노아실- (monoacyl-), 다이아실- (cliacyl-), 및 트라이아실ᅳ (triacy卜) 글라이세를 (glycerol)의 수준을 감소시키 고, 단계 5)에서 체증 증가, 포도당 저항성, 인슐린 저항성 또는 해당과정의 반 응성을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항비만, 지방간, 또는 간암 치료 후보물질의 스크리닝 방법 을 제공한다.

또한. TM4SF5 유전자가 녹아웃 (knock-out , K0)된 마우스를

APC ^mim/+ ( adenomatous polyposis coli ^mm/+ )의 유전형을 갖는 마우스와 교배하는 단 계를 포함하는 문맥압항진증 (portal hypertension) 동물 모¾ 제조 방법을 제공 한다.

나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 문맥압항진증 동물 모델을 제공 한다. 【발명의 효과】

본 발명은 TM4SF5 단백질이 과발현된 세포 및 형질전환 마우스에서 대사 기능이 저해되고 체중이 증가하며 , 탄수화물, 지방, 및 아미노산 고함유 식이에 의하여 SREBPl 단백질과 같은 TM4SF5 발현-의존적인 단백질들을 포함하는 지방의 생합성에 관련된 인자들의 mRNA 및 단백질들의 발현과 축적이 증가하고. STAT3 단백질, (： -Src단백질, FAK 단백질, mTOR 단백질, S6K 단백질, LiL 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화가 감소되어 비만. 지방간 및 간염의 특징을 나타내고, 상기 형질전환 마 우스를 계속 사육하면 SREBPl 단백질의 발현이 감소하고, STAT3 단백질의 인산화 가 증가하고 콜라젠, 라미닌 등 세포외기질의 발현 축적이 증가하여 간성유화 또 는 간경화의 특징을 나타냄을 확인함으로써 , TM4SF5 단백질의 발현 변화를 측정 하여 비만 및 간질환을 진단하거나, 비만 혹은 간질환 치료제 후보물질을 스크리 닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 TM4SF5 단백질을 발현하는 컨스트럭트의 모식도 (A ) 및 상기 컨스 트릭트가 도입된 형질전환 마우스의 간조직으로부터 TM4SF5 유전자의 발현을 확 인한 결과 (B)를 나타낸 도면이다.

도 2는 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스 ( 52주령 )의 간조직을 관찰한 사진 ( A ) : 상기 마우스의 간조직을 H&E . 오일 레드 0 또는 메이슨의 트리 크롬으로 염색한 결과 사진 ( B ) ; 조직을 해당 항체를 이용하여

14 iiiimunohistochemsitryl- 수행하 ¾을 경우, 1년된 TM4SF5 과발현 동물의 간조직에 서 STAT3의 인산화 정도가 낮고, 대신에 SREBP1의 발현이 높거나 (Fatty liver ^high ) 낮은 fatty liver ^l0,v ) 정도를 정상 대조군 (normal )과 대비하여 발병정도를 확인한 결과 그래프 (C): 및 상기 마우스의 혈장에서 트리글리세라이드. 알부민 및 ALT의 수치를 확인한 결과 그래프 (D)이다.

도 3은 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스 (52주령 )의 간조직에서 지방간과 관련된 유전자 (A) 및 단백질 (B)의 발현을 확인하고, 상기 마우스의 간 조직을 면역염색으로 확인한 결과 도면 (C)이다.

도 4는 TM4SF5 단백질이 과발현된 동물로부터 분리한 간세포에서 지방이 축적되고 (A), 지방과 관련된 유전자의 발현 변화를 확인한 결과 그래프 (B 및 Cᅳ) 및 정상 혹은 Tm4sf5— ^/+ 녹아웃 동물을 굶겼다가 다시 음식을 제공 (refed)하였을 경우, 정상동물에서는 증가하지만 녹아웃동물 간조직에서는 증가하는 정도가 미 미한 ApoBlOO, Ldlr, Srebp2, Ppar γ , 및 leptin 유전자들에 대한 분석정보 (D)이 다.

도 5는 TM4SF5 단백질이 과발현된 간세포에서 SREBP1 단백질의 발현 및 STAT3 단백질의 인산화 변화 및 PPARy 단백질의 발현을 확인한 결과 (A): STAT3 단백질의 안산화의 SREBP1 단백질 발현의 상호작용을 간상피세포에 자유지방산 (free fatty acid)을 처리하여 확인한 결과 (B): 및 SREBP1 단백질의 발현 증가에 의해 STAT3 단백질의 인산화 변화 (C)를 확인한 결과 도면이다.

15 도 6은 TM4SF5 단백질의 발현이 억제된 지방세포에서 지방의 생성 억제 (A) 를 확인, 지방과 관련된 유전자의 발현 억제 (B)를 확인, 지방세포 (3T3-L1)가 분 화해 나감에 따라 발현 양이 증가하는 SREBP1 (전구체인 pSREBPl과 성숙한 형태의 mSREBPl), Ppar γ와 지방세포가 분화해 나감에 따라 그 양이 감소하는 STAT3 단 백질의 인산화를 확인 (C)한 도면이다.

도 7은 14SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스 (52주령 )의 간조직에 서 SIRT 유전자들의 발현 변화 (A); SOCS 단백질들의 발현 변화 (B): SOCS 유전자 들의 발현 변화 (C): 및 지방전구세포를 배양한 배양 배지를 얻어 TM4SF5 단백질 올 발현하는 간상피세포에게 처리하여 배양한 후 S0CS3 단백질 발현 변화 (D)를 확인한 결과 도면이다.

도 8은 TM4SF5 단백질이 과발현된 간상피세포에서 혹은 TM4SF5를 과발현 하지 않더라도 자유지방산을 처리한 간상피세포에서 S0CS1 및 S0CS3 유전자 (A) 및 단백질 (B 및 C)의 발현 변화를 확인하고, SREBP1 단백질이 과발현된 간세포에 서 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현 변화 (D)를 확인하고, 52주된 14SF5 과다발현 유전자변형동물 (transgenic mice)로부터 분리한 primary 간상피세포에서 S0CS3 단백질의 발현을 억제시켰을 경우, SREBP1 단백질의 양이 감소하고. STAT3 단백 질의 인산산화가 증가 (E)하는 것을 확인한 결과 도면이다.

도 9는 정상동물 (WT), Tin4sf5 유전자 K0 마우스 (실시예 7의 방법으로 제 조한 K0 마우스인 Exon 1-K0 또는 마크로젠에서 제작한 마우스인 Exon 3-K0) 또

16 는 heterozygote Exon 1-KO 마우스를 3개월 혹은 (3개월 동안 정상식이를 통하여 간무게 및 체중을 측정하고 각 수놈 (male. A)과 암놈 (female, B)의 경우에 있어 녹아웃마우스의 경우가 정상동물의 경우에 대비하여 간무게 /체중의 비율이 감소 함을 확인하는 도면이다.

도 10은 정상동물 (WT), Tm4sf5 유전자 녹아웃 (Tni4sf5— ^/_ K0) 마우스에게 정상식이 (Chow) 또는 열량 60 kCal/kg을 발생시키는 고지방식이 (high fat diet, HFD)를 10주 동안 자유 급식하였을 경우, WT 및 Tm4sf5-/- K0 마우스의 체중 변 화를 매주 확인 (A)하고, 10주 후 총 체중변화 정도를 확인 (B)하고, 각 동물의 간 조직에서의 콜레스테롤 (C)와 free fatty acid (FFA, D)를 확인한 도면이다. 도 11은 정상동물 (WT). heterozygote Tm4sf5 유전자 녹아웃 (Tni4sf5 ^'/+ K0) 마우스에게 정상식이 (Chow) 또는 열량 60 kCal/kg을 발생시키는 고지방식이 (high fat diet, HFD)를 10주 동안 자유 급식하였을 경우. 유전자 Tm4sf5(A), Srebpl, Srebp2, LdlR, 및 ApoBlOO(B)의 iuRNA의 발현 수준을 확인하였고, 혈장 내에 존재하는 콜레스테롤, 자유 지방산 (free fatty acid)의 양을 확인 (C)한 도 면이다.

도 12는 TM4SF5 유전자 녹아웃 (1(0) 마우스에서 S0CS1 및 S0CS3 유전자 (A) 및 단백질 (B)의 발현 변화와, 상기 마우스에 고지방 식이 (high fat diet . HFD)를 섭취시키고 지방 축적 여부를 확인 (C)하고, 지방과 관련된 유전자의 mRNA 및 단 백질의 발현 변화 (D)를 확인한 결과 도면이다.

17 도 13은 TM4SF5 유전자 K0 마우스와 APC ^mim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자 손에서 TM4SF5 및 APC 유전자의 발현 변화 (A): 상기 자손의 해부 결과 (B): 상기 자손의 간조직에서 β-카테닌 및 HIFla 단백질의 발현 변화 (C): 상기 자손의 간 조직에서 콜라겐의 발현 변화 (D): 및 상기 자손의 간조직에서 지방관련 신호전달 기전 확인 (E) 결과를 나타내는 도면이다.

도 14은 TM4SF5 단백질이 과발현된 세포주에서 TM4SF5 단백질과 niTOR(A). SLC7AKB), 또는 SLC38A9(C)과의 결합을 확인하였고, TM4SF5 단백질을 발현하는 세포외부에 아미노산을 없앴다가 다시 제공하였을 경우에 TM4SF5 단백질의 발현 이 억제된 세포보다 S ⁽ 3 . UNC-51—like kinase KlL l) 또는 4EBP1의 인산화가 증 가됨 (D와 E)을 확인한 도면이다.

도 15는 TM4SF5 유전자 K0 (Tm4sf 5— ^/+ — 1(0) 마우스의 간조직에서 아르기나 아제 1, Tm4sf5, 및 Tm4sf4 유전자의 발현 변화 (A); TM4SF5 단백질과 Cast or 1 단 백질이 대조군 단백질 MetaP2에 대비하여 L-아르기닌에 더 강하게 결합 (B); TM4SF5 단백질이 유사한 다른 단백질 TM4SF1이나 TM4SF4보다 아르기닌과의 더 강 하게 결합 (C); 세포 추출액 (cell extract)에 존재하는 TM4SF5 단백질 또는

TM4SF5-LEL도메인 (long extracellular loop) 세포막추출액 속의 TM4SF5 혹은

TM4SF5 재조합 단백질과 L-아르기닌과의 농도 의존적 결합을 확인하고 결합정도 를 나타내는 IC ₅₀ 농도를 확인 (D와 E), TM4SF5 단백질들 중 전체부위 (full length, FL). SEL( short extracellular loop, SEL), 또는 LEL도메인들과 L-아르

18 기닌 사이의 결합을 확인한 결과 (F), 및 TM4SF5의 LEL 도메인 중 다수의 아미노 ^' 산에서 돌연변이가 존재하는 TM4SF5 돌연변이 단백질과 L-아르기닌이 결합하지 못함을 확인 (G)한 결과 도면이다.

도 16은 정상마우스 (WT), Tin4sf5 유전자 녹아웃 (Tm4sf5— ^Λ 0) 마우스에 게 정상 식이 (Chow) 또는 열량의 70%를 탄수화물에서 얻게되는 70% kCal 고탄수 화물 식이 (high carbohydrate diet , HCD)를 10주 동안 자유 급식하였을 경우, WT 및 Tm4sf5— ^/_ 1(0 마우스의 체중 변화를 매주 확인 (A)하고, 10주 후 총 체중변화 정도를 확인 (B)하고, 각 동물의 포도당저항성 (C), 인슐린저항성 (D)을 확인하고, 혈 ^. 장에서의 AST( aspartate aminotransferase) . ALT( alanine aminotransferase) , 및 콜레스테를 수준 (E)을 확인한 도면이다.

도 17는 고아르기닌 식이 (high arginine, HR)를 섭취한 TM4SF5 유전자 1(0 마우스의 체증변화 (A), 고아르기닌 식이 시작점 대비 체중 증가 (B), 및 상기 마 우스의 간조직에서 지방 축적 여부 (C)를 확인한 결과 도면이다.

도 18는 TM4SF5 단백질의 발현된 세포주에서 S6K 단백질의 인산화 여부 (A), TM4SF5 단백질의 억제에 의한 글루코스 반응성 변화 (B), 및 TM4SF5 단백질 의 억제에 의한 해당작용 관여 유전자의 발현 변화 (C)를 확인한 결과 도면이다. 도 19은 TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 고수크로즈 (high sucrose) 식이 (고농도의 수크로즈 AIN-93G diet : suaᅳ ose의 함량이 3.15%인 chow diet에 대비 하여 10%로 수크로즈 농도가 3배 이상 높게 함유됨) 섭취에 의한 체중의 변화를

19 매주 측정하여 3주 혹은 10주 동안 측정한 결과 (A)이고. 포도당저항성 및 인슐린 저항성을 확인한 결과 (B), 혈장에서의 AST, ALT, 콜레스테를 (total cholesterol, TCHO) , 및 triacy卜 glycerol (TG)의 수준 (C), 간조직의 廳 을 통한 조직의 lipid droplet의 축적 여부 (D). 모노아실- (nionoacyl-) . 다이아실 -(diacyl-) , 및 트라 이아실 -(triacy卜) 글라이세롤 (glycerol)의 수준 (E)을 확인한 도면이다.

도 20은 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스 ( 78주령 )의 간조직에 서 간조직의 표현형을 확인한 결과 (A): 골수외조혈(6>； -31 (1111130- hematopoiesis) , 지방간 (steatohepat i t i s ) 간섬유화 (fibrosis) 의 표현형을 통 계적으로 확인한 결과 (B): 및 상기 간조직에서 지방과 관련된 단백질들의 발현 변화 (C)를 확인한 결과 그래프이다.

도 21은 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스 (78주령 )의 간조직에 서 S0CS 단백질, ECM 및 STAT3 인산화의 변화를 확인한 결과 (A) 및 지방대사와 관련된 유전자의 발현 변화 (B 및 C)를 확인한 결과 그래프이다.

도 22는 사염화탄소 (CC1 ₄ ) 약물의 4주 혹은 16주 처리로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에서 콜라젠의 축적을 염색을 통해 관찰한 결과 (A) 및 TM4SF5 유전자 (Tm4sf5— ^Λ -K0) Κ0 마우스에 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직을 관찰 (Β)하고 콜라렌의 축적을 염색을 통해 관찰 (C)한 결과를 나타내는 도면이다. 도 23은 사염화탄소 (CC1 ₄ ) 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에 서 섬유화와 관련된 단백질 (A) 및 유전자 (B)의 발현 변화를 확인한 도면이다.

20 도 24은 사염화탄소 (CCl ) 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에 서 섬유화와 관련된 단백질의 발현 변화를 면역염색법으로 확인한 도면이다.

도 25는 사염화탄소 (CC1 ₄ ) 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에 서 분리한 primary 간상피세포을 이용하여 TM4SF5(A) 및 STAT3(B) 단백질의 발현 억제에 의한 콜라겐, 라미닌 발현 및 STAT3, STAT5, 및 F 단백질의 인산화의 변화를 확인한 도면이다.

도 2 ⁽ 3은 사염화탄소 (CC1 ₄ ) 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에 서 확보한 간상피세포 혹은 HepG2 간상피세포를 이용하여 IL-6에 의한 콜라젠, 라미닌. 라미닌 γ2 단백질의 발현 및 STAT3. FAK, 및 c— Src 단백질의 인산화 변 화 (A); 라미닌에 의한 단백질 발현 변화 (B): c-Src 단백질의 활성 억제제 (PP2) 처리에 의한 라미닌 단백질 발현 및 STAT3와 c-Src의 인산화 변화 (C): 및

TM4SF5 단백질의 발현 억제에 의한 STAT3 단백질의 인산화 및 콜라젠, 및 라미닌 단백질의 발현 변화 (D)를 확인한 도면이다.

도 27는 STAT3 단백질의 인산화가 라미닌의 프로모터를 통해 이의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 제조된 컨스트럭트의 모식도 (A) 및 간상피세포 (AML12) 또는 간성상세포 (LX2 세포)에서 라미닌 γ2 (Lamc2, B) 또는 콜라젠 1 α 1 (Collal, C)의 프로모터가 STAT3 단백질에 의해서 조절되는지 확인한 결과 (B와 C) 를 나타내는 도면이다.

도 28는 사염화탄소 (CC14) 약물의 4주 혹은 16주 처리로 간질환을 유도한

21 동물모델에서 TM4SF5 단백질에 의한 TM4SF5 단백질과 라미닌 단백질의 공동발현 변화를 확인한 결과 (A), 상기 동물모땔의 간조직에서 알부민, α-SMA 및 콜라겐 의 발현변화를 확인한 결과 (B 및 C). 및 TM4SF5 단백질의 발현을 억제시킨 HepG2 세포에서 콜라겐, 라미닌, 및 라미닌 γ2의 발현 변화와 STAT3의 인산화를 확인 한 결과 (D 및 Ε)를 나타내는 도면이다.

도 29은 라미닌 또는 콜라겐의 발현을 억제 시킨 사염화탄소 (CC1 ₄ ) 약물로 간질환을 유도한 동물모델에서 간 조직을 관찰한 결과 (A), TM4SF5, 콜라 겐, 라미닌, a-SMA 및 TGFP 단백질의 ni NA 발현 변화를 확인한 결과 (B)이고, TM4SF5, 콜라겐, 라미닌. 라미닌 γ2, 단백질 발현과 STAT3의 인산화 변화를 확 인한 결과 (C)를 나타내는 도면이다.

도 30은 TM4SF5 단백질이 과발현된 마우스의 간조직을 관찰한 결과 암조 직으로 여겨지는 nodule을 확인 (A), 간암 마커들의 발현 변화를 확인한 결과 (B 및 E), 염증 관련 유전자들의 발현 변화 (C), 및 CD34, Ki67, Cyclin D1. 및

HIFl-a의 발현 변화 (D). 라미닌의 발현과 STAT3의 인산화 확인 (E), 혈장 내 AST ALT, 알부민, LDL( low-density lipoprotein), 트리글리세라이드 (triglyceride의 수준 (F)를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

도 31은 dieth lnitrosamine(DEN) 약물로 간암을 유발시킨 동물모델에서 간조직을 관찰한 결과 (A), TM4SF5 및 라미닌 단백질의 발현 변화와 STAT3의 인산 화를 확인한 결과 (B). TM4SF5, 인산화된 STAT3, 라미닌 ( laminins) , 라미닌

22 2(laminin γ 2) 및 콜라겐 KcoUagen I)의 발현 변화를 조식염색을 통하여 확 인한 결과 (C)를 나타내는 도면이다.

도 32는 간암 환자로부터 수득한 간암조직 (HCC-tumor) 및 암조적 -주변 (tumor-near)에서 인산화된 STAT3 , 라미닌 ( laminins) 및 콜라겐 KcoUagen I)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

【발명을 실시하기 위한 최선의 형태】

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 1) 간질환 의심 환자로부터 분리된 시료에서

TM4SF5( transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 에 비해 증가된 시료를 선별하는 단계:

2) 상기 단계 1)에서 선별된 시료에서 SREBPKsterol regulatory- element -binding transcript ion factor 1)의 mR A 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3( si gnal transducer and activator of transcription 3) 단백질, c- Src(cel hilar sarcoma) 단백질 , FAK( focal adhesion kinase) 단백질 . FAK( focal adhesion kinase), mTOR, S6K. UU(, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계: 및

3) 상기 단계 2)의 SREBP1의 niRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단

23 백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, UL , 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹 에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 정상 대조군 시료의 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질. c—Src단백질, FAK. mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어. "TM4SF5( transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질''이란. 세포막을 4번 통과하는 막수용체 그룹인 테트라스패닌, 테트라 스판 또는 TM4SF( transmembrane 4 super family)에 포함되는 단백질로서, 세포막 을 4번 통과하는 서로 유사한 구조로 이루어진다. 상기 TM4SF5 단백질은 생화학 적으로 막횡단영역 (transmembrane domain)으로 추정되는 4개의 소수성 부위를 포 함하는 구조를 공유하고 있다.

본 명세서에서 사용된 용어. "SREBPKsterol regulatory element -binding transcription factor 1) 단백질"이란, 유전자의 프로모터에 결합되어 전사를 조 절하는 전사인자로서 스테롤 생합성 (sterol biosynthesis)에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 인자를 의미한다. 상기 SREBP1 단백질은 인슐린에 의해 발현이 조절되고, 글루코스 대사나 지방산 및 지방 생산에 관여하는 유전자의 발현을 조 절한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "STAT3(signal transducer and activator of

24

M . ^t ascr ⁱ rn-

βg g p ^, ¾ ^, / ^t ao ^tt bG ⁽ rnsorm ⁱ nrhacore ^t a ⁾ 80ro ^t en TF ^1f w ^{fi 1) 1} -- ^.

y ^, c ^t , ⁽ e ^t re creo ^{jit t} wa ^t Ssoo ^t uscc ^t) cooc ^t h ^lll rn ⁽ s ^t u c ⁱ SA c ⁱ mh m ^l;ii n M ^ll n ⁱ r ⁱ n 6 ⁾ p ^l I - ώ S ^ti r6 (아르기닌), 고수크로즈 (sucrose) 식이는 비만 및 대사질환과 관련되는 식이이며 혈장의 포도당 저항성 , 인슐린 저항성 , 중성지방, 콜레스테롤, 혹은 AST/ ALT 수 치을 측정하거나, 체중증가가 유발되는 정도를 확인함으로써 지방간, 간염 . 성유 화 및 간암을 포함하는 간질환의 유발 여부를 확인할 수 있다. 특히. 수크로즈는 체내에서 fructose와 glucose로 분해되어 세포에게 이용되므로, 고농도의 수크로 즈 섭취는 고농도의 fi-uctose의 섭취효과가 있을 수 있으며, 이는 탄산음료 (가당 음료), 주스, 아침식사용 시리얼등에 단맛을 위해 많이 포함되고 있어 당뇨병, 비만 등 대사질환의 원인이 되고 있다 (Journal of Korean Oriental Association for Study of Obesity 2005:5(1): 121-131],

본 명세서에서 사용된 용어 , 간질환은 비만, 대사장애. 포도당저항성 , 인 술린저항성 . 체중증가. 지방간, 간섬유화증. 간염. 간경화증, 또는 간암을 포함 하는 것일 수 있다.

본 발명의 정보 제공 방법에서 사용된 TM4SF5, SREBP1. Srebp2, Fasn. CD36, Fabpl, ApoBlOO, Ppar a , Ppar γ , Leptin, Acc a . AccP STATS , 콜라겐 I 형 a 1 체인 (collagen type I alpha 1 chain). 라미닌 ( laniinin) , 및 라미닌

Y2(laminin γ2) 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치 지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입 , 치환 또는 이들의 조합에 의 해 상이한 서열을 갖는 아미노산의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 분자의

27 활성을 전체적으로 변화시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 상기 폴리펩티드는 경우에 따라 인산화, 황화 아크릴화, 당화. 메틸화, 파네실화 등으로 수식 (modification)될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 , 상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 트리글리세라이드

(triglyceride. TG), Vldlr. Ldlr, 및 자유 지방산 (free fatty acid, FFA)은 통 상의 기술분야에 알려진 지방산 및 지방의 성분이다.

본 발명의 정보 제공 방법은 SREBP1 단백질의 발현 및 STAT3 단백질의 인 산화 수준 변화를 포함한 TM4SF5-의존적 인자 또는 세포, 조직 . 또는 개체에서 발생하는 특징을 확인하여 간질환의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 상기 간질환은 지방간. 간섶유화증. 간염 . 간경화. 또는 간암일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 . TM4SF5ᅳ의존적 인자는 TM4SF5 단백질의 발현 에 의존 (TM4SF5 단백질의 증가)하여 조직 또는 세포에서 mRNA 혹은 단백질이 증 가하는 것을 의미하며, 지방간의 경우 SREBP1. SREBP2, Fasn. CD36, Fabpl, Vldlr, Ldlr, ApoBlOO, Ppar a , Ppar γ , Leptin, Acc α , 및 Α( β이 있고. 간염 에는 MCP1, TGF β 1 , 및 F4/80 antigen이 있고. 간성유화에는 collagen I, collagen type I alpha 1 chain, laminins . 1 am i n ί n a 5. 1 am i n i n γ 2 , 및 laniinin γ3가 있고, 간암에는 AFP, FUCA(AFU) , CD34 , HIF1 α , i- ⁽ 37, 또는

28 Cyc l i n Dl가 있다.

또한 , TM4SF5-의존적 인자에는 TM4SF5 단백질의 발현 ( TM4SF5 단백질의 증 가)에 따라 조직 또는 세포에서 인산화가 증가하는 신호 단백질이 포함될 수 있 고, 여기에는 STAT3 , c-Src , FAK, mTOR, S6K, ULKL 4EBP1 , 또는 Akt 단백질 이 속할 수 있다.

또한, TM4SF5-의존적 인자에는 TM4SF5 단백질의 발현 (TM4SF5 단백질의 증 가)에 따라 지방간 및 간염 (또는 지방간염 )이 발병됨에 따라 혈장 내에 증가하는 인자들이 포함될 수 있고, 여기에는 트리글리세라이드 ( triglyceride. TG), 자유 지방산 (free fatty acid, FFA). 콜레스테를 (cholesterol). 알라닌 아미노트랜스퍼라 제 (alanine aminotransferase. ALT). 아스파르산 아미노트랜스퍼라제 (aspartate aminotransferase, AST), LDL(Low-density lipoprotein), 글루코스 (glucose), 또 는 인슐린 (insulin)가 속할 수 있다.

TM4SF5—의존적 세포ᅳ 조직 , 또는 개체에서 발생하는 특징은 TM4SF5 단백 질의 발현 단백질의 증가)에 따른 간섬유화 발병에 따라 간세포의 손상, 세포 배열 패턴 무질서화. 또는 col l agen I 혹은 l anii ni n 합성 축적 증가 등이 포함될 수 있고.

TM4SF5 단백질의 발현 (TM4SF5 단백질의 증가)에 따른 동물 개체에서 체중 의 증가, 체중 /간무게의 증가, 고탄수화물 식이, 고수크로즈 식이 . 고지방 식이 , 저지방 /고탄수화물 식이 , 및 고아르기닌 식이에 따른 체중 증가, 인슬린 저항성

29 의 증가, 글루코즈 저항성의 증가. 지방간 및 지방간염의 증가. 또는 콜라렌 및 라미닌 등의 세포외기질 합성 증가 및 간 조직의 축적 증가 등이 포함될 수 있다 본 발명에 따른 정보 제공 방법에서 상기 SREBP1, SREBP2, Fasn, CD3G, Fabpl, Vlcllr, Ldlr, ApoBlOO, Ppar a , Ppar γ . Leptin, Acc α , 또는 Acc 단백 질의 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고ᅳ STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK 단 백질, inTOR 단백질, S6K 단백질, ULK 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질로 이 루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준이 정상 대조군 에 비해 감소하면 지방간으로 판단할 수 있고,

상기 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가 하고, 모노아실 -(monoacyl ), 다이아실 -(diacy卜) , 또는 트라이아실 -( tr iacy卜) 글라이세롤 (glycerol)의 수준이 정상 대조군에 비해 감소하는 경우 지방간으로 판단 할 수 있다.

상기 간암을 포함한 간질환으로 판단된 환자의 시료에서 TMSF5, AFP. FUCA(AFU). CD34, HIF1 α , Ki-67, 및 Cyclin Dl의 발현이 증가함을 확인할 수 있 고, TM4SF5 단백질은 inTOR, SLC7A1 단백질 또는 아르기닌과 결합하고 inTOR 단 백질, S6K 단백질, UNC-51-like kinase KULKl) 단백질. 또는 4EBP1 단백질의 인산화가 증가함을 확인할 수 있다. 상기 TM4SF5 단백질과 아르기닌과의 결합은 TM4SF5 단백질의 N-말단으로부터 124 내지 129번째 잔기에 의해 매개될 수 있다.

30 한편. 본 발명에 따른 정보 제공 방법에서 상기 SREBP1. SREBP2 , Fasn. CD36, Fabpl, Vldlr, Ldlr. ApoBlOO, Ppar a , Ppar γ . Leptin. Acc α , 및 Accf3 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소하고. STAT3 단백질, c-Src 단백 질, FAK 단백질, 또는 Akt 단백질의 인산화 수준이 증가하고, collagen I.

laminin, laminin γ2. α-SMA의 발현이 증가하면 간섬유화증, 간염, 간경화증. 또는 간암으로 판단할 수 있다.

본 발명에 따른 정보 제공 방법에서 SREBP1 단백질의 발현 수준은 SIRT1, SIRT2, SIRT4, SIRT5, SIRT6 및 SIRT7로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 의해 조절될 수 있다. 구체적으로, SREBP1 및 SREBP2 단백질의 발현 증가는 SIRTl, SIRT5 및 SIRT6 단백질의 발현이 감소하고, SIRT2, SIRT4 및 SIRT7 단백질의 발현이 증가함으로써 조겋될 수 있다.

상기 시료는 간질환에 의해 TM4SF5 및 SREBP1 , SREBP2, Fasn, CD36, Fabpl, Vldlr. Ldlr, ApoBlOO. Ppar a , Ppar γ . Leptin. Acc α , 또는 AccP 단백 질의 발현과 STAT3, c-Src, 또는 FAK 단백질에 대한 인산화 수준이 변화할 수 있 는 시료라면 어떠한 시료도 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 소변, 혈 액, 혈청, 혈장 또는 뇌척수액일 수 있다.

상기 단백질의 발현 수준 또는 단백질의 인산화 수준은 통상의 기술분야 에 알려진 어떠한 방법으로도 측정될 수 있다. 구체적으로. 단백질의 발현 수준 은 웨스턴 블롯. 효소-면역화학 검출법 (ELISA). 단백질체 분석. 면역조직화학 염

31 ⁱ ggpyp s.cc/ _, A a _t ee _t e a FS0n _i n a coan _l a ³ 4 _lll h ₁

chain), AFP(Alpha-fetoprotein) , FUCA(AFU, alpha-L-fucosidase 1), CD34 , HIFl a (Hypoxia-inducible factor), Ki-67, 및 Cyclin Dl로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 ni NA 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 SIRT1, SIRT5, SIRT6, laminin α5. laminin γ2 또는 laminin γ3의 mRNAs 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소하고, SREBP2, SREBPlc , CD36, FABPl , FASN, LDLR, VLDLR, PPAR γ , TIMPl, TGF l, TNFa , vinientin, MCPl, SOCSl , S0CS3, ApoBlOO, PPAR a , Leptin, Acc a , 또는 Acc 의 niRNA 혹은 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고, 모노아 실- (nionoacyl-), 다이아실 -(di acy卜), 및 트라이아실 -(tr iacy卜) 글라이세를 (glycerol)의 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK 단백질, niTOR 단백질, S6K 단백질, ULK 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질 로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준이 정상 대 조군에 비해 감소하거나 변하지 않으면 지방간으로 판단할 수 있다. 한편, 상기 SREBP2, SREBPlc, CD36, FABPl, FASN, LDLR, VLDLR 또는 PPAR γ의 niRNA 또는 단 백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소하거나 변하지 않고, SIRT1, SIRT5, SIRT6, TGF β 1 , TNFa , vinientin, laminin, laminin γ 2 , collagen I, SOCSl , S0CS3, F4/80 antigen, 콜라겐 I, 콜라겐 I형 a 1 체인 (collagen type I alpha 1 chain), AFP(Alpha-fetoprotein) , FUCA(AFU, alpha-L-fucosidase 1), CD34, HIFl a (Hypoxia-inducible factor), Ki-67, 또는 Cyclin Dl의 niRNA 또는 단백질

33 의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고, MCP1, TGF β 1 , F4/80 antigen와 같은 사이토카인 /케모카인 인자들이 증가하거나 STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK 단백질, niTOR 단백질, S6K 단백질, ULK 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준이 정상 대조 군에 비해 증가하면 간섬유화증, 간염 , 간경화증. 또는 간암으로 판단할 수 있고 상기 SREBP2, SREBPlc , CD36, FABP1 , FASN, LDLR, VLDLR 또는 PPARy의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소하고, SIRT1, SIRT5, SIRT6, TGF β 1 , TNF α , viment in, laminin, laminin γ 2, collagen I, S0CS1, S0CS3 , F4/80 antigen, 콜라겐 I, 콜라겐 I형 cil 체인 (collagen type I alpha 1 chain), AFP(Alpha-fetoprotein) , FUCA (AFU, a lpha-L- fucosidase 1). CD34, HIFl a (Hypoxia- inducible factor), Ki-67, 또는 Cyclin Dl의 mRNA 또는 단백질 의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고. AFP, FUCA (AFU), CD34, HIFl α , Ki-67, Cyclin Dl, laminin. collagen I, 또는 laminin γ 2의 mRNA 또는 단백질 의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK 단백질, mTOR 단백질, S6K 단백질, ULK 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준이 증가하면 간암으로 판단할 수 있다.

상기 단백질의 발현 증가에 따라 지방간 및 간염이 발병함에 따라 서 혈장 내에서 트리글리세라이드 (triglyceride. TG), 자유 지방산 (free fatty

34 acid, FFA), 콜레스테롤 (cholesterol ) , 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (alanine aminotransferase, ALT) , 아스파르산 아미노트랜스퍼라제 ( aspartate

aminotransferase, AST) , ty lipoprotein), 글루코스 (glucose) , 및 인슐린 (insulin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 양이 증가될 수 있고. 상기 TM4SF5 단백질의 발현 증가에 따라 간성유화가 발병함에 따라서 조직에서 간세포의 손상, 세포 배열 패턴 무질서화, 또는 콜라겐 I 또는 라미닌 합성 축적 증가가 나타날 수 있고, 상기 TM4SF5 단백질의 발현 증가에 따라 환자 에서 체중의 증가, 체중 /간무게의 증가, 고탄수화물 식이. 고지방 식이 , 저지방 / 고탄수화물 식이， 고아르기닌, 및 고수크로즈 (sucrose) 식이에 따른 체중 증가, 인슐린 저항성 증가， 글루코즈 저항성 증가, 지방간 및 지방간염의 증가, 또는 콜라겐 및 라미닌 등의 세포외기질 합성 증가가 나타날 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 14SF5 단백질을 발현하 는 컨스트럭트가 형질전환된 마우스 (52주령 )를 제조하고 (도 1 참조), 상기 제조 된 마우스의 간조직에서 지방 형성이 촉진된 것을 확인하였다 (도 2 참조).

또한, 상기 제조된 형질전환 마우스의 간조직 또는 상기 간조직으로부터 간세포를 수득하여 지방간과 관련된 유전자 및 단백질의 발현 변화를 확인한 결 과, SREBPl, SREBP2 , SREBPlc , CD36, Fabpl, Fasn, Acc a . Acc , Ldlr, SOCSl 및 S0CS3 mRNA 또는 단백질의 발현이 증가하고, STAT3 단백질에 대한 인산화가 감소하고. 간조직에서 triglyceride(TG), AST, 및 ALT의 수준이 증가한 것을 확

35 인하였다 (도 2 및 3 참조). 또한 . 52주령의 TM4SF5 과발현 형질전환된 마우스로 부터 분리한 primary 간상피세포에 추가적으로 TM4SF5 유전자를 발현시키거나 자 유 지방산 (FFA)을 처리, 또는 IL6를 처리할 경우, 세포에 지방이 축적되고 동물 의 간조직에서 SREBP1, SREBP2 , SREBPlc, CD36, Fabpl, Fasn, Acc α , Acc β , Ldlr, S0CS1 및 S0CS3 niRNA의 발현이 증가하였다.

한편 TM4SF5 과발현되지 않은 정상동물에 비해서 Tm4sf5의 유전자가 heterozygote로 제거된 동물의 간조직에서는 ApoBlOO, LcllR, Srebp2. Ppary, leptin의 증가가 미약함을 확인하였다 (도 4 참조).

세포 모델에서도 TM4SF5를 과발현시키거나 TM4SF5 비발현 세포주에 자유 지방산 (free fatty acid)을 처리할 경우， SREBP1. Ppary 단백질의 발현이 증가가 STAT3 단백질의 인산화와 반대관계에 있음을 확인하였다 (도 5 참조).

지방세포 (3T3— L1)에 있어서도 TM4SF5의 발현에 의존적으로 지방이 축적 되고. Ppary , CD36, Fasn, Srebpl, 또는 Fabpl의 niRNA 및 단백질의 수준이 유지 됨을 확인하였다 (도 6 참조).

상기 SREBP1, SREBP2, 또는 SREBPlc niRNA 또는 단백질의 발현 증가는 SIRT1, SIRT5 및 SIRT6 유전자의 발현이 감소되고. SIRT2, SIRT4 및 SIRT7 유전 자의 발현이 증가함으로써 나타나며 , STAT3 단백질에 대한 인산화 증가는 S0CS1 및 S0CS3 유전자 및 단백질의 발현에 의해 조절됨을 확인하였다 (도 7 참조). 또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서 , 52주령의 C57BLV6 정상동물로부터

36 분리한 primary 간상피세포에서 TM4SF5를 발현 또는 자유 지방산 (FFA)을 처리하 는 경우 S0CS1와 S0CS3의 발현이 TM4SF5 발현과 양의 상관성 (또는 연관성)을 가 짐을 확인하였고, SREBP1의 발현과 S0CS3의 발현과의 양의 상관성 (posi t iv'e feedback)을 가짐을 확인하였고, TM4SF5의 발현과 연계된 단백질들 (Srebpl.

Socsl, 및 Socs3)의 발현들은 STAT3 단백질의 인산화와는 음의 상관성 (negative feedback)을 가짐을 확인하였다 (도 8 참조).

나아가, 정상동물에 대비하여 , TM4SF5 유전자가 제거된 녹아옷 마우스 (TM4SF5 유전자 K0 마우스)의 경우 생후 3개월 혹은 6개월의 시점에서 암수 모두 간무게 /체중의 비율이 낮음을 확인하였다 (도 9 참조). 정상동물에 대비하여 . TM4SF5유전자가 제거된 녹아웃 마우스에게 고지방 식이를 10주간 자유 급식하였 을 경우, 정상동물은 정상 식이에 대비하여 체중의 증가가 뚜렷하였으나, 녹아웃 마우스의 경우에는 그 체증 증가가 미약하고 간조직 내 콜레스테를과 FFA의 수준 이 미약함 (낮음)을 확인하였다 (도 10 참조). 또한, 정상동물과는 달리 , Srebpl, srebp2, Ldlr, 및 ΑροΒΙΟΟ의 niRNA의 발현 수준이 고지방 식이에 따라 녹아웃 마 우스에서는 증가하지 않았고, 혈장 내에 트리글리세라이드 (triglyceride, TG), 자유 지방산 (free fatty acid, FFA)의 증가가 미약함을 확인하였다 (도 11 참조).

52주령의 C57BL/6 TM4SF5 녹아웃 마우스 (Tni4sf5— ^/+ )의 간조직은 Socsl 및 Socs3의 niRNA 및 단백질의 수준이 정상마우스의 경우에 대비하여 감소하였고, 고 지방식이를 섭취하게 하였을 경우, 정상동물은 지방간염의 증상이 보였으나, 녹

37 아웃동물의 경우에는 그 정도가 미약하였고, 이때 Srebplc의 niRNA와 Srebpl의 단 백질이 감소하였다 (도 12 참조).

나아가, TM4SF5 단백질은. niTOR. SCL7A1 및 아르기닌과 결합을 형성함으 로써 , 아르기닌 수송에 관여하고. S61 (의 활성을 유발하는 것을 알 수 있었다 (도 14 및 15 참조).

TM4SF5 유전자 1(0 마우스는, 정상마우스와 달리, 고탄수화물 또는 아르 기닌 식이를 섭취하여도 체중 증가, 지방 축적 , 포도당 저항성. 인슐린 저항성, 또는 간조직의 손상이 억제되었다 (도 16 및 17 참조)

TM4SF5 유전자 K0 마우스는. 정상마우스와 달리, 미토콘드리아에 약물적 스트레스를 주어 세포외부산화도 측정 (ECAR, extracellular acidification rate) 을 함으로써 , 에너지생산을 위한 glycolysis의 기능이 감소함을 확인하였고 RNA- Seq 분석을 통하여 TO4SF5의 발현에 의존적으로 변하는 유전자들의 그룹을 확인 하였다 (도 18 참조). 나아가 14SF5 유전자 K0 마우스는 고수크로즈 식이에 의해 서 정상동물과는 달리 지방간 증상이 미약하였고, 혈장 내 AST, ALT, 및 총 콜레 스테를의 수준의 증가가 미약함을 확인하였으며. 지질성분을 분석하였을 경우, 모노아실- (monoacyl-), 다이아실 -(diacy卜). 및 트라이아실 -(triacyl-) 글라이 세를 (glycerol)의 함량이 정상마우스에 대비하여 Tm4sf5 유전자 0 마우스의 경 우에 낮음이 확인되었다 (도 19 참조).

또한， 본 발명자들은 TM4SF5 단백질을 발현하는 컨스트럭트가 형질전환된

38 마우스 (78주령)의 간조직에서 SREBP1 , SREBP2, SREBPlc , S0CS1 및 S0CS3 n舰 또 는 단백질의 발현이 TM4SF5 발현하지 않는 정상대조군에 대비하여 감소하거나 증 가하지 않고, STAT3 단백질에 대한 인산화가 증가하고, 지방간과 관련된 다양한 인자들의 수준이 정상동물에 존재하는 수준과 유사해 ^' 지고 (증가하지 않고). 간성 유화 및 염증 관련한 유전자들의 niRNA 수준이 증가하고, 상기 간조직이 간성유화, 간경화 또는 간염 등의 표현형을 나타냄을 확인하였다 (도 20 및 21 참조).

나아가, 본 발명자들은 종래에 간질환이 유발된 동물모델 제조 방법에 따 라, CC14를 4주 혹은 16주 동안 투여하여 간성유화 /간경화의 간질환 동물모델을 제조하고, 상기 동물모델에서 간조직의 손상 및 콜라렌의 발현 축적을 확인하고 (도 22 참조), TM4SF5 단백질의 발현 및 STAT3 단백질에 대한 인산화가 증가와 더블어 콜라겐 및 라미닌을 이루는 폴리펩타이드 (chain)들의 niRNA 및 단백질들의 발현이 증가함을 확인하였다 (내지 23 참조). 또한, 상기 동물들의 간조직 염색을 통하여. 간섬유화 /간경화의 간질환 동물모델 및 pi-iniary 간상피세포로부터

TM4SF5 발현과 더불어 α-SMA' collagen I , laminin, 또는 laminin γ 2의 발현이 증가하고 STAT3, c-Src, FAK, 또는 Akt 단백질의 인산화가 상관성 있게 증가함을 확인하였다 (도 24, 도 25, 및 도 26 참조).

또한. 본 발명자들은 상기 STAT3 단백질에 대한 인산화는 콜라겐 I형 αΐ 체인 (collagen type I alpha 1 chain) 및 라미닌 γ 2( laminin γ2)의 프로모터에 결합함으로써 간성상세포에서는 콜라겐 및 간상피세포에서는 라미닌의 발현을 조

^' 39 절함을 확인하였다 (도 27 및 도 28 참조).

또한, 본 발명자들은 정상동물에 laminin γ 2 혹은 collagen I ci 1의 chain의 발현을 억제하고 CC1 ₄ 를 처리하였을 경우, 간조직의 손상이 억제되고 TGF I, α-SMA, 라미닌. 또는 콜라겐의 발현과 STAT3 단백질의 인산화가 억제됨 을 확인하여 laniinin γ2 혹은 콜라겐 I형 al 체인의 발현이 간성유화에 중요함 을 확인하였다 (도 29 참조).

FVB/N 동물에 Tm4sf5 유전자를 과다발현하게 할 경우, 간조직에 종양을 시사하는 nodule이 확인되고, CD34, a-SMA, AFP, FUCA. laminin, laminin γ2, 콜라젠, MCP— 1, F4/80 antigen, Hifla. Ki67, 또는 Cyclin Dl의 mRNA 혹은 단백 질 발현이 증가하며, 혈장 내의 AST, ALT, LDL, 또는 tr iglyceride(TG)의 수준이 증가하였다 (도 30 참조). 또한, 정상동물에 DEN을 처리한 간암모델에서 간조직에 nodule의 생성과 간조직의 손상을 확인하고 TM4SF5, 라미닌, 콜라젠. 또는 laniinin γ2 의 발현이 증가하고 STAT3 단백질의의 인산화가 증가하는 것을 확인 하였다 (도 31 참조).

따라서. 상기로부터 간질환이 의심되는 환자의 간조직 시료의 암부위 또 는 암주변 부위에서 TM4SF5 단백질이 증가되었을 때. SREBP1, SREBP2, SREBPlc, 라미닌, 또는 콜라렌의 mRNA 또는 단백질의 발현 및 STAT3, c-Src , FAK, 또는 Akt 단백질의 인산화 수준을 측정함 (도 32 참조)으로써, 간질환을 진단하기 위한 정보 제공에 사용될 수 있음을 알 수 있다.

40 또한, 본 발명은 1) TM4SF5 및 SREBPl 단백질을 발현하는 세포에 피검물 질을 처리하는 단계 :

2) 상기 단계 1)의 세포에서 SREBPl 단백질의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Snr단백질, FAK, niTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질 로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 측정하 는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBPl mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 억제하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, niTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 증가시키거나, 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBPl mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 억제하고, 모노아실 -(iiionoacyl-) , 다이아실 -((liacy卜), 또는 트라이아실 (triacy卜) 글라이세롤 (glycerol)의 합성 을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 지방간 치료 후보물질의 스 크리닝 방법을 제공한다.

상기 TM4SF5, SREBPl, SREBP2, Fasn, CD36, Fabpl, ApoBlOO, Ppar α , Ppar , Lept in, Acc a , Acc β STAT3 , collagen type I , laminin, 및 laminin γ2 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 갖는다. 일례로, 상기 TM4SF5. SREBPl 및 STAT3 단백질은 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 서열일 수 있고, 상기 서열 의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로. 상기 TM4SF5, SREBPl 및

41 STATS 단백질은 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되 는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, Triglyceride, Vldlr, Ldlr, free fatty acid는 통상의 기술분야에 알려진 지방산 및 지방의 성분이다.

본 발명에 따른 지방간 치료 후보물질의 스크리닝 방법은 TM4SF5.

SREBP1, Srebp2. Fasn. CD36. Fabpl . ApoBIOO. Ppara, Ppary, Leptin, Acca, 또는 Accp 단백질을 발현하는 세포에서 그 단백질들의 발현 및 STAT3, c-Src. FA (focal adhesion kinase), mTOR, S6K, ULK1, 4EBP1, 또는 Akt 단백질의 인 산화 수준 변화를 이용하여 지방간을 치료할 수 있는 후보물질을 스크리닝할 수 있다.

본 발명에 따른 간암의 치료 후보물질의 스크리닝 방법은 TM4SF5의 단백 질 발현과 더블어 CD34 , AFU, FUCA, laniinin γ2, HIFl α , 및 cyclin Dl 들로 구 성되는 그룹에서 선택된 어느 하나 이상과 함께 발현 증가를 확인하거나, TM4SF5 단백질과 _m T0R, SLC7A1 단백질 또는 아르기닌과의 결합 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 스크리닝 방법으로 선별된 간암을 포함 하는 간질환 치료 후보물질은 상기 TM4SF5 단백질과 mTOR, SLC7A1 단백질 또는 아르기닌과의 결합을 억제할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서. 본 발명자들은 TM4SF5 단백질을 발현하 는 형질전환 마우스를 제조하고, 상기 제조된 마우스의 간조직에서 지방 형성이

42 촉진되어 지방간의 표현형을 나타냄을 확인하였다 (도 1 및 2 참조). 또한, 상기 제조된 형질전환 마우스의 간조직 또는 상기 간조직으로부터 수득된 간세포에서 SREBP1, SREBP2, SREBPlc, CD36, Fabpl, Fasn, Acc α , Acc β , Ldlr, S0CS1 또는 S0CS3 ni NA 또는 단백질의 발현이 증가하고, STAT3 단백질에 대한 인산화가 감소하고. 간조직에서 triglyceride (TG), AST, 및 ALT의 수준이 증가한 것을 확인하였다 (도 2 및 3 참조), 이는 TM4SF5 단백질을 과발현하는 세 포 모델에서도 동일하였다 (도 5 참조ᅳ).

따라서 , TM4SF5 단백질을 발현하는 세포에서 SREBP1, SREBP2 , SREBPlc , CD36 , Fabpl, Fasn, Acc α , Acc , Ldlr, S0CS1 또는 S0CS3 단백질의 발현량 및 STAT3, c-Src. 또는 FAK 단백질의 인산화를 측정하여 지방간의 치료를 위한 후보 물질을 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 TM4SF5 단백질을 과발현 하는 형질전환 마우스를 제조하고, 상기 형질전환 마우스에서 지방 형성이 촉진 됨을 확인하고 (도 1 및 2 참조), TM4SF5 유전자가 녹아웃된 마우스에서는 정상 식이에 의해서도 체중이 정상마우스에 대비하여 증가정도가 미약하고 (도 9 참조), 고탄수화물 식이, 고지방 식이 . 고아르기닌, 고수크로즈 식이에 의해서도 정상동 물은 체중증가가 큰 반면, 녹아웃마우스에서는 체중 증가가 미약함을 확인하였다 (도 10, 도 11, 도 17. 도 19 참조).

또한, 본 발명은 TM4SF5 단백질을 발현하고， STAT3 단백질이 인산화된 세

43 포에 피검물질을 처리하는 단계: 상기 세포에서 SREBP1 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Src단백질. FAK , mTOR , S6K , ULK , 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루 어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계: 상기 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBP1 단백질의 발현 수준을 증 가시키고, STAT3 단백질의 인산화 수준을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 간성유화증ᅳ 간염 또는 간경화증 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제 공한다.

상기 TM4SF5 , SREBP1 및 STAT3 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 갖는다. 일례로, 상기 TM4SF5 , SREBP1 및 STAT3 단백질은 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 서열일 수 있고, 상기 서열의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 구체 적으로, 상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명에 따른 지방간 치료 후보물질의 스크리닝 방법은 TM4SF5 및

SREBP1 단백질을 발현하는 세포에서 SREBP1 단백질의 발현 및 STAT3 단백질, c- Src단백질, FAK , mTOR . S6K , ULK , 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선 택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준 변화를 이용하여 간섬유화증, 간염, 간경화증, 또는 간암을 치료할 수 있는 후보물질을 스크리닝할 수 있다. 또한, 본 발명은 1 ) TM4SF5 단백질을 발현하는 세포 또는 동물모델에 피

44 검물질을 처리하는 단계 ;

2) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 TM4SF5 단백질과 niTOR 단백질, SLC7A1 단백질 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과의 결합을 측정하는 단계;

3) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 niTOR 단백질, S6K 단백질, UNC-51-like kinase 1(LLK1) 단백질 , 또는 4EBP1 단백질의 인산화를 측정하는 단계 :

4) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 모노아실 -(monoacyl-), 다이 아실 (diacyl-), 또는 트라이아실 -(triacy卜) 글라이세롤 (glycerol)의 수준을 측정하는 단계:

5) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 체중 증가， 포도당 저항성. 인슬린 저항성 및 해당과정의 반응성으로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상을 측정하는 단계: 및

6) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 해당과정 관련된 유전자들의 발현 정도를 측정하는 단계: 및

7) 상기 단계 2)에서 TM4SF5 단백질과 niTOR 단백질, SLC7A1 단백질 및 아 르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과의 결합을 억제하고, 단계 3) niTOR 단백질. S6K 단백질, UNC-51-like kinase 1(ULK1) 단백질. 또는 4EBP1 단백질의 인산화를 억제하며 . 단계 4)에서 모노아실- (monoacyl-), 다이아실- (diacyl-), 및 트라이아실 -Uriacy卜) 글라이세롤 (glycerol)의 수준을 감소시키

45 고, 단계 5)에서 체중 증가. 포도당 저항성ᅳ 인슐린 저항성 또는 해당과정의 반 웅성을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항비만. 지방간. 또는 간암 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어 , mTOR는 mammalian target of rapamycin로 세포 의 대사 기능의 조절을 위한 허브 신호전달이라고 할 수 있다 (GenBank accession number： NM— 004958.3 )이고, "SLC7A1 (solute carrier family 7 member 1) 단백질 "은 세포막 및 라이소좀막에 존재하는 아르기닌수송체이다 (GenBank access i on number： M_003045.4) .

상기 TM4SF5 및 SLC7A1 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 갖는다. 일례 로, 상기 TM4SF5 및 S1X7A1 단백질은 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 서열 일 수 있고. 상기 서열의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로. 상기 TM4SF5 및 S1X7A1 단백질은 각각 서열번호 1 및 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명에 따른 항비만 후보물질의 스크리닝 방법은 TM4SF5 단백질이 mTOR, SLC7A1 단백질 또는 아르기닌과 결합하는 것을 억제하는 피검물질을 선별 함으로써 , 항비만 및 간암세포 생존 억제 후보물질을 스크리닝할 수 있다. 상기 TM4SF5 단백질과 아르기닌과의 결합은 TM4SF5 단백질의 N-말단으로부터 124 내지 129번째 잔기에 의해 매개될 수 있다.

46 본 발명의 구체적인 실시예에서 . 본 발명자들은 TM4SF5 단백질을 과발현 하는 형질전환 마우스를 제조하고ᅳ 상기 형질전환 마우스에서 지방 형성이 촉진 됨을 확인하였다 (도 1 및 2 참조). 또한 이는 TM4SF5 단백질을 과발현하는 세포 에서도 동일하고, 상기 세포에서 TM4SF5 단백질이 mTOR, SLC7A1 및 아르기닌과 각각 결합하는 것을 확인하였다 (도 14 및 15 참조).

따라서, TM4SF5 단백질을 발현하는 세포에서 TM4SF5 단백질과 mTOR. SLC7A1 또는 아르기닌의 결합 억제 여부를 측정하여 항비만 및 항암용 후보물질 을 스크리닝할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명은 TM4SF5 유전자가 녹아웃 (knock-out, K())된 마우스를 APC ^mim/+ 의 유전형을 갖는 마우스와 교배하는 단계를 포함하는 문맥압항진증 동물 모델 제조 방법을 제공한다 (도 13 참조).

본 명세서에서 사용된 "APC(adenomatoLis polyposis coli) 유전자 "는 가족 성 대장선종증의 원인 유전자로서. 상기 APC 유전자로부터 합성된 산물은 β-카 테닌과 복합체를 형성하여 그 분해를 촉진시킨다.

상기 TM4SF5(GenBank Accession NO. 刚 _003963) 및 APC GenBank

Accession NO. M74088) 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 TM4SF5 단백질을 암호화하는 어떠한 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의

47 TM4SF5 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 일 수 있다. 상기 TM4SF5 유전자는 상기 서열번호 3으로 기재되는 염기서열과 70% , 80% , 90% , 95% 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 , 본 발명자들은 TM4SF5 유전자가 녹아웃 ( K0)된 마우스를 제조한 뒤 , 상기 마우스를 APC ^{m im/+} 의 유전자형을 갖는 마우스와 교배하여 자손을 수득하였다 (도 13A 참조) . 상기 수득된 자손에서 문맥압항진증 의 증상을 나타내는 것을 확인하였다 (도 13B 참조) .

따라서 , TM4SF5 유전자 K0 마우스 및 APC ^{m im/+} 의 유전자형을 갖는 마우스를 교배함으로써 문맥압항진증의 동물 모델을 제조할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 문맥압항진증 동물 모델을 제공 한다.

상기 동물 모델은 상술한 바와 같은 제조 방법으로 제조될 수 있다. 일례 로, 상기 제조 방법은 TM4SF5 유전자 K0 마우스를 APC ^{m im/+} 의 유전자형을 갖는 마 우스와 교배하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, TM4SF5 및 APC 유전자는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있으며, 이의 변이체 및 단편을 포함할 수 있다. 상기 TM4SF5 및 APC 유전자는 각각 서열번호 3 및 4로 기재된 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

48 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 TM4SF5 유전자 K0 마우스 및 APC ^mim/+ 의 유전자형을 갖는 마우스를 교배하여 문맥압항진증의 동물 모델을 제조하였다 (도 13A 및 13B 참조). 이하. 본 발명을 다음 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 는 본 발명을 예시하는 것일 뿐. 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다. 실시예 1. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 제조

1-1. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 제조

TM4SF5 단백질을 과발현하는 마우스의 간 질환 표현형을 확인하기 위해 다음과 같은 방법으로 형질전환 마우스를 제조하였다.

먼저 , CMV 프로모터의 조절 하에 Flag가 표지된 TM4SF5 단백질 (GenBank Accession NO. CAG33206) 및 BGH( bovine growth hormone) 폴리 -A 영역 (마크로전 1, 대한민국)이 발현되도록 컨스트릭트를 제작하였다 ( J Cell Sci . 2012, 125(Pt 24 ):5960-73). 제작된 컨스트럭트를 C57BL/6 마우스의 수정란에 미세주입법을 사 용하여 주입하였다. 주입 2주 후, 상기 마우스로부터 간조직을 채취하고 하기 표 1에 기재된 프라이머를 사용하여 통상적인 방법으로 PCR을 수행한 뒤 (도 1A). 그

49 결과를 도 1B 1 나타내었다.

【표 1】 도 1B에 나타난 바와 같이 , 약 0.6 kb의 CMV 프로모터 및 TM4SF4 유전자 단편이 탐지됨으로써, 마우스에 TM4SF5 유전자가 삽입된 것을 확인하였다 (도 1B ) .

1-2. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 지방간 표현형 확인 실시예 1-1에서 제조된 마우스를 52주 동안 사육한 뒤 , 이를 희생시켜 간 조직을 수득하였다. 수득된 간 조직의 외형을 관찰하여 . 그 결과를 도 2A에 나타 내었다. 이때. 대조군으로서는 정상 마우스를 사용하였다.

도 2A에 나타난 바와 같이, TMSF5 단백질이 과발현되는 상태로 52주 동 안 사육된 마우스는 지방간의 특징을 나타내었다 (도 2A ) .

1-3. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 지방간 표현형 확인 실시예 1-1에서 수득된 TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 간 조직을 이용하여 H&E 염낵을 수행하였다.

50 먼저 , 해부한 간조직을 파라핀에 고정 후 슬라이드를 만들고, H&E 염색을 위해, 수득된 간 조직을 6( C의 오븐에 20분 정도 방치하여 파라핀을 제거하였다. 파라핀을 제거한 간 조직을 자일렌 용액에 5분씩 담그고. 이를 3회 반복하였다. 다음으로, 상기 간 조직을 100%, 90%, 80% 및 70% 에탄올, 및 증류수에 순차적으 로 3분씩 넣었다 꺼낸 뒤 이를 헤마토자일린 (hematoxylin) 용액에 넣어 5분 동 안 반웅시켰다. 반응이 끝난 간 조직을 수듯물을 이용하여 세척하고, 에오신 (eosin) 용액에 넣어 20분 동안 반웅시켰다. 이를 다시 수듯물을 이용하여 세척 하고, 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올, 및 자일렌 용액에 순차적으로 3분씩 넣었 다 꺼낸 뒤, 슬라이드에 놓고 마운팅하였다. 현미경을 이용하여 슬라이드 글라스 를 관찰한 결과 사진을 도 2B에 나타내었다.

도 2B에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스 의 간 조직에 지방이 축적된 것을 확인하였다 (도 2B).

1-4. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 지방간 표현형 확인 실시예 1-1에서 수득된 TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 간 조직을 이용하여 다음과 같은 방법으로 오일 레드 0 염색을 수행하였다.

먼저， 실시예 1-1에서 제조된 형질전환 마우스에서 혈액 대신 관류액을 넣어 혈액을 제거하고, 제 2형 콜라겐을 사용하여 간세포를 분리하였다. 분리된

51 간세포를 40 의 포어 크기를 갖는 세포 여과기를 이용하여 여과하고 원심분리 를 수행하여 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 ½ 페니실린 /스트렙토마이신과

10% FBS를 포함하는 월리엄 's E 배양배지 (Willian's E medium)를 이용하여 배양 하였다. 이때 배양은 콜라겐으로 코팅된 플레이트를 사용하여 수행하였다.

배양된 간세포를 1 포르말린에 넣어 15분 동안 고정시키고, 이를 PBS로 세척하였다. 한편, 오일 레드 0 염색약 (Sigma, 독일)을 멸균 증류수와 흔합하여 흔합액을 제조하고, 제조된 흔합액을 여과하여 준비하였다. 여과된 오일 레드 0 용액을 세척된 세포에 첨가하여 30분 동안 염색한 뒤. 증류수로 세척하였다. 염 색된 세포를 현미경을 이용하여 관찰한 사진을 도 2B에 나타내었다.

도 2B에 나타난 바와 같이 . TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스 로부터 수득한 간세포에 지방이 축적된 것을 확인하였다 (도 2B 및 도 2C).

1-5. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 지방간 표현형 확인 그

실시예 1-1에서 수득된 TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 혈액으로부터 트리글리세라이드 (triglyceride, TG), 알부민 및 ALT의 수치를 다 음과 같은 방법으로 측정하였다.

먼저, 상기 형질전환 마우스를 희생시키기 전에 혈액을 수득하였다. 수득 된 혈액을 1 M의 EDTA가 코팅된 1.5 nil' 튜브에 넣고, 여기에 8 // ('의 1 M EDTA를

52 첨가하였다. 이를 1,500 xg 및 4 ^° C에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였 다. 분리된 혈청으로부터 혈액 분석기 (Dricheni 4000, Fuji, 일본)를 사용하여 트 리글리세라이드. 알부민 및 ALT의 수치를 확인하였다.

그 결과, 도 2D에 나타난 바와 같이 , 14SF5 단백질을 과발현하는 형질전 환 마우스의 간 조직에서 정상마우스에 비해 트리글리세라이드 및 ALT 수치는 증 가하였으나, 알부민 수치는 변화가 없었다 (도 2D). 이로부터, TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 간 조직이 손상되었음을 알 수 있었다. 실시예 2. H4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서의 신호 전달 기전 변화 확인

2-1. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서의 지방간과 관련 된 유전자의 발현 변화 확인

실시예 1—1에서 제조된 형질전환 마우스의 간 조직에서 지방간과 관련된 유전자의 발현 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

먼저, 수득된 간 조직에 QiazoHQiagen, 미국)을 첨가하여 세포를 파쇄하 고. 여기에 클로로포름을 넣어 12,000 xg 및 4 ^° C ^' 의 조건하에서 15분 동안 원심분 리하였다. 원심분리 후 수득된 상청액에 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침강시 킨 후, 침강된 NA를 70% 에탄올을 이용하여 세척하였다. 이를 7,500 xg 및 4 ^° C

53 의 조건하에서 5분 동안 원심분리하여 RNA 펠렛을 수득하고, 10분 동안 상온에서 건조시켰다. 건조된 펠렛에 30 , 의 DEPC-증류수를 첨가하여 RNA를 수득하였다. 수득된 RNA는 역전사 키트 (Toyobo, 일본)를 사용하여 제조사의 프로토콜 에 따라 gDNA를 제거하고 cDNA를 수득하였다. 수득된 cDNA에 2x 에바그린 마스터 믹스 (Labopass, 대한민국)， 하기 표 2에 기재된 0.4 _μ Μ의 정방향 및 역방향 프 라이머를 각각 첨가하여 실시간 PCR을 수행하였다. PCR 결과로부터 유전자 각각 의 발현량은 Pfaffl의 변형된 델타 -델타 Ct 방법을 이용하여 수득하였다.

【표 2]

그 결과， 도 3A에 나타난 바와 같이， TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전 환 마우스의 간 조직에서 지방간과 관련된 유전자인 Srebp 1, Srebp 2， Cd36, Fabpl, Fasn, Acc α , Acc 3， 및 Ldlr의 발현이 증가하였다 (도 3A). ^'

54 2-2. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서의 지방간과 관련 된 단백질의 발현 변화 확인

실시예 1-1에서 제조된 형질전환 마우스의 간 조직에서 지방간과 관련된 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯 방법으로 확인하였다.

구체적으로 수득된 간 조직에 용해 완층액 [50 niM Tris-HCKpH 7.4), 1% NP40. 0.25% 소듬 디옥시콜레이트, 150 niM NaCl. 1 niM EDTA] , SDS (sodium dodecyl sulfate), Na304V 및 프로테아제 억제제 칵테일 (GenDepot )을 첨가하여 4 ^° C 에서 15분 동안 방치하여 조직을 용해시켰다. 상기 용해물을 13.000 rpm 및 4 ^° C 의 조건하에서 30분 동안 원심분리하여 상청액을 수득하였다. 상청액 내 존재하 는 단백질은 BCA 시약 (Thermo Scient i f ics)을 이용하여 정량하고. 여기에 4x ¾ 플 완층액 [4 ιι '의 100% 글리세를, 2.4 iiie의 Tris-HCKpH 6.8)， 0.8 g의 SDS, 4 nig의 브름화페놀 블루. 0.4 ιιιί'의 β-머갑토에탄을 및 3.1 iii,의 Η20를 첨가하고, 최종 부피가 10 가 되도록 맞춤]을 첨가하고. 100t에서 5분 동안 끓였다. 이 를 이용하여 SDS-PAGE를 수행하고， 단백질을 니트로셀를로오스 막 (Whatman)에 이 동시켰다. 상기 막을 5% 탈지 우유를 포함하는 용액에 넣어 1시간 동안 전처리하 고, 1차 항체로서 라미닌 (lamininKAbcaiii, 영국), ACCKCell Signalling. 미국), SREBP1 전구체 (precursor. Santa cruz, 미국), 성숙한 SREBP1 (Santa cruz, 미 국), TP( Santa cruz, 미국), PPARa (Santa cruz. 미국), pY ⁷⁰⁶ STAT3(Mi 11 ipore.

55 미국), STAT3( Santa cruz, 미국), α -튜블린 (Sigma, 미국) 및 TM4SF5 (J Clin Invest. 2008 Apr :118(4) :1354-66) 단백질에 대한 항체를 첨가한 뒤 , 이를 4 ^° C에 서 15시간 동안 반웅시켰다. 이후, 2차 항체를 반응시키고, ECL 용액 (Pierce, 미 국)을 사용하여 액스레이 필름에 현상한 결과를 도 3B에 나타내었다.

도 3B에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스 의 간 조직에서 지방간과 관련된 단백질인 SREBP1 및 ACCl(ACCa) 단백질의 발현 이 유의적으로 증가하였으나, STAT3 단백질에 대한 인산화는 억제되었다 (도 3B).

2-3. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서 STAT3 단백질에 대한 인산화 억제 확인

실시예 2-2에서 확인된 , TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에 서 STAT3 단백질에 대한 인산화가 억제되는 것을 조직 염색 방법을 이용하여 확 인하였다.

수득된 간 조직을 60 ^° C의 오븐에 20분 정도 방치하여 파라핀을 제거하였 다 파라핀을 제거한 간 조직을 자일렌 용액에 5분씩 담그고. 이를 3회 반복하였 다. 다음으로, 상기 간 조직을 에탄올 100%. 90%, 80%, 70% 및 증류수에 순차적 으로 3분씩 넣었다 꺼낸 뒤 , 이를 수듯물에 10분동안 넣어두었다. 이를 lOmM Citric acid buf fer(pH6.0) 안에 조직을 넣고 호일로 덮어 Autoclave하였다. Autoclave가 끝난 후, 조직을 충분히 식힌 다음 PBS에 10분씩 2번 반웅 시키고

56 메탄을을 이용하여 3%의 과산화수소를 만들어 15분동안 quenching 단계를 거쳤다. 이를 다시 PBS에 넣어 5분씩 3번 반웅시켰다. 그 다음 Horse나 goat serum을 PBS 에 5%로 만들어 blocking과정을 4 ^° C에서 하루 반응하였다. 그 다음날 PBS로 5분 씩 3번 반웅시킨 후, biot in-conjugated IgG Rabbit or mouse를 1차반웅때 사용 했던 serum을 이용해 1시간동안 반웅시켰다. 이를 다시 PBS를 이용하여 세척하고, Avidin-biot in— peroxidase complex를 미리 만들어 30분동안 반응시켰다. 그리고 PBS로 5분씩 3번 세척하고 DAB을 이용하여 조직을 염색하였다. 이 때 , 사용하는 항체에 따라서 반웅하는 시간이 다르기 때문에 대조군과 비교하여 시점을 정하였 다. DAB 염색이 다 된 조직은 증류수에 넣고 Hematoxylin에 5분이상 반웅시켰다. 그 후에는 수듯물에 세척하고, 에탄올 70%, 80%, 90%, 100%및 자일렌 용액에 순 차적으로 3분씩 넣었다 꺼낸 뒤 슬라이드에 놓고 마운팅하였다.

도 3C에 나타난 바와 같이 , 대조군에 비해 TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 간 조직에서 SREBP1의 발현이 증가하고 STAT3 단백질에 대한 인산화가 억제되었다 (도 3C). 실시예 3. T14SF5단백질이 과발현된 간세포에서의 신호 전달 기전 변화 확인

3-1. TM4SF5 단백질이 과발현된 간세포에서 지방 축적 확인

57 TM4SF5 단백질이 과발현된 간세포를 이용하여 상기와 같은 결과를 재확인 하였다.

먼저 . TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스 대신 C57BL/6 정상 마 우스를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1-4에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법 으로 간세포를 수득하였다. 수득한 간세포에 실시예 1- 1에서 제조된 TM4SF5 유전 자를 포함하는 컨스트릭트를 형질전환시켰다. TM4SF5를 발현하는 컨스트럭트가 형질전환된 세포를 이용하여 실시예 1—4에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 오일 레드 0 염색을 수행하였다. 이때. 양성 대조군으로서 정상 마우스로부터 수 득한 간세포에 지방산 ( FFA )을 처리한 것을 사용하였다. 염색된 세포를 현미경으 로 관찰한 결과 사진을 도 4A에 나타내었다.

도 4A에 나타난 바와 같이 , 마우스로부터 분리한 간세포에 TM4SF5 단백질 을 과발현시킴으로써 지방이 축적되는 것을 확인하였다 (도 4A ) .

3-2 . TM4SF5 단백질이 과발현된 세포에서 지방관련 유전자의 발현 변화 확인

실시예 3- 1에서 제조된 TM4SF5 단백질을 발현하는 간세포를 이용하여 지 방관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 이때. 세포는 T 4SF5 단백질을 과발현 하는 간세포 혹은 TM4SF5를 발현하지 않는 세포에 자유지방산을 처리하거나. TM4SF5 단백질을 발현하는 간세포, 지방간과 관련된 사이토카인인 I L-6를 처리한

58 정상 간세포 및 TM4SF5 단백질을 과발현하는 간세포에 IL-6를 처리한 세포를 사 용하여 비교하였다. 실험은 하기 표 3에 기재된 프라이머를 사용한 것을 제외하 고는, 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.

【표 3】

그 결과， 도 4B 및 4C에 나타난 바와 같이， TM4SF5 단백질을 과발현하는 간세포 및 IL-6를 처리한 정상 간세포 모두에서 지방과 관련된 Srebpl, Srebp2, Fasn, CD36, Fabpl, Vldlr, 및 Ldlr 유전자의 발현이 증가하였다 (도 4B 및 4C). 도 4B에서 cont+FFA는 Control 세포에 free fatty acid (250 yM steric acid + 250 μΜ palmitic acid)를 처리한 것이다. 나아가 Tm4sf5 유전자가 heterozygote 로 제거된 녹아웃마우스 (Tm4sf5-/+)의 경우에 정상마우스와 달리， 지방생합성 및 운송축적에 관련된 ApoBlOO, Ldlr, Srebp2, Ppar γ , 및 Leptin유전자가 낮게

59 유지되었다 (도 4D )

3-3 . TM4SF5 단백질이 과발현된 세포에서 STAT3 단백질에 대한 인산화 억 제 확인

TM4SF5 단백질이 과발현된 세포에서 지방간과 관련된 단백질의 발현 변화 를 웨스턴 블롯 방법으로 확인하였다. 실험은 1차 항체로서 라미닌, SREBP1 전구 체 , 성숙한 SREBP1 , PPAR γ , p ^'705 STAT3 , STAT3 , β -액틴 및 F l ag에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는. 실시예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 단백질이 과발현된 세포는 정상 간세포에 FFA를 처리한 경우와 비슷하게 SREBP1 단백질의 발현이 증가한 반 면 , STAT3 단백질의 인산화는 감소하였다 (도 5A ) .

이와 같은 SREBP1 단백질의 발현 증가와 STAT3 단백질의 인산화 감소가 경¾적 관계를 갖는지 확인하기 위해. 정상 간세포에 STAT3 단백질을 과발현시키 고 지방산을 처리한 세포를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수 행하였다. 그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이 , STAT3 단백질이 과발현되는 경우 에는 지방산 처리에 의한 SREBP1 단백질의 발현 증가가 억제되었다 (도 5B ) . 한편 , 정상 간세포에 SREBP1 단백질을 과발현시킨 뒤 . STAT3 단백질의 인 산화를 상기와 같은 방법으로 확인하였다. 그 결과. 도 5C에 나타난 바와 같이 , 증가된 SREBP1 단백질의 발현량에 의해 STAT3 단백질의 인산화는 현저히 감소하

60 였다 (도 5C ) .

따라서 . 상기로부터 SREBP 1 단백질의 발현량과 STAT3 단백질의 인산화는 ᄋ ᄂ！■ ᄂ- -1 s 丁 >-', a s 厂 人 人 ¹ " ^" · 실시예 4. B14SF5 단백질의 발현이 억제된 지방세포에서의 신호 전달 기 전 변화 확인

4-1 . TM4SF5 단백질의 발현이 억제된 지방세포에서 지방 생성 억제 확인 한편. 지방세포에서 TM4SF5 단백질의 발현을 억제하는 경우, 지방 생성이 억제되는지 여부를 확인하기 위해 오일 레드 0 염색을 수행하였다.

먼저, 마우스 3T3-L1 지방 전구세포를 10% NBCS( Gi bco , 16010159 ) 및 1% 페니실린 /스트랩토마이신을 포함하는 DMEM 배양 배지에 배양하여 준비하였다. 상 기 준비된 세포를 웰 당 lxlO ⁵ 개가 되도록 6웰 플레이트에 분주하였다. 분주 4일 후, 지방 전구세포가 웰에 가득차면 48시간을 더 배양하고, 1 μ Μ의 덱사메타손, 0.5 ιιιΜ의 I BMX ( 3- 1 sobu t y 1 - 1-nie t hy 1 xan t h i ne ) 및 10 / g/iii('의 인슐린 (Si gma , 미국) 을 포함하는 지방세포 분화 배지 ( 10% FBS를 포함하는 MDI 배지)로 배지를 교체하 였다. 이를 2일 동안 배양한 뒤 10% FBS 및 10 //g/iii ⁽ '의 인슐린을 포함하는 DMEM 으로 배지를 교체하였다. 상기 배지로 교체하고, 10일 동안 배양한 뒤, 10% FBS 및 1% 페니실린 /스트랩토마이신을 포함하는 DMEM 배양 배지를 사용하여 배양함으

61 로써 , 분화된 지방세포를 수득하였다. Adipocyte에 1 ipofectamine 3000을 이용하 여 TM4SF5 shRNA ( shTM4SF5 , 5' -CCTGGAATGTGACGCTCTTCTCGCTGCTG- 3' ， 서열번호 35)를 t ransfect i on하였다.

그 결과， 도 6A에 나타난 바와 같이， 지방세포에서 TM4SF5 유전자의 발현 을 억제하면 지방의 생성이 억제되었다 (도 6A) .

4-2. TM4SF5 단백질의 발현이 억제된 지방세포에서 지방관련 유전자의 발 현 변화 확인

지방세포에서 TM4SF5 유전자의 발현이 억제되면 지방관련 유전자의 발현 이 변화하는지 여부를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 실험은 실 시예 4-1에서 수득한 분화된 지방세포에 TM4SF5에 대한 shRNA를 처리한 뒤， 하기 표 4에 기재된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는， 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.

【표 4]

62 Fasn— R GAAGCTGGGGGTCCATTGTG 서열번호 45

Ppary_F CTGGCCTCCCTGATGAATAAAG 서열번호 46

Ppary_R AGGCTCCATAAAGTCACCAAAG 서열번호 47

그 결과， 도 6B에 타난 바와 같이， 지방세포에서 TM4SF5 유전자의 발현 을 억제하면 지방과 관련된 Ppary， CD36, Fasn, Srebpl, 및 Fabpl 유전자의 발 현이 억제되었다 (도 6B).

4-3. TM4SF5 단백질이 발현이 증가된 지방세포가 분화되는 과정에서 지방 관련 유전자의 발현 변화 확인

마우스 3T3-L1 preadipocytes를 10% NBCS (Gibco, 16010159) 및 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 DMEM 배양 배지에 배양하였다. 4일째 preadipocytes가 배양용기에 100%로 가득차면 추가적으로 48시간 더 배양한 후, 1 y M Dexaniethasone, 0.5 mM IBMX( (3-isobutyl-l-methylxanthine) , 10 μ g/ml 인슬린 (Sigma, USA) 및 10% FBS를 포함하는 지방세포 분화 배지 (MDI 배지， 제조 사 및 카탈로그 넘버)를 2 일간 처리하였다. 그 후， 배지를 10% FBS 및 인슐린 (10 /m£)으로 보충 된 DMEM으로 2 일 동안 교체해주었다. 10일째 10% NBCS 및 1% penicillin/strept에 lycin을 포함하는 DMEM 배양 배지로 배양하여 지방세포를 분화시켰다. _

이때， 지방이 축적하게 되는 과정 중에 TM4SF5 유전자의 발현과 더불어 지방관련 유전자의 발현이 변화하는지 여부를 SREBP1 전구체, 성숙한 SREBP1,

63 PPAR Y， _P Y ⁷⁰⁵ STAT3， STAT3 , β -액틴 ( Ce 1 1 Signal ing Techno logy, 미국)，

ERK(Ce l 1 Signal ing Technology, 미국) , p-ERK(Cel 1 Signal ing Technology, 미 국)， Akt (Cel l Signal ing Technology, 미국)， TM4SF5에 대한 1차 항체를 사용하 여 실시예 2-2와 조건 및 방법으로 실험을 수행하여 확인하였다.

그 결과， 도 6C에 나타난 바와 같이， TM4SF5 단백질이 발현이 증가된 지 방세포가 분화되어 감에 따라서 지방과 관련된 단백질 (SREBP1)의 발현이 점차 증 가하였고， 반대로 STAT3 단백질의 인산화는 점차 감소하였다 (도 6C) . 실시예 5. TM4SF5단백질을 과발현하는 형질전환마우스에서 SREBP1 단백 질의 발현 증가 및 STAT3 단백질 인산화 억제 기전 확인

5-1. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서 SREBP1 단백질의 발현 증가 기전 확인

상기 실시예에서 확인된 TM4SF5 단백질의 과발현에 의한 SREBP1 단백질의 발현 증가가, SREBP1 단백질의 발현을 조절하는 인자인 SIRT 유전자들의 발현 변 화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 실험은 하기 표 5에 기재된 프라이머 를 사용한 것을 제외하고는， 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.

【표 5]

64 Sirtl_R TGTGAAGTTACTGCAGGAGTGTAAA 서열번호 49

Sirt2_F TTCCATCGCGCTTCTTCTCC 서열번호 50

Sirt2_R CCAGGCCACGTCCCTGTAAG 서열번호 51

Sirt3_F ACCTCCTGGGGTGGACACAA 서열번호 52

Sirt3_R GGCCCCAAGGGTAGACATCC 서열번호 53

Sirt4_F AGCTTTCAGGTCCCGTGCTG 서열번호 54

Sirt4_R TCAGGCAAGCCAAATCGTCA 서열번호 55

Sirt5_F TCTACCCGGCTGCCATGTTT 서열번호 56 ^■

Sirt5_R TGAGGAGCAAGGGCTTCAGG 서열번호 57

Sirt6_F GGGACCTGATGCTCGCTGAT 서열번호 58

Sirt6_R CAGAGGTGGCAGGGCTTTGT 서열번호 59

Sirt7_F TGCCAGGCACTTGGTTGTCT 서열번호 60

Sirt7_R TAGGCTCCGCTTCGCTTAGG 서열번호 61

그 결과， 도 7A에 나타난 바와 같이, TM4SF5 단백질올 과발현하는 형질전 환 마우스의 간조직에서 SIRTl , SIRT5 및 SIRT6 유전자는 발현이 감소한 반면， SIRT2 , SIRT4 및 SIRT7 유전자는 발현이 증가하였다 (도 7A) .

5-2. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서 STAT3 단백질의 인산화 억제 기전 확인

상기 실시예에서 확인된 TM4SF5 단백질의 과발현에 의한 STAT3 단백질의 인산화 억제가 STAT3 단백질을 억제하는 인자인 SOCS유전자들의 발현 변화에 어 떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 실험은 하기 표 6에 기재된 프라이머를 사용 한 것을 제외하고는， 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.

【표 6】

65 SOCSl— R GTTGAGCGTCAAGACCCAGT 서열번호 63

SOCS2— F TCCAGATGTGCAAGGATAAACG 서열번호 64

SOCS2_R AGGTACAGGTGAACAGTCCCATT 서열번호 65

SC0S3— F TGCAGGAGAGCGGATTCTA 서열번호 66

SCOS3_R AGCTGTCGCGGATAAGAAAG 서열번호 67

SCOS5_F GAGGGAGGAAGCCGTAATGAG 서열번호 68

SC0S5— R CGGCACAGTTTTGGTTCCG 서열번호 69

그 결과， 도 7C에 나타난 바와 같이， TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전 환 마우스의 간조직에서 S0CS1 및 S0CS3 유전자의 발현이 증가하였다 (도 7C) .

5-3. TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서 SREBP1 단백질의 발현 증가 및 STAT3 단백질 인산화 억제 기전 확인

TM4SF5 단백질의 과발현에 의한 SREBP1 단백질의 발현 증가 및 STAT3 단 백질의 인산화 억제가 이들과 관련된 SIRT 및 S0CS 단백질의 발현 변화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 실험은, 1차 항체로서 SCOSKCe U Signal ing , 미 국)， S0CS3( Sant a cruz , 미국)， SIRTK Sant a cruz , 미국) 및 β -튜블린을 사용한 것을 제외하고는， 실시예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.

그 결과， 도 7Β에 나타난 바와 같이， TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전 환 마우스의 간조직에서 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현은 증가한 반면 , SIRT1 단 백질의 발현은 감소하였다 (도 7Β) .

또한， TM4SF5 단백질을 발현하는 컨스트럭트가 형질전환된 정상 간세포인

AML12 세포를 배양한 배양 배지를 배양 4일， 8일 및 12일에 수득하여, 수득된 배

66 양 배지를 이용하여 3T3-L1 세포를 배양하였다. 상기 배양된 3T3-L1 세포에서

S0CS3 단백질의 발현 변화를 상기와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 통해 확인하였 다- 그 결과， 도 7D에 나타난 바와 같이， 지방전구세포를 배양한 배양 배지를 얻어 TM4SF5 단백질을 발현하는 간상피세포에게 처리하여 배양한 후 S0CS3 단백 질의 발현 수준이 증가하였다 (도 7D) .

실시예 6. 1M4SF5 단백질이 과발현된 간세포에서 SREBP1 단백질의 발현 증가 및 S AT3단백질 인산화 억제 기전 확인

정상 마우스로부터 분리한 간세포에 TM4SF5 단백질을 과발현시켰을 때， SREBP1 단백질의 발현 증가 및 STAT3 단백질의 인산화 억제가 이들과 관련된

SIRT 및 S0CS 단백질의 발현 변화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.

먼저， 3—1에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 TM4SF5 단백질이 과발 현된 간세포를 제작하였다. 제작된 간세포를 이용하여 상기 표 3에 기재된 프라 이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2—1과 동일한 조건 및 방법으로 S0CS1 및 S0CS3 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 8A에 나타난 바와 같이 , 과발현된 TM4SF5 단백질에 의해 S0CS1 및 S0CS3 유전자의 발현이 증가하였고， 이 는 지방산을 첨가한 경우와 유사하였다 (도 8A) .

또한， 상기 간세포에서 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블

67 롯으로 확인한 결과ᅳ 도 8B에 나타난 바와 같이. 대조군에 비해 14SF5 단백질이 과발현된 간세포에서 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현이 증가하였다 (도 8B).

나아가. 상기 간세포에서 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현 변화를 면역 염 색으로 확인한 결과. 도 8C에 나타난 바와 같이 , 대조군에 비해 TM4SF5 단백질이 과발현된 간세포에서 SOCS 1 및 S0CS3 단백질의 발현이 증가하였다 (도 8C ) .

한편. 정상 마우스로부터 분리한 간세포에 SREBP1 단백질이 과발현된 간 세포를 제작하고. 제작된 간세포를 이용하여 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현 변화 를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과, 도 8D에 나타난 바와 같이 , 대조군에 비해 SREBP1 단백질이 과발현된 간세포에서 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현이 증 가하였다 (도 8D).

한편, 52주령 정상 마우스로부터 분리한 primary 간세포에 실시예 4-1과 동일한 조건 및 방법으로 S0CS3 (NM_174466) sh NA(shS0CS3 , sense 5' CAACAUCUCUGUCGGAAGAUU- 3 ^' 서열번호 111: ant i sense 5' UCUUCCGACAGAGAUGUUGUU- 3 ^' 서열번호 112: )를 transfect ion하여 S0CS3 유 전자의 발현이 억제된 간세포를 제작하고, 제작된 간세포를 이용하여 SREBP1. S0CS3 단백질의 발현 및 STAT3 인산화 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

그 결과, 도 8E에 나타난 바와 같이 , 대조군에 비해 S0CS3 유전자의 발현 이 억제된 간세포에서 SREBP1 단백질의 발현이 감소하였다 (도 SE).

68 실시예 7. T14SF5유전자가녹아웃 (knock-out , K0)된 마우스의 제조

7-1. TM4SF5 유전자 K0 마우스의 제조

먼저 , C57BL/6.마우스를 이용하여 , 5개의 exon으로 이루어진 Tm4sf5 마우 스 유전자 (GenBank access i on number : 匪_029360.3)의 exon 3을 제거한

cas9/RGEN K0 마우스를 제작하였다 (마크로젠， 서을) . 이때， 하기 표 7에 기재된 RGEN 위치를 이용하여 TM4SF5의 유전자 포함된 DNA 522 bp가 결실된 마우스를 수 득하였다. 또한， 하기 표 7에 기재된 마우스 TM4SF5 프라이머를 이용하여, 상기 수득된 마우스로부터 TM4SF5 유전자가 결실된 마우스를 제조하였다.

【표 7】

T7E1 분석을 통해 wi kltype (정상형)과 돌연변이 PCR산물 사이의 이형 2 중가닥 형성을 관찰함으로써 돌연변이 마우스를 선별하였다.

추가적으로， C57BL/6 마우스를 이용하여， Tm4sf5 마우스 유전자 (GenBank access i on number： NM— 029360.3)의 exon 1을 제거한 cas9/RGEN K0마우스를 제작

69 하였다. 이때， 하기 표 8에 기재된 RGEN 위치를 이용하여 TM4SF5의 유전자 포함 된 DNA 29 bp가 결실된 마우스를 수득하였다. 또한, 하기 표 8에 기재된 마우스 TM4SF5 프라이머를 이용하여 , 상기 수득된 마우스로부터 TM4SF5 유전자가 결실된 Tm4sf5-Exon 1-K0 마우스를 제조하였다. 그리고， 도 9를 제외한 다른 실시예에서 는 Tm4sf5-Exon 1-K0 마우스를 Tm4sf5—K0 마우스로 이용하였다.

【표 8】

T7E1 분석을 통해 정상형 (wi l dtype)과 돌연변이 PCR산물 사이의 이형 2 중가닥 형성을 관찰함으로써 돌연변이 마우스를 선별하였다.

7-2. TM4SF5 유전자 K0마우스에서 STAT3 단백질의 인산화를 조절하는 인 자의 발현 변화 확인

실시예 그 1에서 제조된 TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 STAT3 단백질의 인 산화를 조절하는 S0CS1 및 S0CS3 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 상기 제조된 마우스로부터 수득된 간세포를 이용하여 상기 표 3에 기재된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는， 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 S0CS1 및 S0CS3 유전자

70 의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 12A에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 유전 자의 K0에 의해 S0CS1 및 S0CS3 유전자의 발현이 억제되었다 (도 12A ) .

또한, 이와 같은 S0CS1 및 S0CS3 유전자의 발현 억제가 단백질에서도 동 일하게 나타나는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 실험은 상기 제조 된 마우스로부터 수득된 간세포를 이용하고, 1차 항체로서 SOCSl , S0CS3 및 β - 튜블린을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 수행 되었다. 그 결과, 도 12B에 나타난 바와 같이 , TM4SF5의 유전자 0 마우스의 세 포에서 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현도 억제되었다 (도 12B) . 실시예 8. 고지방 식이를 섭취한 T14SF5유전자 Κ0마우스에서의 지방축 적 억제 확인

8-1 . 고지방 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 1(0 마우스에서의 지방 축적 억 제 확인

TM4SF5 유전자 Κ0 마우스에 고지방 식이를 섭취시키고, 간에서의 지방축 적 여부를 Η&Ε 염색을 통해 확인하였다.

먼저, 실시예 7- 1에서 제조된 TM4SF5 유전자 Κ0 마우스에 사료로서 60% kca l 고지방 (Har l an , 미국)을 10주 동안 섭취시켰다. 식이요법을 수행하는 10주 동안 매주 체중 변화를 측정하였다. 10주 후. 상기 마우스로부터 간조직올 수득

71 한 것을 제외하고는, 상기 1-3에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 H&E 염색 을 수행하였다.

그 결과, 도 10A , 10B , 및 12C에 나타난 바와 같이， 고지방 식이를 섭취 하였음에도 불구하고， 정상 마우스에 비해 TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 지방 축 적이 억제되었다 (도 10A , 10B , 및 12C) .

8-2. 고지방식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 K0마우스에서의 지방관련 유전 자 및 단백질의 발현 변화 확인

고지방식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 K0 마우스로부터 간조직을 수득하고， 상기 간조직에서 지방과 관련된 유전자 및 단백질의 발현변화를 확인하였다. 실험은， 상기 제조된 마우스로부터 수득된 간세포를 이용하여 하기 표 9 에 기재된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는， 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방 법으로 유전자의 발현 변화를 확인하였다.

【표 9]

72 β— actin_R AGGAAGAGGATGCGGCAGTG 서열번호 85 한편， 웨스턴 블롯은 1차 항체로서 SREBP1 전구체， 성숙 SREBP1, CD36( Santa cruz, 미국) 및 α-튜블린 (Cell Signaling Thechnology, 미국)에 대 한 항체를 사용한 것을 제외하고는， 실시예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 수행 하였다.

그 결과， 도 11 및 12D에 나타난 바와 같이 , 정상 대조군과 비교하여 TM4SF5유전자의 K0에 의해 지방과 관련된 Srebpl, Srebplc, Srebp2, Ldlr, ApoBlOO, CD36, Fasn, 및 Ppary , 유전자 및 단백질의 발현증가가 억제되었다 (도 11 및 12D).

8-3. 고지방 식이를 섭취한 TM4SF5유전자 K0마우스에서의 간조직 내 지 방수준 변화 확인

고지방 식이를 섭취한 TM4SF5유전자 K0마우스로부터 간조직 내의 지방 측정을 위해서 RNAlater에 고정된 조직을 ~10 mg크기로 조작을 내어

cholesterol (Abeam, ab65390) , free fatty acid (Abeam, ab65341) 및

Triglyceride (Cell biolabs, STA-396)를 측정하였다.

그 결과， 도 IOC 및 10D에 나타난 바와 같이， 정상마우스는 고지방 식이 의 섭취에 따라 간조직 내 콜레스테롤 및 FFA의 수준이 높았으나， TM4SF5유전자

1(0마우스는 고지방 식이 섭취에도 불구하고 간조직 내 콜레스테롤 및 FFA의 수

73 준이 높지 않음을 확인하였다 (도 10C 및 10D) 실시예 10. 114SF5 및 APC유전자의 상호작용 확인

10-1. TM4SF5 유전자 K0마우스와 APC ^mim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손 의 특징 확인

실시예 7-1에서 제조된 TM4SF5 유전자 K0 마우스를 대장 질환이 발생하기 쉽도록 돌연변이화된 APC ^mim/+ 마우스 [중앙동물실험 (주) , 서울, 대한민국]와 교배 하여 자손의 표현형을 확인하였다.

먼저， 수득된 자손의 간 조직을 이용하여， 하기 표 10에 기재된 프라이머 를 사용한 것을 제외하고는， 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 TM4SF5 및 APC유전자의 발현을 확인하였다.

【표 10]

또한, 상기 수득된 자손을 희생시켜 각 기관을 관찰한 결과를 도 13B에

74 나타내었다. 도 13B에 나타난 바와 같이 . 일반적으로 APC ^+/_ 마우스에서 관찰되는 특징인 비장종대 및 비정상적인 창자에 추가로 비장이 비대해지고 간조직의 동양 혈관이 벌어져 있는 문맥압항진증 (portal hyper tens ion)의 증상을 나타냈다 (도 13B).

10-2. TM4SF5 유전자 KQ 마우스와 APC ⁿ ' ^im/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손 의 지방 및 콜라겐 발현 확인

상기 수득된 자손의 간조직을 이용해 H&E 및 메이슨의 트리크름 (Masson's Tri chrome) 염낵을 수행하였다. 이때. H&E 염색은 상기 실험예 1-3에 기재된 바 와 같이 수행되었다.

한편, 메이슨의 트리크름 염색을 위해 파라핀에 고정된 간 조직을 6C C의 오븐에 20분 정도 방치하여 파라핀을 제거하였다. 파라핀이 제거된 조직을 가열 된 보우인 's 용액 (bouin's solution)에 넣고 1시간 동안 반웅시켰다. 반웅이 끝 난 뒤, 간 조직을 수듯물로 세척하고. 헤마토자일린 용액에 넣어 10분 동안 반웅 시켰다. 이를 다시 수듯물로 세척하고, 비브리히 스칼렛ᅳ산 푹신 (biebrich scarlet-acid fushsin) 용액에 넣어 5분 동안 반응시켰다. 반웅이 끝난 간 조직 을 증류수에 넣은 뒤, 인텅스텐산 /인몰리브덴산 (phosphotungstic

acid/phosphomolybdic acid) 용액에 넣어 15분 동안 반웅시켰다. 이후, 상기 간 조직을 아닐린 블루 ( _an il i _n blue) 용액에 10분 및 1% 아세트산에 1분 동안 각각

75 넣어 반응시킨 뒤, 조직을 탈수시켰다. 탈수된 조직을 자일렌에 넣었다 쩌낸 뒤 . 슬라이드에 놓고 마운팅하였다. 두 염색 방법으로 염색된 세포를 현미경을 이용 하여 관찰한 결과 사진을 도 13D에 나타내었다.

도 13D에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 유전자 0 마우스와 APC ^mim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손의 간조직에서 고혈압 증상 (portal hyper tens ion)을 보이는 위치 주위에 세포의 배열이 비정상적으로 완만하였고, 콜라겐의 발현이 증가하였 다 (도 13으).

10-3. TM4SF5 유전자 KQ 마우스와 APC ^mim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손 의 간세포에서 TM4SF5의 발현 확인

실시예 10-1에서 수득된 자손에서 TM4SF5, β-카테닌 및 HIFla 단백질의 발현 변화를 확인하기 위해 면역 염색을 수행하였다. 실험은, 1차 항체로서

TM4SF5, β-카테닌 및 HIFla 단백질에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는, 실 시예 2-3과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.

그 결과, 도 13C에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 유전자 K0 마우스와 APC ^mim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손의 간세포에서 TM4SF5, β-카테닌 및 HIFla 단백 질의 발현이 증가하였고 혈관의 확장이 확인되었다 (도 13C). 따라서 간조직의 혈 관확장 증세인 portal hypertension은 H4SF5의 발현과 유관하다는 것이 본 실시 예을 통해 확인되었고, 이러한 portal hypertension은 간섬유화 및 간경화와 연

76 결되는 것으로 알려져 있다 (Methods Mol Biol . 2017;1627:91-116).

10-4. TM4SF5 유전자 K0 마우스와 APC ^mim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손 의 간세포에서 지방관련 신호전달 기전 확인

TM4SF5 유전자 0 마우스와 APC ^mim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손의 간 세포에서 지방관련 신호전달 기전을 웨스턴 블롯 방법으로 확인하였다. 실험은, 실시예 10-1에서 수득된 자손의 간세포를 사용하고, 1차 항체로서 라미닌, 피브 로넥틴, ρΥΐ42 β-카테닌. β一카테닌, pY705 STAT3, STAT3, pS9-GSK3 β , GSK3 및 14SF5 단백질에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2-3과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.

그 결과, 도 13E에 나타난 바와 같이, TM4SF5 유전자 K0 마우스와 APC ^mim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손의 간세포에서 라미닌 및 피브로넥틴 단백질의 발 현과 GSK3|3의 인산화가 증가하였다 (도 13E).

따라서 , 상기로부터 TM4SF5 단백질의 발현이 간의 혈과 및 문맥에 장애를 발생시키고, 섬유화와 관련된 세포외 기질 등의 발현을 촉진시킴으로써 간에서 섬유화 증상을 유발할 수 있음을 확인하였다. 실시예 11. H4SF5단백질에 의한 세포 외부 아르기닌 운반 확인

TM4SF5 단백질의 과발현에 의해 지방간의 특징이 나타나는 것을 확인하고,

77 면역침강 실험을 수행하여 TM4SF5 단백질과 niTOR 및 아르기닌 수송체인 SLC7A1 또는 SLC38A9 단백질과의 결합여부를 확인하였다.

먼저 , HEK293T 세포 (KCLB, 대한민국)를 10% FBS 및 항생제가 포함된 DMEM 배양 배지를 사용하여 37 ^° C 및 5% C02 조건하에서 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 100 uiui 플레이트에 분주하여 60% 밀도가 되도록 배양하고,

Polyethyleniniine(PEI)를 이용하여 TM4SF5 단백질에 STE P 태그가 표지된 컨스트 릭트 및 HA 태그가 표지된 SLC7A1 또는 SLC38A9 단백질을 발현하는 컨스트럭트 를 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일 동안 배양된 세포를 PBS로 1회 세힉하고 amino acid 또는 Arginine이 결핍된 배양액에 50분간 37 ^° C 5% C02에서 배양한다. 배양 후 PBS로 2회 세척하고, 500 의 용해 완충액을 첨가하여 4t ^' 에서 15분 동 안 반응시켰다. 세포 용해물을 4 ^° C 및 12,000 xg의 조건하에서 15분 동안 원심분 리하고 상청액을 취하였다. BCA 시약 (Thermo Scientifics, 미국)을 이용하여 상 기 상청액에 포함된 단백질을 정량하고. 여기에 스트렙타비딘이 코팅된 비드를 단백질양에 비례하도록 첨가하였다. 상기 흔합물을 4 ^° C에서 4시간 동안 회전하며 반응시킨 뒤 , 4t ^' 및 7,000 xg의 조건으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후. 수득된 펠렛에 용해 완충액을 첨가하여 가볍게 섞어준 뒤 , 이를 다시 4 ^° C 및 7,000 xg의 조건으로 5분 동안 원심분리하고 펠렛을 취하였다. 이와 같은 세척 과정을 용해 완층액을 이용하여 2회, PBS를 이용하여 2회 반복한 뒤 , 세척된 펠 렛에 2x 샘플 완충액을 첨가하고. 5분 동안 끓여주어 ¾플을 준비하였다. 준비된

78 샘플을 이용하고, 1차 항체로서 HA(Covanvce, 미국) 및 스트랩타비딘 -HRP( IBA, 미국)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2— 3과 동일한 조건 및 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 단백질이 niTOR와 SLC7A1 단 백질 또는 SLC38A9과 결합하였고, 상기 결합은 세포를 배양하는 배지 내에 아 르기닌이 결핍된 상황에서 더욱 강하게 나타났고 (도 14A, 14B, 및 14C), TM4SF5 단백질이 발현하는 경우에는 발현하지 않는 경우에 대비하여, 세포에 아미노산을 없앴다가 (depletion) 다시 처리공급함 ( replaet km)에 따라 S6K, 4EBP1 , 및 ULK1 의 인산화가 증가함을 확인하였다 (도 14D 및 14E). 실시예 12. TM4SF5 단백질과 아르기닌 수송 기전의 관련성 확인

12-1. TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 아르기닌 분해효소 확인

T 4SF5 유전자 K0 마우스를 6시간 동안 굶긴 뒤, 간에 존재하는 아르기닌 분해효소의 함량을 아르기나아제 l(arginasel) 유전자의 발현을 측정함으로써 확 인하였다.

구체적으로, 실시예 7-1에서 제조된 TM4SF5 유전자 1(0 마우스의 식이를 6 시간 동안 중단하고 상술한 바와 같이 회생시켜 간 조직을 수득하였다. 수득된 간 조직을 이용하고, 아르기나아제 유전자에 대해 공지된 프라이머를 사용한 것

79 을 제외하고는 실시예 2—1과 동일한 조건 및 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다. 도 15A에 나타난 바와 같이 TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 아르기닌의 분 해효소인 아르기나아제 1 유전자의 발현이 16시간 식이억제 군 (흰색바)에서 유의 적으로 감소하였다 (도 15A, 검은색바 =16시간 식이억제 후 4시간 재섭취).

12-2. TM4SF5 단백질 및 아르기닌의 결합 확인

TM4SF5 단백질이 아르기닌의 수송에 직접적인 영향을 주는지 확인하기 위 해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, HEK293FT 세포 (Thermo, 미국)를 10% FBS 및 항생제가 포함된 DMEM 배양 배지를 사용하여 37 ^° C 및 5% C0 ₂ 조건하에서 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 150 UIUI 플레이트에 분주하여 60% 밀도가 되도록 배양하고, PEI를 이용하 여 실시예 11에서 제조된 TM4SF5, MetaP2, Castrol, TM4SF1, TM4SF4, 및 TM4SF5 단백질을 발현하는 컨스트럭트로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 실시예 11에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 스트랩타비딘이 코팅된 비드를 이용하여 원하는 단백질을 침강시켰다. 상기 침강물에 10 μΜ의 [3Η]-아르기닌(½ - 311 radiolabeled chemicals, 미국)을 첨가하고. 이를 4 ^° C에서 1시간 동안 반웅시켰 다. 이때, 대조군으로서 동량의 비드에 10 ηιΜ의 L-아르기닌을 첨가한 씸플을 사 용하였다. 반응이 끝난 후, 상기 비드를 용해 완충액을 이용하여 3회 세척하고, 2 의 신틸레이션 칵테일 (scint Π lation cocktail, Ultima gold, Perk in elmer ,

80 미국)을 첨가하였다. 이를 볼텍싱.하고 리퀴드 신틸레이션 카운터 (liquid scintillation counter , Tr i-Carb, Perk in elmer , 미국)를 이용하여 분석하였다. 그 결과. 도 15B와 15C에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 단백질과 세포질에 존재하는 아르기닌 센서로 알려진 Castorl 단백질이 아르기닌과 직접 결합하였다 (도 15B 및 15C ).

12-3. TM4SF5 단백질 및 아르기닌의 농도 의존적 결합 확인

실시예 12-2에서 TM4SF5 단백질이 아르기닌과 결합하는 것을 확인한 바, 상기 결합이 농도 의존적인지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 실험은

TM4SF5 단백질이 형질전환된 HE 293FT 세포를 사용하고 . 0, 0.01, 0.05. 0.1 및 0.5 ιιιΜ의 L-아르기닌을 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 12-2와 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 15D와 15E에 나타난 바와 같이 . 14SF5 단백질이 첨가된 아 르기닌의 농도 의존적으로 아르기닌에 결합하였다 (도 15D 및 15E). 실시예 13. H4SF5단백질에서 아르기닌과의 결합위치 확인

상기로부터 TM4SF5 단백질이 아르기닌과 직접적으로 결합하는 것을 확인 함으로써 , TM4SF5 단백질의 어느 잔기가 아르기닌과의 결합에 중요한 작용을 하 는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

81 먼저 , TM4SF5 단백질을 구성하는 아미노산 서열 (서열번호 1)에서 N-말단 으로부터 31에서 42번째 아미노산 잔기를 포함하는 short extracel lul ar loop(SEL) 조각 돌연변이를 제조, N-말단으로부터 113에서 157번째 아미노산 잔 기를 포함하는 long extracellular loop (LED 조각 돌연변이를 제조, 또는 N-말 단으로부터 124 내지 129 및 153 내지 157번째 아미노산 잔기를 각각 치환하여 TM4SF5 단백질의 돌연변이를 제조하였다. 그 결과. TM4SF5 단백질의 wild type(WT, full length)외에 SEL, LEL, W124A, G125A, Y126S, H127A, F128S, E129A, P153A, W154A, N155Q, V156A 또는 T157A 돌연변이를 수득하였다. 상기 수 득된 돌연변이 단백질을 발현하는 컨스트럭트를 사용한 것을 제외하고. 실시예 12— 2와 동일한 조건 및 방법으로 TM4SF5 단백질과 아르기닌의 결합을 확인하였다 그 결과, 도 15F에 나타난 바와 같이, TM4SF5 단백질의 짧은 세포외루프 (SEL) 돌연변이는 아르기닌과 결합하지 못하였다 (도 15F). 따라서， 상기로부터 TM4SF5 단백질의 LEL 아미노산 잔기가 아르기닌과 결합함을 알 수 있었다.

도 15G에 나타난 바와 같이 ,ᅳ TM4SF5 단백질의 세포외 루프 (extracel lular loop)에 존재하는 124 내지 129번째 아미노산 잔기가 치환된 돌연변이가 아르기 닌과 결합하지 못하였다 (도 15G). 따라서 , 상기로부터 TM4SF5 단백질의 N-말단으 로부터 124 내지 129번째 아미노산 잔기가 아르기닌과 결합함을 알 수 있었다. 한편 , 도 15G에 나타난 바와 같이 , 상기 부위는 양이온 -π 상호작용을 형 성하는 것으로 알려진 부위로, 대부분의 동물 TMSF5 단백질에서 보존된 서열이

82 다 (도 15G) 실시예 14. H4SF5유전자 K0마우스에서 고아르기닌 식이 섭취에 의한 체중 변화 확인

14-1. TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 고아르기닌 식이 섭취에 의한 체중 변화 확인

TM4SF5 유전자 1(0 마우스에서 고아르기닌 식이 (High Arg Diet) 섭취에 의 한 체중변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 실시예 7-1에서 제조된 TM4SF5 유전자 K0 마우스에 사료로서 마우스 체중 1 kg당 40 g의 L-아르기닌 (L-arginine)을 10주 동안 섭취시켰다. 식 이요법을 수행하는 10주 동안 매주 체중 변화를 측정하여 그 결과를 도 17A에 나 타내었다.

도 17A에 나타난 바와 같이, 고아르기닌 식이를 섭취한 정상 마우스는 정 삭 식이를 섭취한 마우스에 비해 체중이 약 25% 증가한 반면. TM4SF5 유전자 K0 마우스는 체중이 약 7% 증가하였다 (도 17A). 한편, 도 17B에 나타난 바와 같이 , 고아르기닌 식이를 시작한 시작점에 대비하여 마우스 개체 각각의 체중 증가를 확인한 결과. TM4SF5 유전자 K0 마우스에서는 체중 증가가 유의적으로 감소되었 다 (도 17B).

83 14- 2. TM4SF5 유전자 Q 마우스에서 고아르기닌 식이 섭취에 의한 지방 축적 확인

실시예 13-1에서 고아르기닌 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 K0 마우스로부 터 간조직을 적출하여 상기 서술한 방법을 이용하여 H&E 염색을 수행하였다. 그 결과, 도 17C에 나타난 바와 같이, 고아르기닌 식이를 섭취한 정상 마 우스는 지방간이 유도된 반면, TM4SF5 유전자 1(0 마우스의 간조직에서는 상대적 으로 지방 축적이 억제되었다 (도 17C ) . 실시예 15. 114SF5 단백질과 글루코스 수송체와의 관계 확인

15- 1 . TM4SF5 단백질에 의한 S61 (의 인산화 여부 확인

질량분석법을 사용하여 TM4SF5 단백질과 결합하는 단백질을 분석하고. GLUTKSLC2A1 ) 단백질을 선택하였다. GLUT1 단백질은 글루코스 수송체로서 인슬 린에 의해 세포막으로 이동하여 글루코스를 세포 안쪽으로 공급하여 에너지를 생 산하는데 관여한다. 이에 . TM4SF5 단백질을 발현하는 컨스트릭트가 형질전환된 세포를 이용하여 S6Ki nase의 인산화 여부를 다음과 같이 확인하였다.

먼저, HEK293FT 세포 (Thermo , 미국)를 10% FBS 및 항생제가 포함된 DMEM 배양 배지를 사용하여 37 t 및 5% C02 조건하에서 배양하여 준비하였다. 준비된

84 세포를 이용하여 포도당 결핍 후 공급을 통해, 이와 같은 스트레스하에서 세포의 생존여부를 확인함으로써 세포의 생존 반응성을 확인하였다.

그 결과, 도 18A에 나타난 바와 같이. TM4SF5 단백질이 발현된 세포주에 서 S6K의 인산화가 증가되었다 (도 18A).

15-2. TM4SF5 단백질의 발현 억제에 따른 해당작용 스트레스 측정

TM4SF5 단백질의 발현을 억제한 세포에서 해당작용 스트레스를 XF 분석기 (Sea Horse)를 사용하여 측정하였다. TM4SF5 발현 억제 세포주 제작을 위해

HEK293FT 세포주에 TMSF5를 타겟하는 sh NA 서열 (shTM4SF5 #2: 5'一

accauguguacgggaaaaugugc-3 ' , 서열번호 95； shTM4SF5 #4, 5' - ccaucucagCLiLigcaaguc-3' , 서열번호 96)을 삽입한 pLKO .1 ( acldgene ) lent i-vi ral plasmid, psPAX2 와 pDM2.G 컨스트릭트를 PEI를 이용하여 전달 감염시켰다. 5시 간후 배양액을 갈아주고 24시간 동안 배양시켜 shTM4SF5 lenti-virus를 얻었다. 이를 Hep3B 세포에 4ug/ml polybrene과 함께 24시간 동안 감염시킨 후 puromycin 으로 48시간동안 selection 하였다.

구체적으로, Hep3B 세포를 XFp 세포 배양 플레이트 (Sea Horse bioscience, 미국)에 웰당 5x103개가 되도록 분주하였다. 분주된 세포를 37 ^° C 및 5% C02 조건 하에서 16시간 동안 배양하고, Sea Horse XF 기본 배지 (Sea Horse bioscience, 미국)로 교체하였다. 배지를 교체한 세포를 C0 ₂ 가 공급되지 않는 37 ^'5 C 배양기에

85 서 1시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 포함하는 XFp 세포 배양 플레이트를 37 ^' C에서 수화 및 보정된 센서 카트리지 (Sea Horse bioscience, 미국)에 결합시 키고, XFp 분석기를 사용하여 분석하였다. 약물의 주입구에는 A: 100 ηΜ 글루코 스, B: 50 LiM 올리고마이신. 및 C: 500 ιιιΜ 2-데옥시—D—글루코스를 로딩하였다. 그 결과, 도 18B에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 유전자의 발현을 억제하면 글루코스에 의한 반웅성이 떨어지는 것을 확인하였다 (도 18B).

15-3. TM4SF5 단백질의 과발현에 의한 해당작용에 관련된 유전자의 발현 변화 확인

TM4SF5 단백질이 과발현된 세포에서 해당작용과 관련된 유전자의 발현이 어떻게 변화하는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저 . SNU449 간암 세포주에 TM4SF5 단백질을 발현하는 컨스트럭트를 형 질전환시켰다. 상기 세포에 액화질소를 첨가하여 파쇄시키고. RNAeasy 키트

(Qiagen, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. 추출된 NA에 DNAse를 첨가하여 DNA를 제거하고, 통상적인 방법으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 어댑터 (adaptor)를 부착시키고, PCR로 증폭하여 200 내지 400 bp 크기를 갖는 PCR 산물을 선별하였다. 선별된 cDNA의 서열을 HiSeci 4000 서열분석 기 (Illuniina. 미국)를 이용하여 분석하였다. 서열분석 결과는 전처리과정을 통해 인공산물 (artifact)을 제거하고, HISTA2 프로그램을 사용하여 게놈에 맵핑하였다

86 맵핑된 데이터는 StringTie를 이용하여 전사물 (transcript) 어 ¾블리를 통해 발 현량을 얻었다.

그 결과. 도 18C에 나타난 바와 같이, TM4SF5 단백질의 과발현으로 인해 세포내에 존재하는 해당작용 관여 유전자들의 발현이 대체적으로 증가하였다 (도 18C). . 실시예 16. H4SF5유전자 K0마우스에서의 고탄수화물 식이 또는 고수크 로즈 식이 섭취에 의한 영향 확인

16-1. TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 고탄수화물 식이 또는 고수크로즈 (자 당. sucrose) 식이 섭취에 의한 체중 증가 억제 확인

실시예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 TM4SF5 유전자 1(0 마우스에 고탄 수화물 식이 (70% kcal 고탄수화물 ) 혹은 고수크로즈 식이 (자당, sucrose, AIN- 93G diet; sucrose의 함량이 3.15%인 chow diet에 대비하여 100 g/kg로 10%높게 함유됨)를 섭취시키고, 체중 변화를 확인한 결과를 각각 도 16A 및 19A에 나타내 었다.

도 16A, 16B, 및 19A에 나타난 바와 같이, 고탄수화물 식이의 경우 정상 마우스는 정상식이에 대비하여 체중이 크게 증가하였으나, TM4SF5 유전자 K0 마 우스는 유의적으로 체중이 증가하지 않았다 (도 1(3A, 16B). 한편 , 고수크로즈 식

87 이를 섭취한 경우에는 정상마우스는 체중 증가 속도가 높았지만 Tm4sf5 유전자 K0 마우스는 체중증가 속도가 미약하였다 (도 19A).

16-2. TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 고탄수화물 식이 또는 또는 고수크로 즈 식이 섭취에 의한 포도당 저항성 변화 확인

실시예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 K0 마우스의 포도당 저항성을 다음과 같 은 방법으로 측정하였다.

구체적으로. 3주 및 10주간의 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이를 각각 섭취한 마우스를 16시간 동안 굶기고, 꼬리에서 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액 내 혈당을 혈당기 (One touch ultra. Johnsons and Johnsons , 미국) 를 이용하여 측정하였다. 혈당 측정 후. 상기 마우스에 2 g/kg의 포도당을 복강 으로 주사하고, 주사 30분, 60분, 90분 및 120분 후에 각각 꼬리에서 혈액을 채 취하여 혈당을 측정하였다.

그 결과, 도 16C와 19B에 나타난 바와 같이, 정상 마우스와 비교하여 TM4SF5 유전자 K0 마우스는 10주 동안의 고탄수화물 식이 혹은 고수크로즈 (자당. sucrose) 식이의 섭취로 인한 포도당 저항성이 감소되었다 (도 16C 및 도 19B).

16-8. TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 고탄수화물 혹은 고수크로즈 (자당

88 sucrose) 식이 섭취에 의한 인슐린 저항성어 1 대한 영향 확인

실시예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 K0 마우스의 인슐린 저항성을 다음과 같 은 방법으로 측정하였다.

구체적으로. 10주간의 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이 를 각각 섭취한 마우스를 6시간 동안 굶기고, 꼬리에서 혈액을 채취하였다. 채취 된 혈액 내 혈당을 혈당기 (One touch ultra, Johnsons and Johnsons, 미국)를 이 용하여 측정하였다. 혈당 측정 후, 상기 마우스에 0.5 U/kg의 인슐린을 복강으로 주사하고, 주사 30분, 60분， 90분 및 120분 후에 각각 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다.

그 결과, 도 16D와 19B에 나타난 바와 같이. 포도당 저항성과 달리, 인슐 린 저항성은 TM4SF5 단백질의 존재 여부와 관련이 없었다 (도 16D). 하지만， 10주 동안의 고수크로즈 식이의 경우, Tm4sf5 유전자 K0 마우스는 인슐린 저항성이 낮 아져 호전되었다 (도 19B).

16-4. TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이 섭취에 의한 혈액 내 AST. ALT, Triglyceride 및 콜레스테를 수준 에 대한 영향 확인

실시예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당,

89 sucrose) 식이를 섶취한 TM4SF5 유전자 K0 마우스의 혈액 내 AST, ALT, 및 콜레 스테를 수준을 Fuji Dri-Chem 3500i를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 16E와 19C에 나타난 바와 같이 , 고탄수화물 식이를 섭취한 정상마우스는 혈액중 ALT, AST, Total cholesterol , 및 Triglyceride의 수준이 증가하였으나, TM4SF5 유전자 K0 마우스에서는 그 증가가 미약하였다 (도 16E). 하지만, 고수크로즈 (자당. sucrose) 식이의 경우, 정상마우스는 혈액중 ALT, AST 수준이 증가하였으나, TM4SF5 유전자 0 마우스에서는 그 증가가 미약 하였으나, Total cholesterol , 및 Triglyceride의 수준은 통계적 유의성 없이 변 화가 없었다 (도 19C).

16-5. TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이 섭취에 의한 지방 축적 확인

실시예 16-1에서 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이를 섭 취한 TM4SF5 유전자 1(0 마우스로부터 간조직을 적출하여 상기 서술한 방법을 이 용하여 H&E 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 19D에 나타난 바와 같이, 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이를 섭취한 정상 마우스는 지방간이 유도된 반면, TM4SF5 유전자 1(0 마우스의 간조직에서는 상대적으로 지방 축적이 억제되었다 (도 19D).

90 16-6. TM4SF5 유전자 KO 마우스에서 고탄수화물 또는 고수크로즈 식이 섭 취에 의한 모노아실- (monoacyl-). 다이아실 -((Uacyl-) , 및 트라이아실一 (triacyl-) 글라이세롤 (glycerol) 합성 축적 확인 실시예 16-1에서 고탄수화물 또는 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이를 섭 취한 TM4SF5 유전자 KO 마우스로부터 간조직을 적출하여, lysophilization하고 막자사발을 이용하여 분쇄한 후. 간조직 10 mg 당 0.3 ml의 메탄을과 0.1% butylated hydroxy toluene 용액으로 지질을 추출하였다. 0.1% butylated hydroxytoluene 를 포함하는 methyl-tert-butyl ether를 추출액에 첨가한 후, 상온에서 1시간동안 shaking 하였다. 0.25 ml의 H20로 회석한 후, 상온에서 10 분간 vertex한 후, 14,000 g로 4 ⁰⁽ ：에서 15분간 원심분리하였다. 상층액과 하층 액을 별개로 분주 확보한 후 dyringl 과정을 거친 후 0.16 ml에 40 μΐ CHCl ₃ :MeOH (1:9)를 처리하여 Lipids analysis using LC- MS/MS (8040, Shimadzu, 일본)로 측정하였다. 그 결과, 도 19E에 나타난 바와 같이. 고수크로즈 (자당, sucrose) 식이를 섭취한 정상 마우스에 대비하여, TM4SF5 유전자 K0 마우스의 간조직에서는 상대 적으로 모노아실- (monoacyl-), 다이아실 -((liacy卜), 및 트라이아실 -(triacy卜) 글라이세를 (glycerol)의 합성이 낮았다 (도 19E).

실시예 17. T14SF5단백질의 과발현에 의한 간경화 증상 확인

91 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 TM4SF5 단백질이 과발현된 마우스 를 제작하고. 이를 78주 동안 사육하였다. 사육된 마우스를 상술한 바와 같이 희 생시켜 간조직을 수득하고, 이를 H&E 및 메이슨의 트리크름 염색을 통해 간조직 의 표현형을 확인하였다. 그 결과, 도 20A에 나타난 바와 같이 . 간조직의 섬유화 가 생성된 간경화의 표현형을 나타내었다 (도 20A). 마우스의 주령이 78주 (1년 6 개월)되어 노령이기 때문에, 정상쥐의 경우에도 지방간의 증세가 미약하게 보였 으나， TM4SF5가 과발현된 동물의 겨웅에는 좀 더 심각한 지방간 증세와 더블어 골수외조혈 (extraniedullary heniatopoiesis) 증상이 확인되었다 (도 20B).

또한, 상기 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 지방과 관련된 단백질들 의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 도 20C에 나타내었다.

도 20C에 나타난 바와 같이, 지방간의 표현형을 나타낸 52주령의 마우스 와 달리 , 78주령의 경우 TM4SF5 단백질의 과발현에 의해 STAT3의 인산화가 증가 하고, 간경화의 주요 인자인 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)이 증가하 였다. 한편, SREBP1 단백질의 발현은 억제되고. SIRT1 단백질의 발현은 증가됨으 로써 간조직 내에서의 지방 합성 및 축적이 감소되었다 (도 20C).

나아가, 상기 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 면역 염색을 수행한 결과를 도 21A에 나타내었다. 도 21A에 나타난 바와 같이 , TM4SF5의 과발현에 의 해 S0CS1 및 S0CS3 단백질의 발현이 억제되고, STAT3의 인산화가 증가되었으며 , α-SMA, 콜라겐 1 및 라미닌과 같은 ECM의 발현이 증가되었다. 이때, 콜라겐 1과

92 α -SMA는 유사한 발현 패턴을 나타낸 반면. 라미닌 및 라미닌 γ 2는 발현 세포 및 발현 패턴이 상이하였다 (도 21A ) .

한편, 상기 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 지방대사. 간경화 및 간 염과 관련된 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 21B 및 21C에 나타 난 바와 같이 , 지방대사와 관련된 유전자의 발현은 14SF5 단백질의 과발현에 영 향을 받지 않았으나, 간경화 및 간염과 관련된 유전자의 발현은 증가하였다 (도 21B 및 21C ) .

따라서 . 상기로부터 TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서 지 방간이 발생하다가 일정 시간이 경과하면 지방간이 간경화나 간염으로 발전하고, 그에 따라 STAT3 단백질의 인산화나 ECM 수준을 증가시키는 것을 확인하였다. 실시예 18. 간질환모델 마우스에서의 T14SF5 단백질 발현 변화 확인

TM4SF5 단백질이 과발현된 마우스에서 생성된 지방간이 시간이 경과함에 따라 간경화 및 간염 증상을 나타내는 것을 확인하였다. 일반적으로 사염화탄소 를 4주 동안 투여한 마우스는 간섬유증을 16주 동안 투여한 마우스는 간경변증의 증상올 나타내는 것이 보고되어 있다. 이에, 약물로 간경화를 유도시킨 모델 마 우스에서 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 확인하였다.

먼저, 4주령의 BALB/C 마우스 (오리엔트 바이오. 대한민국)에 1 nig/kg의 양으로 사염화탄소 ( CC 1 ₄ )를 1 , 4 또는 16주 동안 일주일에 1회 복강 내 주사하여 .

93 간질환이 유도된 모델 마우스를 제조하였다 . 제조된 모델 마우스를 이용하여 상 술한 바와 같이 H&E 및 메이슨의 트리크름 염색올 수행한 결과를 도 22A에 나타 내었다.

도 22A에 나타난 바와 같이 . CC1 ₄ 를 4주 또는 16주 동안 투여한 마우스의 간조직에서 혈관을 중심으로 세포들이 죽어있고, 그 주변으로 면역반웅이 일어나 면서 정상세포와 비교하여 형태가 변형된 세포가 관찰되었다. 또한, 세포 사이에 콜라겐이 축적되면서 혈관과 혈관 사이에 길이 생성되었다 (도 22A).

또한, 상기 모델 마우스의 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 단백질 및 mRNA의 발현 수준을 확인한 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23A에 나타난 바 와 같이 , 모델 마우스의 간조직에서 TM4SF5 단백질의 발현, STAT3 단백질의 인산 화 및 ECM이 증가하였다 (도 23A). 뿐만 아니라， CC1 ₄ 를 4주 또는 16주 처리한 동 물의 간경화가 일어난 조직에서 처리하지 않은 대조군에 대비하여 elastin, 라미 닌 α2, α3, α5. γ2, γ3 chain의 mRNA가 높아지는 것을 확인하였다 (도 23B) 나아가, 상기 모델 마우스의 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 면역 염색을 수행한 결과를 도 24에 나타내었다. 도 24에 나타난 바와 같이 , 모델 마 우스의 간조직에서 TM4SF5 단백질의 발현이 증가함에 따라, STAT3의 인산화가 증 가하였고, a— SMA, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 및 라미닌 γ2 단백질의 발현이 증가하였다 (도 24).

한편, 실시예 7-1에서 제조한 TM4SF5 유전자 Κ0 마우스에 상술한 바와 같

94 이 CC1 ₄ 를 투여한 뒤, 간조직을 수득하여 메이슨의 트리크롬 염색을 수행한 결과 를 도 22C에 나타내었다. 그 결과, 대조군에 비해 TM4SF5 유전자 K0 마우스에서 콜라겐의 축적이 감소하였다 (도 22C). 실시예 19. 간질환모델 마우스에서의 라미닌 단백질 발현 조절 기전확인 실시예 18에서 약물 투여로 제조된 간질환 모델 마우스의 간조직을 이용 하여 라미닌 단백질의 발현 조¾ 기전을 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 먼제 상기 분리된 간조직으로부터 상술한 바와 같이 간세포를 수득하였 다. 수득된 간세포에서 TM4SF5 및 STAT3 단백질의 발현을 shTM4SF5 또는

silencing STAT3 [On-Tar et plus SMART pool s iRNA( Thermo )]¾ ^■ trans feet ion 시 키어 억제시키고, 그에 따라 라미닌의 발현 변화를 상술한 바와 같이 웨스턴 블 롯으로 확인하였다.

그 결과. 도 25에 나타난 바와 같이 , TM4SF5 및 STAT3 단백질의 발현이 억제됨으로써 , 라미닌 단백질의 발현도 억제되었다. 한편 , STAT3 단백질의 발현 을 억제하였을 때는 TM4SF5 단백질의 발현 변화에는 별다른 영향을 미치지 않았 다 (도 25).

또한， 상기 분리된 간조직에 IL-6를 처리하여 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행함으로써 증가된 STAT3 인산화 및 라미닌 단백질의 발현이 IL-6에 의 존적인지 확인하였다. 그 결과, 도 26A에 나타난 바와 같이 IL-6에 의해 STAT3

95 단백질의 인산화 및 콜라겐 1의 발현이 증가하였으나. 라미닌 단백질의 수준은 변 화가 없었다 (도 26A). 따라서 , 상기로부터 라미닌 및 라미닌 γ 2는 TM4SF5 단백질 에 의존적으로 발현이 증가함을 알 수 있었다.

또한, 상기와 같은 신호전달 기전에서 라미닌의 위치를 확인하기 위해. 상기 분리된 간조직에 라미닌을 처리하여 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행 하였다. 그 결과, 도 26B에 나타난 바와 같이, 라미닌에 의해 STAT3 단백질의 발 현 수준은 변화하지 않았다 (도 26B). 따라서 , 상기로부터 TM4SF5 단백질이 STAT3 단백질의 인산화를 통해 라미닌의 발현을 조절함을 알 수 있었다.

또한, 상기 분리된 간조직에 c-Si'c 단백질의 저해제인 PP2 X

Laboratories , 미국) 또는 대조약물 (control compound)인 PP3(LC Laboratories, 미국)를 첨가하여. 그에 따른 단백질의 발현 변화를 상술한 바와 같이 웨스턴 블 롯으로 확인하였다. 그 결과, 도 26C에 나타난 바와 같이 . PP2에 의해 STAT3 단 백질의 인산화 및 라미닌 단백질의 발현이 억제되었다 (도 26C).

나아가. HepG2 (한국세포주 은행, 서을) 간암 세포를 이용하여 , TM4SF5 단백질의 발현을 억제하였을 때, STAT3 단백질의 인산화 및 라미닌 단백질의 발 현 변화를 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과, 도 26D에 나 타난 바와 같이 , TM4SF5 단백질의 발현이 억제되면 STAT3 단백질의 인산화 및 라 미닌의 발현이 억제되었다 (도 26D).

96 실시예 20. STAT3 단백질의 인산화에 의한 라미닌 단백질의 조절 기전 확 인

상기로부터 라미닌 단백질의 발현 변화를 조정하는 것으로 확인된 STAT3 단백질의 인산화가 라미닌의 프로모터를 통해 이의 발현을 조절하는지를 루시퍼 라제 분석 방법으로 확인하였다.

먼저， LAMC2 프로모터의 -1871 내지 +388( 1 kb) 및 —592 내지 +388(2.3 kb)에 해당하는 부위와 C0L1A1 프로모터의 -2865 내지 +85( 0.9 kb) , -2047 내지 +89(2. 1 kb) 및 —845 내지 +89(2.9 kb)에 해당하는 부위를 하기 표 11에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다.

【표 111

증폭된 PCR산물을 pGL3 백터 (Promega , Cat# . E1751 , 미국)에 삽입하여 컨 스트럭트를 제조하였다 (도 27k) . 한편, AML12 세포를 48-웰 플레이트에 배양하고 리포펙타민 3000을 사용하여 상기 제조된 컨스트럭트와 TM4SF5 또는 STAT3 단백

97 질을 각각 발현하는 컨스트럭트를 각각 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시퍼라제 리포터 어세이 키트 (Pi-에 iega. 미국)를 사용하여 제조서 "의 프로토콜에 따라 루시 퍼라제 활성을 측정하였다.

생쥐 간상피세포 [murine hepatocytes, AML12, (도 27B 및 27C)] 또는 인 간 간성상세포 [human hepatic stellate cells, LX2, (도 27B 및 27C)]에 발현하 는 TM4SF5 또는 STAT3 단백질에 의해 라미닌 γ2 (Lamc2, 도 27B) 또는 콜라겐 I Al (Collal, 도 27C)의 프로모터 활성을 나타내는 루시퍼라제 활성이 증가하였다. 실시예 21. B14SF5단백질의 발현 증가에 의해 발현되는 ECM의 종류 확인 일반적으로 간 성상세포에 의해 활성화되는 콜라겐의 축적으로 질병이 악 화됨이 알려져 있다. 또한, 상기 실험에 의해 콜라겐 I 및 라미닌 γ2의 루시퍼 라제 활성 정도가 다른 것으로 보아 세포 종류에 따라 다른 종류의 ECM이 발현될 것이라고 예상되어 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 간경화 조직을 이용하여 상기 서술한 바와 같이 형광염색을 수행하 였고, 그 결과, TM4SF5 단백질의 발현이 증가함으로써 . 라미닌 단백질도 손상된 간조직 주변에 발현된 것을 확인하였다 (도 28Α).

또한, 상기 네포들이 어떤 종류의 세포인지 더욱 명확하게 확인하기 위해 서 간세포 마커인 알부민. 간성상세포 마커인 α-SMA를 콜라겐 I 및 라미닌과 같 이 상술한 바와 동일한 방법으로 염색하였다. 그 결과. 도 28B 및 28C에 나타난

98 바와 같이ᅳ 콜라겐 I은 α-SMA와 같이 염낵되었고, 라미닌은 처음엔 a-SMA 및 알부민과 같이 염색되다가. 간경화가 악화되어 간경변증이되면 알부민에만 염색 되었다 (도 28B 및 28C). 이로부터 라미닌은 콜라겐과는 상이한 패턴으로 간 성상 세포보다는 간세포에서 더 많이 발현되고. 간경화에 영향을 주는 것을 확인하였 다.

한편. HepG2 세포에서 실시예 4-1과 같은 방법으로 TM4SF5 단백질의 발현 을 억제시킨 후 상기와 동일한 방법으로 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 28D 및 도 28E에 나타난 바와 같이 , TM4SF5의 발현을 낮춘 세포에서는 간성상세포를 배양하였을 때 얻게되는 배양액 (conditioned medium)를 처리하거나 HepG2 세포와 간성상세포와 공동배양을 transwell chamber (Corning, 미국, 위쪽 의 chamber에는 간성상세포 배양하고 아래 chamber에는 간상피세포 배양)에서 하 더라도 콜라겐의 발현 양은 올라가지만 라미닌의 발현 양은 올라가지 않는 것을 확인함으로써 간상피세포에서는 TM4SF5와 관련하여 STAT3의 인산화를 통해 라미 닌이 조절된다는 것을 알 수 있다 (도 28D 및 도 28E). 실시예 22. 라미닌 및 콜라겐 유전자의 억제에 의한 간경화 완화 효과 확 인

상기 실험을 통해 STAT3 단백질에 의해 라미닌 단백질의 발현이 조절되는 것을 확인하였다. 먼저. 마우스의 꼬리 정맥으로 라미닌 Y2(LAMC2) 또는 콜라겐

99 KC0L1A1) 유전자에 대한 siRNA를 주사한 뒤. CC1 ₄ 를 투여하였다. 상기 마우스로 부터 간조직을 수득하고, 이를 H&E 염색으로 염색한 결과, CCl 에 의한 간손상이 억제되었다 (도 29A). 또한, TM4SF5, 라미닌 γ2 (LAMC2) 또는 콜라겐 I αΐ ( COL 1 A 1 ) 단백질의 발현과 STAT3의 인산화가 감소하였고 (도 29B ) . TM4SF5. laminin γ2 (LAMC2) 또는 collagen I al (COLIAI), a-SMA, 및 TGFf31의 niRNA (도 29C) 발현 수준이 감소함을 확인하였다. 실시예 23. 간암동물모델에서 TM4SF5 단백질에 의한 라미닌의 조절 확인 지방간, 간경화, 지방간염 및 간경변증을 거쳐 유발된 간암 모델에서도 상기와 같은 신호전달이 적용되는지를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.

구체적으로, TM4SF5 단백질이 과발현된 52주령 FVB/N 동물모델을 1년 동 안 사육한 뒤 , 이를 희생시켜 간조직을 적출하였다. 적출된 간조직에서 TM4SF5 단백질이 과발현되고, 간조직에 nodule이 생긴 것올 확인하였다 (도 30A). 상기 간조직에서 간암 마커인 CD34, AFP, AFU, 인산화된 STAT3, 라미닌, 라미닌 γ2 및 콜라겐 I등의 발현이 증가하였다 (도 30Β 및 30Ε). 한편. 상기 간조직을 이용 하여 mRNA의 발현 수준을 확인한 결과, 지방간과 관련된 유전자의 발현은 증가하 지 않았다 (도 30C). 한편 , 상기 간조직으로부터 간암 마커인 CD34, HIFla , i67 및 cyclinD 유전자의 발현이 HIFl-a의 발현과 함께 증가한 것을 확인하였다 (도 30D). 또한, 혈액 샘플을 분석하였을 경우, AST. ALT, LDL, 및 triglyceride의

100 수준이 증가함을 확인하였다 (도 30E) 실시예 24. 간섬유화 및 간암의 동물모델에서 T14SF5 단백질 및 관련 단 백질의 발현 변화 확인

유전자 변형 마우스를 이용하여 간질환의 심화과정을 다음과 같이 확인하 였다. 구체적으로. 상기 유전자 변형 마우스에 diethylnitrosamine(DEN) 약물을 주입함으로써 간암을 유도하였다. 상기 마우스로부터 간조직을 적출하여 H&E 염 색을 수행한 결과 간암이 유발된 것을 확인하였고 (도 31A), TM4SF5 단백질의 발 현이 증가하면서 STAT3 단백질의 인산화 및 라미닌의 발현이 증가하였다 (도 31B) 또한. 상기 수득된 간조직을 이용하여 면역염색을 수행함으로써 , TM4SF5, 인산화된 STAT3 , 라미닌 (laminins), 라미닌 γ 2(laminin γ 2) 및 콜라겐

K collagen I) 단백질의 발현이 증가한 것을 확인하였다 (도 31C). 실시예 25. 간암 환자의 암조직에서 T 4SF5 단백질의 발현 변화 확인 간암환자로부터 암 조직 및 암 주변조직을 수득하여 상술한 바와 같은 방 법으로 인산화된 STAT3. 라미닌 및 콜라겐 I의 발현변화를 확인하였다. 이때, 암 주변조직은 암으로 발병되기 전 단계로서 간염, 성유화 및 간경화의 병리학적 증 상이 나타날 것으로 예상되었다. 그 결과, 도 32에 나타난 바와 같이 , 암 조직 및 암 주변조직에서 TM4SF5, 인산화된 STAT3, 라미닌 및 콜라겐 I의 발현이 증가

101 하였다 (도 32)

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