【발명의 명칭】 메티오닐 -티알엔에이 합성효소 및 선방세포 특이적 마커를 이용한 췌장암 진단 방법

【기술분야】 본 발명은 메티오닐 -티알엔에이 합성효소 (methionyl-tRNA synthetase , MRS) 및 선방세포 특이적 마커를 이용한 췌장암 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 MRS 단백질 발현 수준을 측정하는 제제 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물， 이를 포함하는 키트 및 상기 두 단백질을 이중 마커로 사용하여 췌장암 진단의 정확도를 높이는 방법에 관한 것이다.

【배경기술】 본 출원은 2017년 9월 5일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2017- 0113372호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.

암이란 주로 통제되지 않는 세포의 증식에서 시작되어 주위의 정상조직 또는 기관으로 침윤하여 파괴시키고 새로운 성장 장소를 만들 수 있어 개체의 생명을 빼앗아 갈 수 있는 질환 군을 총칭한다. 지난 10여년 동안 암을 정복하기 위해 세포 주기나 세포사멸 (apoptosis)의 조절과 발암유전자나 암 억제 유전자들을 포함한 새로운 표적을 모색함에 있어서 눈에 띄는 발전을 거듭해 왔음에도 불구하고 암의 발생률은 문명이 발달됨에 따라증가되고 있다.

이 중 췌장암은 5년 생존율이 1—4%, 중앙생존기간 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 80-90% 환자에서 진단시 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 불량하고 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로， 그 어떤 인체암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다. 현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5- 플루오로유라실， 잼시타민 (gemcitabine) , 타르세바 (tarceva)를 포함한 몇 항암제의 치료 효과는 지극히 실망적이며， 항암치료에 대한 반응율은 15% 내외에 불과하고 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 정확하고, 빠른 진단방법이 필요하다는 것을 시사한다.

한편， 병리검사 (pathological examinat ion)란 적출한 세포, 조직 또는 장기를 이용해 주로 형태학적 입장에서 질병의 근원을 해명하려 하는 검사를 의미하며, 육안적 소견의 파악， 광학， 전자현미경 검색 등의 방법으로 질병의 진단에 웅용되는 중요한 검사다. 이러한 병리검사에는 조직병리검사와 세포병리검사가 있다. 한편， 조직검사와 세포진 (cytodiagnosi s) 검사는 많은 차이를 지니며, 잘 알려진 암 마커들을 이용한 분석 실험에서 조직검사와 세포진검사 사이에는 진단 민감도， 특이도 등 그 예측 정확도에서 많은 차이를 보이는 것으로 알려졌다. 따라서 기존에 알려진 암 마커라고 하더라도 구체적인 검체 (조직 또는 세포)에 따라서 실질적으로 진단 실효성을 거둘 수 있는지는 별개의 문제로 여겨진다.

체내에서 분리된 세포를 병리학적으로 검사함에 있어서 장애가 되는 것 중에 비정형 세포 (atypical cel l )에 대한 판단의 어려움도 한몫하고 있는 실정이다. 1976년 Melamed 등이 염증성 변화는 아니면서 이형성으로 진단하기에는 미흡한 세포변화를 편평세포 비정형성으로 발표한 후, 비정형적 세포에 대한 진단， 해석 및치료방침결정에 많은 논란이 있어왔다. 따라서 이의 개선을 위하여 The bethesda system(TBS)이 제정되었고， TBS에서는 비정형적 세포 (atypical cel l )라는 용어의 사용을 염증성， 전암성 또는 종양성 세포변화로 진단할 수 없는， 본질을 알수 없는 경우 (undetermined signi f i cance)에만 극히 제한하여 사용하고 있다. 비정형 세포에 대한 치료적 방침과 관련하여 다른 견해가 있을 수 있기 때문에， 문제가 된다. 특히， 실제로 암이 진행되고 있는 상태임에도 불구하고 조직 또는 세포 수준의 검사에서 비정형 세포로 진단되거나 또는 조직 검체에서만 결과가 판정되어 나오는 경우가 상당하다는 데에 문제가 있다. 부정형의 조직 구조나 세포 형태가 염증성 병변인지 신생물인지 구분이 명확하지 않은 경우 atypi sm 또는 cel lular atypia라고 진단하는 경우가 많다. 따라서 다른 검사수단 등에 의하여 여러번 반복적인 재검사의 필요성이 따르며 이에 따른 시간적 경제적 비용이 상당히 소모되고 있는 실정이다. 췌장은 신체 깊숙이 위치하므로， 암이 췌장에 존재하는 경우 이를 검출하기가 매우 어렵다. 영상학적 검사들을 통해 수술이 가능한 췌장암일 경우 수술을 시행 받기 전 종괴에 대한 조직검사나 내시경초음파하 세포진 검사를 통해 췌장암의 확정 진단이 필요하다. 또한 수술올 할 수 없는 경우에도 항암치료나 방사선치료를 위한 조직학적 진단을 위해 조직검사나 세포진 검사가 필요하다. 췌장암을 진단하기 위한 종양 마커는 CEA (참조 값: 5.0 ng/mL) 및 CA 19-9(참조 값: 37 U/mL)가 대표적이다. 그러나, CA19-9의 경우， 췌장암 진단용마커로서는 특이도가 낮다는 문제점이 있다. 한 보고에 의하면 건강검진을 받은 사람 중에서 CA19-9 수치가 증가된 경우가 약 1% 이었는데， 증상 없이 CA19-9 수치가 상승된 사람 중에서 암이 발견된 경우는 실제 2¾>에 불과하였다고 한다. 미국 암학회 가이드라인에 따르면， 췌장암의 선별 검사에서 CA19— 9은 민감도나 특이도가 떨어진다고 판단한 바 있다.

이외에도 췌장암을 진단하기 위한 바이오 마커 개발이 활발하게 이루어지고 있으며， 그 예시로서 대한민국 특허 제 10-0819122호는 마트릴린 (matri l in) , 트랜스티레틴 (transthyret in) 및 스트라티핀 (strat i f in)을 췌장암 마커로 이용한 기술을 개시하고 있으며， 대한민국 출원공개 제 2012-0082372호는 여러 가지 췌장암 마커를 이용한 기술을 개시하고 있다. 또한， 한국 출원공개 제 2009-0003308호는 개체의 혈액 시료에서 REG4 단백질의 발현량을 검출하여 췌장암을 진단하는 방법을 개시하고 있으며， 한국 출원공개 제 2012-0009781호는 개체의 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체로부터 분리한 암 조직 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 분석방법을, 한국 출원공개 제 2007-0119250호는 정상 인간의 췌장 조직과 비교하여 인간 췌장암 조직에서 다르게 발현된 신규 유전자 LBFL313 패밀리를 개시하고 있고, 미국 출원공개 제 2011/0294136호는 케라틴 8 단백질 등의 바이오 마커들을 이용한 췌장암 진단방법을 개시하고 있다. 하지만， 상기한 마커들은 마커마다 그 진단 효율 및 정확성에서 큰 차이를 나타낸다는 한계점이 있으며， 특히 세포학적 분석 (Cytologycal analysis)방법에의 한 것이 아닌것으로서, 임상적으로 종양세포인지 또는 기타 다른질환 상태에 있는 세포인지에 대한 구별이 명확하지 않은 비정형 (atypical ) 세포의 경우 췌장암 여부에 대한 명확한 진단의 중요성이 더욱 높다고 할 수 있음에도 불구하고 이를 명확하게 판단해 줄 수 있는 마커가존재하지 않는다. 즉, 종래 보고된 췌장암 진단 마커들의 경우 세포진 검사의 적용에 있어서， 조직 검사에서와는 다르게 세포 수준의 진단에서는 민감도 및 특이도가 좋지 못하여 실효성을 거두고 있지 못하는 실정이다.

따라서， 췌장암을 진단하기 위해서는 상기 종양마커 이외에도 컴퓨터 단층촬영술 (CT) , 내시경역행 담췌간조영술 (endoscopic retrograde cholangiopancreatography: ERCP) , 초음파내시경검사법 (EUS) , 혈관조영술과 같은 고가의 철저한 검사가 요구되고 있으나, 이를 통해서도 췌장암을 정확하게 진단하는 것이 매우 어려운 실정이다. 또한， 췌장암은 진단 당시 이미 절제가 불가능한 진행암일 경우가 많고， 수술이 가능한 예는 10-15% 밖에 되지 않아 수술을 할 수 없는 환자에서 췌장암의 진단은 내시경 초음파 미세바늘 흡인술 검사를 통해 실시하고 있다. 그러나 내시경초음파 미세바늘 흡인술 검사를 통한 세포진단의 경우 수술 후 췌장암 조직에 비해 주변 구조나 세포와의 비교가 어려워 진단을 확진하는데 한계점이 있다.

이 때문에 아직까지 췌장암세포와 다른 질환 (예를 들어 췌장염)의 세포를 감별하는데 있어 주로 H&E 염색 또는 pap 염색 등 일반염색을 기반으로 하는 병리학적 진단에 의존하고 하고 있다. 그러나 상기 기존 염색방법에 의해 췌장암을 확진하는 것은 의료진의 경험과 해석기술에 따라 다른 진단이 내려지기도 하며， 특히 H&E염색 또는 pap 염색을 통한 췌장세포 관찰에서 비정형 (atypical ) 세포로 판정된 경우 췌장암인지 다른 양성 (benign)질환인지 여부에 대한 구별이 매우 어려워 환자의 질환에 대한 정확한 진단 및 치료가 빠르게 이루어지지 못하고 있다. 세포진에 대한 진단이 정확하지 않아 수술을 받을 수 있는 췌장암 환자에게 적절한 치료 * 할 수 없으며, 반대로 불필요한 수술을 방지하기도 어려운 문제점이 있다. 따라서 임상적으로 췌장암의 치료 효과를 증대시키기 위해서는 세포진에 대한 정확한 진단법이 필요한실정이다.

【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】 이에 본 발명자들은 췌장암 임상 환자들로부터 얻은 췌장세포 시료를 이용하여 세포 수준에서 보다 정확하게 췌장암을 진단할 수 있는 마커를 찾기 위해 세포학적 분석 (cytological analysis)을 면밀히 수행한 결과, 췌장 세포 시료에서 MRS(methionyl tRNA synthetase)의 (고)발현 검출을 통해 악성종양세포를 명확히 구분할 수 있으며， 특히 이러한 구분은 H&E 염색 또는 pap 염색을 이용하는 기존 세포 병리학적 검사법에 의해 비정형 세포 (atypical cel l )로 판정되어 종양인지 여부에 대한 확진이 불가능하였던 세포 시료에서도 가능하다는 것을 최초로 규명하였으며, MRS 발현과 더불어 키모트립신 (chymotrypsin)과 같은 선방세포 특이적 마커 단백질을 이중 마커 (dual marker )로 사용하면 췌장암 진단의 정확도가 더욱 현저히 상승함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은， 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여， 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료로부터 메티오닐 티알엔에이 합성효소 (methionyl tRNA synthetase , MRS) 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은， (a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 측정 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현되면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는， 췌장암 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은， 췌장암에 대한 세포진 (cytodiagnosi s) 검사 또는 조직 검사에 있어서， 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 민감도 또는 특이도를 향상시키는 방법을 제공하는 것이다:

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현 증가되었으면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계.

본 발명의 또 다른 목적은， 췌장암에 대한 세포진 (cytodiagnosi s) 검사 또는 조직검사에 있어서, 형태학적 검사와 병용하여

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 선방세포 특어적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현 증가되었으면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장암세포 판별법을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는， 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 (췌장암 진단 방법)을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 메티오닐 티알엔에이 합성효소 (methionyl-tRNA synthetase , MRS) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제 및 선방세포 (acinar cel l ) 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물과 이를 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여， 잠재 환자로부터. 채취한 췌장 시료로부터 상기 MRS 단백질 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 정성 또는 정량 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명은, (a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 측정 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현되면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는， 췌장암 진단 방법을 제공한다.

췌장암에 대한 세포진 (cytodi agnosi s) 검사 또는 조직 검사에 있어서， 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 민감도 또는 특이도를 향상시키는 방법을 제공한다:

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현 증가되었으면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계 .

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 췌장암에 대한 세포진 (cytodiagnosis) 검사 또는 조직검사에 있어서 , 형태학적 검사와 병용하여

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현 증가되었으면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장암세포 판별법을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는， 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 (췌장암 진단 방법)을 제공한다.

이하본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에 개시된 내용 전반에 걸쳐서， 본 발명과 관련된 다양한 양상 또는 조건들이 범위 형식으로 제안될 수 있다. 본 명세서에서 범위값의 기재는， 별다른 언급이 없는 한 해당 경계값을 포함하는 것으로서 즉， 하한값 이상 내지 상한값 이하의 값을들 모두 포함하는 의미이다. 범위 형식의 서술은 단순히 편의성 및 간략성을 위한 것이며， 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한 ( inf lexible l imitat ion)으로서 해석되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적인 수치값들 뿐만 아니라 모든 가능한 하부범위 (subrange)를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어， 1 내지 5와 같은 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적 수치들， 예를 들어， 1， 2, 2.7， 3, 3.5， 4.3 및 5 뿐만 아니라， 1 내지 3， 1 내지 4, 2 내지 5， 2 내지 3， 2 내지 4， 3 내지 4 등과 같은 하부범위들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.

본 발명의 용어 '〜을 포함하는 (comprising)' 이란 '함유하는' 또는 '특징으로 하는' 과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서， 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 둥을 배제하지 않는다. 용어 '-로 구성되는 (consist ing of)' 이란 '〜로 이루어지는' 과 동일하게 사용되며， 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어

'필수적으로 구성되는 (essent ial ly consist ing of )' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 '췌장암 (pancreat ic cancer)' 이란 췌장에 발생한 악성 (mal ignant ) 종양 또는 암을 의미하는 것으로서， 증식속도가 빠르고 주위조직으로 침투 및 다른 기관으로 전이하는 특징을 가진 악성 (mal ignant ) 신생물올 의미한다. 상기 악성 종양 또는 암은, 성장속도가 느리고 전이되지 않는 특성을 지니는 양성 종양 (benign tumor)과 구분된다. 췌장에 생기는 암 중 90% 이상이 췌관세포에 생기며， 췌장암은 보통 췌관암 또는 췌관선암을 의미한다. 따라서 바람직하게, 본 발명에서의 췌장암은 췌관 (선)암종 (pancreat ic ductal (adeno)carcinoma)을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 진단의 목적으로 하는 췌장암은， 이것이 원발암이건 전이에 의하여 췌장에 2차 적으로 암이 생긴 것이건 그 발생원인이 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게 원발암을 대상으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 '정상' 은 악성 종양 또는 암이 아닌 상태 (Negat ive for mal ignancy, 악성종양세포 음성)를 의미하는 것으로서, 아무런 질환이 없는 완전 정상 상태， 악성 종양 (암)이 아닌 췌장염 등의 다른 질병 상태， 또는 /및 ' Benign (양성)' 에 해당하는 판정 상태를 포함하는 의미이다. 본 명세서에서 임상적인 (최종)질환 상태 판정에 있어서 'Benign' 으로 기재되는 양성 표시는 'posit ive' 로 표시되는 해당 검사법 상에서의 양성 표시와 구분되는 것으로， 상기 'posit ive' 로 표시되는 양성은 해당 검사법에서 반웅이 있는 것으로 나음 또는 해당 검사법에서 암의 가능성을 의미하는 결과가 나음을 의미한다.

췌장암 환자 중 약 5-10%는 유전 소인을 가지고 있는데， 췌장암 환자에서 췌장암의 가족력이 있는 경우는 약 7.8% 정도로 일반인에서의 췌장암 발생률 0.6%에 비해 빈도가 높다. 췌장암은 5년 생존율이 5% 이하로 예후가 매우 나쁜 암이다. 그 이유는 대부분 암이 진행된 후에 발견되기 때문에 발견 당시 수술 절제가 가능한 경우가 20% 이내이고， 육안으로 보기에 완전히 절제되었다 하더라도 미세 전이에 의해 생존율 향상이 적으며， 항암제 및 방사선 치료에 대한 반웅이 낮기 때문이다. 현재 췌장암을 진단하는 방법으로는 전산화 단층촬영 (computed tomography ;CT)이나 자기공명 영상장치 (magnet ic resonance imaging; MRI )를 사용하는 조직검사가 있으며， 영상학적인 방법인 CT 또는 MRI가 사용되나， 이는 간접적인 진단 방법이고 최종적으로는 병리학적 방법인 조직 검사나 세포진 검사를 통해 췌장암을 진단한다. 조직검사는 주변의 구조나 세포와 비교를 통해 특정 영역에 암이 있는 것으로 확진가능하지만， 세포진 검사의 경우에는 낱개의 세포를 뽑아내어 도말한 것이므로 주변 조직과의 관계를 증명할 수 없기 때문에， 조직 검사와 세포진 검사는 근본적으로 많은 차이가 있다.

최근에는 췌장암을 진단할 수 있는 임상시료로서 혈장과 같은 체액에서의 단백질 분석을 동시에 측정하여 췌장암 존재 또는 발병 가능성 여부를 판단하고 있다. 그러나， 임상적으로 혈청학적 방법은 췌장암 진단에 있어서 참고자료로서의 의미만을 지닐 뿐， 췌장암 진단에 결정적인 정보를 제공하지는 못하고 있다. 현재 췌장암과 관련되어 가장 흔히 쓰이는 종양 표지자는 카보하이드레이트안티젠 19-9 (carbohydrate ant igen 19—9: CA19— 9) 또는 암태아성항원 (carcinoembryogenic ant igen: CEA)을 들 수 있다. 그러나 CA19-9는 간염， 간경변， 췌장염과 같은 비 암성 질환에서도 혈중농도가 상승하기 때문에, 췌장암의 진단으로의 사용은 적절하지 않은 것이 알려져 있고, 췌장세포 자체에서 검출이 가능한 것이 아니라 혈액에서 검출이 되는 마커이기 때문에 췌장암 특이적이라 할 수 없다. 따라서 수술 후 CA19-9 혈청 수준을 감시함으로써 환자의 예후를 판단하기 위해 사용되고 있다. 또한 CEA의 경우에도 췌장암에 대해 충분한 민감도， 특이도, 양성 예측률 및 /또는 음성 예측률을 보이지 못하고 있어 췌장암을 정확하게 진단하는데는 한계점이 있으며， 이는 본 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.

이에 반해 본 발명자들은 췌장암에서 MRS가 (고)발현됨을 최초로 규명하였으며, 뿐만 아니라 MRS를 췌장암 마커로 이용할 시에 조직검사뿐만 아니라 세포진에서도 높은 정확도의 진단결과를 수득할 수 있음을 발견하였다. 즉， 정상 췌장 세포 (즉, 비-종양성 췌장 세포)와 대비적으로 MRS가 췌장암에서 특이적으로 고발현되며， MRS가 기존에 췌장암 마커로 많이 사용되고 있는 CEA보다도 높은 정확도로 췌장 세포 시료에 대하여 췌장암 판정이 가능하며， 특히 세포진 진단에서 기존 세포병리학적 검사 방법 (예를 들어 H&E 염색 또는 pap 염색 등)으로 확정진단이 어려운 비정형 (atypical ) 세포에 대해서도 높은 정확도로 췌장암 세포의 구별을 가능하게 한다는 현저한 효과를 밝힌 바 있다. 특히 이러한 췌장암 진단 정확도는， 키모트립신과 같은 선방세포 특이적 마커 단백질을 추가하여 이중 마커로 사용하여 진단하였을 때 현저하게 상승된 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 메티오닐 티알엔에이 합성효소 (methionyl-tRNA synthetase, MRS) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제 및 선방세포 (acinar cel l ) 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물, 및 이를 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다. 또한 MRS 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제로 구성되는 췌장암 진단용 조성물， 및 이를 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다. 또한 MRS 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제로 필수적으로 구성되는 췌장암 진단용 조성물， 및 이를 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 췌장암의 진단용 제제를 제조하기 위한 MRS 단백질 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준올 측정하는 제계 (특히, MRS 또는 선방세포 마커 단백질 각각에 대한 측정 제제)의 용도를 제공한다.

본 명세서에서 용어 '진단' 은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인 (판별)하는 것을 의미한다. 구체적으로， 본 발명에 있어서 상기 진단은 MRS 단백질의 발현 여부 또는 발현 수준을 측정하여 췌장암의 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다.

본 발명에서 'MRS' 는 메티오닐 티알엔에이 합성효소 (methionyl-tRNA synthetase)를 의미하는 것으로서， 상기 MRS는 아미노산 메티.오닌과 tRNA의 아미노아실레이션 (aminoacylat ion) 반응을 매개하는 효소이다. 본 발명의 MRS 단백질은 당업계에 공지된 MRS 아미노산 서열을 포함하는 것이라면 그 구체적 서열 및 이의 생물 기원이 특별히 제한되지 않는다. 일례로 인간에서는 MARS 유전자에 암호화되어 있으며， MRS의 서열 정보는 匪_004990(111 ^) , NP_004981.2 , P56192. 2 단백질) 등의 Genbank(NCBI ) accession number로 공지되어 있다. 바람직하게 본 발명의 MRS는 서열번호 1로 표시되는 인간의 MRS 단백질 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 본 발명의 MRS 단백질은 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 MRS는 cyto lasmi c form (cyto lasmic methionyl-tRNA synthetase)과 mi tochondrial form(mi tochondr ial methionyl-tRNA ynthetase)의 두 가지 아형 ( i soform)이 있다. 본 발명에서의 MRS는 바람직하게는 cytoplasmic form일 수 있다.

본 발명에서 용어 '발현 (express ion) '은 세포에서 단백질 또는 핵산 o 생성되는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 '단백질'은 '폴리펩타이드 (polypept ide) ' 또는 '펩타이드 (pept ide) '와 호환성 있게 사용되며， 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

상기 MRS 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는， 당멉계에 단백질의 발현수준 측정에 사용가능한 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 MRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명에서 용어 '항체 (ant ibody) '는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 ( immunoglobul in)을 의미한다. 더욱 구체적으로, 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중 (H) 쇄 및 2개의 경 (L) 쇄를 포함하는 당단백질을 가리킨다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하， HCVR또는 VH로 약기) 및 중쇄불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인， CHI , CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하 LCVR 또는 VL로 약기) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인， CL로 이루어진다. VH및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 일컬어지는 더욱 보존된 영역이 산재된 초가변성 영역 (상보성 결정 영역 (CDR)이라 일컬어짐)으로 더욱 세분될 수 있다. VH및 VL의 각각은 하기 순서: FRl , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 , FR4로 아미노- 말단으로부터 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은， 면역 체계의 다양한 세포 (예， 효과기 세포) 및 전통적인 상보 체계의 첫 번째 성분 (Clq)을 포함하여， 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본 발명에서의 항 -MRS 항체는 MRS 외에, 다른 종류의 아미노아실 티알엔에이 합성효소를 포함하는 다른 단백질에는 반웅하지 않고, MRS 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체이다. 본 발명에서 MRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 (MRS)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 항 -MRS 항체는 MRS유전자를 발현백터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고， 수득한 단백질을 동물에 주입하여 생성되는 항체를 수득하는 등의 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 MRS 항체는 MRS 전장서열 단백질을 통해 제작되는 것일 수도 있고， 또는 MRS 항원성 부위를 포함하는 MRS 단백질의 단편올 이용하여 MRS 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다. 본 발명의 항체의 구체적 서열과 그 형태는 특별히 체한되지 않으며, 다클론항체 (polyclonal ant ibody) 또는 단일클론항체 (monoclonal ant ibody)를 포함한다. 또한 상기 항체는 제공되는 면역글로불린으로서의 종류가 특별히 제한되지 않으며, 일례로 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며， 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다. 나아가 본 발명의 항체에는 MRS 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다. 또한 항원 -항체 결합성 (반웅)을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며， MRS에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편， 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab' ) , F(ab' )2, Fv, 디아바디 (diabody)， scFv등의 형태일 수 있다.

Fab( fragment ant i gen— binding )는 항체의 항원 결합 단편으로， 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab' )2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로， 두 개의 Fab가 중쇄 경첩 (hinge)에서 이황결합 (disul f ide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab' )는 F(ab' )2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment )는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. _sc Fv(single chain variable fragment )는 중쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변 영역 (VU이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디 (diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미하며， 본 발명의 목적상 항체의 단편은 인간 유래 MRS 단백질에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않는다.

본원 발명에서 상기 항 -MRS 항체 (이의 기능적 단편 포함)는 MRS 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면, 상기 항체가 MRS와 상호작용 (즉， 결합)하는 부위 등이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 MRS에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 영역의 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편일 수 있다. 더욱 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 단백질의 861 번째 내지 900번째 아미노산 영역을 포함하는 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편이 바람직할수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 췌장암 세포에 대한 MRS의 고감도의 검출 (염색)을 위해, MRS에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 영역을 에피토프로 하는 항체를 수득하고 이러한 항체가 MRS에 대한 고감도의 검출능을 제공 가능함을 확인한 바 있다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 영역의 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하는 항체는， 목적하는 특이적 결합능을 가지는 한 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 4 또는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 KCDR1) ; 서열번호 6 또는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2) ; 서열번호 8 또는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역 (VU , 및 서열번호 10 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 l(CDRl) ; 서열번호 12 또는 서열번호 24으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2) ; 서열번호 14또는 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역 (VH)을 포함하는 것일 수 있다.

상기 CDR 구성을 가지는 바람직한 일례로서， 본 발명의 항체 (이의 기능적 단편 포함)는 경쇄가변영역이 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고， 중쇄 가변영역은 서열번호 30으로 표시되는 아미노산서열을 포함할 수 있다.

상기 CDR 구성을 가지는 또 다른 바람직한 일례로서， 본 발명의 항체 (이의 기능적 단편 포함)는 경쇄가변영역이 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고， 중쇄 가변영역은 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

가장 바람직한 일례로서， 본원 발명은 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 및 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄로 이루어지는 항체를 제공한다. 또 다른 가장 바람직한 일례로서， 본원 발명은 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 및 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄로 이루어지는 항체를 제공한다.

본 발명에서 검출 제제들 (대표적으로 항체 및 이의 기능적 단편 등)은 이의 '검출 '을 위하여, 일반적으로 검출가능 모이어티 (moiety)로 표지될 수 있다. 예를 들어， 문헌 [Current Protocol s in Immunology, Volumes 1 and 2 , 1991 , Col igen등 Ed. Wi ley- Interscience , New York, N. Y. , Pubs]에 기술된 기술을 이용하여 , 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 또는 다양한 효소 -기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제 4，737，456호)와 같은 루시퍼라제， 루시페린 ( luci fer in) , 2，3-다이하이드로프탈라진디오네스， 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase) , 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP0)와 같은 퍼옥시다제， 알칼라인 포스파타제， β - 갈락토시다제, 글루코아밀라제， 라이소자임， 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제， 및 글루코스 -6-포스페이트 디하이드로게나제)， 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제)， 락토퍼옥시다제， 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들어, 문헌 [0 ' Sul l ivan 등， 1981， Methods for the Preparat ion of Enzyme—항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym . (J . Langone & Η · Van Vunaki s , eds . ) , Academi c press , N . Y . , 73： 147-166]에 기술되어 있다. 표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어， 항체는 바이오틴 (biot in)에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘 (avidin)에 선택적으로 결합하고， 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여， 항체는 작은 합텐 (hapten) (예를 들에 딕옥신 [digoxin] )과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항 -합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대， 항-딕옥신 항체) . 따라서， 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.

본 발명에서 용어 타머' 는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산 (DNA , R A, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. ^' 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라， 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력올 가지는 을리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후， 올리고뉴클레오티드의 5 ' 말단이나 3 ' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도톡， -SH, - OM , -OH또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나， 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 '선방세포 (ac inar cel l ) 특이적 마커' 란, 선방세포와 선방세포가 아닌 타 세포 간에 유의한 차이를 보이는 표지자를 의미한다. 구체적으로 선방세포에만 특이적으로 존재 (발현)하거나 또는 타 세포에 비해 선방세포에만 존재량 (발현량)이 월등히 높아， 이의 존재 (발현) 여부 또는 존재량 (발현량)을 확인함으로써 선방세포를 구분할 수 있는 객관적으로 측정이 가능한 표지자를 말한다. 이러한 표지자로서는 일반적으로 단백질, DNA, RNA 및 대사물질 등이 이용되며， 본 발명에서는 선방세포 특이적 마커 단백질이 사용되는 것이 바람직할 수 있다. 당업계에 선방세포 특이적 마커 단백질로 알려진 것이라면， 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 키모트립신 (Chymotrypsin) , 포스포리파아제 A2 그룹 IB(PLA2G1B, Phospho l ipase A2 group IB) 및 아밀라아제 A2(amylase 2A)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을사용할 수 있다.

상기 '키모트립신 (chymotrypsin)' 은 본 발명에서 당업계에 키모트립신 (특히， 인간의 것)으로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열 구성이 특별히 제한되지 않으며， 일례로 Genbank(NCBI ) accession number EAW51726.1, EAW51725.1, CAA74031.1, AAH15118.1, CAA74031.1, NP_009203.2 등으로 공지된 것을 대상으로 할 수 있다. 일례로 본 발명의 일실시예에서는 NP_009203.2(서열번호 3 참조)로 표시되는 키모트립신 단백질을 표지자로 하는 항체를 사용하여 MRS 항체와 함께 이중염색을 실시한 바 있다.

상기 '포스포리파아제 A2 그룹 IB(PLA2G1B, Phospho 1 ipase A2 group IB)' 은 본 발명에서 당업계에 PLA2G1B 단백질 (특히， 인간의 것)로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열 구성이 특별히 제한되지 않으며， 일례로 Genbank(NCBI ) accession number AAI06727.1, AAI06726.1 , AAH05386.1 , NP_000919.1 등으로 공지된 것을 대상으로 할수 있다.

상기 '아밀라아제 A2(amylase 2Α)' 은 본 발명에서 당업계에 아밀라아제 Α2(특히， 인간의 것)로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열 구성이 특별히 제한되지 않으며， 일례로 Genbank(NCBI ) accession number AAI46998.1 , AAH07060.1, BAD97183.1, AAA51723.1 등으로 공지된 것을 대상으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현수준올 측정하는 제제는， 당업계에 단백질의 발현수준 측정에 사용가능한 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있으며， 이에 대한 구체적인 설명은 전술한 항 -MRS 항체 및 ¾타머에 준한다.

본 발명의 췌장암 진단용 키트에는 MRS 단백질 또는 /및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하기 위하여, 선택적으로 상기 단백질을 각각 특이적으로 인식하는 항체 또는 업타머뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물， 용액 또는 장치가포함될 수 있다. 구체적인 양태로서 상기 키트는 웨스턴 블랏， ELISA, 방사선면역분석， ^' 방사선 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동， 면역염색법， 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법， FACS, SPR 또는 단백질 칩 방법을 수행하기 위해 필요한 공지의 필수요소 및 부수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일례로， 상기 키트는 MRS 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 목적 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차반응성이 거의 없는 (실질적으로 없는) 항체로， 단클론 항체， 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 상기 키트는 추가적으로 임의의 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 키트에 제공되는 항체는 그 자체로서 검출 가능한 모이어티로 표지될 수 있으며, 이는 전술한 바와 같다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 별도의 시약， 예를 들면， 표지된 2차 항체, 발색단 (chromophores) , 효소 (항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질， 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 키트는 잉여의 발색 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 항체와 결합된 단백질 마커만을 보유할수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.

상기 MRS 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는， 또한 MRS 유전자 (MARS)의 발현수준을 검출하는 제제를 포함하는 의미일 수 있다. 단백질 발현 수준의 증가는 상기 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 전사물 (예를들어 mRNA)의 증가가 동반되는 것이므로， 당업자라면 전술한 것과 같이 MRS 단백질 자체를 검출하는 수단 뿐만아니라 간접적으로 MRS 단백질 발현과 직접적으로 관계된 전사물들을 검출하는 수단을 사용가능함이 자명하게 이해 가능하다. 상기 MRS mRNA를 검출하는 제제는 MRS mRNA에 특이적으로 부착 또는 흔성화 (hybr idizat ion)하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 프라이머 (쌍) 또는 프로브 일 수 있다 .

또한 선방세포 (acinar cel l ) 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는， 상기 선방세포 특이적 마커 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 제제를 포함한다. 일례로 선방세포 특이적 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 검출하는 제제를 사용가능하며， 상기 mRNA에 특이적으로 부착 또는 흔성화(1 1) (^ 23 011)하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 프라이머 (쌍) 또는 프로브 일 수 있다.

상기 '프라이머' 는 짧은 자유 3-말단 수산화기 ( free 3 ' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완층용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (즉， DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며， 주형과 흔성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 층분한 상보성을 가지면 층분하다. 따라서 본 발명에서 목적 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 대상으로 하는 단백질을 코딩 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며， DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 목적 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 층분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형 (또는 센스， sense)과 반대편 (안티센스， ant isense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트 (쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.

프로브 (probe) '는. 특정 유전자의 mRNA나 cDNA( complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기 (base pai r) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지 ( label ing)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 둥을 확인할 수 있다. 본 발명와 목적을 위해서는 목적 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 흔성화 반응(11 13 (^ 2 1011)을 수행하여 목적 mRNA의 발현량을 측정함으로써 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 흔성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidi te) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 MRS mRNA와의 흔성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화， 캡화， 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형， 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트， 포스포트리에스테르， 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트， 포스포로디티오에이트 등) , 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질 ( label ing mater i al )의 결합 등이 있다.

본 발명의 진단용 키트에는 MRS 단백질 또는 /및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하기 위하여 각각에 대한 mRNA를 인식하는 프라이머 또는 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 선택적으로 포함될 수 있다. 상기 키트는 당업계에 프라이머 (프라이머쌍) 또는 프로브를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 PCR(polymerase chain react ion, 중합효소연쇄반응)， RNase 보호 분석법， 노던 블랏팅， 서던 블랏팅 또는 DNA마이크로어레이 칩용 키트 등을 포함한다. 일례로, 상기 진단 키트는 중합효소반웅을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 중합효소반웅 키트는 마커 유전자 (mRNA)에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자 (mRNA)의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서， 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 중합효소반웅 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너， 반응 완층액 (pH 및 마그네슴 농도는 다양)， 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs) , DNA 폴리머라아제 (예를 들어 Taq-폴리머라아제) 및 역전사효소， DNAse , RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPC-water )， 멸균수 등을 포함할수 있다.

또한 본 발명은 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여， 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료로부터 MRS 단백질 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 정성 또는 정량 분석하는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 피검체 시료 내의 MRS 단백질 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 췌장암 진단 방법올 제공한다. 구체적으로 상기 방법은

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 측정 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현되면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 '분석' 은 바람직하게 '측정' 을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것올 의미하는 것일 수 있으며， 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 따라서 MRS 단백질 검출은 MRS 단백질의 존재 여부 검출， 또는 상기 단백질 발현량의 증가 (상향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.

이하， 상기 방법을 각 단계에 따라 설명한다.

상기 (a) 단계는 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료를 제공하고 상기 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계이다.

본 발명의 상기 피검체란 동물， 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 상기 동물 유래 세포, 조직， 기관 등을 포함한다. 더 바람직하게는 진단이 필요한 인간 또는 환자 (pat ient ) 일 수 있다. 본 발명에서는 상기 (a) 단계 이전에 피검체 또는 잠재환자로부터 시료를 제공하는 단계를 수행할 수 있다. 본 발명에서 용어 '잠재 환자' 는 췌장암으로 의심되는 환자를 의미하는 것으로서， 임상 증상， 혈액학적 검사 또는 영상학적 검사상 등 다양한 검사들을 통해 췌장암이 있는 것으로 의심되는 환자를 의미한다. 즉， 상기 잠재 환자는 영상학적 검사상으로 췌장암 판정 가능한 환자 및 판정 불가능 환자를 포함하며， 영상학적 검사상으로 췌장암 판정이 불가능하다고 하더라도 임상 증상, 혈액학적 검사에서 췌장암이 의심되는 환자를 의미한다. 췌장암 환자에서 나타날 수 있는 임상증상으로는 복부 통증， 황달， 체중 감소 소화장애， 당뇨 등이 있으나 이러한 증상들이 췌장암에만 국한된 특이 증상은 아니다. 또한 혈액학적 검사상 황달이나 당뇨 검사 수치， CEA, CA19-9와 같은 종양표지자가 상승될 수 있다. 영상학적 검사는 복부 초음파， 복부 CT, 복부 MRI , PET-CT를 시행할 수 있으며 이러한 영상학적 검사에서 췌장의 종괴가 있을 시 췌장암을 의심하게 된다. 이러한 영상학적 검사들로서는 췌장암을 의심할 수는 있으나 췌장암을 확진할 수는 없다. 췌장암의 최종적인 확진은 병리학적 검사로 진행되며， 수술이 가능한 환자에서는 수술 후 얻어진 조직을 통해 확진되고 수술이 가능하지 않는 환자에서는 세포진 검사를 이용해 확진하게 된다. 바람직하게 본 발명의 상기 잠재 환자 (췌장암 의심환자)는 췌장암에서 일반적으로 관찰되는 증상인 복부통증， 황달， 체증감소， 소화장애, 당뇨 등의 일반증상이 있고， CT, 초음파, MRI 등과 같은 진단 장비를 통해 췌장암으로 확진할 수 없는 환자를 의미하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 잠재 환자는 넓은 부위의 침습적 조직 검사가 불가능 또는 불필요한 환자 (즉， 수술에 의한 췌장조직검사가 불가능 또는 불필요하기 때문에)로서 세포검사 (세포진)에 의존적으로 췌장암을 명확히 진단할 필요성이 있는 환자일 수 있다. 즉， 세포 수준의 분석에 의해 췌장암을 명확히 진단할 필요성이 있는 환자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 시료는 췌장암의 존재 여부를 진단하고자 하는 개체 (환자) 또는 피검체로부터 채취된 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 췌장 조직 또는 췌장 세포일 수 있다. 상기 췌장 조직은 췌관 (pancreat ic duct )을 포함하는 췌장의 모든 부위 (특히， 특히， 병변 의심부위)로부터 수득될 수 있다. 상기 췌장 조직은 일반적으로 췌장에서 생검 (biopsy) 또는 수술에 의하여 수득되는 것일 수 있다. 상기 췌장세포를 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않으며， 당업계에서 현재 인체 조직의 세포를 분리하기 위해 사용되고 있는 방법뿐만 아니라， 장래에 동일한 목적으로 개발될 새로운 방법도 포함되는 개념으로 이해된다. 바람직하게는 솔세포진 (brushing cytology) 또는 미세바늘흡입법 (Fine needle aspi rat ion(FNA) , 세침흡인법)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 내시경 초음파 미세바늘 흡입법 (EUS- FNA)일 수 있다. 본 발명에서 용어 '솔세포진 (brush cytology) 방법으로 채취 '란 통상의 세포진 솔 (cytology brush)을 이용해 췌장 특히, 췌관 표면 (특히， 환부 의심 부위)올 문질러서 세포를 채취하는 방식을 의미한다. 본 발명에서 용어 '미세바늘흡입법 (세침흡인법 ) 방법으로 분리된' 이란 세포진 (cytodiagnosis)에 통상적으로 사용되는 얇은 바늘을 이용해 병변 (췌장암 의심 부위)의 세포를 흡인하여 뽑아내는 채취 방식을 의미한다. 바람직하게 하나의 실시양태 (embodiment )에서， 상기 췌장 조직 또는 췌장 세포 시료에는 필수적으로 췌관세포가포함된다. 췌관은 췌장실질과 구분된다.

수득된 췌장 세포 또는 조직은 당업계에 공지된 통상의 시료 전처리 (예를들어 고정， 원심분리， 슬라이드에 도말 둥) 방식에 따라 전처리되어 제공될 수 있다. 바람직한 하나의 실시 양태로서, 상기 췌장 세포 또는 조직 시료는 통상의 파라핀 블톡 (paraf f in block) 또는 파라핀 절편 (paraff in sect ion) 제작법에 의해 전처리되어 실험용 슬라이드 (s l ide) 상에 제공 되는 것일 수 있다. 또한 바람직한 하나의 실시 양태로서， 상기 췌장 세포 또는 조직 시료는 통상의 액상 단층세포 슬라이드 제작법 (액상세포검사용 슬라이드 제작법)에 의해 전처리되어 준비되는 것일 수 있으며， 일례로 ThinPrep , SurePath, Cel l Prep 등을 사용하여 액상 기반 단층 부착 방법에 의해 실험용 슬라이드 (sl ide) 상에 것일 수 있다.

본 발명의 상기 췌장암 진단방법은 바람직하게 췌장 세포를 분석하는 것일 수 있다. 췌장 세포를 직접 분석하는 세포학적 분석 (Cytologycal analysi s)방법은 초직 검사와는 많은 차이가 있고, 때문에 본 명세서에서 전술한 선행기술문헌들에서 보고하고 있는 췌장암 진단방법과는 많은 차이가 있다. 또한 췌장세포 자체를 이용하기 때문에 타 장기의 종양과 흔동될 여지가 없다. 기존에 조직검사는 목적 부위를 내시경적으로 관찰하거나 암으로의 형질전환이 의심되는 조직으로부터 lg 내지 10 ⁹ cel ls 정도의 일정 영역의 조직을 채취한 후 염색 등과 같은 생화학적 방식을 통하여 암진단을 수행한다. 이러한 조직검사는 주변의 구조나 세포와 비교를 통해 특정 영역에 암이 있는 것으로 확진하기가 비교적 용이한 것으로 알려져 있다. 또한 조직 수준에서의 마커 발현형태는 주변의 정상 조직들과 전체적으로 경향성들의 비교를 통해 확진이 더 용이하다. 하지만 세포진 검사의 경우에는 낱개의 세포를 뽑아내어 도말한 것이므로 주변 조직과의 관계를 증명할 수 없어 진단에 상당한 어려움이 따르기 때문에， 세포 수준에서의 질환 진단이 큰 의미를 지닌다.

상기 '단백질의 발현수준을 측정' 하는 것은 발현 여부를 측정하는 것 (즉, 발현 유무를 측정하는 것)， 또는 상기 단백질의 질적， 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법 (분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며， 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에서 용어 '검출' 은 목적하는 물질 (본 발명에서의 마커 단백질, MRS 또는 /및 선방세포 특이적 마커)의 존재 (발현) 여부를 측정 및 확인하는 것， 또는 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 따라서 본 발명에서 용어 '단백질 검출' 은 목적 단백질의 존재 여부 검출， 또는 상기 단백질 발현량의 증가 (상향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다. 본 발명에서 단백질의 '발현 증가 (또는 고발현)' 라는 의미는 발현되지 않던 것이 발현된 것 (즉, 검출되지 않던 것이 검출된 것) 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 과발현된 것 (즉， 검출량이 많아지는 것 )을 의미한다 . 이는 음성대조군과의비교 또는 대조를 포함하는 과정을 수행함을 내포할 수 있다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.

본 발명에서 MRS 단백질 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 검출은 당업계에 공지된 단백질 발현 수준 측정법에 의한 것이라면 그 방법이 특별히 제한되지 않으나， 일례로 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 검출하거나 측정할 수 있다. 본 발명에서 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 대해서는 전술한 바와 같다. 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 공지되어있는 방법이라면 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 웨스턴 블랏， ELISA(enzyme-l inked i隱 unospeci ^' f ic assay, 효소면역분석법)， 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동， 면역염색법 (면역조직화학염색， 면역세포화학염색 및 면역형광염색 등 포함) , 면역침전 분석법， 보체 고정 분석법, F ACS (Fluorescence act ivated cel l sorter) , SPR( surface plasmon resonance) 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다. 이외에도 상기 측정 방법은, 본원 발명에서 제공하는 MRS 단백질 및 선방세포 특이적 마커 단백질 발현수준 측정 제제 및 이를 포함하는 키트에 대하여 기술된 바에 준하여 그 측정 방법이 이해된다.

기존 세포진 검사들의 경우에는 췌장암인지 또는 정상세포 (비췌장암 세포를 포괄적으로 의미하는 것으로 예를 들어 췌장염 세포 등을 포함)인지 여부가 명확하지않은 비정형 세포 (atypical cel l )로서 병리소견을 내는 경우가 많으며， 이러한경우 추가적이고 다수의 반복적인 재검을 필요로 한다. 종래 보고된 췌장암 진단 마커들의 경우 세포진 검사의 적용에 있어서, 조직 검사에서와는 다르게 세포 수준의 진단에서는 민감도 및 특이도가 좋지 못하여 실효성을 거두고 있지 못하는 실정이다. 이는 본 발명의 명세서 일실시예에서 잘 나타나 있다. 기존의 췌장암의 진단에 가장 일반적으로 쓰이고 있는 종양 마커 중 하나인 CEA의 경우， 췌장 종양세포에서 그 발현이 관찰되지 않거나 발현이 되었더라도 그 정도가 매우 약하였으며， H&E 염색결과 비정형 세포로 판단되었고 추후 최종적으로 췌장암으로 확진된 환자의 췌장 세포진 시료에 대하여 CEA가 전혀 검출되지 않았다는 것을 통해서도 나타난다. 즉, 종래 보고된 췌장암 진단 마커들의 경우， 기존 H&E 염색 등을 이용한 병리학적 세포진단 방법으로는 췌장암인지 또는 정상세포인지 여부가 명확하지 않은 비정형 세포에서 일관성 있는 발현이 나타나지 않아 명확한 진단이 불가능하지만， 본 발명에 따른 MRS의 경우에는 비정형으로 판정되는 췌장세포에서도 종양인지 여부에 대한 명확한 판단이 가능하기 때문에 보다 정확하게 췌장암을 진단할 수 있는 현저한 효과를 나타낸다. 즉， 본 발명에 따른 MRS의 경우에는 세포진 검사에 적용하여도 그 정확도가 매우 높으며， 특히 선방세포 특이적 마커와 병용되었올 때 선방세포에 의한 위양성 판단오류를 현저히 감소시키기 때문에 췌장암 진단 정확도가 현저히 상승되는 효과를 가진다.

이에 본 발명은， 상기 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하기 (예를 들어 상기 (a) 단계) 이전에, 동시에 또는 이후에 하기 ( i ) 및 ( Π ) 단계를 추가적으로 수행하여 진단 효과를 더욱 높일 수 있다:

( i ) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 세포를 세포핵을 염색하는 DAPH4' ,6-diamidino—2-phenyl indole) , 메틸렌블루 (methylene blue) , 아세트산카민 (acetocarmine)， 틀루이딘블루 (toluidine blue) , 헤마특실린 (hematoxyl in) 및 훽스트 (Hoechst )로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염색용액， 및 세포질을 염색하는 에오신 (eosin) , 크리스탈바이을렛 (crystal violet ) 및 오렌지 G(orange G)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염색 용액으로 세포 염색하는 단계; 및

( i i ) 상기 세포염색에 의해 췌장 세포를 악성종양세포， 비정형세포 (atypical cel l ) 또는 정상세포로 판단하는 단계.

상기 ( i i ) 단계에서 판별되는 비정형세포는 미확진 및 확진 불가 세포로 이해되며， 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 상기 형태학적 진단 방식의 병리검사에서 Suspicious of mal ignancy (악성 종양세포 의심 ) 판정도 모두 포함하는 의미일 수 있다. 상기 ( i ) 및 ( i i ) 단계는 형태학적 진단 방식의 기존 병리검사에 따른 세포진 (cytodiagnosis) 방법으로서, 본 발명의 일실시예에서 사용하고 있는 H&E 또는 pap 염색에 준하는 것들이다. 본 발명에서， 용어 '형태학적 진단 방식의 병리검사' 또는 '형태학적 검사' 란， 정상 세포가 암으로 변화될 때의 비정상적인 형태학적 변화를 검사하는 것을 의미한다. ^' 상기 비정상적인 형태학적 변화에 관한 구체적 검사 항목 또는 기준은， 당업계에 암세포가 가지는 형태학적 변화의 ^' 종류라면 그 구체적 내용이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 세포 군집성; 세포핵 /세포질 비율 (N/C rat io) ; 핵막의 모양 (핵막 모양의 불규칙성) ; 염색질의 뭉침 현상; 핵 내 핵소체의 출현; 및 유사분열의 출현으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 검사하는 것일 수 있다. 상기 형태학적 검사는 본 발명에서 제공하는 MRS 단백질 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현 수준을 정성 또는 정량 분석하는 것에 의해 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 (췌장암 진단 방법)과 동시에 (simultaneous) , 별도로 (separate) 또는 순차적 (sequent ial )으로 수행될 수 있다.

이에， 상기 ( Π ) 단계에서 상기 ( i ) 단계의 세포 염색결과로부터 췌장 세포 시료를 악성종양세포, 비정형 세포 또는 정상세포로 판별하 ¾ 것은 정상 세포가 암으로 변화될 때의 비정상적인 형태학적 변화에 근거하여 판별되는 것일 수 있으며， 그 구체적 판별 기준은 당업계에 잘 알려져 있다. 이때 비정형 세포란 형태학적 변화로는 악성 종양세포 (암세포) 또는 정상세포로 명확한 판정이 불가한 세포를 의미한다. 본 발명의 바람직한 일 실시양태에서， 상기 ( i i ) 단계에서 상기 ( i ) 단계의 세포 염색결과로부터 췌장 세포 시료를 악성종양세포， 비정형 세포 또는 정상세포로 판별하는 것은 바람직하게 하기와 같은 기준에 의해 수행되는 것일 수 있다: 세포가 3차원으로 도말됨; 세포핵 /세포질 비율 (N/c rat io, Nuclear to cytoplasmic rat io)이 높음; 염색질의 뭉침 현상 출현; 거친 모양의 핵막 (핵막의 불규칙 정도가 커짐) ; 핵소체의 출현; 및 유사분열의 출현으로 이루어지는 군에서선택된 두 가지 이상의 형태학적 이상을 보이는 경우에 악성 종양세포로 판정하며， 세포가 한 겹으로 도말되어 있으며 세포핵 /세포질 비율 (N/C rat io)이 작고 핵막이 매끄러운 모양일 경우에는 정상 세포로 판정하고， 세포의 변화가 악성 세포에는 미치지 못하나 정상 (benign 포함)으로 판정할 수 없는 경우 비정형 세포 (aypical cel l )로 판정한다.

상기 ( i ) 및 ( Π ) 단계를 MRS 검출 (발현수준 측정) 단계 이전에, 동시에 또는 이후에 병행하여 추가적으로 수행하게 되면， 세포수준의 검사 (즉, 세포진 검사)만으로도 매우 높은 정확도의 진단결과를 얻을 수 있는 것이 특징이다. 일례로 MRS 검출 이전에 ( i ) 및 ( i i ) 단계를 수행하는 경우에 어서, 세포염색을 통해 악성종양세포 또는 정상세포로 판단이 된 췌장 세포의 경우에는 후속적으로 수행되는 (a) 단계에서 MRS 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 발현수준 (또는 여부)을 추가적으로 재분석함으로서 보다 확실하게 췌장암인지 정상인지 여부를 판단할 수 있어 진단오류를 현저히 줄일 수 있으며， 상기 세포염색올 통해 비정형 세포로 판단이 된 경우에는 후속적으로 수행되는 (a) 단계에서 선방세포 특이적 마커 단백질과 MRS 발현수준 (여부)을 분석함으로서 종양인지 여부에 대한 명확한 판단이 가능하다.

상기 본 발명은 MRS 및 선방세포 특이적 마커 단백질의 이중 염색법을 통해 조직뿐만 아니라 세포수준의 검사에서 정확도 높은 확정 진단이 가능하다는 것이 그 특징이다. 기존에 비정형 세포로 검진결과가 나왔을 때 조직 생검을 다시 수행하여 재진단하여야 하는 번거로움이 있고， 다량의 생검을 필요로 하는 조직검사의 경우 세포진 검사 보다 시료 취득에 있어서 환자에 신체적 부담이 가중되고 뿐만 아니라 췌장암 진행 정도에 따라 다량의 조직 시료를 얻기 어려운 경우가 있는 문제점이 것을 고려하였을 때， 세포 수준에서 정확한 진단을 제공하는 본원 발명은 더욱 큰 장점을 지닌다고 할 수 있다.

상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계의 측정 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현 (발현증가)되면 췌장암 세포인 것으로 판단한다.

본 발명의 일실시예에 따르면， H&E 염색을 통해 정상세포로 판정이 된 췌장 세포에서는 MRS가 전혀 검출 (발현증가)이 되지 않았지만， 종양세포에서는 MRS가 강하게 발현 되는 것으로 확인되었다. 즉, MRS가 췌장암 진단 마커로서 사용될 수 있음을 확인한 것이다. 한편, H&E염색을 통해 비정형 세포 (atypical )로 판정이 되었으나 향후 환자를 추적 관찰하여 본 결과 최종적으로 췌장암으로 진단이 확정된 환자의 췌장세포에서도, MRS가 발현되어 검출되는 것으로 확인되었다. 한편， 췌장암의 진단에 있어서 정상세포에서는 대부분 MRS가 전혀 발현이 되지 않았지만 소수의 정상 시료에서 MRS가 발현되어 위양성올 나타내는 경우가 있는데， 이러한 위양성 판단은 정상 선방세포 (acinar cel l )에서 MRS가 고발현되는 현상에 기인함을 알아내었다. 이에 선방세포 특이적 마커로서 일례로 키모트립신 사용하여 MRS와 이중 마커 (dual marker )로 이용하는 본 발명의 이중 염색법을 개발하였다. 췌장암 세포의 경우 선방세포 마커 (키모트립신)가 발현되지 않고 MRS의 강한 발현 신호가 매우 우세하게 나타나며， 이를 통해 기존 세포진 검사에서 비정형 세포로 분류된 시료를 매우 ^' 높은 정확도로 췌장암과 비췌장암 (정상)으로 구분할 수 있다.

상기 (b) 단계는 다른 대조군 (시료)과 비교 없이도 MRS의 (고)발현 검출을 통해서 바로 췌장암 (특히， 췌관암 또는 췌관선암)의 검출이 가능한 것을 장점으로 한다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다. 췌장암 진단의 기준이 되는 MRS 검출 수준 (MRS 발현 수준， 특히 증가 수준)에 대해서는， 당업자가 선택한 측정 방법에 따라 검출 (발현)의 유무로， 혹은 검출 (발현) 정도의 등급을 나누어 결정할 수 있다. 예를 들어, 다수의 정상인과 환자의 시료에서 MRS의 발현 수준을 측정하여 데이터를 축적하고 분석함으로써 MRS 검출 (발현) 수준의 정도에 따라 정상 범주， 췌장암 발병 범주 등으로 구분하여 적절한 진단의 기준을 제공할 수 있다.

또한 상기 (b) 단계는 음성 대조군 (특히， 정상 대조군) 시료와 비교적으로 수행될 수도 있다. 따라서 상기 방법은 (b) 단계에서 또는 (b) 단계 이후에 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료로부터 검출된 MRS 단백질 수준을 음성 대조군 시료와 비교하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 정상 대조군은 검사 대상인 잠재 환자 (즉， 상기 (a) 단계에서 검사 대상이 된 환자와 동일 개체)의 췌장에서 정상인 부위로부터 채취된 췌장 시료 또는 다른 정상 개체 (췌장암이 없는 개체)로부터 채취된 췌장 시료를 모두 포함하는 의미이다. 이때 상기 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 검출된 MRS 단백질 수준이 음성 대조군 (특히， 정상 대조군) 수준보다높으면 췌장암 환자인 것으로 판단할수 있다. 이러한 대조군에 대한 정보 (예를 들어 검출강도 또는 발현강도)는 후술된 본원 발명에서 제공하는 MRS 발현수준 측정 제제 및 이를 포함하는 키트에 명시되는 형태로 제공될 수 있고, 혹은 다른 형태로 부수적으로 제공될 수 있다. 이러한 대조군에 비해 검사 대상 시료에서 MRS 반현수준이 높으면 췌장암 환자인 것으로 판단할수밌다.

하나의 실시양태 (embodiment )에서 본 발명은

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 측정 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현되면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는， 췌장암 진단 방법을 제공한다.

하나의 실시양태에서， 더욱 바람직하게 본 발명은

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 측정한 메티오닐 티알엔에이 합성효소 수준을 음성 대조군과 비교하고， 음성 대조군과 비교하여 메티오닐 티알엔에이 합성효소 수준이 발현 증가되었고 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않았으면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 췌장암 진단 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 '정상 췌장 세포' 또는 '정상 대조군' 이란 비- 종양 (암)성 췌장 세포를 의미하는 것으로， 종양 (암)이 아닌 다른 질병 (예를 들어， 췌장염 등) 상태에 있는 췌장 세포， Benign (양성) 상태의 세포 및 완전히 건강한 췌장 세포 (무질병 췌장 세포)를 모두 포함하는 의미이다. 또한 본원 발명은 전술한 (a) 및 (b) 단계를 포함하여， 비정형 세포를 암세포 (악성 종양세포)와 정상세포 (비 -암세포)로 구분하는 방법을 제공한다고 할 수 있다.

기존에 췌장암 진단을 위해서 컴퓨터 단층촬영술 (CT) , 내시경역행 담췌간조영술 (endoscopic retrograde cholangiopancreatography: ERCP) , 초음파내시경검사법 (EUS) , 혈관조영술과 같은 고가의 철저한 검사가 요구되고 있으나， 이를 통해서도 췌장암을 정확하게 진단하는 것이 매우 어려운 실정이다. 결국 췌장암의 확진을 위해서는 병리학적인 방법인 조직검사나 세포진 검사를 수행하여야 한다. 한편， 췌장암은 진단 당시 이미 절제가 불가능한 진행암일 경우가 많고， 수술이 가능한 예는 10-15% 밖에 되지 않아 수술을 할 수 없는 환자에서 췌장암의 진단은 내시경 초음파 미세바늘 흡인술 검사를 통해 실시하고 있다. 그런데 이러한 내시경초음파 미세바늘 흡인술 검사를 통한 세포진단의 경우 수술후 췌장암 조직에 비해 주변 구조나 세포와의 비교가 어려워 진단을 확진하는데 한계점이 있다. 기존 세포 병리학적 진단은 췌장암세포와 다른 질환 (예를 들어 췌장염)의 세포를 감별하는데에 주로 H&E 염색 또는 pap 염색 등 일반염색에 의존하고 하고 있다. 그러나 이러한 전통적인 일반 염색에 근거한 기존 세포병리학적 진단 방식에 의해 췌장암을 확진하는 것은 의료진의 경험과 해석기술에 따라 다른 진단이 내려지기도 하며, 또한 이러한 기존 검사들의 경우 췌장암인지 또는 정상세포 (비췌장암 세포를 포괄적으로 의미하는 것으로 예를 들어 췌장염 세포 등을 포함)인지 여부가 명확하지 않은 비정형 세포 (atypical cel l )로서 병리소견을 내는 경우가 많으며， 이러한 경우 추가적이고 다수의 반복적인 재검을 필요로 한다. 특히 H&E염색 또는 pap 염색을 통한 췌장세포 관찰에서 비정형 (atypical ) 세포로 판정된 경우 췌장암인지 다른 양성질환인지 여부에 대한 구별이 매우 어려워 환자의 질환에 대한 정확한 진단 및 치료가 빠르게 이루어지지 못하고 있다. 세포진에 대한 정확한 진단이 늦어짐에 따라 수술을 받을 수 있는 췌장암 환자에게 적절한 치료를 할 수 없으며, 반대로 불필요한 수술을 방지하기도 어려운 문제점이 있다. 따라서 임상적으로 췌장암의 치료 효과를 증대시키기 위해서는 세포진에 대한 정확한 진단법이 필요한 실정이다. 이처럼 암을 진단하기 위해 일반적으로 사용되고 있는 H&E 염색, pap 염색을 통해서는 종양인지 또는 비종양인지 구분이 매우 어려운 비정형 (atypical ) 세포에서 종양여부의 판정이 임상적으로 매우 중요한데, 이러한 비정형 세포에서 MRS의 (고)발현이 확인되면 (선방세포 제외) 종양세포로 판정할 수 있다는 점에서 매우 의미가 있다고 할 수 있다. 또한 상대적으로 많은 양의 생검을 필요로 하는 조직검사의 경우 세포진 검사보다 시료 취득에 있어서 환자에 신체적 부담이 가중되며 어떠한 경우에는 암의 진행 상태에 따라 수술이 불가 및 조직의 채취가 불가한 문제점이 있는 것을 고려하였을 때， 세포 수준에서도 정확한 진단을 제공하는 본원 발명의 진단 방법은 더욱 큰 장점을 지닌다고 할 수 있다.

췌장암 진단에 있어서， MRS 단백질 및 선방세포 특이적 마커 단백질을 동시에 마쩌로 사용하여 이들의 검출 패턴을 분석하는 본원 발명의 방식을 채용하는 경우, 조직 및 세포 수준의 검사에 있어서 진단의 민감도， 특이도， 양성 예측률 및 /또는 음성예측률이 거의 100%수준을 나타내는 것이 특징이다.

이에， 본원 발명은 췌장암에 대한 세포진 (cytodiagnosis) 검사 또는 조직 검사에 있어서， 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 민감도 또는 특이도를 향상시키는 방법을 제공한다:

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS단백질의 발현수준을 측정하는 단계 ; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현 증가되었으면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계.

본 발명에서 용어 '민감도' 란 최종 임상병리학적 진단이 췌장암인 시료 또는 환자에 대하여, 대상 검사법 (ex. 본원 발명의 검사법)을 통해 췌장암 판정이 내려진 비율을 의미한다.

본 발명에서 용어 '특이도' 란 최종 임상병리학적 진단이 정상인 시료 또는 환자에 대하여， 대상 검사법 (ex . 본원 발명의 검사법)을 통해 정상 판정이 내려진 비율을 의미한다. 구체적으로 상기 민감도， 특이도， 양성 예측률 및 음성예측률로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이 80% 이상의 수준 (80% 내지 100¾>， 바람직하게는 85% 내지 99%， 더욱 바람직하게는 90 내지 98% 수준)을 나타내는 것이 특징이다. 상기 수준의 구체적 수치는 80 ), 81%, 82%, 83%. 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%로 이루어지는 군에서 선택되는 두 개의 숫자를 경계값으로 하는 범위값올 모두 포함한다. 본원 발명의 하나의 실시양태 (embodiment )에서， 상기 수치범위 중 구체적으로 80% 및 95%의 경계값이 선택될 수 있고， 이에 따라 80% 내지 95¾» 범위에 있는 모든 값들이 본 발명에서 의도됨은 당업자에 자명하다. 또 다른 하나의 실시양태 (embodiment )에서 바람직하게 상기 민감도， 특이도， 양성 예측률 및 /또는 음성예측률이 85% 이상의 수준 (85% 내지 100%， 바람직하게는 87% 내지 99%, 더욱 바람직하게는 90 내지 98% 수준)을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 민감도， 특이도, 양성 예측률 및 /또는 음성 예측률의 향상이 정확도의 향상으로 이어지는 것임은 당업자에게 자명하다. 따라서 본 발명의 방법은 정확도를 향상시키는 방법으로 이해될 수 있으며， 바람직하게 정확도가 90% 내지 100%, 더욱 바람직하게 정확도가 90% 내지 99% 수준을 나타내는 것일 수 있다. 상기 수준의 구체적 수치는 90%， 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5% , 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 및 100%로 이루어지는 군에서 선택되는 두 개의 숫자를 경계값으로 하는 범위값을 모두 포함한다. 본원 발명의 하나의 실시양태 (embodiment )에서, 상기 수치범위 중 구체적으로 92.5% 및 99.5%의 경계값이 선택될 수 있고， 이에 따라 93.5% 내지 99.5% 범위에 있는 모든 값들이 본 발명에서 의도됨은 당업자에 자명하다. 또 다른 하나의 실시양태 (embodiment )에서 더욱 바람직하게 93¾> 내지 98%， 가장 바람직하게 95% 내지 98%수준을 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본원 발명은， 췌장암에 대한 세포진 (cytodiagnosis) 검사 또는 조직검사에 있어서 , 형태학적 검사와 병용하여

(a) 잠재 환자로부터 채취한 췌장 시료에서 선방세포 특이적 마커 단백질 및 MRS단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 선방세포 특이적 마커 단백질이 발현되지 않고 MRS 단백질이 발현 증가되었으면 췌장암 세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장암세포 판별법을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 (췌장암 진단 방법 )을 제공한다.

상기 형태학적 검사란， 바람직한 일례로 전술한 ( i ) 및 ( i i ) 단계 과정을 포함하여 수행되는 검사를 포함하여， 이러한 방식에 준하는 다른 형태학적 검사 방식들도 모두 포함하는 의미이다. 이에 대한 설명은 전술한 바를 참조로 하여 당업자라면 그 방식을 적의 선택하여 사용 가능하다. _.

상기 (a) 및 (b) 단계에 대한 구체적 설명은 전술한 바와 같으며， 이러한 단계가 보조적으로 (즉, 보조요법으로서) 수행되는 경우, 상기 형태학적 검사와 동시에 (simul taneous) , 별도로 (separate) 또는 순차적 (sequent ial )으로 수행될 수 있다. 또한， 상기 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 판별법은 형태학적 검사 이전에， 동시에 또는 이후에 수행 가능하다.

【발명의 효과】

MRS는 기존의 CEA와 같은 췌장암 마커보다 진단 정확도가 높으며， 특히 MRS의 발현과 더불어 키모트립신 (chymotrypsin)과 같은 선방세포 특이적 마커단백질을 추가의 이중마커 (dual marker)로 사용하면 췌장암 진단의 정확도가 현저히 상승된다.

【도면의 간단한 설명】 도 1은 si -MRS를 처리한 H460 세포의 세포 용출액을 사용하여， ant i-MRS 항체 (1E8 , 8A12)의 MRS 결합 강도 및 특이도를 공지의

항체 (Ab50793)와 비교한 웨스턴 블랏 결과이다.

도 2는 PANC-1 세포주 (췌장암 세포주) 및 SCK 세포주 (비췌장암 세포주)의 세포 용출액을 사용하여， 본 발명 ant i-MRS 항체 ( 1E8 , 8A12)의 MRS 결합 강도 및 특이도를 공지의 시판 MRS항체 (Abl37105)와 비교한 웨스턴 블랏 결과이다.

도 3은 1E8 항체의 다른 ARS(aminoacyl-tRNA synthetase) , AIMP 단백질에 대한 교차 활성을 확인하기 위하여 ELISA를 실시한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 8A12 항체의 다른 ARS(aminoacy卜 tRNA synthetase) , AIMP 단백질에 대한 교차 활성을 확인하기 위하여 ELISA를 실시한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 1E8 항체의 MRS+AIMP3 단백질에 대한 항체 친화력을 확인하기 위하여 수행한 SPR(Surface plasmon resonance) 실험 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 1E8 항체가 AIMP3에 대해서는 반웅성이 없음을 확인한 SPR(Surface lasmon resonance)실험 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 8A12 항체의 MRS+AIMP3 단백질에 대한 항체 친화력을 확인하기 위하여 수행한 SPR(Surface plasmon resonance) 실험 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 8A12 항체가 AIMP3에 대해서는 반응성이 없음을 확인한 SPR(Surface lasmon resonance)실험 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 PANC-1 세포주 (췌장암 세포주) 및 SCK 세포주 (비췌장암 세포주)에 대하여, 본 발명 ant i-MRS 항체 ( 1E8, 8A12)와 시판 MRS 항체 (Abl37105)를 이용하여 면역형광염색을 수행한 결과를 비교하여 나타낸다.

도 10은 임상현장에서 환자세포 시료 processing에 사용하는 Thinprep 장비 (Hologi c . Inc)를 활용하여， PANC-1 세포주로 임상조건과 유사하게 Thinprep 슬라이드를 제작하고 본 발명의 1E8 항체 및 8A12 항체의 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸다.

도 11은 정상 환자로부터 분리한 췌장세포의 H&E 염색결과， MRS의 발현여부 관찰 결과 및 CEA의 발현여부 관찰 결과를 나타낸다 (각각의 슷자는 환자코드번호) .

도 12는 췌장암 환자로부터 분리한 췌장세포에의 H&E 염색결과， MRS의 발현여부 관찰 결과 및 CEA의 발현여부 관찰 결과를 나타낸다 (각각의 슷자는 환자 코드번호) .

도 13은 H&E 염색결과 비정형 세포로 판단되었고 추후 췌장암으로 확진된 환자의 췌장 세포진 시료에 대하여 MRS의 발현여부 관찰 결과 및 CEA의 발현여부 관찰 결과를 나타낸다 (각각의 슷자는 환자 코드번호) .

도 14는 정상 췌장 조직 중 정상 선방세포 (acinar cel l )에서 MRS 발현 강도를 관찰한 결과를 나타낸다.

도 15는 정상 췌장 조직 중 선방세포 (acinar cel l )대한 H&E

보여준다.

도 16은 정상 췌장 조직 중 선방세포 (acinar cel l )대한 MRS 및 키모트립신 단백질에 대한 이중 검출을 수행한 결과를 나타낸다.

도 17은 췌장 선방세포 세포진 시료 대하여 본 발명의 이중염색법을 적용하였을 때 선방세포가 나타내는 대표적 염색 패턴 두 가지 증， MRS가 매우 미약하게 검출되고 상대적으로 키모트립신이 매우 강하게 검출되어 나타나는 패턴 양상을 보여준다.

도 18은 췌장 선방세포 세포진 시료 대하여 본 발명의 이중염색법을 적용하였을 때 선방세포가 나타내는 대표적 염색 패턴 두 가지 중, 키모트립신과 함께 MRS 검출도 상당히 나타나지만 merge 결과 상대적으로 키모트립신 검출이 강하게 나타나는 패턴 양상을 보여준다. 도 19는 기존 세포 병리검사상 (pap staining)으로 췌장암 확진되고， 최종적으로도 췌장암 확진된 환자의 췌장 세포 시료에 있어서， 본원 발명의 이중 염색법을 수행한 결과를 나타낸다.

도 20은 기존 세포 병리검사 상 (pap staining)으로는 비정형세포 (atypical cel ls)로 분류되어 확진이 불가하였으나， 최종적으로 췌장암 확진된 환자의 췌장 세포 시료에 있어서， 본원 발명의 이중 염색법을 수행한 결과를 나타낸다.

【발명의 실시를 위한 형태】 이하본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예

실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본원 발명의 췌장암 검사법에 대한 유용 항체 제작 (MRS에 대한 특이성이 높은 항체의 수득) 생체 내에서 MRS(methyonyl-tRNA synthetase)는 AIMP3(Aminoacyl tRNA synthetase com lex- interact ing mul t i funct ional protein 3)와 결합된 상태로 존재하며， UV 조사 등에 의해서 이러한 결합상태가 분리되는 것으로 알려졌다. 따라서 실질적으로 MRS의 정확한 검출을 위해서는 MRS가 AIMP3와 결합하고 있는 상태 등의 상황에서도 MRS만을 특이적으로 검출할 필요가 있으나， 현재 AIMP 종류 및 ARS 종류들에는 단백질 구조상 유사한 점이 많아서 시중 항체의 경우 다른 AIMP 및 ARS 종류들과 교차반웅성이 나타나는 문제점이 있다. 이에， 본 발명의 췌장암 검사법의 진단 정확도를 위하여, 본 발명자는 다른 단백질에는 교차반웅성이 없는 고감도의 MRS 항체를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

1-1. MRS-AIMP3 단백질 제조 대장균 (E. col i ) 상에서 MRS-AIMP3 co-pur i f ied 단백질을 정제하였으며 구체적인 실험방법은 다음과 같다. BL21DE3 strain을 이용하여 MRS (서열번호 1)와 AIMP3서열번호 40， NCBI ref . 匪_004280.4)가 발현되도록 형질전환하고， LB 배지에서 배양한 뒤 단일 콜로니를 암피실린 (ampici l in)을 포함하는 5ml LB 액체 배지에서 0D 600값이 0.6 내지 0.8이 되도록 배양하였다. 이후 ImM의 IPTG를 넣어준 다음 37 ^° C에서 3시간 동안 배양하였고， 그 다음 10분 동안 원심분리하여 세포만올 획득하였다. 세포액으로 SDS-PAGE를 실시하여 쿠마시 용액 (coomassie stain)을 이용하여 상기 단백질들의 발현을 확인하였다. 이 후， IPTG로 과발현을 유도하였던 세포액을 모아 원심 분리를 실시하여 세포를 획득하였다. imi DPBS로 세포를 풀어 준 후 초음파분쇄기를 이용하여 세포 용해하였고， 그 다음 용해된 세포로 원심분리를 실시하여 MRS-AIMP3 co-puri f ied 단백질을 분리하였다..

1-2. MRS-AIMP3 단백질의 주입을 통한 마우스 면역화 하이브리도마 세포의 제조에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여， 상기 실시예 1-1에서 획득한 MRS-AIMP3 co-puri f ied 단백질을 8~10주령 마우스 4마리의 복강 내에 1차주사하였다. 몸무게 25 내지 30g의 10주령 BALB/c 마우스들을 Orient Bio Co. (Sungnam, KyungKiDo, Republ ic of Korea)로부터 구입하였고， 동물들은 일정한 조건 (온도: 20±2 ^° C , 습도: 40~60%, 명암: 12시간 l ight/dark cycle)하에서 층분하게 적웅시킨 후에 본 연구에 이용하였다. 동물 실험은 서울대 학교의 대학 동물 관리 및 사용 위원회 지침을 준수하였다. 1차 면역화 후 마우스의 면역성을 높이기 위하여 2주 후에 동일한 용량의 MRS-AIMP3 co-puri f ied 단백질을 마우스의 복강 내에 2차 주사하였다. 그 후 1주일 후에， 세포융합 실험을 실시하기 3일 전 MRS-AIMP3 co-puri f ied 단백질을 마우스의 꼬리 정맥에 부스터 (booster) 주사하였다. 상기 면역화된 마우스를 에테르로 마취시킨 후 헤파린 처리된 주사기로 심장에서 채혈한 후， 혈액을 4 ^° C에서 하룻밤 정치시키고 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 적당히 나누어 -80 ^° C에 보관하였다.

1-3. 하이브리도마 세포 (hybridoma cel l ) 제조 먼저， 세포융합을 위해 골수종 세포 (myeloma cel l )를 준비하였다. 골수종 세포를 배양하고， 세포밀도를 2.5~5>< 10 ^11/111£로 하였다. 세포융합 24시간 전에 골수종 세포를 1/3로 회석하여 준비하였다. 상기 실시예 1-2에서 면역화된 마우스를 에테르로 마취시키고 비장을 채취하여 B 세포를 분리한 뒤， SF-DMEM2(DMEM + 2XAA)로 세척하고 세포를 용출시켰다. 세포 현탁액을 수거하여 튜브에 담고 정치시켜 무거운 덩어리들을 가라앉히고 상층액을 새 튜브로 옮긴 다음 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 비장세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 (tapping) 후 SF-DMEM2를 채웠다. B 세포와 골수종 세포를 각각 원심분리하고 세척한 다음, 세척 과정을 1회 더 반복하였다. 세척한 골수종 세포의 상층액올 제거하고 탭핑한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 또한， 세척한 B 세포의 상충액을 제거하고 랩핑한 후, LBClysis buffer) Ιπ 에 적혈구 (RBC, red blood cell)를 넣어 처리한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 그 다음， B 세포와 골수종 세포를 각각 원심분리하고， 원심분리된 B 세포와 골수종 세포의 상층액을 제거한 다음 탭핑하고 SF-DMEM2 10^를 채웠다. B 세포와 골수종 세포를 각각 e-튜브에서 100배로 회석하고 계수하여 농도를 결정하였다 [B 세포의 농도 (1X10 ⁸ , 8X10 ⁷ , 5X10 ⁷ ), 골수종 세포의 농도 (1X10 ⁷ , 8X10 ⁶ , 5 X10 ⁶ )]. B 세포와 골수종 세포는 10:1의 비율로 결정하였다. 결정된 농도의 B 세포와 골수종 세포를 튜브에 함께 넣고 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 제거한 후 알콜솜 위에 엎어 놓고 30초〜 1분 동안 반건조시키고 탭핑하였다. 여기에 PEG(2 )를 1분 동안 천천히 넣으면서 피펫팅하여 반응시키고 SF-DMEM2를 넣으면서 튜브를 흔들어준 다음 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 탭핑하지 않은 상태에서 HT 배지 [HT50X(HT( sigma) 1 vial + SF-DMEM1 lOm^) l i, FBS lOm^, SF-DMEMKDMEM + lxAA) 30 ]를 방울방울 떨어뜨리고, 조금씩 속도를 올리면서 50 가 되도록 하였다. 이 현탁액을 다시 37 ^° C, 5% C0 ₂ 배양기에서 3시간동안 배양하였다.

1-4. MRS특이적 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별 상기 실시예 1-3에서 제조한 융합세포군 중에서 MRS를 잘 인식하면서， AIMP3를 인식하지 않는 세포를 선별하고， 항체의 생성여부를 확인하기 위하여， 다음과 같이 실험을 실시하였다. 먼저, 세포융합 후 8~9일째에 배지를 교환하고, 96 웰에서 배양시 및 24 웰에서 배양시， 잘 자랄 때까지 cDMEM2에서 배양하였다. 배지를 교환한 후 5~7일째에 색이 변한 웰의 상층액을 거두고 CDMEM2로 채운 후， 각 융합세포에서 생산된 항체와 MRS 및 AIMP3와의 결합성에 대한 ELISA 시험을 수행하였다. ELISA 시험 후 웰을 선택하여 24 웰로 옮겨 배양하였다. 24 웰에서 배양한 후 다시 ELISA 시험을 수행하였다. 구체적으로는， 24 웰의 융합세포 농도를 확인하고, 96 웰 플레이트에 0.5 cel l/wel l이 되도록 15 의 배양액에 융합세포를 회석하였다. 융합세포 희석액을 각 웰당 150 씩 분주하였다. 현미경으로 검경하여 1개의 세포가 들어있는 웰올 체크하였다. 세포가 어느 정도 자란 웰의 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 각 융합세포에서 생산된 항체와 MRS 및 AIMP3와의 결합성을 확인하여 1차 스크리닝을 수행하였다. 1차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 24 웰로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하여 2차 스크리닝을 수행하였다. 24 웰에서 키운 융합세포의 흡광도 (0.D 값)를 ELISA로 확인하고， 흡광도가 1.0이 넘는 융합세포만 선택하여 25T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 MRS를 잘 인식하면서 AIMP3를 인식하지 않는 세포를 선택하였고， 최종적으로 "1E8" 및 "8A12" 클론을 확보하였다.

1-5. MRS 특이적 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양 및 항체 정제

MRS에 대한 단일클론항체는 상기 실시예 1-4에서 선택된 최종 융합세포 (하이브리.도마 세포 "1E8" 또는 "8A12" )로부터， 각각 다음의 두 가지 방법을 통해 수득될 수 있다.

1) 7-8 주령의 암컷 마우스 복강 (abdominal cavi ty)에 프리스탄 (pri stane) 500 /^를 주사하였다. 75T/C 배양 플라스크에서 배양한 융합세포를 수거하여 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 인산염 완층액에 넣고 피펫팅하였다. 프리스탄 투여 7~10일 후 상기 실시예 1-4에서 선택한 융합세포를 각각 8 X 10 ⁵ ~4X 10 ⁷ 으로 마우스의 복강 내에 주사하였다. 1~2주 후에 마우스의 복강에 복수 (asci tes)가 가득찼을 때 18G 주사 바늘을 이용하여 복수를 뽑았다. 복수를 4 ^° C에서 하룻밤 두었다가 다음날 원심분리하여 노란 지방층을 포함한 덩어리 물질을 제거하고 상층액만을 분리하였다. 분리한 상층액은 분주하여 -2CTC에 보관하였다. 상기 복수액으로부터 항체 정제를 위하예 저장액 (20% 에탄올)에 저장되어 있는 Protein A를 적당량 컬럼에 채우고 20% 에탄올을 홀려 내린 후， 5 Bed Volume의 결합 완층액 (20mM sodium phosphate , H 7.0)으로 세척하였다. 복수액을 인산염 완층액으로 적당량 회석시킨 후 Protein A 컬럼에 로딩하였다. 3 Bed Volume의 결합 완충액 (20mM sodium phosphate , pH 7.0)으로 결합한 후, 3 Bed Volume의 용출 완층액 (0.1M glycine buffer , H 3.0 2.5)으로 0.5mC씩 분획을 용출하였다. 각 분획을 의 중화 완층액 ( 1M Tris-HCl , pH 9.0)으로 중화시켰다. SDS-PAGE를 통해， 분획의 순도를 확인하였고, Ammersharm GE 컬럼으로 탈염 (desalt ing)하였다.

2) 상기 실시예 1-4에서 수득한 하이브리도마세포를 GlutaMAX(Gibco) (최종 5 mM)와 lx Cholesterol l ipid concentrate(Gibco)가 첨가된 무혈청 배지 (Thermo)에서 순응시켰다 (8A12 항체 생산 하이브리도마세포는 34-8F2로도 명명) . 이후 Cel lstack- 5 (Corning, Corning, NY)를 사용하여 최대 배양 부피 860 mL에서 배양을 수행하였다. 무혈청 배지 (Thermo)에 GlutaMAX(Gibco) (최종 5 mM)와 lx Cholesterol l ipid concentrate (Gibco)를 첨가하였으며， 초기 세포 농도는 1.4-2.0 X 10 ⁵ cel l/mL로 접종하였다. 접종 4~5일 후， 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고 배양액 상층액을 회수하였다. 상층액의 pH를 확인 한 후 제조된 20X 결합 용액 (1M Potassium phosphate dibasic) (pH 9.0)을 사용하여 pH 7.6을 맞추었다. 이후 0.22um 필터를 사용하여 여과하여 중화된 항체배양액을 수득하였다. 수득한 항체배양액을 protein A 컬럼을 통해 정제를 하였다. protein A 컬럼에 10 컬럼 부피의 증류수를 흘려준 뒤 동량의 IX 결합용액 (50mM Potassium phosphate dibasic) (pH 9.0)을 홀려주었다. 이후， 수득한 항체배양액을 흘려주어 항체를 protein A에 결합시킨 뒤 IX 결합용액 (50mM Potassium phosphate dibasic) (pH 9.0)으로 washing하였다. 그 다음， protein A 에 결합된 항체를 용출하기 위해 2 컬럼 부피의 용출 용액 (0.2M Ci tric acid)(pH 3.0)을 홀려주어 용출액을 얻었다. 1M Tris 로 중화한 뒤 항체의 농도를 280nm 흡광도에서 측정하여 확인하였다. 그 후， GE PD-10 컬럼을 생리식염수 25 ml로 평형시킨 후， 원심분리 (1000 _g , 2분) 하였다. 이후 protein A 컬럼에서 얻어진 항체 용출액 2.5 ml를， 상기 GE PD- 10 컬럼에 넣고 원심분리 (lOOOg, 2분) 하여， 생리 식염수로 용액 교환이 된 항체를 수거하였다. 항체 농도를 280nm 흡광도에서 측정하여 확인하고 분주하여 -80 ^° C에 보관하였다.

1-6. 항체의 서열정보 분석 및 클로닝 각각 1E8, 8A12 클론 발현 항체의 클로닝 및 서열 분석은 YBI0 inc . 및 앱클론 (Abclon Inc . Korea)에 의뢰하여 진행하였다. 간략하게, 먼저 1E8 또는 8A12 하이브리도마 세포에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성 하였다. 그 다음， 각각 VL, CL, VH 및 CHI에 특이적인 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 예상되는 크기의 PCR product를 agarose gel에서 정제하여 sequencing을 통해 서열을 확인하였고 Kabat numbering을 통해 CDR region올 확인하였다. 1E8 항체의 항원 결합부위 서열확인 결과를 표 1에 나타내었으며， 8A12 항체의 항원 결합부위 서열확인 결과를 표 2에 나타낸다. 확인된 서열로 Fab을 합성하여 MRS에 높은 결합력을 보임을 ELISA로 확인하였다. 또한 상기에서 확인된 서열은， 상기 실시예 1-5에서 하이브리도마 세포를 마우스 복강에 주입한 뒤 복수 정제를 통해 얻어진 항체의 단백질 서열 분석 결과 (mass spectrometry 결과)와도 일치됨을 확인하였다.

수득된 1E8 Fab 또는 8A12 Fab 서열을 각각 mouse IgG heavy chain(pFUSE- mIgG2a-Fc, InvivoGen) 및 mouse l ight chain 서열 백터 (pFUSE2-CLIg-mK, InvivoGen)에 클로닝하였다. 그 다음 상기 백터를 freestyle 293F 세포에 PEKPolysciences , 23966-2)를 이용하여 공동형질전환시켜, 항체의 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 동시에 발현되도록 하였다. 형질전환된 293F 세포를 37 ^° C , 8% C0 ₂ 조건에서 7일 동안 배양하였다. 그 다음， 세포를 수득하여 원심분리한 뒤 상층액을 수득하였다. 상층액의 pH를 확인 한 후， 제조된 20X 결합 용액 (1M Potassium phosphate dibasic) (pH .9.0)을 사용하여 상층액의 pH를 7.6으로 조정하였다. 이후 0.22 μ πι 필터로 상층액을 여과하여 중화된 항체배양액을 수득하였다. 항체배양액으로부터 상기 실시예 1-5의 2) 에서 기술된 방법으로 항체를 수득하 ¾다. 이렇게 수득된 1E8 IgG의 전체 항체는 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 및 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄로 이루어지는 것을 확인하였다. 또한 8A12 IgG의 전체 항체는 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 및 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄로 이루어지는 것을 확인하였다.

【표 1】

Amino ac id sequence DNA sequence

VH DVKLQESGPGLVNPSQSLSLTCTVTGYSIT

FR1 Gatgtgaagct tcaggagtcgggacctggcctggtgaa

(서열번호 41) tcct ctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactg gctat tcaatcacc

(서열번호 42)

[Z 표】

99C0T0/8l0ZaM/X3d CZ.Z0S0/6T0Z OAV CDR-H2 YINYNGNTNLNPSLKS Tacataaactacaatggcaacactaacttaaatccat (서열번호 24) ctctcaaaagt

(서열번호 25)

RISI IRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR

FR3 Cgaatctctatcattcgagacacatccaagaaccagt

(서열번호 61) tcttcctgcagttgaattctgtgacaactgaggacac agccacat at t actgtgcaaga

(서열번호 62)

CDR-H3 SLWPRGWFAY Tcact t tggcccaggggctggtttgcttac

(서열번호 26) (서열번호 27)

FR4 WGQGTLVTVSA Tggggccaagggactctggtcactgtctctgca

(서열번호 63) (서열번호 64)

VL FR1 DIQMTQSPSSMYASLGERVTITC gacat tCtgatgacccagtctccatcttccatgtatg

(서열번호 65) catctct aggagagagagtcac tatcact tgc

(서열번호 66)

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(서열번호 16) (서열번호 17)

FR2 WFQQKPG SP TLMY Tggt t ccagcagaaaccagggaaatctcct agaccc

(서열번호 67) tgatgtat

(서열번호 68)

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(서열번호 18) (서열번호 19)

FR3 GVPSRFSGSGSGQDYSLT I SSLEYEDMG I YYC Ggggtcccatcaaggt tcagtggcagtggatctggcc

(서열번호 69) aagat tat tctctcaccatcagcagcctggaatatga agatatgggaat ttattattgt

(서열번호 70)

CDR-L3 LQYDEFPRT Ctacagt atgatgagt t tcct cggacg

(서열번호 20) (서열번호 21)

FR4 FGGGTKLEI Ttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa

(서열번호 71) (서열번호 72)

1-7. MRS에 대한항체의 결합 특이성 비교 확인- 웨스턴 블랏 실험 상기 실시예에서 획득한 1E8 항체 및 8A12 항체의 MRS 결합능력을 확인하기 위하여 다음과 같이 웨스턴블랏 실험을 실시하였다. H460 세포를 10% FBSCFetal bovine serum, Hyclone , GE- 1 i fesciences) , 1% 페니실린 (Hyclone , GE l i fesciences)을 포함하는 DMEM (Hyclone , GE l i fesciences)배지에서 배양하였다. 각 세포는 5% C0 ₂ , 37 ^° C의 조건에서 배양하였다. 상기 배양된 H460 세포에 si -MRS를 72시간 동안 처리하였다. 그 다음 H460 세포를 수득한 뒤， 용해시킨 후， H460 세포 용해물로 웨스턴 블랏올 실시하였다. 실험은 2번 반복되었다. 1차 항체로서 1E8 항체 또는 8A12 항체를 1 : 5000(0.2 yg/ml )으로 회석하여 사용하였고， 결합능력 비교를 위하여 시중에서 유통되고 있는 MRS 항체 (Abeam, Ab50793)을 동일한 방법으로 사용하였으며, 대조군으로는 튜블린 (Tubl in)을 사용하였다. 실험 결과 도 1에 나타난 바와 같이， 시중에 유통되고 있는 기존 MRS 항체는 si-MRS를 처리한 군에서 MRS를 전혀 검출하지 못하였고， si-MRS를 비 리한 군에서도 본원 발명의 8A12 항체 및 1E8 항체와 비교하여 현저히 낮은 수준의 검출능 (MRS와의 결합능)을 보였다. 반면 본원 발명의 1E8항체 및 8A12 항체는 기존 시중 MRS 항체보다 현저히 MRS 특이적 결합능 및 감도가 뛰어난 것을 확인하였으며， 특히 8A12 항체는 매우 우수한 결합능 및 감도를 보이는 것을 확인하였다.

또한 PANC-1 췌장암 세포주와 SCK (비췌장암 세포주) 세포주를 이용하여， 1E8 항체 및 8A12 항체의 MRS 결합능력을 추가 확인하였다. 이때 대조군으로는 시판되고 있는 MRS 항체 (Abeam, Abl37105)를 사용하였으며 (항체들은 1 : 1000로 회석하여 사용하였다. 0.137/ /πι1 ) , si -MRS를 처리하는 과정은 제외하고 전술한 바와 동일한 방식으로 웨스턴 블랏 실험을 수행하였다. 실험결과 도 2에서 보는 바와 같이, 본원 발명의 1E8 항체 및 8A12 항체는 MRS 특이적으로 검출을 수행하였으나, 동일 조건에서 기존 시판항체 Abl37105 항체는 비특이적 밴드가 많이 나타나는 것으로서 선택적 검출능이 매우 떨어지는 것으로 나타났다. 본 실험 조건하에서는 SCK 세포주 (비췌장암 세포주)에서 MRS는 거의 검출되지 않았다.

1-8. 다른 단백질에 대한 교차반응성 여부 확인 - ELISA 상기 실시예에서 획득한 8A12 항체가 다른 ARS(aminoacyl-tRNA synthetase) 단백질에 대한 교차 활성 (cross act ivity)이 있는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

96 웰 플레이트 (Corning 3690 f lat bottom, 96-wel l hal f-area plates)에 MRS 단백질 (His-MRS, MRS ful l )과 다른 ARS 단백질 (DX2 tag free , 34S-DX2, 34S- AIMP2, His-CRS, His-AIMPl, His-GRS, His.-WRS, His— KRS)을 각각 1 yg/ml의 농도로 코팅하였다. 1E8 항체 또는 8A12 항체를 500 ng/ml 농도로 각각의 ARS 단백질이 코팅된 96웰 플레이트에 넣은 뒤 1시간 동안 반응시켰다.. 그 후 HRP-conjugated ant i -mouse IgG 2차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰고， ELISA를 실시하여 450nm에서 . 흡광도를 측정하였다. 기질로는 ΤΜΒ(3,3' ,5, 5' -

Tetramethylbenzidine)을사용하였다. 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 , 1E8 항체는 MRS에만 결합하여 반응하고, 다른 ARS 단백질과 AIMP 단백질에는 반응하지 않는 것으로 나타났다. 또한 도 4에 나타난 바와 같이, 8A12 항체는 MRS에만 결합하여 반웅하고, 다른 ARS 단백질과 AIMP 단백질에는 반웅하지 않는 것으로 나타났다. 이를 통해， 1E8항체 및 8A12 항체는 다른 ARS 단백질과 AIMP 단백질에 대하여 교차 활성이 없으며， MRS만 특이적으로 검출하는 것을 확인할 수 있었다.

1-9. 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 항체 친화성 확인

1E8 항체 및 8A12 항체의 MRS 특이적 친화성을 확인하기 위해， MRS-AIMP3 co-puri f ied 단백질 (이하, MRS+AIMP3 단백질) 및 AIMP3 단백질을 이용하여 SPRCSurface plasmon resonance, 표면 플라즈몬 공명) 실험을 실시하였다. MRS+AIMP3 또는 AIMP3 단백질을 CM5 chip에 코팅하고， 1E8항체 또는 8A12 항체를 다양한 농도로 흘려보내면서 단백질과의 결합 반응 정도를 측정하였다. 분석시료나 버퍼는 30 ii l/min의 유속으로 8분 동안주입하였고， 20분 동안 세척하였다. 그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이， 1E8 항체는 MRS+AIMP3 단백질에는 결합하나 AIMP3 단백질에는 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한 1E8항체는 MRS에 대하여 5.42nM KD value를 갖는 것을 확인할수 있었다 또한 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이， 8A12 항체는 MRS+AIMP3 단백질에는 결합하나 AIMP3 단백질에는 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한 8A12 항체는 MRS에 대하여 1.56nM KD value를 갖는 것을 확인할 수 있었다.

1-10. MRS항체의 결합부위 확인 상기 1E8 항체 또는 8A12 항체가 결합하는 부위 (에피토프, main binding si te)를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험올 실시하였다. 먼저， MRS 전체 단백질에서 GST, catalyt ic domain, tRNA binding domain 부위들을 고려하여 각각 길이와 위치가 상이한 여러 개의 MRS 단편을 제작하였으며， pcDNA3 vector (EV)에 MRS 전체 단백질 또는 각각의 MRS 단편 (MRS fragment )을 클로닝 하였다. 각 MRS 단편의 위치는 서열번호 1의 MRS 전체 아미노산 서열 중에서, 1 ~ 266aa 단편， 267~597aa 단편 , l~598aa 단편 , 598~900aa 단편 , 660~860aa 단편 , 660-900 단편， 730-900 단편 등을 비롯하여 여러 가지 소단위 영역올 포함하는 위치에서 선정되었다. 이때， Myc 단백질을 각각의 펩타이드 N-말단에 결합시켰고， Myc 단백질을 대조군으로 사용하였다. 그 다음 H460 세포에， 클로닝한 백터 DNA 2 _U g을 제조사의 지침에 따라 Turbofect (Thermo)를 사용하여 트랜스펙션 (transfect ion) 시켰다. 24시간 후 세포를 수득하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 이때 1차 항체로 1E8 항체 및 8A12 항체를 1 : 5000(0.2 _U g/mL)으로 회석하여 사용하였다. 상기 실험을 통하여 1E8 항체 및 8A12 항체는 서열번호 1의 MRS 단백질 중에서 최소한 598~900aa 영역쎄 epi tope가존재하는 것으로 나타났다.

이에， 811-840aa 단편， 821_850aa 단편， 831-860aa 단편， 841-870aa 단편， 846-875aa 단편， 851-880aa 단편， 856-885aa 단편， 861-890aa 단편， 866-895aa 단편， 871-900aa 단편을 비롯하여 다양한 소단위 단편 펩타이드를 제작하고， 각각의 펩타이드를 300 ng/wel l씩 96 wel l EL ISA plate에 coat ing하여 통상의 프로토콜에 따라 ELISA를 수행하였다. 1차 항체로서 1E8 항체 또는 8A12 항체를 ΙΟηΜ 농도로 회석 ( lx PBST-Tween 0.05%)하여 사용하였으며， 2차 항체로 HRP conjugated Goat ant i -mouse IgG(Thermo)를 1 : 10000희석 ( lxPBST-TweenO .05%)하여 사용하였고， 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과， 1E8 항체와 8A12 항체는 MRS 단백질 중에서 861-900 aa 영역 (AQKADKNEVA AEVAKLLDLK KQLAVAEGKP PEAPKGKKKK, 서열번호 2)을 에피토프로 특이적으로 인식하는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과는 861-900 aa 영역을 에피토프로 인식하는 다른 결합분자 (다른 항체 및 이의 기능적 단편 등)들도， MRS 특이적 결합 및 MRS구분능이 뛰어날 것임을 시사한다. 이하에서， 본 발명자들이 신규하게 고안한 췌장암 검사법에 대하여， 상기에서 제작한 MRS 검출능이 뛰어난항체를 적용한 일 실시예를 보여준다.

1-11. 본원 발명의 ant i -MRS 항체를 이용한 췌장암 세포 염색 및 시판 항체와의 효과 대비

PANC-1 췌장암 세포주와 SCK (비췌장암 세포주) 세포주에. 대하여， 각각 1E8 항체 또는 8A12 항체를 이용하여 MRS 형광염색을 수행하였다. 이때 대조군으로는 시판되고 있는 MRS 항체 (Abeam, Abl37105)를 사용하였다. 구체적으로 다음과 같은 과정으로 염색을 수행하였다. 슬라이드 상에 준비된 각각의 대상 세포에 0.2% tween 20을 포함하는 PBS를 처리하여 투과성.을 증가시킨 뒤 , 2% goat serum 으로 1 시간 동안 블록킹 (blocking)처리하였다. 1차 항체로서 본 발명의 항체들 (1E& 항체 또는 8A12 항체， Oncotag社 제작) 또는 Abl37105 항체 (Abeam)를 l y g/ml 37 ^° C 1시간동안 처리하고， 0.05% TBSTC500 μ ΐ )로 3회 세척하였다. 그 후 형광 물질이 결합되어있는 2차 ant ibody로서 Al exa-488-con j ugat ed secondary _. ant i id ies (구입처: Molecular probes , Cat . No. A11001)를 1 : 100으로 회석하여 상온의 어두운 곳에서 1 시간 동안 처리하고， 0.05% TBSTC500 μ ΐ )로 3회 세척하였다. DAPI가 첨가되어있는 마운팅 솔루션 (Pro mg Gold ant i fade regent with DAPI/ Molecular probes , Cat . No. P36931)을 슬라이드 상의 조직에 20 μ 1 처리 후 커버슬립 (coversl ip)을 덮고， 공초점레이저 현미경 및 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 9에서 보는 .바와 같이， 상기 실시예 1—7에서 MRS 특이성이 떨어지는 것으로 확인되었던 시판 Abl37105 항체는 PANC-1 췌장암 세포와 SCK 세포 (비췌장암 세포) 모두를 비특이적으로 염색하였으나, 본원 발명의 1E8 항체 및 8A12 항체는 MRS 만을 특이적으로 염색할 수 있음을 확인하였다.

또한 임상현장에서 환자세포 시료 processing에 사용하는 Thinprep 장비 (Hologic . Inc)를 활용하여， PANC-1 세포주로 임상조건과 유사하게 Thinprep 슬라이드를 제작하여 (하기 실시예 2 참조)， 본 발명의 1E8 항체 및 8A12 항체의 염색효과를 확인하였다. 그 결과 도 10에서 보는 바와 같이， 본원 발명의 1E8 항체 및 8A12 항체는 임상현장에서 흔히 사용되는 시료제공방법 (Thinprep 슬라이드 등)과 함께 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 2: 세포진 (cytodiagnosis) 검사법에 있어서, 췌장암세포 특이적 MRS 발현 검출법 (염색법)의 정립 및 효과 확인

실험방법

1) 검체로서 췌장 세포를， 통상적인 내시경초음파 세침홉입술 (EUS-FNA)에 따라 수득하였다. 먼저， 내시경초음파 기기 ( _a l inear array echoendoscope EUS, 제품명; GF-UCT140 또는 GF-UCT180 , 회사: Olympus , Japan)를 위나 십이지장으로 진행하고 내시경 선단에 장착된 초음파 장비를 이용하여 췌장 종괴를 초음파 영상으로 확인하였다. 초음파상으로 조준된 종괴에 대해 세침흡입을 위한 바늘 (제품명 : 22G Echo-ultraTM, 회사: Cook Medical , Cork, Ireland)을 진입하여 췌장 세포를 채취하였다. 그 후， 상기 채취된 췌장 세포를 Cellient Automated Cell Block System (Hologic)를 이용하는 통상적인 방법 (Antonio Ieni et al .， Cell-block procedure in endoscopic ultrasound一 guidedᅳ fineᅳ needle一 aspiration of gastrointestinal sol id neoplastic lesions, World J Gastrointest Endosc 2015 August 25; 7(11): 1014-1022)으로 파라핀 절편 (Cellient paraffin sections)으로서 슬라이드 상에 제공되었다. 또한 상기 췌장 세포 시료는 ThinPrep (Hologic. Inc)을 이용하여 통상적인 방법으로 ThinPrep 슬라이드에 도말하거나 direct smear하여 제공될 수 있다 (de Luna R et al., Comparison of ThinPrep and conventional preparations in pancreatic fine-needle aspiration biopsy. Diagnostic Cytopathology, 2004 Feb;30(2):71-6.). 이들 세포 시료는 각각 하기의 검사법을 적용하여 결과가 비교되었다.

2) 기존 세포학적 검사 방식에 의한 병리소견 (Conventional pathologic cytology)은 현재까지 흔히 사용되고 있는 H&E staining 방법을 이용한 염색 결과에 의하여 내려질 수 있다. 상기 H&E staining은 hematoxylin 및 eosin을 통상적 프로토콜에 따라 사용하여 수행되었다 (하기 실시예 3의 상세 프로토콜 참조). 또한 Pap staining 방법을 통한 염색 결과에 의하여 내려질 수 있다. 상기 Pap staining은 hematoxylin, 0G-6( Orange G—6), eosin azure를 통상적 프로토콜에 따라 사용하여 수행되었다 (하기 실시예 3의 상세 프로토콜 참조). 파라핀 절편 시료를 이용하는 경우에는， 통상적인 방법으로 파라핀 제거 및 수화 (hydration)를 진행한 후 염색 물질들을 처리하였다. 슬라이드 상에 세포가 한 겹으로 도말되어 있으며 세포핵 /세포질 비율 (N/C ratio)이 작고 핵막이 매끄러운 모양일 경우 양성 (benign, 정상) 세포로 판정하고， 세포가 3차원으로 도말되며 세포핵 /세포질 비율이 높고 염색질의 뭉침 현상이 보이며 핵막이 거친 모양이고 핵소체 및 유사분열이 출현할 경우 악성종양 세포로 판정하며， 세포의 변화가 악성 세포에는 미치지 못하나 양성 (benign)으로 판정할 수 없는 경우 비정형 세포 (atypical cell)로 판정한다. 3) 임상적 최종 진단 결과는 영상학적 검사 (복부 초음파， 복부전산화 단층촬영， 복부 자기공명영상， 내시경역행 담췌간조영술， 양전자방출 단층촬영)와 병리학적 검사 (세포진 검사， 조직검사)에 의하여 측정된 결과들에 의하여 의사가 종합적으로 최종 판단하였다.

4) 본 발명자들은 췌장암 세포와 정상 췌장 세포 (암이 아닌 양성 (benign) 췌장염 세포 포함)에서의 MRS 발현도를 측정하기 위한 면역조직화학법 (특히， 면역형광염색)을 하기와 같이 개발하였다. 구체적으로， 상기 파라핀 절편을 사용하는 경우， 다음과 같이 처리하였다.

① 파라핀 제거 : 60 ^° C 오븐에서 파라핀을 녹임

② 수화 (Hydrat ion) : 자일렌 (Xylene)으로 5분씩 3번 세척， 100% 에탄올로 2분 세척， 95% 에탄을로 2분 세척， 90% 에탄을로 2분 세척， 70% 에탄을로 2분 세척， D.W로 2분 세척， PBS로 5분 세척

③ 투과성 (peraeabi l ize) 증가 처리: 0.2% Triton X-100으로 30분간 처리하고 PBS로 5분 세척

④ 전처리: 2% goat serum으로 1 시간 동안 블록킹 (blocking)

⑤ 1차 항체 처리: ant i -MRS 항체 (대표적으로 본 발명의 8A12 항체 사용함, Oncotag社 제작)를 1 ： 300으로 희석하여 4 ^° C에서 overnight 처리하고， PBS로 5분씩 3회 세척

⑥ 발색: 형광 물질이 결합되어있는 2차 ant ibody로서 Alexa-488-conjugated secondary ant ibodies (구입처: Molecular probes , Cat . No. A11001)를 1 :200 ~ 1 :300으로 회석하여 상온의 어두운 곳에서 1 시간 동안 처리하고, PBS로 5분씩 3회 세척

⑦ DAPI가 첨가되어있는 마운팅 솔루션 (ProLong Gold ant i fade regent with DAPI/ Molecular probes , Cat . No. P36931)을 슬라이드 상의 조직에 20 μ 1 처리 후 커버슬립 (coversl ip)을 덮었다. thinprep 슬라이드 시료의 경우에는, 파라핀 제거 과정 없이 상기 ③ 내지 ⑦의 과정을 포함하는 방법으로 처리되었으며, 상기 방법으로 준비된 표본 시료는 공초점 레이저 현미경 및 형광 현미경으로 관찰하였다. 상기 표본 시료에서 양성 세포 샘플 (PANC-1 , 도 15 참조) 및 음성 세포 샘플 (CT-26 , 도 16 참조)을 기준으로 MRS 염색 강도를 판단하였으며， 음성 대조군에 비하여 2배 이상 증가한 세포를 췌장암 세포인 것으로 판단하였다. 이러한 결과를 이러한 결과를 상기 검체에 대한 병리 소견 및 임상적 최종 진단결과와 비교하여 진단의 정확성 (민감도 및 특이도)을 확인하였다.

실험결과 구체적 실험결과는 하기 표 3, 표 4 및 표 5에서 보는 바와 같다. 정상 (Benign) 췌장 세포 시료 14개 및 췌장암 (Mai ignancy) 세포 시료 94개를 대상으로 본원 발명의 MRS 염색을 통한 췌장암 판별 방법을 적용한 결과， H&E staining 방식을 사용하는 기존 세포병리학적 검사 결과는 민감도가 75.5% 정도에 불과하였던 것과 대비하여 본원 발명의 MRS 염색은 민감도 (Sensi t ivi ty)가 92.6%로 나타났다. 특히, 기존에 세포학적 병리검사 방식으로는 비정형 (atypia)로 분류될 수밖에 없었던 세포 시료에 대해서도 췌장암 여부의 판별이 가능하였기 때문에， 기존 세포학적 병리검사로는 음성예측율 (NPV)이 36% 수준이었던데 반해서 MRS 염색올 통해서는 음성예측률이 현저히 높아지는 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 췌장암에 있어 MRS를 마커로 이용하는 본 발명의 염색법은 세포 수준에서의 진단에서도 높은 판별능 (진단능)을 가짐을 보여주는 것으로, 후술하는 실시예 3에서 보이는 바와 같이 기존에 상용의 췌장암 마커들 (CEA와 같은 공지의 최장암 마커)이 세포 수준의 진단 (즉， cytodiagnosis)에서는 실효성을 나타내기 어려웠던 것과 명확히 구별되는 것이었다.

【표 3】 비교 상세: 최종 임상병리학적 진단 결과 대비, 기존 세포학적 검사 결과 (convent ional pathologic cytology)와 본원 발명의 MRS 면역염색을 통한 검사 결과 비교

Final MRS immunostaining

Conventional pathologic

clinicopathological

cytology Posi t ive Negat ive

diagnosis Malignancy (n=43) 42 1

Malignancy

(n=43)

Benign (n=0) 0 0

Malignancy (n=28) 26 2

Suspicious of malignancy

(n=29)

Benign (n=l) 1 0

Malignancy (n=18) 17 1

Atypical

(n=21)

Benign (n=3) 2 . 1

Malignancy (n=5) 2 3

Negative for malignancy

(n=15)

Benign (n=10) 2 8

【표 4] 비교 요약: 최종 임상병리학적 진단 결과 대비， 기존 세포학적 검사 결과 비교 (상기 표 3의 기존 세포학적 검사 결과에서 positive for mali nancy 판정 및 suspicious malignancy판정은 최종 positive로 분류하고， Atypia판정 및 Negative for malignancy판정은 최종 negative로 분류함)

PPV: positive predictive value, NPV: negative predictive value

【표 5] 비교 요약: 최종 임상병리학적 진단 결과 대비， 본원 발명의 MRS 면역염색을 통한 검사 결과 비교 Final cl inicopathological diagnosis

Malignancy Benign

Positive 87 5

MRS immunostaining

Negative 7 9

Sensitivity: 92.6% Specificity: 64.3% Accuracy= 88.1% PPV: 94.6% NPV: 56.3%

PPV: positive predictive value, NPV: negative predictive value 실시예 3: 세포 수준에서, 상용 췌장암 마커 CEA와 본원 발명의 MRS의 췌장암판별능 비교

실험방법

1) 환자군 및 세포진 (cytodiagnosis)을 위한 췌장 세포 시료의 수득

26명의 췌장암 의심 환자에서 내시경 초음파하 세포흡입시술 (미세바늘흡입법， Fine needle aspiration)로 채취 및 수득된 췌장세포 시료 26례로 연구를 실행했으며 본 연구는 강남세브란스병원 연구윤리위원회의 승인을 받았다. 상기 환자들로부터 췌장 세포 시료는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로, 내시경초음파 세침흡입술 (EUS— FNA)을 통해 수득되었다. 그 후 채취된 췌장 세포를 Cellient Automated Cell Block System Otologic)를 이용하는 통상적인 방법으로 파라핀 절편 (Cellient paraffin sections) 상태 혹은 Thinprep 방식으로 준비하였다 (실시예 2참조).

26명의 췌장암 의심환자는 추적 관찰을 통해 췌장암 (13례), 정상 췌장 (13례)으로 최종 진단되었다. 상기 췌장암으로 최종 진단된 13명의 환자들 중 병리학자에 의한 조직학적 관찰에 의해 췌장암 세포로 구분이 된 것은 7 례였고， 나머지 6 례는 조직학적 관찰에서는 비정형세포로 구분이 된 환자였으며 추적관찰을 통해 최종적으로는 췌장암으로 진단이 된 환자군이었다. 췌장세포 채취 시 환자로부터 서류에 의한 동의를 받았으며 췌장암 세포， 비정형세포, 정상세포는 병리학자에 의해 조직학적으로 확인되었다 (실시예 2의 판단기준 참조). 수득한 26례의 샘플 중 정상세포， 종양세포 및 비정형세포의 각 유형 별로 대표적인 진단사례를 각실험별 도면에서 보여준다. 2) 기존 세포진 염색 방법

H&E 염색: 파라핀 절편 시료는, Xylene으로 5분씩 3번 처리， 100% 에탄올 2분 처리, 95% 에탄을에서 2분 처리, 90% 에탄올에서 2분 처리， 70% 에탄올에서 2분 처리， 수듯물에서 10분간 처리를 각각 실시하여 Paraffin 제거와 Hydration올 실시하였다. 상온에서 hematoxyline을 30초 간 반웅시키고， 수듯물로 10분간 세척하였다. 상온에서 _eos i _n 올 1분간 반응시키고, 수듯물로 10분간 세척하였다. 70% 에탄올에서 1분, 90% 에탄을에서 1분， 95% 에탄을에서 1분， 100% 에탄을 1분， Xylene 5분씩 3번 처리를 실시하여 dehydration과 clearing을 실시하였다. Mounting solution을 슬라이드 조직에 떨어뜨린 후 coverslide로 세포를 덮은 다음 샘플을 광학 현미경으로 관찰하였다.

pap 염색: Papanicolaou stain 은 Thermo Scientific의 Varistain 24-4 염색기를 사용하여 기기에 '내장돤 프로토콜에 따라 시행하였다. 프로토콜은 하기 표 6과 같다.

【표 6】 reagent programl program2

1 water 10분 10분

2 Hema. 1분 30초 1분 30초

3 water 30초 30초

4 water 30초 30초

5 0.5% Hcl. 7초 7초

6 0.5% Amm. 5초 5초

7 water 30초 30초

8 50% ale. 30초 30초

9 70% ale. 30초 30초

10 80% ale. 30초 30초

11 95% ale. 30초 30초 12 0G 6 1분 10초

13 95% ale . 30초 30초

14 95% ale . 30초 30초

15 EA 50 1분 10초

16 95% ale . 30초 30초

17 95% ale . 30초 30초

18 95% ale . 30초 30초

19 99% ale . 30초 30초

20 99%+xyl . 20초 20초

^' 21 xyl . 30초 30초

22 xyl . 30초 30초

23 xyl . 30초 30초

24 xyl . 30초 30초

25 end.

3) 기존 염색법에 의한 형태학적 병리검사에 따른 세포진 (cytodiagnosis)에서 판별 기준 악성종양을 형태학적으로 진단하려 할 때 가장 결정적인 증거는 주변 정상 조직으로 침윤성 성장을 한다는 것이지만， 암조직과 주변 조직의 관계를 증명하기 용이한 조직검사와는 달리, 세포진 검사의 경우 낱개의 세포를 뽑아내어 도말한 것이므로 주변 조직과의 관계를 증명할 수 없다. 따라서 차선책으로 개개 세포의 비정형성 (atypia)을 평가하게 되는데 이 때 비정형성이라 함은 세포의 핵 (nucleus)이 커지고 세포질 (cytoplasm)은 줄어들어 세포핵 /세포질 비율 (Nuclear to cytoplasmic rat io, N/c rat io)이 커지는 것; 염색질 (chromat in)이 핵 내에 균등하게 분포되지 않고 부분적으로 뭉치는 현상 (clumping) , 핵 내 핵소체 (nucleolus)의 출현, 유사분열 (mitosis) 출현 등을 말한다. 이들 비정형성의 소견이 모두 나타나고 정도가 현저할 때 세포진 검사로도 악성종양을 진단하는 것이 가능하지만, 이들 소견이 부분적으로 나타나거나 정도가 미약할 경우에는 비정형세포 (atypical cel l )로 분류하여야 한다. 심한 염증 등 양성병변에서도 이와 같은 소견이 부분적으로 나타날 수 있기 때문이다. 반대로 이와 같은 소견이 어느 것도 보이지 않을 경우는 정상 세포로 판정할 수 있다. 물론 세포를 채취한 부위에서 관찰될 수 있는 세포라는 것이 전제되어야 한다.

4) 공지의 상용 췌장암 마커인 CEA와 본원 발명의 MRS를 이용한 비교 염색

MRS에 대한 면역염색은 상기 실시예 2에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다 CEA에 대한 면역염색의 경우， 1차 항체로서 Carcinoembryonic Ant igen(CEA) ant ibody (구입처: Dako, Cat . No . M7072)를 이의 최적 처리 조건으로 사용한 것 이외에는 실시예 2와 동일한 과정으로 수행되었다.

5) 통계분석 실험결과는 최소 3회 이상의 독립적인 실험결과를 바탕으로 평균士 표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 다수의 그룹 간의 차이 관찰을 위해 Student ' s t test를 활용하여 데이터를 분석하였다. P-value가 0.05 미만일 때의 실험결과가유의성이 있는 것으로 판단하였다.

실험결과

3-1. 정상세포의 면역염색 정상환자 또는 췌장암 환자의 췌장으로부터 EUS-FNA 방법으로 분리한 세포를 H&E 염색을 통해 분석한 결과， 정상으로 판단된 세포를 MRS 또는 CEA 항체를 이용하여 면역형광염색을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이， 네 명의 환자로부터 수득한 췌장세포는 H&E 염색에서 아무런 종양소견을 나타내지 않아 정상세포로 판단이 되었으며， 상기 정상으로 판단된 췌장세포에서는 MRS 및 CEA모두 염색이 되지 않는 것으로 확인되었다.

3-2. 종양세포의 면역염색 췌장암 환자의 췌장으로부터 분리한 세포를 H&E 염색을 통해 분석한 결과， 종양으로 판단된 세포를 MRS 또는 CEA항체를 이용하여 면역형광염색을 수행하였다ᅳ 이에 대한 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이， 네 명의 환자로부터 수득한 췌장세포는 H&E 염색에서 종양세포로 판단이 되었다. 네 명의 췌장암 환자 종양세포 모두에서 MRS 염색이 강하게 나타났으며， 이는 정상세포의 MRS 염색군과 비교해 통계학적으로 유의성 있는 결과로 나타났다 (p=0.019) . 그러나 CEA 염색은 두 명의 환자 샘플에서 만 약하게 염색이 되었으며， 이는 정상세포의 MRS 염색군과 비교해 통계학적인 유의성이 없었다 (ρ=0 · 187) .

3-3. 비정형세포의 면역염색

Η&Ε염색만으로는 종양세포인지 여부를 명확히 판단하기 어려운 비정형 (atypical )세포로서, 향후 환자의 예후를 추적 관찰한 결과 최종적으로 종양으로 판명이 되었던 환자의 췌장세포를 이용하여 MRS 또는 CEA염색을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, H&E 염색을 통해서 비정형 세포 (atypical cel l )로 구분이 된 췌장세포는 종양인지 또는 정상세포인지의 구분이 명확하지 않다는 것을 알 수 있었다. 한편, 비정형 세포군에 포함된 환자들은 모두 향후 췌장암으로 확정 진단을 받은 환자들이다. 네 명의 비정형 췌장세포 모두에서 MRS 염색이 강하게 나타났으며， 이는 정상세포의 MRS 염색군과 비교해 통계학적으로 유의성 있는 결과로 나타났다 (p=0.020) . 그러나 네 명의 비정형 췌장세포 모두에서 CEA 염색이 전혀 ^타나지 않았다.

상기 실시예 3의 결과를 통해， 췌장암 의심 환자로부터 분리한 췌장세포에 H&E염색 및 MRS 염색을 함께 수행한다면, 다른 종양마커들보다 훨씬 높은 정확도로 췌장암올 진단할 수 있음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라， H&E염색으로도 종양세포인지 정상세포인지 여부를 명확히 판단할 수 없는 비정형 (atypical ) 세포에서 기존의 종양마커들 (예를들어 , CEA)은 종양인지 여부를 명확하게 구분할 수 없었지만, MRS는 이러한 비정형 췌장세포 또한 종양세포인지 여부를 상당히 높은 정확도로 명확하게 구분할 수 있다는 점에서 매우 의미가 있는 췌장암 진단 마커라 할수 있다.

실시예 4 : 정확도높은 췌장암 판별 방법 수립 _MRS 이증 염색법

4-1. 위양성 결과의 원인 탐색 상기 실시예 3에서 보는 바와 같이 MRS는 CEA 등 기존 췌장암 마커 보다 높은 정확도로 췌장암의 진단이 가능한 것으로 입증되었지만， 전술한 실시예들에서의 실험은 이미 모든 확정 판단을 가진 시료에 대하여 수행한 것이므로， 췌장암 발병 의심 환자로부터 조직 채취 후 bl ind (미지) 상태.에서 어느 정도의 정확성을 가지고 진단가능한지 확인할 필요가 있다. 또한 상기 실시예 2에서 보는 바와 같이， MRS는 췌장암 진단에 있어서 매우 우수한 민감도를 나타내지만, MRS를 단독으로 췌장암을 판단할 시에 민감도에 비하여 특이도가 다소 낮은 경향을 보였다. 이에 본 연구자들은 새로운 환자들로부터 수득한 췌장 시료에서 MRS의 췌장암 판별능을 시험하던 중 세포조직병리검사상 negat ive (비췌장암)로 나타난 10건의 샘플 중에서 3건의 샘플에서 MRS 발현이 나타나는 듯한 모습올 관찰하였다. 즉， 정상 췌장 세포 시료에서 MRS 발현도가 높은 경우가 있어 위양성 (췌장암이 아닌 것을 췌장암이 발생한 것으로 판단할 수 있는 것) 결과가 포함되는 문제가 있음을 확인하였다.

이에 전체 검체들에 대해 H&E stain으로 암조직, 정상조직을 감별한 후 다시 MRS염색을 수행하는 것을 통해서 상기 위양성 판단의 원인을 파악한 결과， 도 14에 서 보는 바와 같이 정상 췌장 조직 중 정상인 선방세포 (acinar cel l , 췌관실질에 존재하는 세포)에서 MRS 발현이 높은 상태로 있는 것을 확인하였다.

4-2. MRS진단 정확도 향상 전략수립 상기 실시예 4-1. 항목의 결과에서 보는 바와 같이 정상인 선방세포 (acinar cel l )에서도 MRS가 높은 수준으로 발현되고 있어 이의 단독으로는 췌장암 판단의 위양성률에 기여하고 있기 때문에 (즉 MRS 단독으로만 판단할 시에는 진단의 특이도가 상대적으로 낮음)， 위양성률을 줄이기 위해 MRS와 선방세포 (acinar cel l ) 특이적 마커 단백질을 이용하여 이중 염색법을 신규하게 고안하였다. 본 발명자들은 선방세포 (acinar cell) 특이적 마커 후보들 중， 일례로 키모트립신을 사용하여 선방세포에서의 염색 양상을 확인하였다. 먼저, 선방세포를 포함하는 정상 조직에 대해서 구분 가능한지， 상기 본 발명의 이중 염색 전략을 ICC(I隱 unohistochemistry) 방법으로 검증한 결과를 도 16에서 보여준다. 도 16의 조직은 도 15의 H&E 염색 이미지에서 보여주듯이 정상인 조직이다. 도 16은 이러한 정상 조직에 본 발명의 이중 염색을 수행하였을 때 나타나는 선방세포 (acinar cell)의 모습과 주변의 다른 세포들의 모습을 각각 확대하여 나타낸다. acinar cell에서만 MRS와 키모트립신이 모두 강하게 발현되어 색이 진하게 겹쳐보였고, 정상 조직의 다른 부분에서는 MRS가 검출되지 않음을 확인하였다 (도 16). 이러한 염색양상을 기준으로， 선방세포 마커 (대표적으로 키모트립신)가 고강도로 검출되는 세포 및 조직 영역은 췌장암 판별 과정에서 배제가능하다.

4-3. 이중염색법 수립 파라핀 절편 시료를 이용하는 경우에는, 먼저 6(rc 오븐에서 파라핀을 녹이고， Xylene으로 5분씩 3번 세척， 100% 에탄을 2분 세척， 95% 에탄올에서 2분 세척， 90% 에탄을에서 2분 세척， 70% 에탄을에서 2분 세척， D.W에서 2분 세척하여 Paraffin 제거와 Hydration을 실하였다.

MRS 및 키모트립신의 이중염색을 위하여 , MRS는 녹색 (Alexa Fluor 488)으로 검출되고 키모트립신은 붉은색 (Texas Red)으로 검출되도록 구체적 실험 프로토콜을 수립하였다. 먼저 0.2% Triton X-100를 처리하여 세포 투과성을 증가시켰다. blocking solution인 2% 염소 혈청으로 1 시간동안 반응시켰다. 그 후 췌장 세포 (검체)에 1차 항체인 Methionyl tRNA synthetase ant i body (1 ： 100) 및 Anti- Ant i -Chymot ryps i n ant i body (1 ： 100 회석， abeam, catalog no. abl55400)와 4 ^° C에서 overnight 반웅 시켰다. 그 후 IX TBST로 30회 이상 dipping (1회로 간주) 하여 3회 이상 세척 후 각각 Alexa Fluor 488 및 Texas Red가 부착된 2차 항체 (1:200 ~1:300 회석 / ThermoFisher Scientific, catalog no. A-11001/ SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. , catalog no. sc-278)를 어두운 곳에서 상온에 1시간동안 처리하였다. IX TBST PBS로 30회 이상 dipping (1희로 간주) 하여 3회 이상 세척 후 DAPI가 첨가되어 있는 mounting solut ion(ProLong Gold anti fade regent with DAPI, Molecular probes, Cat. No. P36931)을 슬라이드 조직에 떨어뜨린 후 coverslide로 세포를 덮은 다음 샘플을 형광 현미경으로 관찰하였다. 췌장암 판별 기준은 하기 표 7와 같이 판단하였다. 키모트립신이 검출 (발현)되지 않고 MRS 단백질이 검출 (발현)되면 췌장암 세포로 판단하였다. 즉， 본 발명의 검사상 MRS (+) 및 ACT (-)인 경우에 췌장암 Posit ive로 분류하고， 나머지의 경우에는 Negat ive로 분류한다.

【표 7] 실시예 5: 세포진 (cytodiagnosis)에 있어서， 본 발명 이중염색법의 췌장암 판별능 평가 전술한 실시예들에서 사용된 것과는 다른 피검체들로부터 수득된 새로운 췌장 세포 시료 29개에 대하여 본 발명의 이중염색법을 적용하여 췌장암을 판별하였다. 이들 췌장암 세포는 전술한 바와 동일하게 EUS-FNA 방법으로 채취되었다. 본 발명의 이중염색법을 수행하는데 있어서， 병리학적 진단 결과나 최종 임상적 진단은 미지 (bl ind)인 상태로 진행되었다.

5-1. 정상 췌장선방세포 (acinar cel l )에서의 면역형광염색 양상 확인 췌장으로부터 EUS-FNA 방법으로 수득한 정상 선방세포 (acinar cel l )군 시료가 실제 본 발명의 이중 염색법으로 염색되었을 때 어떤 양상을 나타내는 지 확인하였다. 이에 대한 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다.

도 17 및 도 18에서 보는 바와 같이 선방세포의 경우 키모트립신이 강하게 검출 (발현)되어 붉은색이 매우 강하게 나타났다. 구체적으로 도 17에서 보는 바와 같이 MRS가 매우 미약하게 검출되고 상대적으로 키모트립신이 매우 강하게 검출되어 나타나는 패턴과 도 18에서 보는 바와 같이 키모트립신과 함께 MRS 검출도 상당히 나타나는 패턴이 있었다. 그러나 도 18과 같은 염색 패턴에서도 merge 이미지에서는 키모트립신을 나타내는 붉은 색이 높은 강도로 나타났으며， 이러한 염색 패턴은 선방세포 판단의 근거가 된다.

5-2. 기존 세포 병리검사상으로 췌장암 확진되고， 최종적으로도 췌장암 확진된 환자의 경우 염색 양상 췌장으로부터 분리한 세포를 pap staing올 통해 분석한 결과 종양세포로 판단된 세포 시료의 염색 양상을 본 발명의 이중 염색법으로 평가하였다.

도 19에서 보는 바와 같이， 본 실험에서 사용된 세포진 시료 (pap staing을 통해 분석한 결과 종양세포로 판단된 세포)는 붉은색은 거의 나타나지 않고 녹색이 매우 강한 발현을 띠고 있어, 즉 키모트립신이 거의 검출되지 않고 MRS의 발현이 매우 강하게 발현되고 있는 것으로서 췌장암으로 판단 가능함을 확인하였다.

5-3. 기존 세포 병리검사 상으로는 비정형세포 (atypical eel Is)로 분류되어 확진이 불가하였으나, 최종적으로 췌장암 확진된 환자의 경우 염색 양상 기존 pap staining상 비정형세포 (atypical eel Is)였으나 임상적으로 췌장암 확진된 환자의 세포진 (세포시료) 염색 양상을 본 발명의 이중 염색법으로 평가하였다.

그 결과 도 20에서 보는 바와 같이, MRS는 발현 강도가 매우 높게 나타났으며 키모트립신은 상대적으로 검출강도가 상당히 낮아 암세포임을 확인할 수 있었다 (merge 이미지 참조) . 이처럼 본 발명의 이중염색법은 비정형세포에 대해서도 암의 판정이 가능함을 확인하였다.

5-4. 결과 종합 총 26개의 세포시료 검체에 대하여 본 발명의 이중 염색법을 수행하여 판단한 결과와， 최종적 임상 진단 결과를 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 8에서 보여준다. 본 발명의 이중염색 결과, MRS (+) 및 선방세포 마커 (-) 인 경우에 췌장암 Posit ive로 분류하고， 나머지의 경우 (즉， MRS (+) 및 선방세포 마커 (+)로 나타나거나， MRS (-) 및 선방세포 마커 (-)로 나타나거나， MRS (-) 및 선방세포 마커 (+)로 나타나는 경우)에는 Negat ive로 분류한다.

【표 8] 최종 임상병리학적 진단 결과 대비, 본원 발명의 MRS 및 키모트립신 이중염색을 통한 검사 결과 비교

PPV: posit ive predict ive value, NPV: negat ive predict ive value 상기 표 8에서 보는 바와 같이， 본원 발명의 MRS 및 선방세포 마커 (대표적으로, 키모트립신) 이중 염색법을 통한 췌장암의 판정은 민감도 腦， 특이도 100%, 양성 예측치 (PPV) 100%, 음성 예측치 (NPV) 100%로 진단 정확도가 향상되었음을 확인하였다.

종합하여 상기 실시예 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 이중 염색법은 비정형 세포를 포함하여 기존 세포병리학적 판단방법 (pap-staining 또는 H&E stainig 등에 기반한 형태학적 판단 방법)으로는 확진 불가 및 미확진된 췌장세포 (특히 Atypia)에 대해서도 명확히 악성종양세포 여부를 판별 가능하여， 세포진에서의 진단효율올 현저히 상승시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

【산업상 이용가능성】 이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 메티오닐 -티알엔에이 합성효소 및 선방세포 특이적 마커를 이용한 췌장암 진단 방법에 관한 것이다. MRS는 기존의 CEA와 같은 췌장암 마커보다 진단 정확도가 높으며, 특히 MRS의 발현과 더불어 키모트립신 (chymotrypsin)과 같은 선방세포 특이적 마커단백질을 추가의 이중마커 (dual marker)로 사용하면 췌장암 진단의 정확도가 현저히 상승되므로， 체외 진단산업 등의 분야에 있어서 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.