DEGENERACIÓN MUSCULAR

La presente invención se encuadra en el campo de la biología molecular y la medicina, específicamente dentro de los métodos basados en la cuantificación de la expresión de biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la degeneración muscular, preferiblemente de la degeneración muscular provocada por enfermedades de motoneurona, más preferiblemente de la degeneración muscular provocada por esclerosis lateral amiotrófica (ELA), así como dentro de los kits para el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de este tipo de enfermedades.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), también conocida como enfermedad de Lou Gehrig, es una enfermedad neurodegenerativa que cursa con una degeneración progresiva de las neuronas motoras encargadas de controlar los músculos voluntarios, favoreciendo su pérdida irreversible y consecuentemente la muerte del paciente. Esta enfermedad pertenece a un grupo de dolencias llamado enfermedades de las neuronas motoras o enfermedades de motoneurona.

La ELA es una de las enfermedades de motoneurona más comunes en el mundo y afecta a personas de todas las razas y etnias. Representa la tercera causa de muerte debida a enfermedades neurodegenerativas en individuos adultos, después del Alzheimer y el Parkinson. Generalmente afecta a personas de entre 40 y 60 años, aunque también pueden desarrollarla personas de mayor o menor edad, siendo más frecuente en los hombres que en las mujeres.

Las neuronas motoras son las células nerviosas localizadas en el cerebro, el tallo del cerebro, y la médula espinal, que sirven como unidades de control y enlaces de comunicación vital entre el sistema nervioso y los músculos voluntarios del cuerpo. Los mensajes de las neuronas motoras cerebrales (llamadas neuronas motoras superiores) son transmitidos a las neuronas motoras en la médula espinal (neuronas motoras inferiores) y de allí a cada músculo en particular. En la ELA, tanto las neuronas motoras superiores como las inferiores se degeneran o mueren y dejan de enviar mensajes a los músculos, los cuales, imposibilitados funcionalmente, gradualmente se debilitan, se gastan (atrofia) y se contraen (fasciculaciones) conduciendo finalmente a una parálisis. Por ello, la ELA ocasiona debilidad que se manifiesta en un amplio rango de discapacidades, ya que eventualmente quedan afectados todos los músculos que se encuentran bajo control voluntario, perdiendo así la capacidad de controlar el movimiento. Además, cuando fallan los músculos del diafragma y de la pared torácica, los pacientes pierden la capacidad de respirar sin un ventilador o respirador artificial. La mayoría de las personas con ELA mueren de fallo respiratorio, generalmente entre los 3 y 5 años desde el comienzo de los síntomas. Sin embargo, alrededor del 10% de los pacientes con ELA sobreviven 10 años o más.

En la actualidad, la etiología de la ELA es desconocida, aunque se han propuesto diversas causas posibles de la neurodegeneración, como son la excítotoxicidad, tono excitatorio excesivo, proteínas desnaturalizadas, producción de energía defectuosa, metabolismo y transporte de calcio anormal y activación de proteasas y endonucleasas. De todos los casos de ELA, un 90 a 95% ocurre aparentemente de manera aleatoria (ELA esporádica) sin ningún factor de riesgo claramente asociado. Bajo estas circunstancias, los pacientes no tienen una historia familiar de la enfermedad y no se considera que los miembros de su familia tengan un riesgo mayor de desarrollarla. Por el contrario, la forma familiar de ELA, representada en el 5 al 10% del total de los casos, generalmente resulta de un patrón hereditario que responde a una herencia autosómica dominante, aunque también se han descrito casos de ELA familiar debida a una herencia autosómica recesiva. Un 20% de todos los casos familiares resulta de una mutación específica en la enzima conocida como superóxido dismutasa 1 (SOD1 ). Sin embargo, no todos los casos familiares de ELA se deben a esta mutación, por lo tanto es claro que existen otras causas genéticas no identificadas. En cuanto al diagnóstico de la enfermedad, son varias las pruebas clínicas empleadas rutinariamente (Merit Cudkowicz, et al., 2004, NeuroRx: The Journal oí the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, 1 :273-283), destacándose dentro de ellas la electromiografía (EMG). No obstante, el tiempo de espera desde el comienzo de los síntomas hasta el diagnóstico clínico definitivo suele prolongarse varios meses, limitando el uso de una terapia efectiva. Este lapso temporal podría verse disminuido radicalmente mediante la utilización de biomarcadores. Por ello, los estudios de investigación biomédica de esta enfermedad se han centrado principalmente en la búsqueda de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico capaces de proporcionar la información clínica necesaria para que pueda aplicarse un tratamiento más efectivo, el cual podría tener lugar incluso desde el comienzo de los síntomas. Estos biomarcadores permitirían además monitorear la eficacia de las drogas administradas durante un tratamiento o estudiadas durante los ensayos clínicos. Los fluidos y tejidos biológicos que se han empleado para detectar estos biomarcadores, en animales modelo y en pacientes de ELA, han sido principalmente suero, líquido cefalorraquídeo, médula espinal y cerebro (Ryberg H., Bowser R., 2008, Proteomics, 5:249-262; Ryberg H., et al., 2010, Muscle&Nerve, 42:104-1 1 1 ). En este sentido se han propuesto biomarcadores para el diagnóstico y detección de la progresión de ELA a partir de muestras de sangre, plasma, suero o fluido cerebroespinal (WO2010061283; WO2008044213).

Por otro lado, el músculo esquelético es decisivo en el diagnóstico clínico desde el punto de vista de la EMG. Teniendo en cuenta además que este tejido es uno de los más dañados por la enfermedad y que se puede abordar de una forma menos invasiva que el líquido cerebroespinal y en etapas más tempranas de la enfermedad, éste también ha sido estudiado en algunos análisis de expresión génica en ratones transgénicos modelo de la enfermedad, como son los ratones que expresan la SOD1 humana mutada en las posiciones G86R o G93A (González de Aguilar, J. L, et al., 2008, Physiological Genomics, 32:207-218; Kevin H.J. Park and Inez Vincent, 2008, Biochim Biophys Acta, 1782(7-8) :462-468).

No obstante, a pesar de los esfuerzos realizados hasta la fecha no se dispone de un biomarcador fiable que pueda ser empleado en la práctica clínica para el diagnóstico o pronóstico de la ELA, por lo que continúa siendo una necesidad su descubrimiento. La identificación de tales biomarcadores moleculares permitiría llevar a cabo un diagnóstico temprano de la enfermedad, lo cual posibilitaría a su vez la pronta administración de un tratamiento efectivo. Además, se dispondría así de una valiosa herramienta que ayudaría a realizar un seguimiento de los efectos de las terapias administradas al paciente y vigilar el progreso o evolución de la enfermedad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos basados en la cuantificación de un conjunto de biomarcadores para llevar a cabo el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la degeneración muscular, preferiblemente de la degeneración muscular provocada por enfermedades de motoneurona, más preferiblemente de la degeneración muscular provocada por esclerosis lateral amiotrófica (ELA), así como un kit para el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de este tipo de enfermedades.

Ya que los biomarcadores cuantificados en los métodos de la presente invención se analizan, preferiblemente, a partir de muestras biológicas aisladas de músculo esquelético, principal tejido afectado por la degeneración muscular en ELA, el patrón de expresión de dichos biomarcadores en este tejido dañado por la enfermedad es representativo de situaciones de degeneración muscular. Esta degeneración muscular es un proceso común a diversas enfermedades que afectan al músculo esquelético. Por ello, los métodos de la invención son de utilidad en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la degeneración muscular causada tanto por enfermedades de naturaleza miopática como por enfermedades neuromusculares, aunque preferiblemente son útiles en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la degeneración muscular provocada por enfermedades de motoneurona, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la ELA.

En la presente invención se demuestra que el gen Col19 1 se encuentra sobreexpresado en muestras biológicas aisladas de pacientes que presentan degeneración muscular como es, por ejemplo, aunque sin limitarnos, el caso de pacientes de ELA, con respecto a individuos sanos que no presentan dicha degeneración. Por ello, este gen puede considerarse un biomarcador aplicable en la práctica clínica para el diagnóstico temprano de la degeneración muscular, presentando la ventaja, frente a otros métodos rutinarios de detección de este tipo de procesos degenerativos, de que permite reducir el tiempo de espera entre el inicio de los síntomas y el establecimiento de un diagnóstico, lo que posibilita la administración de un tratamiento desde etapas tempranas de la enfermedad responsable de dicha degeneración.

Por ello, un aspecto de la invención se refiere al uso del gen Col19 1 o de los productos de su expresión para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la degeneración muscular. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la degeneración muscular está provocada por una enfermedad de motoneurona. En una realización más preferida, la enfermedad de motoneurona se selecciona de la lista que comprende: atrofia muscular espinal, atrofia bulboespinal, atrofia muscular progresiva, esclerosis lateral primaria, paraplejía espástica hereditaria, paraplejía espástica tropical, parálisis bulbar, parálisis pseudobulbar, adrenomieloneuropatía, latirismo, poliomielitis aguda, síndrome postpolio, apnea motora multifocal, amiotrofía focal benigna o esclerosis lateral amiotrófica. En una realización aun más preferida, la enfermedad de motoneurona es esclerosis lateral amiotrófica. El gen Col19 1 o Col19a1 es el gen del colágeno tipo XIX alfa 1 ("collagen, type XIX, alpha 1 ", según su nomenclatura en inglés), cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 12823 en ratón y 1310 en humano, y cuya función se ha relacionado con la adhesión celular, la organización de la matriz extracelular y el desarrollo y la diferenciación celular del músculo esquelético, como por ejemplo, el músculo esofágico, entre otros.

Además del gen Col19 1, otro gen, IMPA 1, se encuentra sobreexpresado en muestras biológicas aisladas, preferiblemente en linfocitos, de pacientes que presentan degeneración muscular como es, por ejemplo, aunque sin limitarnos, el caso de pacientes de ELA, con respecto a individuos sanos que no presentan dicha degeneración. Por ello, este gen también puede considerarse un biomarcador aplicable en la práctica clínica para el diagnóstico temprano de la degeneración muscular. Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso de los genes Col19a1 y/o IMPA1 o de los productos de su expresión para el diagnóstico de la degeneración muscular. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de los genes Col19 1 e IMPA 1 o de los productos de su expresión para el diagnóstico de la degeneración muscular. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la degeneración muscular está provocada por una enfermedad de motoneurona. En una realización más preferida, la enfermedad de motoneurona se selecciona de la lista que comprende: atrofia muscular espinal, atrofia bulboespinal, atrofia muscular progresiva, esclerosis lateral primaria, paraplejía espástica hereditaria, paraplejía espástica tropical, parálisis bulbar, parálisis pseudobulbar, adrenomieloneuropatía, latirismo, poliomielitis aguda, síndrome postpolio, apnea motora multifocal, amiotrofía focal benigna o esclerosis lateral amiotrófica. En una realización aun más preferida, la enfermedad de motoneurona es esclerosis lateral amiotrófica. El gen IMPA 1 es el gen también conocido como "inositol (myo)-1 (or 4)- monophosphatase 1 ", según su nomenclatura en inglés, cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 55980 en ratón y 3612 en humano, y cuya función se ha relacionado con la homeostasis del inositol.

Por otro lado, la presente invención demuestra que la variación en los niveles de expresión del gen Col19 1 a lo largo del proceso de degeneración muscular se encuentra correlacionada significativamente con la evolución de este proceso, por lo que el análisis de dicha variación de la expresión génica a lo largo del proceso degenerativo, a partir de varias muestras biológicas aisladas del paciente tomadas a diferentes tiempos, permite determinar la velocidad de progresión de la degeneración muscular si se comparan los valores de variación de la expresión génica obtenidos para el paciente con unos niveles de variación de la expresión génica de referencia. Ocurre lo mismo para el gen NOGO A. Por lo tanto, estos dos genes se proponen como biomarcadores para el pronóstico y seguimiento de la degeneración muscular. Dicho pronóstico y seguimiento es de utilidad, por ejemplo, para determinar la efectividad de un tratamiento que esté siendo administrado a un paciente y catalogar a este último como efectivo o no efectivo.

Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso de los genes Col19a1 y/o NOGO A o de los productos de su expresión para el pronóstico y seguimiento de la degeneración muscular. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de los genes Col19a1 y NOGO A o de los productos de su expresión para el pronóstico y seguimiento de la degeneración muscular. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la degeneración muscular está provocada por una enfermedad de motoneurona. En una realización más preferida, la enfermedad de motoneurona se selecciona de la lista que comprende: atrofia muscular espinal, atrofia bulboespinal, atrofia muscular progresiva, esclerosis lateral primaria, paraplejía espástica hereditaria, paraplejía espástica tropical, parálisis bulbar, parálisis pseudobulbar, adrenomieloneuropatía, latirismo, poliomielitis aguda, síndrome postpolio, apnea motora multifocal, amiotrofía focal benigna o esclerosis lateral amiotrófica. En una realización aun más preferida, la enfermedad motoneurona es esclerosis lateral amiotrófica.

El gen NOGO A es el gen también conocido como reticulon 4 o RTN4, cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 68585 en ratón y 57142 en humano, y cuya función se ha relacionado con la angiogénesis, la apoptosis, la regulación negativa de la regeneración axonal, etc. Este gen induce inestabilidad en la unión neuromuscular al sobreexpresarse en músculo. En el caso de individuos hembra, los ejemplos de la presente invención demuestran que, además de los genes Col19a1 y NOGO A, la variación en los niveles de expresión de otros 6 genes más a lo largo del proceso de degeneración muscular presenta correlación significativa con la evolución de este proceso, por lo que el análisis de dicha variación de la expresión génica a lo largo del proceso degenerativo, a partir de varias muestras biológicas aisladas del paciente tomadas a diferentes tiempos, permite determinar la velocidad de progresión de la degeneración muscular si se comparan los valores de variación de la expresión génica obtenidos para cada uno de estos genes en el paciente con unos niveles de referencia de variación de la expresión génica dados para cada gen. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de los genes Col19a1, NOGO A, ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNT y/o SLN o de los productos de su expresión para el pronóstico y seguimiento de la degeneración muscular en un individuo hembra. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de los genes Col19 1, NOGO A, ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNT y SLN o de los productos de su expresión para el pronóstico y seguimiento de la degeneración muscular en un individuo hembra. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la degeneración muscular está provocada por una enfermedad de motoneurona. En una realización más preferida, la enfermedad de motoneurona se selecciona de la lista que comprende: atrofia muscular espinal, atrofia bulboespinal, atrofia muscular progresiva, esclerosis lateral primaria, paraplejía espástica hereditaria, paraplejía espástica tropical, parálisis bulbar, parálisis pseudobulbar, adrenomieloneuropatía, latirismo, poliomielitis aguda, síndrome postpolio, apnea motora multifocal, amiotrofía focal benigna o esclerosis lateral amiotrofica. En una realización aun más preferida, la enfermedad de motoneurona es esclerosis lateral amiotrofica.

El gen ANKRD1 es el gen también conocido como "ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)", según su nomenclatura en inglés, cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 107765 en ratón y 27063 en humano, y cuya función se ha relacionado con la plasticidad muscular.

El gen SNX10 es el gen también conocido como "sorting nexin 10", según su nomenclatura en inglés, cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 71982 en ratón y 29887 en humano, y cuya función se ha relacionado con la regulación de la homeostasis del endosoma.

El gen MYOG es el gen también conocido como miogenina, "myogenin" o "myogenic factor 4", según su nomenclatura en inglés, cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 17928 en ratón y 4656 en humano, y cuya función se ha relacionado con la diferenciación de las células musculares.

El gen MYOD1 es el gen también conocido como "myogenic differentiation 1 ", según su nomenclatura en inglés, cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 17927 en ratón y 4654 en humano, y cuya función se ha relacionado con la miogénesis y con la diferenciación muscular.

El gen NNT es el gen también conocido como "nicotinamide nucleotide transhydrogenase", según su nomenclatura en inglés, cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 181 15 en ratón y 23530 en humano, y cuya función se ha relacionado con la homeostasis de la glucosa.

El gen SLN es el gen también conocido como "sarcolipin", según su nomenclatura en inglés, cuyo número de referencia en el GenBank (Gen ID) es 66402 en ratón y 6588 en humano, y cuya función se ha relacionado con la regulación del transporte de calcio y los ciclos de contracción-relajación musculares. El término "producto de la expresión", tal y como se utiliza en esta descripción, hace referencia a cualquier producto de transcripción o traducción (ARN o proteína) de los genes Col19a1, IMPA1, NOGO A, ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNT o SLN, o a cualquier forma resultante del procesamiento de dichos productos de transcripción o traducción.

Se entiende por "diagnóstico" el procedimiento mediante el cual se identifica la presencia o ausencia de degeneración muscular, preferiblemente de degeneración muscular provocada por una enfermedad de motoneurona, más preferiblemente de degeneración muscular provocada por esclerosis lateral amiotrófica. El término "pronóstico" se refiere al procedimiento mediante el cual se establece una predicción de los sucesos que ocurrirán en el desarrollo o curso de un proceso de degeneración muscular, preferiblemente de un proceso de degeneración muscular provocado por una enfermedad de motoneurona, más preferiblemente de un proceso de degeneración muscular provocado por esclerosis lateral amiotrófica. En el contexto de la presente invención, el término "pronóstico" se refiere al procedimiento mediante el cual se establece la velocidad de progresión de la degeneración muscular.

En la presente invención se entiende por "degeneración muscular" la afección que provoca debilidad y degeneración progresivas de los músculos que controlan el movimiento, alterando la movilidad o funcionalidad del músculo esquelético. La degeneración muscular puede ser un síntoma de una enfermedad englobada dentro de las miopatías, entendiéndose por "miopatías" cualquier tipo de miopatía inflamatoria, distal, miotónica, congénita, mitocondrial, metabólica, parálisis periódica primaria o distrofia muscular; o bien puede ser un síntoma de una enfermedad neuromuscular, las cuales afectan a los nervios que controlan los músculos voluntarios, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la esclerosis múltiple o la miastenia grave; más preferiblemente la enfermedad neuromuscular es una enfermedad de neurona motora. Se entiende por "enfermedad de neurona motora" o "enfermedad de motoneurona" aquella patología de tipo degenerativo, progresivo y fatal que afecta a la primera motoneurona (motoneurona superior), a la segunda motoneurona (motoneurona Inferior) o a ambas, y pueden ser esporádicas o hereditarias. En función del tipo de motoneurona afectada y la proporción de su afección, se pueden diferenciar varios tipos de enfermedades de motoneurona, como por ejemplo, aunque sin limitarse, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular progresiva, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular espinal (AME), encontrándose dentro de ella la AME tipo I o enfermedad de Werdnig-Hoffman, AME tipo II, AME tipo III o enfermedad de Kugelberg- Welander y AME IV; parálisis bulbar, parálisis pseudobulbar, ELA con demencia frontotemporal, amiotrofía focal benigna, atrofia bulboespinal o síndrome de Kennedy, paraplejía espástica hereditaria, paraplejía espástica tropical, enfermedad de motoneurona asociada a enfermedad linfoproliferativa o a síndrome paraneoplásico, apnea motora multifocal, ataxia espinocerebelosa tipo 2 y 3, adrenomieloneuropatía, síndrome de Allgrove, neuropatía motora postirradiación, poliomielitis aguda, síndrome postpolio, latirismo, konzo o esclerosis lateral amiotrófica de Guam.

La "esclerosis lateral amiotrófica" o "ELA" es el trastorno, de origen esporádico o familiar, degenerativo de tipo neuromuscular en el cual la primera y segunda motoneuronas disminuyen gradualmente su funcionamiento y posteriormente mueren, provocando una parálisis muscular progresiva de pronóstico mortal.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el diagnóstico "in vitro" de degeneración muscular en un individuo, de ahora en adelante "primer método de la invención", que comprende:

a. determinar la cantidad del producto de la expresión del gen Col19 1 en una muestra biológica aislada de un individuo, y b. comparar la cantidad determinada en el paso (a) con una cantidad de referencia.

El término "muestra biológica aislada", tal y como se utiliza en el primer método de la invención, se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia muscular de músculo esquelético, o puede ser un fluido biológico, por ejemplo, pero sin limitarse, sangre, plasma, suero o linfa. En una realización preferida, la muestra biológica aislada del primer método de la invención es un linfocito o músculo esquelético. El término "linfocito" en la presente invención ha de entenderse como un linfocito o como una población de linfocitos, y puede obtenerse por aislamiento a partir de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, una muestra de sangre. La muestra de músculo esquelético puede obtenerse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante la extracción de una biopsia muscular de bíceps braquial o de gluteus superficialis. Dicha muestra puede ser tomada de un humano, pero también de mamíferos no humanos, como por ejemplo, pero sin limitarse, roedores, rumiantes, felinos o cánidos. Por ello, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo del cual procede la muestra biológica aislada del primer método de la invención es un mamífero. En una realización más preferida, el mamífero es un humano.

El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en el paso (b) del primer método de la invención, se refiere a cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificación del producto de la expresión del gen ColWcri en una muestra biológica control procedente de un individuo que no presenta degeneración muscular. Así, en otra realización preferida, la cantidad de referencia del paso (b) del primer método de la invención es la cantidad del producto de la expresión del gen Col19a1 en una muestra biológica aislada de un individuo que no presenta degeneración muscular. En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende:

c. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con degeneración muscular cuando la cantidad determinada en el paso (a) es significativamente superior a la cantidad de referencia.

En otra realización preferida, la muestra biológica aislada del primer método de la invención es un linfocito, y dicho método además comprende:

d. determinar la cantidad del producto de la expresión del gen IMPA1 en el linfocito del individuo del paso (a), y

e. comparar la cantidad determinada en el paso (d) con una cantidad de referencia.

En una realización más preferida, el primer método de la invención además comprende:

f. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con degeneración muscular cuando la cantidad determinada en los pasos (a) y (d) es significativamente superior a la cantidad de referencia. El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en el paso (e) del primer método de la invención, se refiere a cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificación del producto de la expresión del gen IMPA1 en una muestra biológica control procedente de un individuo que no presenta degeneración muscular. Así, en una realización aun más preferida, la cantidad de referencia del paso (e) del primer método de la invención es la cantidad del producto de la expresión del gen IMPA1 en un linfocito de un individuo que no presenta degeneración muscular.

La determinación de la cantidad del producto de la expresión del gen Col19 1 o del gen IMPA 1 en una muestra biológica aislada, se refiere a la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa. Esta medida puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de la expresión del gen basada en una señal que se obtiene directamente del producto de la expresión del gen y que está correlacionada directamente con el número de moléculas del producto de la expresión del gen presente en la muestra. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del producto de expresión. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto del producto de la expresión génica) o un sistema de medida biológica (por ejemplo, la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).

De acuerdo con la presente invención, la determinación de la cantidad de producto de la expresión del gen puede ser llevada a cabo por cualquier método de determinación de la cantidad del producto de la expresión de los genes conocido por el experto en la materia. En otra realización preferida, la determinación de la cantidad de producto de la expresión del gen se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total de la muestra biológica aislada lo cual puede llevarse a cabo por métodos conocidos por un experto en la materia. El análisis del nivel de ARNm se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RTLCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. En otra realización preferida, la determinación de la cantidad de producto de la expresión del gen se realiza determinando el nivel de proteína Col19oc1 o IMPA1 mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, ELISA, inmunohistoquímica o western blot.

Una cantidad "significativamente" superior a una cantidad de referencia puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el pronóstico y seguimiento "in vitro"de la degeneración muscular en un individuo, de ahora en adelante "segundo método de la invención", que comprende:

a. determinar el valor de ACt del gen Col19a1 en una muestra biológica aislada de músculo esquelético de un individuo que presenta degeneración muscular,

b. determinar el valor de ACt del gen Col19a1 en una segunda muestra biológica aislada de músculo esquelético del individuo del paso (a) obtenida al menos 1 mes después de la obtención de la muestra biológica aislada del paso (a),

c. calcular la pendiente de una recta obtenida tras la unión de los valores determinados en los pasos (a) y (b), y

d. comparar el valor de la pendiente calculada en el paso (c) con un valor de referencia.

En una realización preferida, el valor de referencia del paso (d) del segundo método de la invención es el valor de la pendiente de una recta obtenida tras la unión del valor de la media de los valores de ACt del gen Col19a1 en varias muestras biológicas aisladas de músculo esquelético de varios individuos que presentan degeneración muscular y del valor de la media de los valores de ACt del gen Col19a1 en varias muestras biológicas aisladas de músculo esquelético de varios individuos que presentan degeneración muscular obtenidas al menos 1 mes después de la obtención de la primera muestra biológica. Cuando el individuo del paso (a) del segundo método de la invención es un macho, las muestras biológicas aisladas empleadas para el cálculo del valor de referencia del paso (d) proceden, preferiblemente, de individuos macho y cuando el individuo del paso (a) del segundo método de la invención es una hembra, las muestras biológicas aisladas empleadas para el cálculo del valor de referencia del paso (d) proceden, preferiblemente, de individuos hembra. En una realización más preferida, el segundo método de la invención además comprende:

e. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con alta velocidad de progresión de la degeneración muscular cuando el valor de la pendiente calculada en el paso (c) es significativamente inferior al valor de referencia.

En otra realización preferida, el segundo método de la invención además comprende:

f. determinar el valor de ACt del gen NOGO A en la muestra biológica aislada del paso (a),

g. determinar el valor de ACt del gen NOGO A en la muestra biológica aislada del paso (b),

h. calcular la pendiente de una recta obtenida tras la unión de los valores determinados en los pasos (f) y (g), y

i. comparar el valor de la pendiente calculada en el paso (h) con un valor de referencia. En una realización más preferida, el valor de referencia del paso (i) del segundo método de la invención es el valor de la pendiente de una recta obtenida tras la unión del valor de la media de los valores de ACt del gen NOGO A en varias muestras biológicas aisladas de músculo esquelético de varios individuos que presentan degeneración muscular y del valor de la media de los valores de ACt del gen NOGO A en varias muestras biológicas aisladas de músculo esquelético de varios individuos que presentan degeneración muscular obtenidas al menos 1 mes después de la obtención de la primera muestra biológica. Cuando el individuo del paso (a) del segundo método de la invención es un macho, las muestras biológicas aisladas empleadas para el cálculo del valor de referencia del paso (i) proceden, preferiblemente, de individuos macho y cuando el individuo del paso (a) del segundo método de la invención es una hembra, las muestras biológicas aisladas empleadas para el cálculo del valor de referencia del paso (i) proceden, preferiblemente, de individuos hembra.

En una realización aun más preferida, el segundo método de la invención además comprende:

j. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con alta velocidad de progresión de la degeneración muscular cuando el valor de la pendiente calculada en los pasos (c) y (h) es significativamente inferior al valor de referencia.

En otra realización preferida, el individuo del segundo método de la invención es una hembra y dicho método además comprende:

k. determinar el valor de ACt de al menos un gen seleccionado de la lista que comprende: ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNTo SLN en la muestra biológica aislada del paso (a),

I. determinar el valor de ACt del gen/es seleccionado/s en el paso (k) en la muestra biológica aislada del paso (b),

m. calcular la/s pendiente/s de una/s recta/s obtenida/s para cada gen tras la unión de los valores determinados en los pasos (k) y (I), y n. comparar el valor de la/s pendiente/s calculada/s en el paso (m) con un valor de referencia.

En una realización más preferida, el segundo método de la invención además comprende:

o. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con alta velocidad de progresión de la degeneración muscular cuando el valor de las pendientes calculadas en los pasos (c), (h) y (m) es significativamente inferior al valor de referencia.

En una realización aun más preferida, el valor de referencia del paso (n) del segundo método de la invención es el valor de la pendiente de una recta obtenida tras la unión del valor de la media de los valores de ACt del gen ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNT o SLN en varias muestras biológicas aisladas de músculo esquelético de varios individuos hembra que presentan degeneración muscular y del valor de la media de los valores de ACt del gen ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNT o SLN en varias muestras biológicas aisladas de músculo esquelético de varios individuos hembra que presentan degeneración muscular obtenidas al menos 1 mes después de la obtención de la primera muestra biológica.

Para determinar el valor de ACt de un gen en una muestra biológica debe llevarse a cabo la amplificación de su producto de expresión a partir de dicha muestra, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante PCR, RTLCR, RT-PCR o qRT-PCR. El término "ACt" se refiere al valor umbral (es decir, al momento del ciclo de la PCR, RTLCR, RT-PCR o qRT-PCR empleada para la amplificación del producto de expresión del gen en que empieza a aparecer el producto amplificado) normalizado. Para la normalización puede llevarse a cabo la amplificación de los productos de expresión de uno o de varios genes control o "housekeeping" cuyo nivel de expresión se mantenga constante a lo largo del proceso de degeneración muscular, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, el gen 18S rRNA, GAPDH o β-actina, o cualquiera de sus combinaciones.

La muestra biológica aislada del paso (a) del segundo método de la invención podría obtenerse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el momento en que el individuo que presenta degeneración muscular es diagnosticado o bien antes de que comience a serle administrado un tratamiento o en el momento en que se le administra. La muestra biológica aislada del paso (b) del segundo método de la invención podría obtenerse, como mínimo, un mes después de la obtención de la muestra biológica aislada del paso (a) o en cualquier momento posterior a este: preferiblemente, a los 2 meses, a los 3 meses, a los 4 meses, a los 5 meses, a los 6 meses o a los 7 meses de la obtención de la muestra biológica aislada del paso (a). La muestra de músculo esquelético del segundo método de la invención puede obtenerse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante la extracción de una biopsia muscular de bíceps braquial o de gluteus superficialis. Dicha muestra puede ser tomada de un humano, pero también de mamíferos no humanos, como por ejemplo, pero sin limitarse, roedores, rumiantes, felinos o cánidos. Por ello, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo del cual procede la muestra biológica aislada del segundo método de la invención es un mamífero. En una realización más preferida, el mamífero es un humano. Los valores determinados en los pasos (a) y (b), para el gen Col19 1, (f) y (g) para el gen NOGO A y (k) y (I) para al menos uno de los genes ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNT o SLN, del segundo método de la invención, pueden emplearse para la elaboración de una recta correspondiente a cada gen cuya pendiente pueda ser calculada. Dicha recta representará el valor de ACt en cada muestra frente al tiempo en que fueron obtenidas dichas muestras biológicas aisladas de los pasos (a) y (b). El cálculo de la pendiente de dicha recta puede ser llevado a cabo por operaciones matemáticas conocidas por un experto en la materia, entendiéndose por "pendiente" el valor de inclinación de dicha recta con respecto a la horizontal.

El valor de referencia de los pasos (d), (i) y (n) del segundo método de la invención corresponde, preferiblemente, al valor de la pendiente de la recta que representa cómo varía, en función del tiempo, la expresión de los genes Col19 1, NOGO A, ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNT y SLN, respectivamente, en un proceso de degeneración muscular cuya velocidad de progresión es normal. Debido a que el nivel de ACt de todos estos genes disminuye progresivamente a medida que avanza el proceso de degeneración muscular, los valores de las pendientes correspondientes a los valores de referencia son negativos. Así, cuando el valor de la pendiente calculada en cualquiera, aunque preferiblemente en todos, de los pasos (c), (h) y/o (m) del segundo método de la invención sea inferior al valor de referencia dado para el gen en estudio, el individuo del paso (a) presenta una alta velocidad de progresión de la degeneración muscular. En la presente invención se entiende por "alta velocidad de progresión" aquella velocidad de progresión del proceso de degeneración muscular que se encuentra por encima de la velocidad de progresión normal en un proceso de degeneración muscular. La velocidad de progresión normal del proceso de degeneración muscular vendrá determinada por los valores de referencia calculados como se ha explicado anteriormente.

Un valor "significativamente" inferior a un valor de referencia puede ser establecido por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher.

En otra realización preferida, la degeneración muscular del individuo del primer y segundo método de la invención está provocada por una enfermedad de motoneurona. En una realización más preferida, la enfermedad de motoneurona se selecciona de la lista que comprende: atrofia muscular espinal, atrofia bulboespinal, atrofia muscular progresiva, esclerosis lateral primaria, paraplejía espástica hereditaria, paraplejía espástica tropical, parálisis bulbar, parálisis pseudobulbar, adrenomieloneuropatía, latirismo, poliomielitis aguda, síndrome postpolio, apnea motora multifocal, amiotrofía focal benigna o esclerosis lateral amiotrófica. En una realización aun más preferida, la enfermedad de motoneurona es esclerosis lateral amiotrófica.

Los pasos (a), (b), (d) y/o (e) del primer método de la invención, y los pasos (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h), (i), (k), (I), (m) y/o (n) del segundo método de la invención pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un equipo robótico para la determinación de la cantidad del producto de la expresión en el paso (a) y/o (d) del primer método de la invención, o para la determinación del valor de ACt en los pasos (a), (b), (f), (g), (k) y/o (I) del segundo método de la invención.

Además de los pasos especificados anteriormente, el primer y segundo método de la invención pueden comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con el pre-tratamiento de las muestras biológicas aisladas previamente a su análisis o bien con la obtención de una tercera muestra biológica aislada de músculo esquelético y su correspondiente análisis en el segundo método de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante "kit de la invención", que comprende los cebadores, sondas o anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones, específicos para el gen Col19 1. En una realización preferida, el kit de la invención además comprende los cebadores, sondas o anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones, específicos para el gen NOGO A y/o para el gen IMPA 1. En una realización más preferida, el kit de la invención además comprende los cebadores, sondas o anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones, específicos para al menos uno de los genes seleccionados de la lista que comprende: ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNTo SLN. Los cebadores, sondas y/o anticuerpos comprendidos en el kit de la invención presentan complementariedad, y por tanto, capacidad de hibridación, con al menos un producto de la expresión del gen Col19 1, IMPA 1, NOGO A, ANKRD1, SNX10, MYOG, MYOD1, NNT y/o SLN. En general, el kit de la invención comprende todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el primer y segundo método de la invención descritos anteriormente. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, enzimas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. El kit puede contener además otras moléculas, cebadores, anticuerpos, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos o para la normalización de los valores obtenidos. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el primer y segundo método de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la degeneración muscular en un individuo. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la degeneración muscular está provocada por una enfermedad de motoneurona. En una realización más preferida, la enfermedad de motoneurona se selecciona de la lista que comprende: atrofia muscular espinal, atrofia bulboespinal, atrofia muscular progresiva, esclerosis lateral primaria, paraplejía espástica hereditaria, paraplejía espástica tropical, parálisis bulbar, parálisis pseudobulbar, adrenomieloneuropatía, latirismo, poliomielitis aguda, síndrome postpolio, apnea motora multifocal, amiotrofía focal benigna o esclerosis lateral amiotrófica. En una realización aun más preferida, la enfermedad de motoneurona es esclerosis lateral amiotrófica. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Recta representativa de la variación en la expresión del gen Col19a1 a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones macho SOD1 ^G93A modelo de ELA.

Fig. 2. Recta representativa de la variación en la expresión del gen NOGO A a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones macho SOD1 ^G93A modelo de ELA.

Fig. 3. Recta representativa de la variación en la expresión del gen Col19a1 a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones hembra SOD1 ^G93A modelo de ELA. Fig. 4. Recta representativa de la variación en la expresión del gen NOGO A a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones hembra SOD1 ^G93A modelo de ELA.

Fig. 5. Recta representativa de la variación en la expresión del gen ANKRD1 a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones hembra SOD1 ^G93A modelo de ELA.

Fig. 6. Recta representativa de la variación en la expresión del gen SNX10 a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones hembra SOD1 ^G93A modelo de ELA. Fig. 7. Recta representativa de la variación en la expresión del gen MYOG a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones hembra SOD1 ^G93A modelo de ELA. Fig. 8. Recta representativa de la variación en la expresión del gen MYOD1 a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones hembra SOD1 ^G93A modelo de ELA.

Fig. 9. Recta representativa de la variación en la expresión del gen NNT a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones hembra SOD1 ^G93A modelo de ELA.

Fig. 10. Recta representativa de la variación en la expresión del gen SLN a lo largo del proceso de degeneración muscular en músculo esquelético de ratones hembra SOD1 ^G93A modelo de ELA.

Fig. 11. Gráfico representativo del nivel de expresión del gen Col19a1 en muestras de linfocitos humanos de individuos sanos (control) y de pacientes de ELA. Nivel de expresión representado en relación a la expresión del gen control en las muestras.

Fig. 12. Gráfico representativo del nivel de expresión del gen Col19oc1 en muestras de músculo esquelético humanas de individuos sanos (control) y de pacientes de ELA. Nivel de expresión representado en relación a la expresión del gen control en las muestras.

Fig. 13. Gráfico representativo del nivel de expresión del gen IMPA1 en muestras de linfocitos humanos de individuos sanos (control) y de pacientes de ELA. Nivel de expresión representado en relación a la expresión del gen control en las muestras. EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de los biomarcadores aquí propuestos para llevar a cabo el primer y segundo método de la invención para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento "in vitro" de la degeneración muscular en un individuo. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica.

EJEMPLO 1. Detección de biomarcadores pronóstico de la degeneración muscular a partir de biopsias de ratones transgénicos SOD1 ^G93A modelo de ELA.

1 .1. Modelo animal v búsqueda de biomarcadores de degeneración muscular.

El modelo animal utilizado fue el ratón transgénico de la estirpe B6SJL que sobreexpresa la proteína superoxido dismutasa humana (SOD1 ) mutada en la posición G93A (SOD1 ^G93A ), por ser considerado el modelo más adecuado para el estudio de la ELA. Los animales hemicigotos que expresaban la mutación se obtuvieron a través del cruce de un macho muíante con una hembra sana (wild type). El genotipado de la descendencia se llevó a cabo a partir del ADN extraído de la cola del animal. Los animales se mantuvieron siguiendo las directrices generales para el uso de animales de laboratorio. La comida y el agua se suministraron ad libitum. Los análisis microbiológicos rutinarios no mostraron evidencias de infecciones con patógenos murinos comunes. La selección de los genes candidatos para ser posteriormente testados en las biopsias musculares como se explica en el ejemplo 1 .2. se basó principalmente en un estudio previo de microarrays (Affymetrix) a partir de muestras de músculo esquelético de ratones de 2 meses sanos y de ratones transgénicos SOD1 ^G93A y en los resultados obtenidos tras su validación por PCR a tiempo real. De entre los genes que presentaban expresión diferencial, se seleccionaron los siguientes: Ankrdl, Calml, Col19a1, Fbxo32, Gsr, IMPA 1, Mef2c, Mt2, Myf5, Myodl, Myog, Nnt, Pax7, Rrad, Rtn4, también conocido como NOGO A, Sin y SnxW. En la Tabla 1 se detalla la información correspondiente a cada gen. En particular, Mef2c, Myf5, Myodl y Pax7 se incorporaron en este estudio para completar la cascada de factores de regulación miogénica junto con Myog, cuya expresión resultó estar alterada en la enfermedad. De igual forma, se incorporaron Gsr y NOGO A, por presentar alteraciones en sus niveles de expresión como consecuencia del proceso degenerativo de la enfermedad. La validación mediante PCR a tiempo real de la variación de los niveles de expresión de los genes seleccionados se llevó a cabo en el equipo StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystem), según el siguiente protocolo: incubación a 95 °C durante 20 segundos, 40 ciclos de 95 °C durante 1 segundo y 60 °C durante 20 segundos. Las reacciones se realizaron en un volumen final de 5μί que contenía una mezcla del reactivo 1 X TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (4352042, No AmpErase® UNG, Applied Biosystems), 1X del cebador y sonda TaqMan® MGB y 2 L del cDNA diluido 10X. Los genes housekeeping que se utilizaron para la normalización de los datos fueron 18S rRNA, GAPDH y β-actina.

SÍMBOLO ID GEN FUNCION

Ankrdl 107765 Plasticidad muscular

Calml 12313 Modulador señal calcio

Mediador endocitosis en placa

motora

Col19ct1 12823 Desarrollo y diferenciación

músculo esofágico

Fbxo32 67731 Promueve atrofia muscular

Reducción de sus niveles de

expresión en desórdenes

neuromusculares

Gsr 14782 Metabolismo estrés oxidativo

Impal 55980 Homeostasis inositol

Diana de calbindina

Mt2 17750 Propiedades de unión a metales

y de eliminación de radicales libres

Metabolismo estrés oxidativo

Homeostasis Zinc

Mef2c 17260 Mantenimiento integridad

sarcómero

Diferenciación muscular

Myodl 17927 Miogénesis

Diferenciación muscular

Myf5 17877 Regulador miogénesis

Homeostasis muscular

Myog 17928 Diferenciación células

musculares

Nnt 181 15 Homeostasis glucosa

Pax7 18509 Desarrollo muscular

Rrad 56437 Tolerancia glucosa y sensibilidad

insulina

Regulación intracelular de

señalización calcio

NOGO A 68585 Inhibidor regeneración axonal

Sin 66402 Regulador transporte calcio

Ciclos contracción-relajación

musculares

Snx10 71982 Regulación homeostasis

endosoma

Tabla 1. Genes seleccionados para su posterior estudio en biopsias musculares del animal modelo SOD1 ^G93A .

1 .2. Extracción de biopsias musculares v búsqueda de biomarcadores pronóstico de degeneración muscular.

La realización de biopsias musculares en animales modelo de neurodegeneración permite la obtención de tejido procedente del mismo animal a lo largo de la enfermedad para ser posteriormente analizado con el fin de encontrar posibles biomarcadores pronóstico, ya que permite correlacionar la variación de la expresión del gen con la progresión de la enfermedad en el animal. Sin embargo, conforme avanza la enfermedad en estos animales, su deterioro es muy rápido, con lo que es necesario que esta técnica de obtención de biopsias sea lo menos invasiva posible a fin de asegurar la viabilidad del animal. Por esta razón, en la presente invención se eligió la zona del músculo gluteus superficialis de animales transgénicos SOD1 ^G93A para la obtención de las biopsias, ya que la manipulación en esta zona puede llevarse a cabo por ser fácilmente accesible y por no dificultar la movilidad del animal después de cada intervención. La principal ventaja de la extracción de biopsias musculares llevada a cabo en la presente invención es que permite realizar un seguimiento a lo largo de la enfermedad en el mismo animal, manteniéndolo vivo. A su vez, mediante esta metodología los cambios en los niveles de expresión de un biomarcador pueden seguirse de forma más rigurosa y más cercana a la evolución real de la enfermedad en un tejido que resulta seriamente dañado consecuencia de la misma, como es el músculo esquelético. El procedimiento de extracción se dividió en varias fases:

1 . Pre-medicación y preparación del animal: 10-20 minutos antes de obtener la biopsia, se administró por vía subcutánea el analgésico Meloxicam 2 mg/kg (Metacam ©) y se procedió a rasurar la zona del músculo gluteus superficialis (aproximadamente 4 cm ² ). Tras el rasurado, se realizó una desinfección de la zona con alcohol 70 ° y povidona iodada.

2. Cirugía: se procedió a anestesiar al animal con ísofluorano en una cámara de inducción (4-5% de ísofluorano), seguidamente se acopló al animal una mascarilla reduciendo el flujo al 1 ,5-2%. Una vez en la mascarilla se comprobó la ausencia de reflejos y se aplicó un gel humectante sobre los ojos del animal para evitar cualquier daño en la cornea durante y después del procedimiento (lubrithal ©). Por medio de un bisturí, se realizó una incisión < 1 cm en la piel a la altura del músculo gluteus superficialis, se retiró el tejido conectivo hasta acceder al tejido muscular y se cortó un "ojal" de músculo de 1 mm ² aproximadamente. Una vez extraída la biopsia, se procedió al cierre de la piel mediante una grapa (EZ 9 mm clip) para después aplicar una pomada cicatrizante, facilitando de esta forma el cierre de la herida en poco tiempo (Aloe vet ©). Finalmente, se rehidrató con suero fisiológico 0,9%. Después de cerrar el flujo de anestésico, se comprobó que el animal volvía a tener reflejos y se devolvió a su cubeta correspondiente.

3. Post-cirugía: en este proceso se pretendió mantener un ambiente cálido utilizando una lámpara de rayos IR para facilitar la recuperación del animal. De igual forma, se añadió un poco de alimento hidratado y papel para facilitar la recuperación durante las primeras horas tras la extracción de la biopsia. A lo largo de las primeras 24 horas los animales se revisaron 2 veces y una semana más tarde de la cirugía se les retiraron las grapas.

Este proceso de extracción se realizó en 48 animales transgénicos (24 hembras y 24 machos) de forma que se extrajeron dos biopsias de las extremidades traseras, alternando cada extremidad, a los 75 días (estado sintomático temprano de la enfermedad) y a los 105 días (estado sintomático avanzado de la enfermedad) ( iana-Mena, et al., 2005 Amyotroph Lateral Soler Other Motor Neu ron Disord., 6(1 ):55-62) y finalmente una tercera biopsia previa al sacrificio del animal (estado terminal de la enfermedad). El animal se sacrificó cuando, colocado de cúbito supino, no era capaz de girarse en 30 segundos sobre sí mismo. Cada biopsia se reservó en un tubo eppendorf con RNAIater (Ambion) con el fin de preservar el tejido y evitar la degradación del RNA.

Una vez realizadas todas las biopsias, se procesaron las muestras extraídas para obtener en un primer paso el ARN total (kit Micro Kit Protocol, Quiagen, que permite obtener ARN a partir de muestras muy pequeñas, en condiciones óptimas) y finalmente el ADN complementario correspondiente (kit SuperScript™ First-Strand Synthesis System kit, Invitrogen).

La expresión de los genes seleccionados como se explica en el ejemplo 1 .1 : Ankrdl, Calml, Col cri, Fbxo32, Gsr, IMPA1, Mef2c, Mt2, Myf5, Myodl, Myog, Nnt, Pax7, Rrad, Rtn4, también conocido como NOGO A, Sin y SnxW, se estudió en las biopsias musculares para determinar si podían ser considerados marcadores pronóstico de la degeneración muscular. La validación mediante PCR a tiempo real de la variación de los niveles de expresión de los genes seleccionados se llevó a cabo en el equipo StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystem), según el siguiente protocolo: incubación a 95 °C durante 20 segundos, 40 ciclos de 95 °C durante 1 segundo y 60 °C durante 20 segundos. Las reacciones se realizaron en un volumen final de 5 iL que contenía una mezcla del reactivo 1 X TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (4352042, No AmpErase® UNG, Applied Biosystems), 1 X del cebador y sonda TaqMan® MGB y 2 pL del cDNA diluido 10X. Los genes housekeeping que se utilizaron para la normalización de los datos fueron 18S rRNA, GAPDH y β-actina, cuya expresión se mantiene constante a lo largo de la enfermedad. De los 17 genes seleccionados, aquellos cuya expresión génica a lo largo de la enfermedad estaba correlacionada con la progresión de la misma, podían identificarse como marcadores pronóstico de degeneración muscular. Es interesante destacar que debido a las diferencias existentes en el comportamiento del músculo esquelético entre ambos sexos ante una situación de degeneración, se analizaron los datos de machos y hembras por separado.

En el estudio de correlación con la progresión de la enfermedad, se analizaron los valores de ACj obtenidos a partir de cada muestra biopsiada procedente de animales transgénicos SOD1 ^G93A machos y hembras a los 75, 105 días y a la edad de sacrificio de cada animal. De este modo, para cada animal, macho o hembra, y para cada gen, se obtuvieron 3 valores umbrales del ciclo (Ct) obtenidos en la correspondiente PCR a tiempo real y normalizados (AC _T ) para los genes housekeeping, correspondientes con las tres edades bajo estudio. Estos valores se representaron gráficamente para calcular el valor de la pendiente de la recta obtenida para cada gen. De esta forma, para cada gen y en cada sexo, se consiguió un grupo de valores de pendientes, cada valor perteneciente a un animal, que se sometió a un análisis estadístico como se explica a continuación. Los resultados de los valores de las pendientes obtenidas fueron tratados con el software SPSS 15.0, para determinar el coeficiente de correlación lineal de Pearson, R. Este coeficiente estima el grado de linealidad, que varía en el rango -1 a 1 , de los valores de las pendientes con respecto a la edad de sacrificio en cada caso, de forma que cuando el coeficiente alcanza el valor 1 , las variables bajo estudio presentan una correlación lineal perfecta. Todos los valores se expresaron como media ± desviación estándar. La significación estadística se alcanzó con p<0,05.

1 .3. Resultados.

Los datos que se obtuvieron en el estudio de correlación con la progresión de la degeneración muscular mostraron que de los 17 genes validados por PCR a tiempo real, sólo 2 correlacionaron linealmente con dicha progresión en ambos sexos (Col19 1 y NOGO A). El coeficiente de Pearson, R, para ambos genes es positivo tanto en machos (Tabla 2) como en hembras (Tabla 3), lo que indica que los dos genes disminuyen gradualmente su valor de ΔΟτ en ambos sexos a medida que avanza el proceso degenerativo, y por tanto, muestras de músculo esquelético procedentes de individuos que se encuentran en una etapa más temprana del proceso de degeneración muscular presentan mayores valores de AC de cualquiera de estos dos genes en comparación con muestras procedentes de individuos que se encuentran en etapas degenerativas más avanzadas. NOGO A induce inestabilidad en la unión neuromuscular cuando se sobreexpresa en músculo, lo que es consistente con el hecho aquí observado de que a mayor expresión de NOGO A (teniendo en cuenta que ΔΟτ es inversamente proporcional a la concentración relativa del gen) más avanzado es el estadio de degeneración muscular.

MACHOS

Tabla 2. Valores de las pendientes calculadas en los machos a partir de los ACj para cada gen y de los correspondientes coeficientes de Pearson ( ^* p<0,05, ^** p<0,01). Col19a1 y NOGO A son los únicos genes en los que se encontró una correlación con la progresión de la degeneración muscular.

Estos dos genes fueron los únicos en animales transgénicos machos en los que se encontró una correlación lineal significativa entre la variación de sus niveles de expresión y la progresión de la degeneración muscular, mientras que en animales transgénicos hembras en otros seis genes más se observó un grado de correlación positiva significativo con la progresión de dicha degeneración {Ankrdl, Myodl, Myog, Nnt, Sin y SnxW) (Tabla 3). Estos genes disminuyen gradualmente su valor de AC _T en hembras a medida que avanza el proceso degenerativo, y por tanto, muestras de músculo esquelético procedentes de individuos hembra que se encuentran en una etapa más temprana del proceso de degeneración muscular presentan mayores valores de ΔΟγ de cualquiera de estos seis genes en comparación con muestras procedentes de individuos hembra que se encuentran en etapas degenerativas más avanzadas. Este resultado sugiere que conforme avanza el proceso neurodegenerativo de la enfermedad, el aumento en la expresión de cualquiera de estos seis genes indica un agravamiento del proceso degenerativo, ya que se ven alterados procesos como la diferenciación, la integridad del tejido y la homeostasis de la glucosa y del calcio.

HEMBRAS

Tabla 3. Valores de las pendientes calculadas en las hembras a partir de los AC _T de cada gen y de los correspondientes coeficientes de Pearson (*p<0,05, ^* *p<0,01 ). De los 17 genes testados, en 8 se detectaron correlaciones con la progresión de la enfermedad en hembras {Ankrdl, Col19a1, Myodl, Myog, Nnt, NOGO A, Sin y

SnxW).

Se calcularon los valores de ΔΟτ medios correspondientes a cada gen y en cada sexo para cada uno de los tres estadios analizados de la enfermedad, a partir de los valores de ΔΟτ de varios individuos. Estos valores medios se representaron gráficamente (figuras 1 -10) y se calcularon las pendientes de las rectas obtenidas, de manera que dichas rectas y pendientes representarían lo que podría considerarse la evolución normal de la variación en la expresión génica de cada uno de los genes propuestos como biomarcadores pronóstico a lo largo del proceso degenerativo. Por ello, los valores de estas pendientes podrían denominarse "valores de referencia".

Así, para realizar el estudio de un individuo que presenta degeneración muscular, deben tomarse al menos dos muestras biológicas aisladas de músculo esquelético de dicho paciente y determinarse en ellas los valores de ACT de los genes aquí propuestos como biomarcadores pronóstico para, posteriormente, representar los valores obtenidos en una recta de la cual se obtenga su pendiente. Cualquier desviación significativa del valor de la pendiente así obtenida con respecto a un valor de pendiente de referencia (que sería el obtenido para cada gen según el cálculo anteriormente expuesto) sería indicativa de una alteración en la velocidad de progresión de la degeneración muscular.

Como se muestra en la tabla 4, todos los valores de referencia son negativos, puesto que el valor de ACT de los biomarcadores propuestos en la invención disminuye a lo largo del proceso degenerativo.

Tabla 4. Valores control o cantidades de referencia para cada gen propuesto como biomarcador pronóstico de degeneración muscular en cada sexo.

EJEMPLO 2. Detección de biomarcadores diagnóstico de la degeneración muscular a partir de muestras biológicas de humano.

2.1 . Muestras de pacientes.

La obtención de muestras de pacientes y controles se hizo siempre bajo consentimiento informado. Se realizó una toma de muestra por enfermo. Linfocitos: a partir de 10 mi de sangre total se aisló la subpoblación de linfocitos en gradiente de Ficoll (Ficoll-Paque™ Plus; GE Healthcare) y se llevó a cabo la extracción del ARN total con TriReagent (Sigma-Aldrich Co.)- Se determinó la cantidad y pureza del ARN extraído en el espectrof otó metro NanoDrop y se comprobó su integridad mediante visualización de las bandas correspondientes a los ARNr 28S y 18S en una electroforesis en gel de agarosa. La obtención del ADN complementario se realizó a partir de ^g de ARN (High Capacity cDNA RT kit; Applied Biosystems). La recogida de muestras fue realizada en el momento del diagnóstico definitivo de la enfermedad.

Músculo: las biopsias de músculo se obtuvieron del bíceps braquial mediante biopsia abierta tras la administración de anestesia local subcutánea. Inmediatamente tras su extracción el tejido fue congelado en nitrógeno líquido. Para el aislamiento del ARN y la síntesis posterior de ADN complementario se partió de 30-40 mg de tejido y se procedió de la misma manera que en linfocitos. El momento de la recogida de muestras en este caso fue variable.

2.2. Análisis de la expresión génica. A partir del ADN complementario obtenido se analizó la expresión génica mediante PCR tiempo real. En linfocitos se realizaron estudios en el gen Col19a1 y en el gen IMPA 1 y las muestras analizadas fueron 47 controles con un rango de edad de 59,9 ± 8,69 años, de los cuales 29 eran hombres y 18 mujeres, y 53 pacientes de ELA esporádica con un rango de edad de 59,1 ± 15,15 años distribuidos en 30 hombres y 23 mujeres. En músculo se replicó el estudio de expresión del gen Col19 1 y las muestras analizadas fueron 4 controles con un rango de edad de 77 ± 6,4 años, de los cuales 4 eran mujeres y 8 pacientes de ELA esporádica con un rango de edad de 58,26 ± 5,59 años distribuidos en 7 hombres y 1 mujer.

La reacción de PCR se llevó a cabo en el equipo 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystem) con sondas Taqman inventariadas (Applied Biosystems) cuya eficiencia ha sido probada y es en todos los casos cercana al 100%. Todas las reacciones se realizaron por triplicado y la expresión de GAPDH como gen endógeno se empleó para la normalización. Los datos fueron analizados cuantitativamente frente a los de una muestra calibradora mediante el método AACt. Brevemente, para cada muestra se resta el valor de Ct del gen normalizador (GAPDH) al valor de Ct del gen analizado ó diana (ACt = Ct _d ¡ _a na- Ctendógeno o diana); al ACt así obtenido se le resta el valor normalizado (ACt) del calibrador (AACt) y los valores son linearizados con el cálculo 2 ^"(ΔΔα) de forma que se muestra la expresión del gen diana de cada muestra en relación con la expresión de ese mismo gen en la muestra calibradora. La muestra calibradora es una muestra de un individuo control sano.

El análisis estadístico se realizó mediante el programa estadístico SPSS. Se utilizaron en todos los casos pruebas no paramétricas para asegurar que la posible distribución no normal de las diferentes muestras no interfiriera en los resultados. Para la comparación de variables se utilizó la prueba de Wilcoxon.

Los resultados de los genes Col19 1 e IMPA1 en muestras de linfocitos humanos dieron lugar a una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo de pacientes de ELA y el grupo de controles. Podemos observar dichos resultados en las figuras 1 1 , para Col19 1, y 13, para IMPA 1. La media de expresión del grupo control para el gen Col19 1 fue de 0,46 ± 0,25 (expresión relativa a la expresión del gen control) (0,10 a 1 ,21 ) y la media de expresión de este gen en el grupo de ELA fue de 0,80 ± 0,52 (0,10 a 2,09), siendo la diferencia estadística (Test de Wilcoxon): 0,0166. La media de expresión del grupo control para el gen IMPA 1 fue de 0,61 ± 0,25 (expresión relativa a la expresión del gen control) (0,10 a 1 ,35) y la media de expresión de este gen en el grupo de ELA fue de 0,84 ± 0,35 (0,15 a 1 ,64), siendo la diferencia estadística (Test de Wilcoxon): 0,0028.

Los resultados de la expresión del gen Col19 1 en biopsias musculares de pacientes con ELA frente a controles mostraron una alteración más marcada de este gen que en linfocitos, la cual puede observarse en la figura 12, siendo la diferencia estadística: 0,0047.