基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试 剂盒与应用 技术领域

本发明涉及一种诊断地中海贫血的方法， 特别涉及一种基于液相芯片系统诊断地中海贫 血的方法及试剂盒与应用。 说 背景技术

地中海贫血 （简称地贫） 是世界上最常见的人类单基因遗传性血液病， 是一组由于珠蛋 白基因缺失或点突变， 使血红蛋白中珠蛋白肽链合成减少或不能合成 所致的遗传性溶血性贫 血。 本病主要见于西自地中海沿岸， 中经土耳其、 中东各国， 东至和东南亚各国和中国南部。 中国长江以南各省发病率最高， 其中以广东、 广西、 四川、 云南、 海南、 香港、 台湾多见。

书

根据本病缺乏的珠蛋白链的种类及缺乏程度 给以命名和分类， 分为 α、 β 等几种类型， 其中 以 α、 β 地中海贫血最多见， 也最严重。 本病由于珠蛋白缺失的多样性， 所致缺乏的珠蛋白 链的类型、 数量不一， 临床表现呈多样性， 轻重程度也不同， 有在胎儿及婴幼儿即因极重的 溶血性贫血致死的， 也有需要反复输血进行治疗， 也有虽有血红蛋白异常而一生无任何临床 症状的。 目前该病尚无有效的治疗方法， 且一般的治疗费用昂贵， 给患者及家庭带来巨大的 经济负担和精神痛苦。 因此遗传咨询、 产前诊断和在中国南方及东南亚等高发地区开 展大人 群的分子筛查是防治该疾病的首要途径， 对控制重型地贫患儿的出生， 提高出生人口素质具 有重要意义。

随着对地中海贫血的研究的深入，临床上各种 地贫表型的分子基础也逐步地被人们认识。 目 前 全 世 界 已 报 道 的 珠 蛋 白 基 因 突 变 类 型 有 1000 多 种 (http : AZglobin. cse. psu. edu/hbvar/)。 其中 α -地中海贫血主要是缺失突变， 也有少数的 非缺失型突变。 在中国和东南亚人群中常见的 α -地中海贫血缺失型突变是 α 基因上的 - α 3. 7、 - α 4. 2和 -SEA三种片段缺失； 常见的 α -地中海贫血非缺失型点突变主要为 Hb CS、 Hb QS和 Hb WS三种。 β _地中海贫血的基因突变大多数属于非缺失型� � 是由于 β 基因点突 变造成 β -珠蛋白合成异常。 β _地中海贫血突变位点较多。 这些突变具有种族特异性， 各个 种族都有几种常见的突变类型。 中国及东南亚人群常见的突变频率较高的突变 类型有二十几 种， 大约占中国和东南亚人群突变发生频率的 90%以上 （如表 1所示）。

表 1 中国及东南亚人群 β 珠蛋白基因常见突变位点

序号 突变位点 序号 突变位点

1 CD41-42 (-TCTT) 12 -320A

2 IVS-2-654 ΟΤ 13 -30T>C

3 CD17 Α〉Τ 14 IVS-1-1 G〉T

4 -28A>G 15 IVS-1-5 G〉C 5 CD26 G〉A 16 CD3K-C)

6 CD71-72 (+A) 17 CAP +40-+43 (-AAAC)

7 CD43 G〉T 18 -870A

8 - 29A〉G 19 -31A>G

9 起始密码子 ATG〉AGG 20 CD19 A〉G

10 CD14-15 (+G) 21 CD90 G〉T

11 CD27-28 (+C) 22 IVS-2-1 G〉A

目前， 用于地中海贫血基因诊断的方法主要包括： 跨跃断裂位点 -PCR ( gap-PCR), 聚合 酶链式反应 -等位特异性寡核苷酸杂交 （PCR-AS0)、 聚合酶链反应 -扩增阻抗突变系统 （PCR- ARMS)、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（ PCR_SSCP)、聚合酶链式反应一限制性片段长 度多态分析（PCR-RFLP)等， 这些方法都广泛用于了地中海贫血的基因检测 ， 但是操作繁琐、 检测通量低， 难于用于临床大样本量检测。 目前临床常用的检测 β -地贫突变的方法是 PCR 反向点杂交 （PCR-RDB), 该法同样步骤繁琐， 操作时间长， 不适用于大样本量的检测。

生物芯片 （biochip) 也称微阵列 （microarray), 是 20世纪 90年代初期发展起来的一 种新技术， 它可将多个生物分子 （核酸、 抗原、 抗体） 或细胞以阵列方式固定在面积不大的 基片上。 因此， 可同时分析成千上万种生物分子， 它具有高通量、 高集成、 微型化、 连续化 和自动化等特点， 适用于基因缺陷的检测， 目前已有一些产品应用于了临床。 液相芯片技术 也称悬浮阵列技术（suspension array), 是由美国 Luminex公司研制开发的最新一代诊断技 术平台。 其技术核心是把微小的聚苯乙烯小球用荧光染 色法进行编码 （即通过 2种荧光染料 对微球染色， 调节这 2种荧光染料的比例可获得 100种不同颜色的微球）， 然后将每种颜色的 微球 （或称为荧光编码微球） 交联上 1种针对某个检测物的特定生物探针 （探针通过氨基与 羧基结合到微球表面）。应用时，先把针对不 同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样 本， 在悬液中靶分子与微球表面交联的探针进行特 异性结合，在 1个反应孔内可同时完成多达 100 种不同的生物学反应。 最后用激光流式仪鉴定微球颜色以判断结果， 同时通过靶分子上的报 告分子完成反应的定量分析。 由于分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行 的， 所以其检测 速度极快， 可在 1个微量液相反应体系中同时检测 100个指标。 它同样具有生物芯片的高通 量、 高集成、 微型化、 连续化和自动化等优点， 还具有液相反应的高敏感性、 高重复性、 检 测线性范围宽、 反应快速等优点， 并且该方法操作简便、 快捷、 样品用量少。 可用于免疫分 析、 核酸研究、 酶学分析、 受体、 配体识别分析等研究， 已有多家公司基于此技术平台开发 出了多种基因芯片、 蛋白芯片， 已有部分产品经 FDA批准进入了临床应用。 目前已经有用液 相芯片检测地中海贫血的报道， 但其检测的位点较少， 技术也不够成熟， 达不到临床的需求， 国内外也未见同类产品上市。 发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与 不足， 提供一种基于液相芯片系统诊断地 中海贫血的方法。

本发明的另一目的在于提供实现所述基于液相 芯片系统诊断地中海贫血的方法的试剂 。

本发明的目的在于提供所述的试剂盒的使用方 法。

本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法 ， 包括以下步骤：

( 1 )设计 PCR引物和探针序列， 在与探针互补的一条链的 PCR引物（上游引物或下游引 物） 的 5' 端进行生物素修饰： PCR引物序列见表 2， 其中：

PCR引物序列 （均为 5'

表中的 For表示上游引物， Rev表示下游引物。

探针序列如表 3〜5所示， 探针 5' 末端进行 Aminolinker C12修饰: 表 3 检测 α -ϊ\ 中海贫血非缺失型突变的探针

编号 直 探针 探针序列 （5' -3' )

a -mut 1 Hb QS N GCGGTGCACGCCTCCC

M TGCGGTGCAGGCCTCCC

a -mut 2 Hb WS N CACGCCTCCCTGGACAAGTTC

M CACGCCTCCCCGGACAAGTT

a -mut 3 Hb CS N GCAAATACCGTTAAGCTGGAGCC M GCAAATACCGTCAAGCTGGAGC 其中， N为针对野生型探针， M为针对的突变型探针， 下同。 表 4 检测 α -地中海贫血缺失型突变的探针

表 5 检测 β -ϊ\ 中海贫血突变型探针

探

编号 突变位点 探针序列 （5' -3' ) 针

N CAGGGCTGGGCATAAAAGTCA

β -mut 1 -320A

M CCAGGGCTGGGAATAAAAGTCA

N GGGCTGGGCATAAAAGTCAGG

β -mut 2 -30T>C

M GGCTGGGCACAAAAGTCAGG

N GGCTGGGCATAAAAGTCAGGG

β -mut 3 - 29A〉G

M GCTGGGCATGAAAGTCAGGG

N GCTGGGCATAAAAGTCAGGGC

β -mut 4 -28A>G

M CTGGGCATAGAAGTCAGGGCA

N CTAGCAACCTCAAACAGACACCA

β -mut 5 +40-+43 (-AAAC)

M CACTAGCAACCTCAGACACCATG

N ACAGACACCATGGTGCATCTG

β -mut 6 ATOAGG

M ACAGACACCAGGGTGCATCT

N TACTGCCCTGTGGGGCAAG

β -mut 7 CD14-15 (+G)

M TACTGCCCTGGTGGGGCA

N CTGTGGGGCAAGGTGAACG

β -mut 8 CD17 A〉T

M CTGTGGGGCTAGGTGAACG

N AGTTGGTGGTGAGGCCCTG

β -mut 9 CD26 G〉A

M AGTTGGTGGTAAGGCCCTGG

N GTGGTGAGGCCCTGGGC

β -mut 10 CD27-28 (+C)

M TGGTGAGGCCCCTGGGC

N CCCTGGGCAGGTTGGTATCAA

β -mut 11 IVS-1-1 G〉T

M CCCTGGGCAGTTTGGTATCAAG

N TGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTA

β -mut 12 IVS-1-5 G〉C

M TGGGCAGGTTGCTATCAAGGTTA

N ACCCTTAGGCTGCTGGTGG

β -mut 13 CD3K-C)

M CACCCTTAGGTGCTGGTGGT

N ACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTT

β -mut 14 CD41-42 (-TCTT)

M GGACCCAGAGGTTGAGTCCTTT N GAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGG β -mut 15 CD43 G〉T

M GAGGTTCTTTTAGTCCTTTGGGGA

N CGGTGCCTTTAGTGATGGCC

β -mut 16 CD71-72 ( +A)

M CGGTGCCTTTAAGTGATGGCC

N CTGGGTTAAGGCAATAGCAATATC

β -mut 17 IVS- 2- 654C-〉T

M CTGGGTTAAGGTAATAGCAATATCTC

N GAGCCACACCCTAGGGTTG

β -mut 18 -87 C -〉 A

M GAGCCACACACTAGGGTTG

N GGGCTGGGCATAAAAGTCA

β -mut 19 -31 A〉G

M GGGCTGGGCGTAAAAGTCA

N GGCAAGGTGAACGTGGATG

β -mut 20 CD19 A > G

M GGCAAGGTGGACGTGGATG

N CACACTGAGTGAGCTGCAC

β -mut 21 CD90 G〉T

M CACACTGAGTTAGCTGCAC

N GAACTTCAGGGTGAGTCTATG

β -mut 22 IVS- 2-1 G -〉 A

M GAACTTCAGGATGAGTCTATG

( 2 ) 液相芯片的制备： 将荧光编码微球与步骤 （1 ) 中所述的探针分别偶联， 然后根据 检测目的将偶联好探针的荧光编码微球混合， 得到液相芯片；

( 3 ) 标本检测：

从标本中提取基因组 DNA， 根据检测目的选择步骤 （1 ) 中所述的 PCR引物分别进行缺失 型突变的 α 珠蛋白基因片段和非缺失型突变的 α、 β 珠蛋白基因片段扩增， 分别得到缺失 型突变的 α 珠蛋白基因片段的 PCR扩增产物和非缺失型突变的 α、β 珠蛋白基因片段的 PCR 扩增产物； 接着将两种 PCR扩增产物混合后与步骤（2 )得到的液相芯片进行杂交， 得到杂交 产物； 再用藻红蛋白对杂交产物进行标记， 通过液相芯片检测仪读出检测结果；

步骤（2 )中所述的荧光编码微球优选为美国 Luminex公司的表面羟基修饰的 MicroPlex® 微球；

步骤（2 )中所述的偶联好探针的荧光编码微球优选通� �如下步骤进行制备： 将荧光编码 的微球与 0. 1M、 pH值 4. 5的 2- (N-吗啉代） 乙磺酸 （MES ) 溶液， 混匀， 得到偶联体系； 接 着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷 （EDC)， 避光反应， 得到偶联好探针的荧光编码微球； 步骤（2 )中所述的偶联好探针的荧光编码微球更优选� �过如下步骤进行制备： 将荧光编 码的微球与 0. 1M (M表示 mol/L)、 pH值 4. 5的 2- (N-吗啉代） 乙磺酸 （MES ) 溶液， 混匀， 得到偶联体系； 接着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷 （EDC ) , 避光反应 30min ; 再加入二 氯乙烷（EDC )再次进行避光反应 30min; 探针在偶联体系中的终浓度为 0. 02mM， 二氯乙烷在 偶联体系中的终浓度为 0. 8〜lmg/ml _; 接着用吐温溶液和十二烷基硫酸钠溶液洗涤， 得到偶 联好探针的荧光编码微球；

所述的吐温溶液优选为 Tween-20溶液， 更优选为体积百分比 0. 02% Tween-20溶液； 所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度优选为质量 体积比 0. 1%；

步骤（3 )中所述的缺失型突变的 α 珠蛋白基因片段的扩增条件为： 95 °C 10分钟； （95 °C 45秒、 60°C 1分 15秒、 72°C 2分 30秒） X 30次循环； 72°C 10分钟；

所述的非缺失型突变的 α、 β 珠蛋白基因片段的扩增条件为： 95°C 10分钟； （95°C 30 秒、 55 °C 30秒、 72 °C 30秒） X 45次循环； 72 °C 10分钟；

步骤 （3 ) 中所述的杂交的反应条件优选为 95°C变性 5 min后， 55°C杂交 15 min _;

步骤 （3 ) 中所述的藻红蛋白优选为链霉亲和素 R-藻红蛋白 （ Streptavidin, R-phycoerythrin conjugate, SAPE )；

步骤（3 )中所述的液相芯片检测仪为 Luminex液相芯片检测仪， 参数设置为 Count 100； Doublet Discriminator Gate Value为 5437-24807；

实现上述方法的试剂盒， 包括 PCR弓 I物、 探针和荧光编码微球； 其中， PCR引物如表 2 所示， 探针序列如表 3〜5所示；

所述的荧光编码微球优选为美国 Luminex公司的表面羟基修饰的 MicroPlex®微球； 所述的试剂盒， 更优选包括 PCR引物和液相芯片， 液相芯片为 54种偶联好探针的荧光编 码微球混合得到；

所述的偶联好探针的荧光编码微球为表 3〜5 中所列的探针分别与不同颜色的荧光编码 微球偶联， 共 54种；

所述的液相芯片优选为将 54种偶联好探针的荧光编码微球分散在 1. 5 X TMAC杂交液，每 种偶联好探针的荧光编码微球的浓度优选为 100个 / μ 1 ; 1. 5 X TMAC杂交液的组成的物质终 浓度如下： 4. 5M的 TMAC (四甲基氯化氨）、 质量体积比 0. 15%的十二烷基肌氨酸钠、 pH 8. 0 的 75mM Tris-HCl和 pH 8. 0的 6mM EDTA;

所述的荧光编码微球优选为美国 Luminex公司的表面羟基修饰的 MicroPlex®微球； 所述的偶联好探针的荧光编码微球优选通过如 下步骤得到： 将 MicroPlex®微球和 0. 1M、 pH值 4. 5的 MES (2- (N-吗啉代）乙磺酸）溶液， 混匀， 得到偶联体系， 偶联体系中 MicroPlex® 微球的浓度为 2 X 10 ⁴ 个 / μ 1 ;接着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷（EDC)� ��避光反应 30min; 再加入二氯乙烷（EDC)再次进行避光反应 30min; 探针在偶联体系中的终浓度为 0. 02mM， 二 氯乙烷在偶联体系中的终浓度为 0. 8〜lmg/ml ; 接着用吐温溶液和十二烷基硫酸钠溶液洗涤， 得到偶联好探针的荧光编码微球； 该偶联好探针的荧光编码微球优选置于 PH8. 0、 1 X TE溶液 中进行保存；

所述的吐温溶液优选为 Tween-20溶液， 更优选为体积百分比 0. 02% Tween-20溶液； 所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度优选为质量 体积比 0. 1%；

所述的试剂盒的使用方法， 包括以下步骤：

( l ) PCR扩增： 根据检测目的， 选择 PCR引物分别进行 PCR， 得到 PCR扩增产物； 其中： 缺失型 α -地中海贫血检测的引物选择为： α ^{3 7} For和 α ^{3 7} Rev检测- α 3. 7缺失型突变； α ^{4 2} For禾 Β α ^{4 2} Rev检测- α 4. 2缺失型突变； SEA For和 SEA Rev检测 -SEA缺失型突变； α 2 For和 α 2 Rev检测正常 α 2珠蛋白基因；

非缺失型 α、 β -地中海贫血检测的引物选择为： β -Ml For, β -Ml Rev, β -M2 For, β_Μ2 Rev、 β -M3 For, β _M3 Rev、 β -M4 For, β _M4 Rev、 β _M5 For禾口 β _M5 Rev共同 检测 β 地中海贫血非缺失型突变； α-Μ For和 α -M Rev检测的是非缺失型 α -地中海贫血 点突变 Hb CS、 Hb QS和 Hb WS;

空白对照用无菌水代替标本基因组 DNA进行 PCR反应；

缺失型突变的 α 珠蛋白基因片段 PCR扩增条件为： 95°C 10分钟； （95°C 45秒、 60°C 1 分 15秒、 72°C 2分 30秒） X 30次循环； 72°C 10分钟；

非缺失型突变的 α、 β 珠蛋白基因片段 PCR扩增条件为： 95°C 10分钟； （95°C 30秒、 55 °C 30秒、 72 °C 30秒） X 45次循环； 72 °C 10分钟；

(2) 杂交

杂交反应体系由如下组成： 33 μΐ分散于 1. 5 XTMAC杂交液稀释混合的偶联好探针的 荧光编码微球 （即液相芯片， 包含有 54种微球， 每种微球的浓度分别为 100个 /μ1)， 7 μΐ ρΗ 8.0的 ΙΧΤΕ, 10 μΐ PCR产物混合物； 杂交程序为： 95°C 5 min, 55°C15 min, 循环 1次， 加入 25 μ 1 IX TMAC杂交液稀释的 0.04 μ g链霉亲和素 R_藻红蛋白， 混匀， 55°C 5 min; IX TMAC杂交液的物质组成的终浓度如下： 3M TMAC、 质量体积比 0.1%的十二烷基肌氨 酸钠、 50mM Tris-HCl (pH 8.0)、 4mM EDTA (pH 8.0)；

(3) 上机检测： 使用 Luminex 液相芯片检测仪， 参数设置为 Count 100； Doublet Discriminator Gate Value为 5437-24807， 通过 Luminex附带 XPonent 3.1数据收集软件检 测突变探针 (M)和正常探针 (N)的荧光强度比值分析判断； 判断标准如下：

①非缺失型突变 （点突变） 判读标准

A、 正常标本

各位点相应的突变探针 (M)和正常探针 (N)比值（M/N) 0.5， 各位点相应的正常探针 (N) 和空白对照正常探针 (N)比值

B、 突变杂合标本

有突变的基因位点相应的突变探针 (M)和正常探针 (N)比值 0·5 (M/N) 1.5， 无突变 的基因位点相应的突变探针 (M)和正常探针 (N)比值（M/N) 0.5， 各位点相应的正常探针 (N) 和空白对照正常探针 (N)比值

C、 突变纯合标本

有突变的基因位点相应的突变探针 (M)和正常探针 (N)比值 （M/N) 2, 无突变的基因位 点相应的突变探针 (M)和正常探针 (N)比值（M/N) 0.5， 各位点相应的正常探针 (N)和空白对 照正常探针 (N)比值

D、 突变探针 (M)和正常探针 (N)比值 （M/N) 不在上述判断标准范围内的标本的突变类型 可疑， 需进一步确证 （采取技术重复和测序等方法进行确证）；

② α-地中海贫血缺失型突变判读标准：

检测 α-地贫缺失型突变的探针有 4种： α-del SEA、 a -del 4.2, a -del 3.7和 a 2， 它们的信号值与相应空白对照比值 3判读为阳性， 信号值与相应空白对照比值 3为阴性； A、 正常标本

α 2探针为阳性， 其它 3种探针均为阴性；

Β、 杂合型缺失

α 2探针为阳性， 其它 3种探针有一个为阳性， 即为该探针的杂合型缺失；

C 纯合型缺失

α 2探针为阴性， 其它 3种探针有一个为阳性， 即为该探针的纯合型缺失；

D、 同时两种缺失类型

α 2探针为阴性， 其它探针中有 2种探针为阳性， 即发生了两种类型的缺失。 本发明设计的用于检测 α、 β 地中海贫血基因缺陷类型的探针， 包括缺失型和非缺失型 α _地中海贫血、 β _珠蛋白基因突变。 这些探针经过和荧光编码的微球交联等处理后 就制成 了诊断 α、 β 地中海贫血的液相芯片。 本发明的液相芯片可以仅包含针对 α -珠蛋白基因缺 失 （α -地中海贫血缺失型突变） 检测的液相芯片， 或仅包含针对非缺失型 α -珠蛋白基因突 变（ α -地中海贫血非缺失型突变）检测的液相芯片� � 或仅包含针对 β -珠蛋白基因突变（ β - 地中海贫血突变） 检测的液相芯片， 也可以同时包含检测 α -地中海贫血缺失型突变、 非缺 失型突变以及 β _地中海贫血突变的液相芯片。

本发明设计的用于扩增人类 α、 β 珠蛋白基因的 PCR引物， 针对缺失 α -地中海贫血的 PCR引物 4对， 针对非缺失型 α -地中海贫血 PCR引物 1对， 针对 β -地中海贫血突变的 PCR 引物 5对。

本发明通过将待检样品用本发明的特异性引物 （其中一条 5 ' 末端生物素 biot in修饰） 进行多重 PCR扩增后， 得到生物素标记的产物， 然后与本发明的液相芯片进行杂交， 再用藻 红蛋白进行荧光标记， 最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ：

本发明的液相芯片同时具有生物芯片和液相反 应的优点：①检测耗时短，操作步骤简单， 整个检测流程能在 6个小时内完成； ②自动化程度和检测通量高， 整个反应可以在 96孔板中 完成， 中间手工操作步骤极少， 一次可以同时检测 96个样品； ③可以同时检测 α 地贫和 β 地贫， 本发明可以同时检测非缺失型和缺失型的 α 地中海贫血症或 /和 β 地中海贫血症， 检 测效率大大提高； ④结果稳定可靠， 每一次反应的计数都在上百次以上， 消除了偶然实验波 动造成的影响， 增加了检测的准确性， 仪器直接读出结果， 不受人为主观影响。 具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述 ， 但本发明的实施方式不限于此。

实施例 1

本发明基于液相芯片技术， 建立了一种诊断 α、 β 地中海贫血基因缺陷的方法。本发明 利用液相芯片技术， 运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件 ， 对地中海贫血基因缺陷 进行序列分析， 设计出针对地中海贫血基因缺陷片段的 PCR引物和特异性探针， PCR引物反 向 5 ' 末端进行生物素修饰； 特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联制成 特异性检测微球， 即液相芯片。 液相芯片能够特异性的识别地中海贫血基因缺 陷片段， 经过多重 PCR扩增后与 液相芯片杂交， 最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。 具体如下：

(一） 设计引物

中国及东南亚人群常见的 α _珠蛋白基因缺失型突变有 _SEA、 _ α ³ · ⁷ 、 - α ⁴ · ² 三种； 常见的 α -珠蛋白非缺失型突变有 Hb CS、 Hb QS和 Hb WS三种。 背景技术中的表 1是中国及东南亚 人群常见 22个 β _珠蛋白基因突变位点，大约占中国及东南亚� �群突变发生频率的 98%以上。 从 NCBI的 GenBank上下载所有地中海贫血基因缺陷的核酸� �列，对所有基因缺陷的位置在基 因组的分布和缺陷类型进行分析， 设计的 PCR引物（如表 2所示）和探针序列 （如表 3〜5所 示）， 其中在与探针互补的链的 PCR 引物的 5 ' 端进行生物素修饰， 探针 5 ' 末端进行 Ami no l inker C12修饰。

(二） 液相芯片的制备

具体反应过程如下： 取出 40 μ 1 ( 1 X 10 ⁵ 个） 美国 Luminex公司研制的表面羟基修饰的 MicroPlex®微球， 12000rpm离心 2min后弃上清， 在沉淀中加入 5 μ 1 0. 1Μ、 ρΗ 4· 5的 MES 溶液 (2- (N-吗啉代）乙磺酸）， 混匀得到偶联体系。 将探针稀释至 0. lmM， 在偶联体系中加入 1 μ 1。 然后加入 2. 5 μ 1 10m _g /ml EDC (二氯乙烷）， 混匀后避光放置 30min。 再次加入 2. 5 μ 1 lOmg/ml EDC, 混匀避光放置 30min。用 0. 2ml体积百分比 0. 02% Tween- 20和质量体积比 0. 1% 的 SDS (十二烷基硫酸钠） 溶液分别各洗一次， 最后将微球重新悬浮于 ΙΟ μ Ι Ι Χ ΤΕ (ρΗ8. 0， 其中的物质组成是 10mM Tris-HCl 、 ImM EDTA) 溶液中， 得到偶联好探针的微球。 表 3〜5 中所示的探针分别与不同颜色的荧光编码微球 偶联， 各探针偶联相对应的微球编号见表 6。 将偶联好探针的微球混匀， 使用血细胞计数器计数微球数量 （计数四角 4个大方格的数目后 换算为每微升微球个数）， 再 4°C避光保存。 将上述各种偶联好探针的微球混合， 使用 1. 5 X TMAC (组成的物质终浓度如下： 4. 5M的 TMAC (四甲基氯化氨）、 质量体积比 0. 15%的十 二烷基肌氨酸钠、 pH 8. 0的 75mM Tris-HCl和 pH 8. 0的 6mM EDTA) 稀释， 使每种微球的浓 度分别为 100个 / μ 1， 得到液相芯片， 待进行杂交检测。 探针偶联对应的微球编码

探针编号 微球编号 探针编号 微球编号

a -mut 1 (N) Bead region β -mut 9 (M) Bead region 74#

49# beads beads

a -mut 1 (Μ) Bead region β -mut 10 (N) Bead region 46#

50# beads beads

α -mut 2 (Ν) Bead region β -mut 10 (M) Bead region 73#

51# beads beads

α -mut 2 (Μ) Bead region β -mut 11 (N) Bead region 47#

53# beads beads a -mut 3 (N) Bead region β -mut 11 (M) Bead region 66# 54# beads beads a -mut 3 (M) Bead region β -mut 12 (N) Bead region 52#

56# beads beads a -del SEA Bead region β -mut 12 (M) Bead region 65#

48# beads beads a -del 3. 7 Bead region β -mut 13 (N) Bead region 55#

59# beads beads a -del 4. 2 Bead region β -mut 13 (M) Bead region 64#

60# beads beads a -del a 2 Bead region β -mut 14 (N) Bead region 61#

67# beads beads β -mut 1 (N) Bead region β -mut 14 (M) Bead region 63#

68# beads beads β -mut 1 (M) Bead region β -mut 15 (N) Bead region 33#

69# beads beads β -mut 2 (N) Bead region β -mut 15 (M) Bead region 72#

79# beads beads β -mut 2 (M) Bead region β -mut 16 (N) Bead region 35#

80# beads beads β -mut 3 (N) Bead region β -mut 16 (M) Bead region 75#

83# beads beads β -mut 3 (M) Bead region β -mut 17 (N) Bead region 37#

85# beads beads β -mut 4 (N) Bead region β -mut 17 (M) Bead region 78#

87# beads beads β -mut 4 (M) Bead region β -mut 18 (N) Bead region 30#

88# beads beads β -mut 5 (N) Bead region β -mut 18 (M) Bead region 40#

89# beads beads β -mut 5 (M) Bead region β -mut 19 (N) Bead region 31#

90# beads beads β -mut 6 (N) Bead region β -mut 19 (M) Bead region 41#

42# beads beads β -mut 6 (M) Bead region β -mut 20 (N) Bead region 32#

77# beads beads β -mut 7 (N) Bead region β -mut 20 (M) Bead region 57#

43# beads beads β -mut 7 (M) Bead region β -mut 21 (N) Bead region 38#

76# beads beads β -mut 8 (N) Bead region β -mut 21 (M) Bead region 48#

44# beads beads β -mut 8 (M) Bead region β -mut 22 (N) Bead region 39#

75# beads beads β -mut 9 (N) Bead region β -mut 22 (M) Bead region 70# 45# beads beads

(三） 标本检测

(1) 待检样品的多重 PCR扩增

对 8个样本进行检测， 每个样本有两个反应体系， 其中：

检测缺失型突变的 α 珠蛋白基因片段的体系所用的引物为表 3中所示的 a ³⁷ For、 α ³ · ⁷ Rev、 α ⁴ · ² For, α ⁴² R _ev 、 SEA For 、 SEA Rev、 a 2 For和 a 2 Rev; 每个反应体系 50μ1， 其中 10XPCR缓冲液 5μ1、 dNTP (各 2· 5mM) 4μ1、 Hot Start Taq Enzyme 1· 5U、 前述引 物浓度各为 0.25 μΜ、 待检样品基因组 DNA 100 ng; 扩增条件为： 95°C 10分钟； （95°C 45 秒、 60°C 1分 15秒、 72°C 2分 30秒） X 30次循环； 72°C 10分钟。

检测非缺失型突变的 α、β珠蛋白基因片段的体系所用的引物为表 3中所示的 a-MFor、 α -M Rev、 β -Ml For, β -Ml Rev、 β _M2 For, β _M2 Rev、 β _M3 For, β _M3 Rev、 β _M4 For, β -M4 Rev, β -M5 For禾卩 β -M5 Rev; 每个反应体系 50μ1， 其中 10 X PCR缓冲液 5μ1、 dNTP (各 2.5mM) 4μ1、 Hot Start Taq Enzyme 1.5U、 前述引物浓度各为 0.25 μ M、 待检样 品基因组 DNA 100 ng _; 扩增条件为： 95°C 10分钟； （95°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒） X 45次循环； 72 °C 10分钟。

PCR产物混合后置 4°C待杂交检测。

(2) 扩增产物与液相芯片的杂交

将 PCR产物与步骤 （二） 制备的液相芯片进行杂交， 杂交体系为 50μ1， 其中含液相芯 片 33 μ 1, PCR产物 10μ1， 加入 IXTE (pH 8.0， 其中的物质组成是 10mM Tris-HCl 、 ImM EDTA) 补充体积至反应体积为 50 μ lo 95°C变性 5 min后， 55°C杂交 15 min。 加入 25 μ 1 1 XTMAC 杂交液 （其中的物质的终浓度如下： 3M TMAC、 体积百分比 0.1% 十二烷基肌氨酸钠 溶液、 50mM Tris-HCl pH 8.0、 4mM EDTA pH 8.0) 稀释的 0.04 μ g链霉亲和素 R_藻红蛋白， 混匀， 55°C 5 min, 得到杂交产物， 等待上机检测；

(3) 上机检测

杂交产物上机检测 （Luminex 液相芯片检测仪参数设置为 Count 100； Doublet

Discriminator Gate Value为 5437-24807)， 仪器读出各探针荧光信号值 MFI, 通过 Luminex 附带 XPonent 3.1数据收集软件获得突变探针 (M)和正常探针 (N)的荧光强度比值及 α 珠蛋白 基因缺失型突变检测探针的荧光信号值进行判 断分析检测结果， 结果如表 7〜9所示。

表 7 8个样本的检测结果 （荧光信号值 MFI)

标本

1 2 3 4 5 6 7 8 Neg PCR 探针

a -mut 1 N 545 745 712 59 694 564 571 781 35

M 67 97 77 606 75 63 67 83 43

a -mut 2 N 570 780 726 681 696 536 633 653 44

M 70 72 529 92 74 51 92 71 39

a -mut 3 N 641 716 687 697 645 696 580 546 40 M 77 59 96 51 59 51 57 52 47 a -del SEA 67 91 55 52 53 71 93 61 34 a -del 4. 2 68 89 99 52 99 72 99 742 39 a -del 3. 7 92 87 67 88 90 63 611 54 47 a 2 661 657 631 542 519 752 763 686 33

N 662 513 611 684 671 608 632 798 36 β -mut 1

M 89 100 88 90 77 64 92 64 34

N 510 617 794 665 627 526 553 639 50 β -mut 2

M 50 84 90 81 94 65 63 81 44

N 733 769 559 562 763 693 761 706 39 β mut 3

M 68 70 53 95 83 56 92 92 46

N 508 544 731 686 684 551 604 629 34 β -mut 4

M 66 55 91 67 82 60 87 98 45

N 781 680 545 689 515 520 543 800 42 β mut 5

M 64 100 57 71 97 53 70 77 43

N 790 633 775 643 610 562 723 539 34 β mut 6

M 83 61 84 57 90 99 56 77 41

N 562 559 603 766 743 520 512 534 43 β -mut 7

M 82 73 71 66 72 64 52 83 43

N 77 727 584 549 706 662 554 580 43 β -mut 8

M 551 71 83 92 94 72 56 89 43

N 603 573 532 522 593 785 753 765 43 β -mut 9

M 82 90 53 59 89 67 72 82 43

N 747 757 647 550 682 576 659 586 35 β -mut 10

M 58 60 54 66 71 50 67 79 40

N 787 675 628 770 531 588 629 693 32 β -mut 11

M 72 61 100 73 68 51 61 66 36

N 736 560 703 624 522 706 676 753 36 β -mut 12

M 55 85 95 86 55 83 87 82 35

N 676 540 699 736 614 640 720 572 34 β -mut 13

M 82 561 65 50 88 85 57 98 48

N 525 583 755 640 553 770 747 791 37 β -mut 14

M 100 67 79 92 64 63 93 83 41

N 598 572 739 731 656 747 599 657 48 β -mut 15

M 55 53 64 76 78 88 88 62 47

N 780 659 722 560 661 773 720 759 38 β -mut 16

M 56 70 64 76 82 92 74 63 46

N 657 595 626 757 691 667 796 651 50 β -mut 17

M 70 84 84 62 64 54 72 59 42

N 1002 860 920 815 783 990 820 760 33 β -mut 18

M 89 61 73 67 83 95 75 65 41

N 770 820 679 902 883 957 713 819 47 β -mut 19

M 53 61 58 81 77 89 72 80 39 β -mut 20 N 1108 970 992 861 1009 1077 911 1002 40 M 109 88 95 80 100 110 93 98 45

N 770 810 907 885 726 873 949 882 49

β -mut 21

M 75 83 89 71 69 91 97 90 37

N 705 831 730 819 783 855 796 870 42

β -mut 22

M 66 72 69 77 71 82 80 83 39 表 8 样本的点突变类型分析结果

表 9 样本的缺失型突变分析结果

可见， 本发明能准确检出地贫患者。 使用本发明所述的方法和试剂盒， 约 6小时能得出结 果。 现在临床上使用的 PCR-RDB方法， 需要 2日才能完成。 而且， 对于大样本量检测， 本发明 与 PCR-RDB方法相比， 更具有优势。

应用本发明所述的方法和试剂盒对 230例的样本进行了检测，与经典的测序方法比 较准确 率达 100%。 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制 ， 其 他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所 作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等 效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 SEQUENCE LISTING

〈110〉 广东省妇幼保健院

〈120〉 基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试 剂盒与应用 < 130> 1

〈160〉 74

〈170〉 Patentln version 3. 5

〈210〉 1

〈211〉 21

〈212〉 DNA

<213> Art ificial Sequence

〈220〉

〈223〉 SEA For

〈400〉 1

agcgatctgg gctctgtgtt c 210〉 2

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 SEA Rev

〈400〉 2

ccaagcccac gttgtgttca tg

〈210〉 3

〈211〉 18

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 a 3. 7 For

〈400〉 3

cccctcgcca agtccacc

〈210〉 4

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence

<220>

〈223〉 a 3. 7 Rev

〈400〉 4

tcaaagcact ctagggtcca gc 〈210〉 5

〈211〉 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a 4. 2 For

<400> 5

cagtttaccc atgtggtgcc t

〈210〉 6

〈211〉 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a 4. 2 Rev

<400> 6

cccgttggat cttctcattt cc

〈210〉 7

〈211〉 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a 2 For

<400> 7

tacccatgtg gtgcctccat

〈210〉 8

〈211〉 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a 2 Rev

<400> 8

ttctcatttc ccctccctgt ct

〈210〉 9

〈211〉 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

〈223〉 a - M For

<400> 9

ctcttctctg cacagctcct aa <210> 10 〈211〉 24

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a -M Rev

<400> 10

ctgcccactc agactttatt caaa

〈210〉 11

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

〈223〉 β - Ml For

〈400〉 11

acaggtacgg ctgtcatcac tt

〈210〉 12

<211> 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 -Ml Rev

<400> 12

cctcaggagt cagatgcacc

〈210〉 13

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

〈223〉 β -Μ2 For

〈400〉 13

agaagtctgc cgttactgcc

〈210〉 14

<211> 24

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -Μ2 Rev

〈400〉 14

attggtctcc ttaaacctgt cttg 〈210〉 15 〈211〉 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -Μ3 For

〈400〉 15

actctctctg cctattggtc tatt

<210> 16

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

<223> β -Μ3 Rev

〈400〉 16

tgaggttgtc caggtgagc

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -M4 For

<400> 17

gcacctttgc cacactgagt

〈210〉 18

〈211〉 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

〈223〉 β -Μ4 Rev

〈400〉 18

ccacactgat gcaatcattc gtct

<210> 19

<211> 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence <220>

<223> β -Μ5 For

<400> 19

catgcctctt tgcaccattc ta 〈210〉 20

<2Π> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -Μ5 Rev

〈400〉 20

tagctggatt gtagctgcta ttag

<210> 21

〈211〉 16

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

<223> a -mut 1 (N)

〈400> 21

gcggtgcacg cctccc

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a -mut 1 (M)

<400> 22

tgcggtgcag gcctccc

〈210〉 23

〈211〉 21

〈212〉 DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> a -mut 2 (N)

〈400〉 23

cacgcctccc tggacaagtt c

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

<223> a -mut 2 (M)

<400> 24

cacgcctccc cggacaagtt 〈210〉 25 〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

<223> a -mut 3 (N) 〈400〉 25

gcaaataccg ttaagctgga gcc

〈210〉 26

〈211〉 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a -mut 3 (M) 〈400〉 26

gcaaataccg tcaagctgga gc

<210> 27

<211> 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a -del SEA

〈400〉 27

tgacgctgtc tgcttaaggc cc

〈210〉 28

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

<223> α - del

<400> 28

catgcctgta aacccaccta ct

〈210〉 29

〈211〉 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a -del 3. 7 〈400〉 29

tggaggaggg aaagtggagc ca 〈210〉 30

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 a 2

〈400〉 30

ccgcgcaggc cccgcccggg ac

〈210〉 31

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 1 (N)

〈400〉 31

cagggctggg cataaaagtc a

〈210〉 32

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 -mut 1 (M) 〈400〉

ccagggctgg gaataaaagt ca

<210> 33

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 2 (N)

〈400〉 33

gggctgggca taaaagtcag g

<210> 34

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 2 (M)

〈400〉 34

ggctgggcac aaaagtcagg 〈210〉 35

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

〈223〉 β -mut 3 (N)

〈400〉 35

ggctgggcat aaaagtcagg g

〈210〉 36

〈211〉 20

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 3 (M)

〈400〉 36

gctgggcatg aaagtcaggg

<210> 37

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 4 (N)

〈400〉 37

gctgggcata aaagtcaggg c

〈210〉 38

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

<223> β -mut 4 (M)

〈400〉 38

ctgggcatag aagtcagggc a

〈210〉 39

〈211〉 23

〈212〉 DNA

<213> Art ificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 5 (N)

〈400〉 39

ctagcaacct caaacagaca cca 〈210〉 40 〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 5 (M) 〈400〉 40

cactagcaac ctcagacacc atg

〈210〉 41

〈211〉 21

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 -raut 6 (N)

〈400〉 41

acagacacca tggtgcatct g

〈210〉 42

<211> 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

<223> β -mut 6 (M)

〈400〉 42

acagacacca gggtgcatct

<210> 43

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

〈223〉 β -mut 7 (N)

〈400〉 43

tactgccctg tggggcaag

〈210〉 44

〈211〉 18

〈212〉 DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 7 (M)

〈400〉 44

tactgccctg gtggggca <210> 45

<211> 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

<223> β -mut 8 (N)

〈400> 45

ctgtggggca aggtgaacg

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

<223> β -mut 8 (M)

<400> 46

ctgtggggct aggtgaacg

〈210〉 47

<211> 19

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

<223> β -mut 9 (N)

<400> 47

agttggtggt gaggccctg

〈210〉 48

<211> 20

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 9 (M)

<400> 48

agttggtggt aaggccctgg

〈210〉 49

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

<223> β -mut 10 (N)

<400> 49

gtggtgaggc cctgggc 〈210〉 50 〈211〉 17

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence 〈220〉

<223> β -mut 10 (M) 〈400〉 50

tggtgaggcc cctgggc

〈210〉 51

〈211〉 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 11 (N)

〈400〉 51

ccctgggcag gttggtatca a

<210> 52

<211> 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 11 (M)

<400> 52

ccctgggcag tttggtatca ag

〈210〉 53

〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

<223> β -mut 12 (N)

〈400〉 53

tgggcaggtt ggtatcaagg tta

〈210〉 54

〈211〉 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 12 (M)

〈400〉 54

tgggcaggtt gctatcaagg tta 〈210〉 55

〈211〉 19

〈212〉 DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 13 (N)

〈400〉 55

acccttaggc tgctggtgg

<210> 56

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -隠 t 13 (M)

〈400> 56

cacccttagg tgctggtggt

〈210〉 57

〈211〉 23

〈212〉 DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 14 (N)

〈400〉 57

acccagaggt tctttgagtc ctt

<210> 58

〈211〉 22

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β - mut 14 (M) <400> 58

ggacccagag gttgagtcct tt

〈210〉 59

〈211〉 23

〈212〉 DNA

〈213〉 Art ificial Sequence <220>

〈223〉 β - mut 15 (N) 〈400〉 59

gaggttcttt gagtcctttg ggg 〈210〉 60

〈211〉 24

〈212〉 DNA

<213> Art ificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 15 (M)

〈400〉 60

gaggttcttt tagtcctttg ggga

〈210〉 61

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 16 (N)

〈400〉 61

cggtgccttt agtgatggcc

〈210〉 62

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 16 (M)

〈400〉 62

cggtgccttt aagtgatggc c

〈210〉 63

〈211〉 24

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

<223> β -mut 17 (N)

〈400〉 63

ctgggttaag gcaatagcaa tatc

〈210〉 64

〈211〉 26

〈212〉 DNA

<213> Art ificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 17 (M)

〈400〉 64

ctgggttaag gtaatagcaa tatctc <210> 65

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 18 (N)

〈400〉 65

gagccacacc ctagggttg

<210> 66

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 18 (M) 〈400〉 66

gagccacaca ctagggttg

<210> 67

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 19 (N)

〈400〉 67

gggctgggca taaaagtca

<210> 68

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 19 (M)

〈400〉 68

gggctgggcg taaaagtca

<210> 69

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 20 (N)

〈400〉 69

ggcaaggtga acgtggatg <210> 70 〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence <220>

<223> β -mut 20 (M) 〈400〉 70

ggcaaggtgg acgtggatg

〈210〉 71

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 21 (N)

<400> 71

cacactgagt gagctgcac

〈210〉 72

〈211〉 19

〈212〉 DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> β -mut 21 (M)

〈400〉 72

cacactgagt tagctgcac

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉

〈223〉 β -mut 22 (N)

<400> 73

gaacttcagg gtgagtctat g

〈210〉 74

〈211〉 21

〈212〉 DNA

<213> Artificial Sequence <220>

〈223〉 β -mut 22 (M)

〈400〉 74

gaacttcagg atgagtctat g