Domaine technique

L'invention concerne une nouvelle méthode pour le diagnostic de l'état de nutrition soufrée d'une plante en mesurant la teneur en certains nutriments minéraux dans ladite plante.

Arrière-plan technologique

Au cours de leur développement, les plantes ont besoin de maintenir un certain niveau d'homéostasie entre les différents nutriments minéraux. Ainsi, les plantes doivent constamment absorber des nutriments provenant du sol par un réseau complexe de transporteurs spécifiques présent au niveau des racines. Certains nutriments minéraux peuvent également être absorbés via des transporteurs non-spécifiques. Par conséquent, des nutriments minéraux de nature différente peuvent rentrer en compétition au niveau du site actif de transporteurs non-spécifiques. Des systèmes non-spécifiques d'absorption de nutriments minéraux capables de transporter à la fois les ions sodium (Na ⁺ ) et les ions potassium (K ⁺ ) ont été identifiées dans les cellules racinaires de la plante. Il a notamment été démontré que lorsque le sol est riche en Na ⁺ , les plantes absorbent le Na ⁺ plutôt que le K ⁺ . On peut également mentionner un autre cas de compétition entre différents éléments nutritifs présents dans la rhizosphère qui concerne le sulfate (S0 ₄ ^2~ ), le molybdate (Mo0 ₄ ^2~ ), le sélénate (Se0 ₄ ^2~ ) et le tungstate (W0 ₄ ^2~ ). Il a en effet été suggéré que l'absorption du molybdate peut également se faire via les transporteurs du sulfate. Il a notamment été montré que molybdate et sulfate peuvent rentrer en compétition au niveau du site de liaison des mêmes transporteurs, notamment des transporteurs du sulfate.

Le soufre (S) est un élément essentiel pour la synthèse des protéines chez la plante. La carence en S réduit considérablement l'efficience d'utilisation de l'azote (N) et donc limite la synthèse protéique. Les signes de carence comprennent notamment le jaunissement des feuilles nouvelles ou des organes jeunes.

Certaines plantes crucifères, comme le colza et le chou, ont besoin d'une quantité importante de soufre. Elles ont en effet un besoin supplémentaire en S pour assurer la production des glucosinolates, qui sont utilisés par la plante dans leur mécanisme de défense face à certains pathogènes.

Un colza déficient en soufre peut présenter une coloration pourpre et des jeunes feuilles recroquevillées, une floraison retardée et prolongée, des fleurs de couleur pâle et des siliques plus petites et moins nombreuses. De plus, un colza carencé en S génère des pertes de rendement et des semences de moins bonne qualité au travers d'une modification de la composition lipidique et protéine des graines.

Des études ont mis en évidence une accumulation de certains nutriments minéraux, comme le molybdène (Mo) et le sélénium (Se), en réponse à une carence en S. Il a été suggéré que la diminution de l'absorption de sulfate observée en situation de carence en S pourrait être due à la liaison du molybdate au niveau du site actif des transporteurs de sulfate racinaires qui est favorisé par la carence en sulfate. Il a également été mis en évidence que l'accumulation de Mo en situation de carence en S était corrélée avec une augmentation de l'expression des transporteurs de sulfate racinaires. Il a également été montré que l'ajout de soufre conduit à une diminution significative de l'absorption de Mo.

Néanmoins, les interactions entre les différents nutriments minéraux nécessaires à la plante sont nombreuses et il est difficile de prédire et d'identifier les bons indicateurs qui permettent de diagnostiquer l'état de nutrition soufrée d'une plante.

Il a notamment été suggéré de diagnostiquer les carences en S en mesurant la teneur en S total de la plante, la teneur en S0 ₄ ^2" ou en calculant les ratios azote/soufre (N/S), malate/sulfate ou (Cr+N0 ₃ ^~ +P0 ₄ ^3~ )/S0 ₄ ^2~ . Mais ces paramètres peuvent être faussés en fonction du stade de développement de la plante ou peuvent nécessiter des analyses en laboratoire difficiles à mettre en œuvre, ce qui rend l'utilisation de ces paramètres peu fiable pour le diagnostic d'une carence en soufre. Il est donc essentiel de disposer d'une méthode fiable et facile à mettre en œuvre pour diagnostiquer l'état de nutrition soufrée d'une plante, notamment pour diagnostiquer une carence en soufre (S).

Les demandeurs ont mis en évidence que le ratio de concentration Mo/S dans un échantillon de feuille est un indicateur fiable, précis et facile à mettre en œuvre pour diagnostiquer l'état de nutrition soufrée d'une plante, et ainsi diagnostiquer une carence en S.

Résumé de l'invention

La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode pour le diagnostic de l'état de nutrition soufrée d'une plante en mesurant la teneur en certains nutriments minéraux dans un échantillon de feuille.

Selon un premier aspect, l'invention concerne une méthode de diagnostic de l'état de nutrition soufrée d'une plante comprenant les étapes suivantes :

a) prélèvement d'un échantillon de feuille de la plante ;

b) mesure de la teneur en soufre (S) de l'échantillon en mg/g ;

c) mesure de la teneur en molybdène (Mo) de l'échantillon en g/g ; d) calcul du ratio Mo/S ;

e) comparaison avec un ratio Mo/S de référence d'une plante non- carencée en soufre et/ou avec un ratio Mo/S de référence d'une plante carencée en soufre ; et

f) déduction de l'état de nutrition soufré de la plante.

Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une méthode de diagnostic de l'état de nutrition soufrée d'une parcelle comprenant les étapes suivantes :

a) prélèvement d'un échantillon de feuille représentatif de la parcelle ; b) mesure de la teneur en soufre (S) de l'échantillon en mg/g ;

c) mesure de la teneur en molybdène (Mo) de l'échantillon en g/g ; d) calcul du ratio Mo/S ;

e) comparaison avec un ratio Mo/S de référence d'une parcelle non- carencée en soufre et/ou avec un ratio Mo/S de référence d'une parcelle carencée en soufre ; et

f) déduction de l'état de nutrition soufré de la parcelle.

Selon un troisième aspect, l'invention concerne une méthode d'adaptation de la fertilisation en soufre d'une plante ou d'une parcelle comprenant les étapes successives suivantes :

A) mise en œuvre de la méthode de diagnostic selon l'invention sur la plante ou la parcelle ;

B) ajout d'un fertilisant soufré si une carence en soufre ou un risque de carence est détectée lors de l'étape A).

Selon un quatrième aspect, l'invention concerne l'utilisation du ratio massique Mo/S foliaire, et éventuellement du ratio massique (Cl+P)/S foliaire, pour déterminer l'état de nutrition soufrée d'une plante ou d'une parcelle.

Description détaillée de l'invention

La présente invention découle des avantages surprenants mis en évidence par les inventeurs d'une corrélation entre le ratio Mo/S d'un échantillon de feuille d'une plante ou d'une parcelle et l'état de nutrition soufré de ladite plante ou parcelle.

L'invention concerne en effet une méthode de diagnostic de l'état de nutrition soufrée d'une plante comprenant les étapes suivantes :

a) prélèvement d'un échantillon de feuille de la plante ;

b) mesure de la teneur en soufre (S) de l'échantillon en mg/g ;

c) mesure de la teneur en molybdène (Mo) de l'échantillon en g/g ; d) calcul du ratio Mo/S ; e) comparaison avec un ratio Mo/S de référence d'une plante non- carencée en soufre et/ou avec un ratio Mo/S de référence d'une plante carencée en soufre ; et

f) déduction de l'état de nutrition soufré de la plante.

Toutes les plantes ont besoin de nutriments minéraux pour croître de manière optimale, en particulier de S. Ainsi, au sens de l'invention, l'« état de nutrition soufrée » est un indicateur qui permet de savoir si la plante dispose de suffisamment de S pour lui assurer une croissance optimale. Une évaluation de l'« état de nutrition soufrée » repose généralement sur la confrontation entre l'offre du sol en S (i.e. le souffre présent dans le sol) et le besoin de la plante en S (i.e. pour assurer la croissance optimale de la plante). La détermination de l'offre du sol en S étant en l'état actuel des connaissances difficile, l'analyse de la plante permet de savoir si elle dispose de suffisamment de S pour lui assurer une croissance optimale. Une faible disponibilité en S peut affecter l'état de nutrition soufrée de la plante et provoquer une carence en soufre.

Au sens de l'invention, on entend par « carence » une absence, une présence insuffisante ou un défaut d'assimilabilité d'un élément indispensable, empêchant ainsi une croissance optimale.

Au sens de l'invention, on entend par « carence en soufre » une absence, une présence insuffisante ou un défaut d'assimilabilité de soufre, empêchant ainsi une croissance optimale.

Ainsi, au sens de l'invention, on entend par « plante carencée en soufre » une plante qui n'a pas assimilé suffisamment de soufre pour lui assurer un croissance optimale.

Ainsi, au sens de l'invention, on entend par « plante non-carencée en soufre » une plante qui a assimilé suffisamment de soufre pour lui assurer une croissance optimale. Ainsi, au sens de l'invention, on entend par « plante en risque de carence en soufre » une plante qui n'a pas assimilé suffisamment de soufre mais qui semble avoir une croissance optimale.

Une plante ou une parcelle en risque de carence en soufre qui n'a pas été traitée avec un fertilisant soufré peut évoluer vers une plante ou une parcelle carencée en soufre. Ainsi, la présente invention a comme avantage majeur de permettre de déduire si la plante ou la parcelle est carencée en soufre, si la plante ou la parcelle est non-carencée en soufre, mais également si la plante ou la parcelle est en risque de carence en soufre. Ce diagnostic complet de l'état de nutrition soufré de la plante est un des avantages de la présente invention.

L'état de nutrition soufrée d'une plante est évalué en prélevant un échantillon de feuille de la plante. Un des avantages de la présente invention est que tous les types de feuilles et à tous les stades de développement peuvent être utilisées pour la mise en œuvre de l'invention.

Dans un mode de réalisation particulier, la plante a été cultivée en plein champ.

La méthode de diagnostic peut également être mise en œuvre à l'échelle d'une parcelle, c'est-à-dire à l'échelle d'un champ d'un seul tenant de même culture. Ainsi, l'invention vise aussi une méthode de diagnostic de l'état de nutrition soufrée d'une parcelle comprenant les étapes suivantes :

a) prélèvement d'un échantillon de feuille représentatif de la parcelle ; b) mesure de la teneur en soufre (S) de l'échantillon en mg/g ;

c) mesure de la teneur en molybdène (Mo) de l'échantillon en g/g ; d) calcul du ratio Mo/S ;

e) comparaison avec un ratio Mo/S de référence d'une parcelle non- carencée en soufre et/ou avec un ratio Mo/S de référence d'une parcelle carencée en soufre ; et

f) déduction de l'état de nutrition soufré de la parcelle. Dans ce mode de réalisation, l'échantillon de feuille représentatif de la parcelle peut être prélevé au niveau d'une seule plante ou au niveau de plusieurs plantes. De préférence, l'échantillon de feuille représentatif de la parcelle comprend des feuilles provenant de plusieurs plantes distinctes présentes sur la parcelle, avantageusement présentes à différents endroits de la parcelle.

Préparation de l'échantillon

L'échantillon de feuille peut être préparé de différentes manières pour pouvoir mesurer la teneur en nutriments minéraux d'intérêt.

Dans un mode de réalisation particulier, les étapes b) et c) sont directement mises en œuvre sur un échantillon de feuille séché qui est prélevé directement au sol ou sur la plante. La mesure ne prend alors que quelques minutes, notamment par spectrométrie de fluorescence X ou par spectrométrie de masse couplée à une torche plasma (e.g. pour des teneurs en Mo inférieures à 10 ppm).

Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon de feuille est séché et broyé avant les étapes b) et c). Etant entendu que l'échantillon de feuille peut être uniquement broyé si l'échantillon de feuille est déjà sec, par exemple s'il s'agit d'un échantillon de feuille séché qui est prélevé directement au sol ou sur la plante.

L'échantillon de feuille peut être séché par des méthodes bien connues de l'homme du métier, comme par exemple le séchage dans une étuve ou dans un four à micro-ondes avantageusement par lyophilisation. Un échantillon est considéré comme séché lorsque qu'il contient moins de 5% d'eau, avantageusement moins de 3% d'eau.

L'échantillon peut être broyé par des méthodes bien connues de l'homme du métier et faciles à mettre en œuvre, comme par exemple avec un broyeur de type moulin à café domestique ou avantageusement avec un broyeur à billes. Généralement, l'échantillon de feuille comprend entre 40mg et 50g de matière sèche de feuille, par exemple entre 50mg et 50g, entre 500mg et 50g, entre lg et 50g, entre lg et 10g, ou encore entre 10g et 50g de matière sèche de feuille.

Mesure de la teneur en nutriments minéraux

La mesure de la teneur en nutriments minéraux d'intérêt (i.e. S et Mo, et éventuellement Cl et P) est réalisée par une méthode d'analyse appropriée. Différentes méthodes d'analyse connues permettent de mesurer la teneur en nutriments minéraux d'échantillon de feuille, comme par exemple la spectrométrie de fluorescence X (pour l'analyse du S, du Cl, du P et des concentrations supérieures à 10 ppm de Mo) ou la spectrométrie de masse couplé à une torche plasma (pour l'analyse du S, P et des concentrations inférieures à 10 ppm de Mo). La mesure de la teneur en S, Mo, Cl et P est une teneur massique :

- la teneur en soufre (S) de l'échantillon s'exprime en mg/g, ce qui correspond à la masse de S exprimée en mg contenu dans 1 gramme d'échantillon séché ;

- la teneur en molybdène (Mo) de l'échantillon s'exprime en Mg/g, ce qui correspond à la masse de Mo exprimée en contenue dans 1 gramme d'échantillon séché ;

- la teneur en chlore (Cl) de l'échantillon s'exprime en mg/g, ce qui correspond à la masse de Cl exprimée en mg contenue dans 1 gramme d'échantillon séché ;

- la teneur en phosphore (P) de l'échantillon s'exprime en mg/g, ce qui correspond à la masse de P exprimée en mg contenue dans 1 gramme d'échantillon séché. Dans un mode de réalisation particulier, les étapes b) et c) sont réalisées par spectrométrie de fluorescence X ou par spectrométrie de masse couplé à une torche plasma.

Dans un mode de réalisation particulier les étapes b) et c) sont mises en œuvre simultanément. C'est-à-dire que la mesure de la teneur en S, éventuellement en chlore (Cl) et phosphore (P), et la mesure de la teneur en Mo, se font de manière simultanée. Ce mode de réalisation a comme avantage de permettre la mesure de la teneur en nutriments minéraux du même échantillon de feuille.

Une fois que la mesure de la teneur en nutriments minéraux d'intérêts est réalisée, le ratio Mo/S peut être calculé aisément.

Comparaison avec un ratio de référence

Le ratio Mo/S est ensuite comparé avec un ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S et/ou un ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S.

Au sens de l'invention, on entend par « ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S », le ratio Mo/S d'un échantillon de feuille d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre. Le ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S peut être déterminé par des études à grande échelle sur des plantes dont l'alimentation en S est suffisante pour permettre à la plante d'avoir une croissance optimale.

Au sens de l'invention, on entend par « ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S », le ratio Mo/S d'un échantillon de feuilles d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre. Le ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S peut être déterminé par des études à grande échelle sur des plantes dont l'alimentation est substantiellement dépourvue de S. Dans un mode de réalisation particulier, le ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S correspond au seuil supérieur de l'intervalle de confiance (avantageusement pour une probabilité inférieure à P=0,05 selon le test de Student) de la moyenne des ratios Mo/S mesurés lors des études à grande échelle sur des plantes ou des parcelles non-carencées en S. Le ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S correspond au seuil inférieur de l'intervalle de confiance (avantageusement pour une probabilité inférieure à P=0,05 selon le test de Student) de la moyenne des ratios Mo/S mesurés lors des études à grande échelle sur des plantes ou des parcelles carencées en S.

Ces études permettent de déterminer les ratios Mo/S de référence pour différentes espèces de plante. Il est alors possible de constituer une base de données avec les ratios Mo/S de référence de différentes espèces de plante. Une telle base de données peut alors être utilisée pour la mise en œuvre de l'invention, notamment lors de l'étape e).

Il est alors possible de déterminer, pour chaque espèce de plante, un ratio de référence au-delà duquel la plante est considérée comme carencée en S (i.e. au-delà du ratio Mo/S de référence d'une plante carencée en S), et un ratio de référence en deçà duquel la plante est considérée comme non-carencée en S (i.e. en deçà du ratio Mo/S de référence d'une plante non-carencée en S). Il est donc possible de déterminer 3 états de nutrition soufrée différents pour une plante ou une parcelle :

- plante ou parcelle non-carencée en S : lorsque le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est inférieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S ;

- plante ou parcelle carencée en S : lorsque le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est supérieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S ; et - plante ou parcelle en risque de carence en S : lorsque le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est inférieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S et supérieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S. Dans un mode de réalisation préféré, la plante analysée pour son état de nutrition soufrée est de la même espèce que la plante non-carencée en soufre et/ou que la plante carencée en soufre (i.e. les plantes de l'étape e)). Dans un mode de réalisation préféré, la parcelle analysée pour son état de nutrition soufrée est de la même espèce que la parcelle non-carencée en soufre et/ou que la parcelle carencée en soufre (i.e. les parcelles de l'étape e)), c'est-à-dire que les plantes qui constituent la parcelle analysée pour son état de nutrition soufrée sont de la même espèce que les plantes qui constituent la parcelle non- carencée en soufre et/ou que les plantes qui constituent la parcelle carencée en soufre. Par exemple, pour le colza (B. napus) :

une plante ou une parcelle est carencée en soufre lorsque le ratio Mo/S est supérieur à 0,28±0,05

- une plante ou une parcelle est non-carencée en S lorsque le ratio Mo/S est inférieur à 0,16±0,05.

- une plante ou une parcelle est en risque de carence en soufre lorsque le ratio Mo/S est compris entre 0,28±0,05 et 0,16±0,05. Les demandeurs ont montré que le ratio Mo/S d'un échantillon de feuille d'une plante carencée en S ou d'une parcelle carencée en S était significativement supérieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non- carencée en S. Ainsi, la méthode selon l'invention permet de diagnostiquer aisément et avec précision l'état de nutrition soufré d'une plante ou d'une parcelle.

Dans un mode de réalisation particulier, la plante ou la parcelle (i.e. la plante analysée ou la parcelle analysée) est carencée en soufre et le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est supérieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la plante ou la parcelle (i.e. la plante analysée ou la parcelle analysée) est non-carencée en soufre et le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est inférieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la plante ou la parcelle (i.e. la plante analysée ou la parcelle analysée) est en risque de carence en soufre et le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est inférieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre, et le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est supérieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre.

Calcul des ratios Mo/S et fCI+PVS

Dans un mode de réalisation particulier :

- l'étape b) comprend en outre la mesure de la teneur en chlore (Cl) et en phosphore (P) de l'échantillon en mg/g,

- l'étape d) comprend en outre le calcul du ratio (Cl+P)/S, et

- l'étape e) comprend en outre la comparaison avec un ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre et/ou avec un ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre.

Au sens de l'invention, on entend par « ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S », le ratio (Cl+P)/S d'un échantillon de feuille d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre. Le ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S peut être déterminé par des études à grande échelle sur des plantes dont l'alimentation en S est suffisante pour permettre à la plante d'avoir une croissance optimale. Au sens de l'invention, on entend par « ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S », le ratio (Cl+P)/S d'un échantillon de feuille d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre. Le ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S peut être déterminé par des études à grande échelle sur des plantes dont l'alimentation est substantiellement dépourvue de S.

Dans un mode de réalisation particulier, le ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S correspond au seuil supérieur de l'intervalle de confiance (avantageusement pour une probabilité inférieure à P=0,05 selon le test de Student) de la moyenne des ratios (Cl+P)/S mesurés lors des études à grande échelle sur des plantes ou des parcelles non-carencées en S. Le ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S correspond au seuil inférieur de l'intervalle de confiance (avantageusement pour une probabilité inférieure à P=0,05 selon le test de Student) de la moyenne des ratios (Cl+P)/S mesurés lors des études à grande échelle sur des plantes ou des parcelles carencées en S.

Ces études à grande échelle permettent de déterminer les ratios (Cl+P)/S de référence pour différentes espèces de plante. Il est alors possible de constituer une base de données avec les ratios (Cl+P)/S de référence de différentes espèces de plante. Une telle base de données peut alors être utilisée pour la mise en œuvre de l'invention, notamment lors de l'étape e).

Dans ce mode de réalisation particulier, la teneur en chlore (Cl) et en phosphore (P) est mesurée en plus de la teneur en S et en Mo. Ainsi, les ratios Mo/S et (Cl+P)/S peuvent être calculés et comparés respectivement aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence tels que définis ci-dessus. Les demandeurs ont montré de manière tout à fait surprenante que la prise en compte de ces deux ratios (i.e. Mo/S et (Cl+P)/S), permet d'améliorer la précision et la reproductibilité de la méthode de diagnostic selon l'invention Les demandeurs se sont aperçu qu'il pouvait y avoir des interférences liées au fait que la teneur en Mo des feuilles peut être augmentée dans des conditions très particulières, par exemple lorsque le sol est riche en Mo et/ou lorsque le sol est carencé en un ou plusieurs des nutriments minéraux choisis parmi le Fer (Fe), le Cuivre (Cu), le Zinc (Zn), le Manganèse (Mn) et le Bore (B). Dans ces conditions particulières, il est possible d'observer une augmentation de la teneur en Mo des feuilles. Le ratio Mo/S d'un échantillon de feuille est alors susceptible d'être diminué sans que cela résulte nécessairement d'une carence en soufre. Par contre, et c'est un avantage majeur de ce mode de réalisation, ces conditions particulières n'ont pas de conséquence sur le ratio (Cl+P)/S d'un échantillon de feuille.

Inversement, les demandeurs se sont aperçu qu'un sol riche en Chlore (Cl) ou en Phosphore (P), était susceptible de diminuer la valeur du ratio (Cl+P)/S d'un échantillon de feuille, mais sans affecter le ratio Mo/S d'un échantillon de feuille.

Ainsi, il est particulièrement avantageux de prendre en compte les deux ratios (i.e. Mo/S et (Cl+P)/S) lors de la mise en œuvre de la méthode de diagnostic selon l'invention.

En tenant compte des ratios Mo/S et (Cl+P)/S), il est donc possible de déterminer 3 états de nutrition soufrée différents pour une plante ou une parcelle :

- Plante ou parcelle non-carencée en S : lorsque les ratios Mo/S et (Cl+P)/S de l'échantillon de feuille sont respectivement inférieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non- carencée en S ;

- Plante ou parcelle carencée en S : lorsque les ratios Mo/S et (Cl+P)/S de l'échantillon de feuille sont respectivement supérieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S ; - Plante ou parcelle en risque de carence en S : lorsque les ratios Mo/S et (Cl+P)/S de l'échantillon de feuille sont respectivement inférieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S et respectivement supérieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S.

Dans un mode de réalisation particulier, la plante ou la parcelle (i.e. la plante analysée ou la parcelle analysée) est non-carencée en soufre et les ratios Mo/S et (Cl+P)/S de l'échantillon de feuille sont respectivement inférieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la plante ou la parcelle (i.e. la plante analysée ou la parcelle analysée) est carencée en soufre et les ratios Mo/S et (Cl+P)/S de l'échantillon de feuille sont respectivement supérieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la plante ou la parcelle (i.e. la plante analysée ou la parcelle analysée) est en risque de carence en soufre et les ratios Mo/S et (Cl+P)/S de l'échantillon de feuille sont respectivement inférieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S et respectivement supérieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S.

Plantes préférées

La méthode de diagnostic selon l'invention est particulièrement adaptée pour les plantes ou les parcelles qui nécessitent un apport significatif en soufre, c'est-à-dire les plantes ou les parcelles sensibles aux carences en soufre. En particulier, la plante ou la parcelle est choisie parmi le colza, en particulier de l'espèce B. napus, le choux, en particulier de l'espèce B. oleracea, la tomate, en particulier de l'espèce S. lycopersicum, le maïs, en particulier de l'espèce Z mays, le blé, en particulier de l'espèce T. aestivum, le pois, en particulier de l'espèce P. sativum, l'amarantine globuleuse, YArabidopsis thaliana et l'orge, Hordeum vu/gare.

Avantageusement, la plante ou la parcelle analysée pour son état de nutrition soufrée est de la même espèce que la plante ou la parcelle non-carencée en soufre (de l'étape e)) et/ou que la plante ou la parcelle carencée en soufre (de l'étape e)).

L'invention vise également une méthode de diagnostic de l'état de nutrition soufrée d'une plante ou d'une parcelle comprenant les étapes suivantes :

a) prélèvement d'un échantillon de feuille de la plante ou de la parcelle ; b) mesure de la teneur en soufre (S) de chlore (Cl) et de phosphore (P) de l'échantillon en mg/g ;

c) calcul du ratio (Cl+P)/S ;

e) comparaison avec un ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre et/ou d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre ; et

f) déduction de l'état de nutrition soufré de la plante ou de la parcelle.

Il est alors possible de déterminer, pour chaque espèce de plante, un ratio de référence au-delà duquel la plante est considérée comme carencée en S (i.e. au-delà du ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante carencée en S), et un ratio de référence en deçà duquel la plante est considérée comme non-carencée en S (i.e. en deçà du ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante non-carencée en S). Il est donc possible de déterminer 3 états de nutrition soufrée différents pour une plante ou une parcelle :

- Plante ou parcelle non-carencée en S : lorsque le ratio (Cl+P)/S de l'échantillon prélevé est inférieur au ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S ; - Plante ou parcelle carencée en S : lorsque le ratio (Cl+P)/S de l'échantillon prélevé est supérieur au ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S ;

- Plante ou parcelle en risque de carence en S : lorsque le ratio (Cl+P)/S de l'échantillon prélevé est inférieurs au ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en S et supérieur au ratio (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en S.

Par exemple, pour le colza (B. napus) :

- une plante ou une parcelle est carencée en soufre lorsque le ratio (Cl+P)/S est supérieur à 3,21±0,5.

- une plante ou une parcelle est non-carencée en S lorsque le ratio (Cl+P)/S est inférieur à 2,13±0,5.

- une plante ou une parcelle est en risque de carence en soufre lorsque le ratio (Cl+P)/S est compris entre 2,13±0,5 et 3,21±0,5.

Comme montré ci-dessus, la méthode de diagnostic selon l'invention est particulièrement avantageuse pour traiter une carence en soufre ou prévenir une carence en soufre. Elle permet notamment d'identifier les plantes ou les parcelles en risque de carence en soufre afin de pouvoir les traiter avec un fertilisant soufré. Ainsi, l'invention vise également une méthode d'adaptation de la fertilisation en soufre d'une plante ou d'une parcelle comprenant les étapes successives suivantes :

A) mise en œuvre de la méthode de diagnostic selon l'invention sur la plante ou la parcelle ;

B) ajout d'un fertilisant soufré si une carence en soufre ou en risque de carence en soufre est détecté lors de l'étape A).

Une carence en soufre est détectée lorsque :

- le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est supérieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre ; ou - les ratios Mo/S et (Cl+P)/S de l'échantillon de feuille sont respectivement supérieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre.

Une situation à risque de carence en soufre est détectée lorsque :

- le ratio Mo/S de l'échantillon de feuille est (i) supérieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre et (ii) inférieur au ratio Mo/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre ; ou

- les ratios Mo/S et (Cl+P)/S de l'échantillon de feuille sont respectivement (i) supérieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle non-carencée en soufre et (ii) inférieurs aux ratios Mo/S et (Cl+P)/S de référence d'une plante ou d'une parcelle carencée en soufre.

La fertilisation en soufre de la plante ou de la parcelle peut alors être adaptée afin de mettre la plante ou la parcelle dans un état de non-carence en soufre. Plusieurs types de fertilisants soufrés peuvent être ajoutés à l'étape B), par exemple l'urée soufrée, le sulfate d'ammonium, les solutions azotées soufrées, l'ammonitrate soufré, le sulfate de magnésium, le sulfate de potassium, le superphosphate, les engrais hydrosolubles soufrés, les engrais foliaires soufrés.

Ainsi, la méthode d'adaptation de la fertilisation en soufre permet d'ajuster les apports en soufre en fonction des besoins de la plante. Cette méthode permet notamment de prévenir les carences en soufre qui sont susceptibles d'affecter la croissance et/ou la qualité de la plante ou de la parcelle.

L'invention vise également l'utilisation du ratio massique Mo/S foliaire, et éventuellement du ratio massique (Cl+P)/S foliaire, pour déterminer l'état de nutrition soufrée d'une plante ou d'une parcelle.

L'invention vise également l'utilisation du ratio massique (Cl+P)/S foliaire pour déterminer l'état de nutrition soufrée d'une plante ou d'une parcelle. Etant entendu que le ratio massique Mo/S ou (Cl+P)/S foliaire correspond au ratio Mo/S ou (Cl+P)/S tel que définit plus haut.

L'invention est illustrée dans les exemples ci-dessous, qui illustrent l'invention sans en limiter la portée.

Légendes des figures

Figure 1 : graphique qui représente le changement relatif (exprimé en % par rapport à une plante non-carencée en S) de la quantité de plusieurs nutriments minéraux (N, P, K, S, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, B et Na) dans une plante de B. napus carencée en S (i.e. sans apport de soufre). Les plantes ont été cultivées en serre et en hydroponie. La quantité de chaque élément dans une plante correspond à la teneur de chaque élément multipliée par la biomasse sèche de la plante entière.

Figure 2 : graphiques qui représentent : (A) l'évolution de la quantité de S dans une plante de B. napus carencée en S (-S) et dans une plante de B. napus non- carencée en S (+S) ; (B) l'évolution de la quantité de Mo dans une plante de B. napus carencée en S (-S) et dans une plante de B. napus non-carencée en S (+S) ; et (C) l'évolution du ratio Mo/S dans une plante de B. napus carencée en S (-S) et dans une plante de B. napus non-carencée en S (+S). Les plantes ont été cultivées en serre et en hydroponie. La quantité de chaque élément dans une plante correspond à la teneur de chaque élément multipliée par la biomasse sèche de la plante entière.

Figure 3 : graphiques qui représentent l'évolution de la teneur en S (A et B), de la teneur en Mo (C et D) et du ratio Mo/S (E et F) dans :

- un échantillon de feuille émergée avant l'application d'une carence en soufre (A, C et E), et

- un échantillon de nouvelle feuille apparaissant durant la carence en soufre (B, D et F) de plantes de B. napus carencées en S (-S) et de plantes de B. napus non- carencées en S (+S). Les plantes ont été cultivées en serre et en hydroponie..

Figure 4 : graphique qui représente la teneur des feuilles en S (A, B et C), en Mo (D, E, F) et le ratio Mo/S (G, H et I) dans des échantillons de feuilles de B. napus cultivé dans des conditions de plein champ (i.e. +/- fertilisation en S et +/- fertilisation en N, exprimée en kg/ha). Les échantillons de feuilles ont été récoltés 15 jours (A, D, G) ou 47 jours (B, C, E, F, H, I) après une fertilisation en soufre.

Figure 5 graphique qui représente la teneur d'échantillons de feuille en S0 ₄ ^2" (A, B et C), en (Cr+N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" ) (D, E et F) et le ratio (Cl ^" +N0 ₃ ^" + P0 ₄ ^3" )/ S0 ₄ ^2" (G, H et I) dans des échantillons de feuille de B. napus cultivé dans des conditions de plein champ (i.e. +/- fertilisation en S et +/- fertilisation en N, exprimée en kg/ha). Les échantillons de feuille ont été récoltés 15 jours (A, D, G) ou 47 jours (B, C, E, F, H, I) après une fertilisation en soufre.

Figure 6 : graphiques qui montrent une corrélation entre la teneur en S0 ₄ ^2" , P0 ₄ ^3" , CI ^" et N0 ₃ ^" et la teneur en S, P, Cl et N respectivement. Les graphiques montrent une corrélation entre la teneur en S0 ₄ ^2" , P0 ₄ ^3" , CI ^" et S, P, Cl respectivement (A, B et C), mais une absence de corrélation entre N0 ₃ ^" et N (d).

Figure 7: graphique qui montrent une corrélation entre le ratio (Cl ^" +N0 ^3" + P0 ₄ ^3" )/ S0 ₄ ^2" et le ratio (Cl+P)/S.

Exemples

Exemple 1 : Préparation des échantillons de feuille pour les tests en laboratoire sur B. napus

Des graines de B. napus L variété Bohême ont été mises à germer dans de l'eau déminéralisée sur de la perlite pendant 7 jours dans le noir puis 5 jours à la lumière naturelle. Juste après l'apparition des premières feuilles, les semis ont été mis sous serre dans des conditions hydroponiques, entre octobre et décembre, à une température de 20°C le jour et 15°C la nuit.

La lumière naturelle a été supplémentée avec des lampes à sodium (Master Greenpower T400W, Philips, Amsterdam, Netherlands) (350 μηιοΙ m ^"2 s ^{" 1} de rayonnement photosynthétiquement actif) 16 heures par jour.

La solution nutritive des semis contenait : 3,75 mM de KNO3, 0,5 mM de MgS0 ₄ , 0,5 mM de CaCI ₂ , 0,25 mM de KH ₂ P0 ₄ , 0,2 mM d'EDTA-2NaFe, 14 μΜ de H3BO3, 5 μΜ de MnS0 ₄ , 3 μΜ deZnS0 ₄ , 0,7 μΜ de CuS0 ₄ , 0,7 μΜ de (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ 0 ₂₄ , 0,1 μΜ de CoCI ₂ , 0,04 μΜ de NiCI ₂ et tamponnée à pH 6.6 avec 0,91 mM de CaC0 ₃ . Cette solution a été renouvelée régulièrement en fonction de la disparition du NO3 ^" dans la solution afin de maintenir des conditions d'alimentation optimales. A cette fin, la quantité de N0 ₃ ^" dans la solution nutritive a été mesurée à l'aide de bandelettes prévues à cet effet (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)

Après 4 semaines de croissance, les plantes ont été séparées en deux lots alimentés avec une solution nutritive adaptée pour induire ou non une carence en soufre tout en maintenant une même concentration pour les autres éléments de la solution nutritive:

- Lot 1 : Plantes contrôles (+S) cultivées avec 508,7 μΜ de S0 ₄ ^2" ,

- Lot 2 : Plantes privées de soufre (-S) cultivées avec 8,7 μΜ S0 ₄ ^2" (la présence de S est liée à l'apport en S0 ₄ ^2" des oligoéléments de la solution nutritive, cette quantité est négligeable).

Ces solutions nutritives adaptées ont également été renouvelée régulièrement en fonction de la disparition du NO3 ^" dans la solution nutritive (environ tous les deux jours à la fin de l'expérience).

Les feuilles présentes au jour 0 (J0) ont été identifiées et marquées, et ont été considérés comme « feuilles émergées » avant l'application de la carence en soufre, tandis que les feuilles qui sont apparues les jours ultérieurs ont été récoltées séparément et identifiées comme « feuilles apparaissant » après l'application de la carence en soufre.

Quatre échantillons indépendants ont été prélevés au jour 0 (J0), au jour 1, 2, 3, 7, 13, 21 et au jour28 (J28). Le jour 0 correspond au jour à partir duquel les plantes ont été alimentées avec une solution nutritive adaptée. Les quatre échantillons prélevés à chacun des jours correspondent chacun à quatre plantes contrôles (+S) ou quatre plantes privées de soufre (-S)

Les plantes entières ont ensuite été congelées dans de l'azote liquide et stockées à -80°C pour analyse ultérieure. Pour chacun des échantillons, un sous échantillon de feuille a été lyophilisé et broyé en poudre fine à l'aide d'une broyeur à billes (MM400, Retsch, Haan, Germany). La poudre ainsi obtenue a été utilisée pour mesurer la teneur des différents nutriments minéraux.

Exemple 2: Mesure de la teneur en nutriments minéraux par spectrométrie de masse a) Mesure de la teneur en soufre (S et en azote (H)

Pour mesurer la teneur en soufre (S) et en azote (N), 4 mg de matière sèche (MS) de poudre a été placé dans des capsules d'étain. La quantité de S ou N a été déterminé avec un spectromètre de masse à ratio isotopique à flux continu (Nu Instruments, Wrexham, Royaume-Uni) couplé à un analyseur C / N / S (EA3000, Euro Vector, Milan, Italie). La teneur en S total (S _to t) ou la teneur en N total (N _to t) à un temps "t" a été mesuré comme suit:

Stot (ou N _to t)= [% S _t (ou N _t ) x MS _t ] x 100 b) Mesure de de la teneur des autres nutriments minéraux

La mesure de la teneur en P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mo, Mn, B, Ni et Na dans les échantillons de feuille a été réalisée avec un spectromètre de masse haute résolution couplé à une torche plasma (HR ICP-MS, Thermo Scientific, Elément 2™, Bremen, Germany) après digestion de la poudre préparée selon l'exemple 1 par un traitement acide et microondes (Multiwave ECO, Anton Paar, les Ulis, France) en utilisant 800μί de HNO3 (Thermo Fischer, Illkirch, France), 200 μί. de H2O2 (SCP SCIENCE, Québec, Canada) et ImL d'eau illi-Q pour 40 mg de matière sèche (MS). Chaque échantillon de feuille a été supplémenté avec deux standards internes, gallium et rhodium (SCP SCIENCE, Québec, Canada), à une concentration finale de 10 et 2 pg.L ^" , respectivement, et dilué avec de l'eau Milli-Q afin d'obtenir une solution contenant 2,0% (v/v) d'acide nitrique. Cette solution a ensuite été filtrée sur un système de filtration en Téflon de 40 μηη (Courtage Analyses Services, Mont-Saint-Aignan, France), La mesure de la teneur des nutriments minéraux a été réalisée en utilisant des courbes standard préparées et vérifiées avec une référence certifiée de feuilles de citronnier (CRM NCS ZC73018, Sylab, Metz, France). La teneur des nutriments minéraux a ensuite été calculée en utilisant la même formule que pour S et N.

Exemple 3 : impact d'une carence en soufre sur la teneur des nutriments minéraux

La teneur de plusieurs nutriments minéraux a été mesurée pour des échantillons préparés selon l'exemple 1, après 21 jours de carence en soufre (J21). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type pour les quatre échantillons de 4 plantes. Toutes les données ont été analysés par le test de Student (logiciel Excel) et marquées par un ou plusieurs astérisques lorsque la différence est significative entre les échantillons (+S) et (-S) (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Les résultats sont présentés sur la figure 1. Comme attendu, après 21 jours de carence en S, l'absorption de S est diminuée de -100,7 ± 0,90 % comparé aux plantes (+S). L'absorption d'autres nutriments minéraux est également diminuée : N (-8,7 ± 1,06 %), K (- 20,2 ± 0,88 %), Ca (-22,0 ± 2,41 %) et Na (-23,4 ± 1,85 %). L'adsorption de B est quant à elle diminuée plus fortement (-52,9 ± 2,82 %). Inversement, la carence en S augmente fortement l'absorption de Mo (+197,0 ± 10,73 %). L'absorption de P, Mg, Fe, Cu, Zn et Mn n'est pas affecté par la carence en S.

Exemple 4 : évolution du ratio Mo/S lors d'une carence en S

La teneur en S et Mo de différents tissus des plantes (feuilles, racines) a été mesurée pour des échantillons préparés selon l'exemple 1, au jour 0 (J0), au jour 1 (Jl), 2, 3, 7, 13, 21 et au jour 28 (J28). La figure 2 présente la teneur en S ou en Mo et le ratio Mo/S sous forme de moyenne ± écart type dans quatre plantes. Toutes les données ont été analysés par le test de Student (logiciel Excel) et marquées par un ou plusieurs astérisques lorsque la différence est significative entre les échantillons (+S) et (-S) (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Les résultats sont présentés sur la figure 2.

La quantité de S des plantes privées de soufre (-S) est restée à un niveau basai (Figure 2A) indiquant une absence d'absorption de S. La quantité de S des plantes contrôles (+S) augmente de façon constante au cours du temps et est significativement plus élevée que pour les plantes privées de soufre (-S) dès J3.

Inversement, la quantité de Mo des plantes privées de soufre (-S) et des plantes contrôle (+S) augmente au cours du temps, mais à un niveau plus élevé pour les plantes privées de soufre (-S) (Figure 2B). Par exemple, la quantité en Mo est 2,23 fois plus importante pour les plantes privées de soufre (-S) par rapport aux plantes control (+S) à J28. Dès le premier jour, la quantité en Mo des plantes privées de soufre (-S) est 28% plus importante que pour les plantes control (+S). Cette différence devient beaucoup plus marquée à partir de J3.

En conséquence, le ratio Mo/S au niveau des plantes privées de soufre (-S) augmente de manière significative dès Jl, et est environ 21 fois plus important à J28 (Figure 2C). Le ratio Mo/S des plantes contrôles (+S) n'augmente pas au cours du temps. Conclusion : le ratio Mo/S permet de distinguer de manière significative une plante carencée en soufre et une plante non-carencée en soufre.

Exemple 5 : évolution du ratio Mo/S lors d'une carence en S pour différents types de feuille

La teneur en S et Mo a été mesurée pour des échantillons préparés selon l'exemple 1 au jour 0 (J0), au jour 1, 2, 3, 7, 13, 21 et au jour 28 (J28), en distinguant les « feuilles émergées » avant la carence en soufre et les « nouvelles feuilles » apparaissant durant la carence en soufre.

Il a été montré quel que soit le type de feuille analysé que la carence en S diminue les teneurs en S mais augmente les teneurs en Mo (Figures 3 A-F). Par conséquent, le ratio Mo/S augmente au cours du temps dans les feuilles des plantes carencées en soufre (Figures 3 E-F) et ce, quel que soit le type de feuille analysé.

Conclusion : le ratio Mo/S des feuilles est augmenté de façon très précoce lors d'une carence en soufre et quel que soit le type de feuille.

Exemple 6 : Evolution du ratio Mo/S après une fertilisation en S et impact de la fertilisation en N

Un champ de colza (B. napus) a été divisé en trois parcelles distinctes, chacune ayant un niveau de fertilisation en S différent, de 36, 12 ou 0 kg S ha ^"1 .

Chacune des parcelles a été subdivisée en trois, chaque subdivision ayant un niveau de fertilisation en N différent (0, 65 ou 125 kg N ha ^"1 ).

Des échantillons de feuille ont été prélevés dans chacune des subdivisions. La teneur en S et Mo a été mesurée pour chaque échantillon à 15 et 47 jours après fertilisation au S. La teneur en S a été significativement réduite en condition de carence en S, indépendamment du niveau de fertilisation en N (65 ou 125 kg N ha ^"1 ) (Figure 4 A-C). La teneur en Mo la plus élevée a été observée chez les plantes ayant reçu une fertilisation N et sans ou peu de fertilisation S (0 ou 12 kg S ha ^"1 ) (Figure 4 D-F). Le ratio Mo/S a permis de différentier les parcelles en fonction de leur niveau de fertilisation en S 0, 12 et 36 kg S ha ^"1 . (Figure 4 G-I). En effet, les plantes avec fertilisation N (65 ou 125 kg N ha ^"1 ) et sans fertilisation S avaient le ratio Mo/S le plus élevé, alors que les plantes avec fertilisation S à 36 kg S ha ^"1 avaient le ratio Mo/S le plus faible. Les plantes avec fertilisation S à 12 kg S ha ^"1 avaient un ratio Mo/S intermédiaire.

Il a été observé des interactions entre la fertilisation en N et la fertilisation en S. On peut supposer que le niveau de croissance des plantes a été significativement réduit en l'absence de fertilisation N. Par exemple, 15 jours après la fertilisation en S, la biomasse des feuilles matures était de 5,03 ± 0,38 g MS feuille ^"1 dans la parcelle non fertilisée N, alors que la biomasse dans la parcelle fertilisée N avec 65 kg N ha ^"1 était de 6,70 ± 0,01 g MS feuille ^"1 (p<0,01). Cette diminution de la croissance des plantes non fertilisées N a eu un impact direct sur la teneur en S étant donné que les besoins en S des plantes non fertilisées N étaient moins importants que pour les plantes fertilisées N. En effet, les plantes fertilisées N ont consommé plus de S pour assurer leur croissance. Ainsi le ratio Mo/S était significativement inférieur (Figure 4 G-I) en absence de fertilisation N, ce qui est le reflet d'un besoin moins important en S pour les plantes non fertilisée N.

De la même manière, il a été observé que le ratio Mo/S était plus élevé pour les plantes avec le plus haut niveau de fertilisation N (i.e. 125 kg N ha ^"1 ) indépendamment du niveau de fertilisation S, ce qui reflète également le besoin plus élevé en S des plantes fertilisées N.

Conclusion: Cet exemple montre donc que le ratio Mo/S des feuilles peut aussi être utilisé pour des plantes cultivées en conditions de plein champ. Le ratio Mo/S peut discriminer de façon précoce et durable des plantes ayant des disponibilités variables en S (apporté dans cet exemple par une fertilisation en S).

Exemple 7 : reproductibilité sur différentes espèces de plante

Le ratio Mo/S a été calculé sur des échantillons de feuille de différentes espèces de plante : B. oleracea, T. aestivum, Z. mays, P. sativum and S. lycopersicum, dans des conditions de croissance en serre et durant lesquels l'apport de soufre a été supprimé ou réduit.

Pour chacune des espèces, en condition de carence en S, la teneur en S a été réduite de manière significative et la teneur en Mo a été augmentée de manière significative (Tableau 1, ci-dessous).

he Les résultats ont montré que le ratio Mo/S a été significativement augmenté en condition de carence en S. La valeur du ratio Mo/S a été spécifique de l'espèce de plante analysée, avec des valeurs allant de 3 à 250 pour le ratio Mo/S de référence (i.e. plante control ou +S) et de 27 à 5934 pour les plantes carencées en S (i.e. -S).

Conclusion : le ratio Mo/S est un indicateur fiable pour diagnostiquer l'état de nutrition soufrée indépendamment de l'espèce de plante considérée.

Exemple 8 : impact de la carence en soufre sur la teneur en Cl et P et intérêt du ratio rcl+PVS a) Analyse des ions SC ^2" , Ρθ CI ^" et NC ¹

Les ions ont été extraits de 30 mg d'un échantillon broyé et lyophilisé de feuille de B. Napus cultivé en plein champ et avec différents niveaux de fertilisation N et S selon les modalités de l'exemple 6.

Les ions ont été extraits de l'échantillon suivant les étapes ci-dessous :

(i) Dans un premier temps, l'échantillon de feuille a été mis dans 1,5 mL d'une solution d'éthanol concentrée à 50%,

(ii) La solution obtenue a ensuite été incubée à 40°C pendant 1 heure,

(iii) La solution a ensuite été centrifugée à 12000g pendant 20 min,

(iv) Le surnageant a été collecté,

(v) Le culot a été resuspendu dans 1,5 mL d'eau puis incubé une heure à 95°C

(vi) Les étapes de centrifugation (iii) et de collecte (iv) ont été répétées une deuxième fois et les deux surnageants obtenus à l'étape (iv)ont été mélangés ,

Les surnageants ont ensuite été évaporés sous vide (Concentrator Evaporator RC 10.22, Jouan, Saint-Herblain, France). Le résidu sec a été remis en solution dans 1,5 ml_ d'eau ultra pure et a été filtré sur un filtre de 45 μηι. La teneur en anion a ensuite été mesurée par HPLC avec un détecteur de conductivité (ICS3000, Thermo Scientific-Dionex, Villebon-sur-Yvette, France) avec l'aide d'un tampon de course contenant 4,05 mM Na ₂ CC> ₃ et 1,26 mM NaHC03 et au travers d'une colonne analytique (AS22 4*250 mm, Thermo Scientific-Dionex, Villebon-sur-Yvette, France). b) Analyse des nutriments minéraux S, P, Cl et N

Après séchage et broyage, des échantillons de feuille ont été placés dans une coupelle et la teneur en S, P et Cl a été déterminée par spectrométrie de fluorescence X (Portable XRF SI TITAN 800, Bruker, Kalkar, Germany).

La teneur en S, P et Cl a été déterminée en utilisant des courbes de calibration obtenues par un spectromètre de masse haute résolution couplé à une torche plasma (HR ICP-MS, Thermo Scientific, Elément 2TM, Bremen, Germany).

Exemple 9 : intérêt et rationnel de la prise en compte du ratio CCI+PVS a Intérêt du ratio rcr+NO^+PO^ ^' VSO^

Un champ de colza a été divisé en trois parcelles distinctes, chacune ayant été fertilisée en S à J0 (i.e. premier jour de fertilisation en S) avec différentes quantités de S, de 36, 12 ou 0 kg S ha ^"1 .

Les trois parcelles ont été subdivisées en trois, chaque subdivision ayant un niveau de fertilisation en N différent, 0, 65 ou 125 kg N ha ^"1 .

Des échantillons de feuille ont été prélevés dans chacune des subdivisions (i.e. dans les 6 subdivisions). La teneur en S0 ₄ ^2" , Cl-, NO3 ^" et P0 ₄ ^3" et le ratio (CI ^" +N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" ont été mesurés dans les échantillons à 15 (J 15) et 60 jours (J60) après la fertilisation en S (ou non-fertilisation en S pour les deux subdivisions ayant un niveau de fertilisation en S de 0 kg S ha ^"1 ).

La teneur en S0 ₄ ^2" dans les échantillons de feuille a été significativement réduite en condition de faible fertilisation en S (Figure 5a-c), indépendamment du niveau de fertilisation en N. La diminution de la teneur en S0 ₄ ^2" a été compensée par une augmentation de la teneur en CI ^" , N0 ₃ ^" , et P0 ₄ ^3" (Figure 5d- f)- La teneur la plus basse en (CI ^" +NC>3 ^" +P0 ₄ ^3" ) a été mesurée dans les échantillons de feuille des plantes fertilisées avec la dose la plus élevée en S {Le. 36 kg S ha ^"1 ). Les échantillons de feuille des plantes fertilisées avec N (65 ou 125 kg N ha ^"1 ), sans fertilisation en S, ont présenté le ratio (CI ^" +NC>3 ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" le plus élevé. Les échantillons de feuille des plantes fertilisées avec 36 kg S ha ^"1 de S ont présenté le ratio (Cl ^" +N0 ^3" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" le plus bas. Les échantillons de feuille des plantes fertilisées avec 12 kg S ha ^"1 de S ont présenté un ratio (Cl ^" +N0 ^3" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" intermédiaire. Le ratio (Cl ^" +N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" a donc permis de différencier les trois parcelles en fonction de leur niveau de fertilisation en S (36, 12 ou 0 kg S ha ^"1 ) (figure 5G-I).

Il a été observé des interactions entre la fertilisation en N et la fertilisation en S. On peut supposer que le niveau de croissance des plantes a été significativement réduit en l'absence de N. Par exemple, à J15, la biomasse des feuilles était de 5,03 ± 0,38 g MS feuille ^"1 pour les plantes non fertilisée en N, alors que la biomasse des plantes fertilisée avec 65 kg N ha ^"1 était de 6,70 ± 0,01 g MS feuille ^"1 (p<0,01). Cette diminution de la croissance des plantes non fertilisées en N a eu un impact direct sur la teneur en S0 ₄ ^2" étant donné que les besoins en S0 ₄ ^2" des plantes non fertilisées en N ont été moins importants que pour les plantes fertilisées en N. En effet, les plantes fertilisées avec N ont utilisé plus de S0 ₄ ^2" pour assurer leur croissance. Par exemple, pour un même niveau de fertilisation en S, la teneur en S0 ₄ ^2" dans les échantillons de feuille des plantes sans fertilisation N était significativement plus élevée (figure 5A et C) ou similaire (figure 5B) que la teneur dans les échantillons de feuille des plantes recevant une fertilisation N.

Cependant, la teneur en (C +NC>3 ^" +P0 ₄ ^3" ) dans les échantillons de feuille des plantes avec fertilisation en N et sans fertilisation en S a été inchangée comparé à la teneur en (Cr+NC>3 ^" +P0 ₄ ^3" ) des échantillons de feuille des plantes sans fertilisation en N (figure 5d-f). Par conséquent, le ratio (Cr+N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" était significativement diminué (figure 5g et i) ou était similaire (figure 5h) en absence de fertilisation en N, ce qui reflète un plus faible besoin en S.

De la même manière, la croissance des plante a d'avantage été stimulée avec une fertilisation en N de 125 kg N ha ^"1 , ce qui a eu comme effet d'augmenter les besoin en S et de réduire la teneur en S0 ₄ ^2" dans les feuilles (p<0,05). Cette observation est illustrée en figure 5 b et c.

Il a également été observé en comparant les figures 6h et 6i que le ratio (C +N03 P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" était augmenté pour les plantes ayant reçu la dose la plus importante en N (i.e. 125 kg N ha ^"1 ), ce qui reflète une besoin plus important en S pour ces plantes.

Le ratio (Cl ^" +N0 ^3" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" a également été calculé sur des échantillons de feuille d'autres espèces cultivées en plein champ {B. oleracea, T. aestivum, Z. mays, M. truncatula, S. lycopersicum and B. napus) dans des conditions de fertilisation contrôlées, avec fertilisation S (+S) ou en carence de soufre (-S). Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.

: matière sèche Les résultats ont montré que le ratio (Cl ^" +N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" a été significativement augmenté en condition de carence en S quelque soit l'espèce. Les valeurs pour le ratio (Cl ^" +N0 ^3" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" sont spécifiques de l'espèce de plante analysée. Conclusion : la diminution de la teneur en S0 ₄ ^2" est compensée par une augmentation de la teneur en (Cl ^" +N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" ), et donc une augmentation du ratio (Cr+N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" . Par conséquence, le ratio (Cr+N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" est un indicateur qui permet de diagnostiquer l'état de nutrition soufrée d'une plante, indépendamment de l'espèce de plante considérée. b Validation du ratio fCI+PVS

Afin de faciliter la mise la mise en œuvre de l'invention, une simplification du calcul du ratio (Cl ^" +N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" a été recherché.

Dans un premier temps il a été montré sur les échantillons de feuille de colza que la teneur en ions CI ^" , N0 ₃ ^" , P0 ₄ ^3" et S0 ₄ ^2" était corrélée à la teneur en Cl, N, P et S, respectivement.

La figure 6 montre une corrélation entre la teneur en ions CI ^" , N0 ₃ ^" , P0 ₄ ^3" et S0 ₄ ^2" (mesuré HPLC) et la teneur en Cl, N, P et S (mesuré par spectrométrie de fluorescence X). La teneur en CI ^" , P0 ₄ ^3" et S0 ₄ ^2" est fortement corrélée à la teneur en Cl, P et S (figure 6a-c) avec des coefficients de corrélation de 0,97, 0,70 et 0,91 respectivement.

Inversement, il n'a pas été observé de corrélation entre la teneur en N0 ₃ ^" et la teneur en N (Figure 6d).

Par la suite, il a été montré que le ratio (Cl ^" +N0 ₃ ^" +P0 ₄ ^3" )/S0 ₄ ^2" était corrélé de manière significative avec le ratio (Cl+P)/S (figure 7), avec un coefficient de corrélation de 0,94. Les figures 8b et 8c montrent que cette corrélation est indépendante du stade de développement de la plante. Conclusion: le ratio (Cl+P)/S est un indicateur fiable et facile à mettre en œuvre pour diagnostiquer l'état de nutrition soufrée d'une plante.