PLURIPOTENTES EN CARDIOMYOCYTES

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine de la différenciation des cellules souches pluripotentes en cellules spécialisées, en particulier en cardiomyocytes.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE

Les cellules pluripotentes induites (ou iPSC, de l'anglais, induced pluripotent stem cells) ont été mises au point en 2007 à partir de fibroblastes humains (Takahashi et al., 2007. Cell. 131(5):861-72). Ce type de cellules est obtenu par transfection des gènes de pluripotence (comme par exemple c-Myc, Oct3/4, Sox2 et Klf4) dans des cellules somatiques. Ces cellules sont ensuite sélectionnées pour leur capacité à exprimer Oct3/4 et Nanog, deux protéines impliquées dans la pluripotence (Takahashi et al., 2007. Cell. 131(5):861-72; Yu et al., 2007. Science. 318(5858): 1917-20).

Les iPSC possèdent les mêmes caractéristiques que les cellules souches embryonnaires, tant par leur morphologie, leur expression génique et leur statut épigénétique. Elles présentent la capacité de s'autorenouveler en conservant leur pluripotence et de pouvoir se différencier dans les trois feuillets embryonnaires, endoderme, ectoderme et mésoderme, in vitro et in vivo.

Les iPSC possèdent en outre l'avantage de pouvoir reproduire les étapes précoces du développement, contrairement aux modèles existants issus de cultures primaires de cellules de patients. De plus, elles possèdent l'ensemble du patrimoine génétique du patient donneur, constituant ainsi un excellent modèle pour étudier la physiopathologie des maladies génétiques. En effet, les anomalies responsables de ces pathologies peuvent s'exprimer au niveau cellulaire à différents stades de la différenciation des iPSC in vitro.

Enfin, les iPSC et les cellules qui en sont dérivées, aux différents stades de différenciation, permettent de tester de nouvelles molécules thérapeutiques in vitro (Yamanaka & Blau, 2010. Nature. 465(7299):704-12), et représentent donc un espoir pour le développement de nouvelles thérapies cellulaires, dans le cadre de la médecine régénérative.

Par conséquent, ces cellules constituent une source quasi-infinie de matériel pour l'étude des fonctions cellulaires normales ou pathologiques. Cependant, l'obstacle principal pour la compréhension de ces mécanismes est la mise en place de protocoles robustes et efficaces permettant l'obtention de cellules matures d'intérêt.

Parmi ces cellules d'intérêts, les cardiomyocytes sont des cellules contractiles composant le muscle cardiaque, dont l'accès est excessivement limité chez l'homme. Le processus de différenciation d'iPSC en cardiomyocytes est actuellement basé sur la stimulation successive de facteurs clés de la cardiogenèse par l'utilisation de cytokines ou de petites molécules.

Ces procédés présentent deux inconvénients : une efficacité limitée (généralement autour de 50%) et la nécessité de suivre temporellement les différentes étapes de l'embryogénèse, se traduisant par un délai d'environ 4 semaines avant la production des cardiomyocytes.

La Demanderesse propose ici une amélioration majeure de ces procédés par le biais de l'activation précise d'un programme génique impliqué dans la cardiogenèse. Ce nouveau procédé, applicable aux cellules souches pluripotentes, permet ainsi d'induire une différenciation spontanée, efficace et rapide vers les cardiomyocytes.

En effet, les inventeurs ont pu montrer qu'étonnamment, le procédé de l'invention permet d'augmenter l'efficacité de production des cardiomyocytes par un facteur 3, et ceci seulement une semaine après l'induction de la différenciation.

RÉSUMÉ

La présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes, comprenant une étape d'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi Gata4, Mef2c et/ou Tbx5.

Selon un mode de réalisation, ladite étape d'activation comprend l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR guide spécifique (AR gs) complémentaire de la région promotrice du gène dudit au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.

Selon un mode de réalisation, ladite étape d'activation comprend l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'un vecteur permettant l'expression d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase.

Selon un autre mode de réalisation, lesdites cellules souches pluripotentes expriment de manière stable une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase.

Dans un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend en outre avant, concomitamment et/ou après ladite étape d'activation, la mise en contact desdites cellules souches pluripotentes avec au moins un agent pharmacologique de différenciation, de préférence au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.

Dans un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend :

a) l'introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARN guide spécifique (ARNgs) dirigé contre la région promotrice du gène dudit au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque ;

b) avant, concomitamment et/ou après l'étape a), l'expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase ;

c) la culture desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ; et d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence dans un milieu de différenciation supplémenté d'au moins un agent pharmaco logique de différenciation, de préférence d'au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou d'au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.

Un autre objet de l'invention est un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARN guide spécifique (ARNgs), ledit ARN guide étant complémentaire d'au moins 80% de la région promotrice du gène d'un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi Gata4, Mef2c et/ou Tbx5. Selon un mode de revendication, le vecteur de l'invention comprend au moins une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et/ou 24, de préférence les séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 12 13, 14, 15, 16 et 17.

La présente invention concerne également une composition comprenant un vecteur tel que décrit ci-dessus.

De plus, la présente invention concerne un kit comprenant :

- un vecteur ou une composition tels que décrits ci-dessus ;

- une lignée de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée ou un vecteur exprimant une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase ; et

optionnellement, au moins un agent pharmacologique de différenciation, de préférence, au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt. DÉFINITIONS

Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :

Dans la présente invention, le terme « cellules souches pluripotentes » se réfère à des cellules souches capables de se différencier en n'importe quel type de cellule mature, i.e. en n'importe quelle cellule normalement dérivée de l'un des trois feuillets embryonnaires, à savoir l'endoderme, le mésoderme et l'ectoderme, y compris en cellules de la lignée germinale. À ce titre, le terme « cellules souches pluripotentes » englobe les cellules souches embryonnaires et les cellules souches pluripotentes induites.

Dans la présente invention, le terme « cellules souches embryonnaires » se réfère à des cellules pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste, i.e., de l'embryon à un stade précoce. Dans un mode de réalisation, les cellules souches embryonnaires ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines (hESCs).

Dans la présente invention, le terme « cellules souches pluripotentes induites » ou « iPSC » ou « cellules iPS » se réfère à des cellules souches pluripotentes artificielles, dérivées de cellules non-pluripotentes, généralement de cellules somatiques matures, par dédifférenciation ou reprogrammation. Outre leur morphologie et leur potentiel d'autorenouvellement et de pluripotence similaires à ceux des cellules souches embryonnaires, les iPSC présentent également une reprogrammation épigénétique avec un profil global de méthylation des histones et d'expression des gènes très proche de celui des cellules souches embryonnaires. Les iPSC sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, notamment la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines Nanog, Sox2, Oct4 et Ssea3/4.

Dans la présente invention, le terme « différenciation » se réfère à un processus par lequel une cellule pluripotente acquiert une spécialisation structurale et fonctionnelle au cours de sa division, prolifération et croissance.

Dans la présente invention, les termes « cardiomyocyte » ou « cellule du muscle cardiaque » s'emploient de manière interchangeable. Ces termes se réfèrent à une cellule impliquée dans les fonctions cardiaques normales, entre autres, dans la contraction du muscle cardiaque. Les cardiomyocytes sont les unités contractiles de base du cœur. De ce fait, la contraction synchronisée des cellules du muscle cardiaque résulte en un battement cardiaque.

Dans la présente invention, le terme « activation » se réfère à un processus direct ou indirect de stimulation de l'expression d'un gène et/ou d'une protéine. De ce fait, « l'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque » se réfère à la stimulation directe ou indirecte de la transcription du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque et/ou à la stimulation directe ou indirecte de la traduction de l'ARN messager (ARNm) d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque. Dans la présente invention, le terme « CRISPR/Cas9 » se réfère à un système ribonucléoprotéique constitué de deux partenaires : la protéine Cas9 et un ARN guide (ARNgs). CRISPR se réfère au système « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats type II » utilisé en immunité innée chez les bactéries et les archées. Ce système permet aux bactéries et aux archées de détecter les acides nucléiques exogènes (par exemple, les acides nucléiques viraux ou plasmidiques) de manière séquence- spécifique (Jinek et al, 2012. Science. 337(6096):816-21). Dans un système de type II, un ARN guide (ARNgs) interagit avec l'endonucléase Cas9 et dirige l'activité nucléase de Cas9 vers la séquence d'ADN cible, complémentaire de celle de l'ARN guide.

Dans la présente invention, le terme « ARN guide spécifique » ou « ARNgs » se réfère à une molécule d'ARN simple-brin capable de diriger l'endonucléase Cas9 vers un ADN cible, par complémentarité de séquence. Dans un mode de réalisation de l'invention, un ARNgs est un ARN simple-brin de séquence complémentaire à la région promotrice du gène codant pour un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.

Dans la présente invention, le terme « domaine de transactivation » se réfère à un domaine contenant un/des site(s) de liaison à d'autres biomolécules corégulatrices (protéines ou acides nucléiques, par exemple). La liaison de ces molécules corégulatrices au domaine de transactivation permet d'induire, ou d'augmenter l'efficacité d'une expression génique. Des exemples de domaines de transactivation comprennent, sans y être limités, le domaine VP16 du virus Herpès simplex (SEQ ID NO : 19), des répétitions multiples de VP16 (généralement, 3, 4 ou 10 répétitions, dénommées respectivement VP48, VP64 (SEQ ID NO : 20) et VP160), le domaine d'activation de la sous-unité de transactivation du facteur NF-κΒ (p65 , SEQ ID NO : 21 ), le transactivateur R du virus Epstein-Barr (Rta, SEQ ID NO : 22).

Dans la présente invention, le terme « promoteur reconnu par l'ARN Polymérase III » se réfère à une séquence d'ADN permettant d'initier la transcription par l'ARN polymérase III de gènes codant pour des ARN de transfert, l'ARN ribosomal 5S et d'autres petits ARN. En particulier, un promoteur reconnu par l'ARN Polymérase III permet d'initier la transcription de gènes codant pour des ARN guides. De préférence, le promoteur reconnu par l'ARN Polymérase III est un promoteur humain. De tels promoteurs comprennent, sans y être limités, U6, 7SK et Hl .

Dans la présente invention, le terme « séquence polyT » se réfère à une séquence nucléotidique comprenant au moins 3 nucléotides thymine (T) consécutifs. Dans un mode de réalisation, la séquence polyT comprend de 5 à 50 nucléotides, de préférence de 7 à 30 nucléotides. Dans la présente invention, le terme « vecteur » se réfère à tout type de vecteur (tels que, par exemple, plasmide, cosmide, phage, chromosome artificiel) contenant un gène (codant pour une protéine ou un ARN), capable d'être exprimé par une cellule (c'est-à-dire, incluant par exemple un promoteur, un codon d'initiation ATG, un codon stop, etc.). Ainsi, un vecteur permettant l'expression d'une protéine par une cellule pluripotente peut comprendre la séquence ADN codant ladite protéine, sous le contrôle d'un promoteur.

Dans la présente invention, le terme « sujet » fait référence à un animal, y compris un être humain. Au sens de la présente invention, un sujet peut être un patient, c'est-à-dire une personne recevant des soins médicaux, subissant ou ayant subi un traitement médical, ou surveillée dans le cadre du développement d'une maladie.

Dans la présente invention, le terme « traitement » se réfère à la réduction ou au soulagement d'au moins un effet indésirable ou symptôme d'une maladie, d'un désordre ou d'une condition associé avec la déficience ou l'absence d'un organe, tissu ou fonction cellulaire. Un sujet est traité avec succès si, après avoir reçu les cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention, le sujet présente une amélioration d'au moins un symptôme, une réduction du nombre de cellules pathogéniques, et/ou une réduction de la morbidité ou de la mortalité. Les paramètres ci-dessus sont facilement mesurables par des procédures courantes pour un praticien.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

La présente invention concerne un procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes, comprenant une étape d'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.

Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention est un procédé in vitro. Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention est un procédé ex vivo.

Les facteurs de transcription spécifiques du tissu cardiaque comprennent, mais ne sont pas limités à, BOP, CRP1, CRP2/SmLIM, CRP3/MLP, CSRP3, dHAND, eHAND, G AT A4, GATA5, GATA6, HAND2, ISL1, MEF2A, MEF2B, MEF2C, MEF2D, MESP1, MESP2, NKX2-5, POP3, TBX1, TBX2, TBX3, TBX5, TBX18, TBX20, TEF- 1 , TEF-3 , TEF-5 , TINMAN, UNC- 120/SFR.

Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d'activation d'au moins un facteur de transcription sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.

Le facteur de transcription G AT A4 ou GATA Binding Protein 4 (numéro d'accession Uniprot P43694) est codé chez l'homme par le gène GATA4 (Gene ID 2626). GATA4 appartient à la famille des facteurs de transcription GATA, constituée de GATAI à GATA6. Ces protéines se fixent sur la séquence ADN « GATA », retrouvée dans les promoteurs d'une multitude de gènes, par l'intermédiaire de doigts de zinc. GATA4 est notamment impliqué dans la régulation des gènes impliqués dans l'embryogénèse et dans la différenciation du myocarde.

Le facteur de transcription MEF2C ou Myocyte Enhancer Factor-2 isoform C (numéro d'accession Uniprot Q06413) est codé chez l'homme par le gène MEF2C (Gene ID 4208). MEF2C est l'un des 4 isoformes connus de la protéine MEF2, un important régulateur de la morphogenèse cardiaque et de la myogenèse.

Le facteur de transcription TBX5 ou T-Box 5 (numéro d'accession Uniprot Q99593) est codé chez l'homme par le gène TBX5 (Gene ID 6910). TBX5 est un membre d'une famille très conservée de protéines partageant un domaine de liaison à l'ADN commun, le domaine T-Box. Il joue un rôle important dans le développement cardiaque et la différenciation des membres supérieurs.

Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d'activation de GATA4. Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d'activation de MEF2C.

Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d'activation de TBX5.

Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d'activation de GATA4 et MEF2C.

Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d'activation de GATA4 et TBX5.

Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d'activation de MEF2C et TBX5. Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d'activation de GATA4, MEF2C et TBX5.

Selon un mode de réalisation, l'activation d'au moins un facteur de transcription tel que défini ci-dessus est réalisée par activation de la transcription du gène dudit au moins un facteur de transcription. Selon un autre mode de réalisation, l'activation d'au moins un facteur de transcription tel que défini ci-dessus est réalisée par activation de la traduction de Γ ARNm du gène dudit au moins un facteur de transcription.

Dans un mode de réalisation, l'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque utilise un système dérivé du système CRISPR/Cas9, dans lequel la protéine Cas9 est dépourvue d'activité endonucléase et possède une activité de transactivation. Dans la présente invention, cette protéine Cas9 modifiée est appelée dCas9.

Dans un mode de réalisation, dCas9 est une protéine Cas9 catalytiquement inactive fusionnée à un peptide d' activation de la transcription (aussi appelé domaine de transactivation, ou domaine transactivateur) qui permet d'augmenter la transcription d'un gène.

Ainsi, selon ce mode de réalisation, la cellule pluripotente exprime une protéine Cas9 dépourvue d'activité endonucléase et possédant une activité de transactivation. La protéine Cas9 est une endonucléase retrouvée dans plusieurs espèces bactériennes et archées. La plus répandue est la protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes (numéro d'accession Uniprot Q99ZW2), bien que des homologues de Cas9 aient été isolés dans d'autres espèces telles que Francisella novicida, Leptotrichia shahii, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus thermophilus, Treponema denticola.

Dans un mode de réalisation, la protéine Cas9 utilisée dans la présente invention est dérivée de la protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes (SP-Cas9).

Les protéines Cas9 modifiées sont bien connues de l'homme du métier (Perez-Pinera et al., 2013. Nat. Methods. 10:973-976 ; Chavez et al., 2015. Nat. Methods. 12(4):326-8).

Dans un mode de réalisation, au moins un résidu catalytique responsable de l'activité endonucléase de Cas9 est muté (par exemple, en résidu alanine) pour créer une protéine dCas9 dépourvue d'activité endonucléase. Les résidus catalytiques responsables de l'activité endonucléase de Cas9 comprennent notamment AsplO, Asp839, His840 et Asn863 (numérotation d'après SP-Cas9, Uniprot Q99ZW2). Un exemple de Cas9 dépourvue d'activité endonucléase est SEQ ID NO : 18. SEQ ID NO : 18 est dérivée de SP-Cas9, et contient des mutations des résidus AsplO, Asp839, His840 et Asn863. Dans un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à l'une de ses extrémités N- ou C-terminale, de préférence C-terminale, à au moins un domaine de transactivation.

Dans un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à un domaine de transactivation, de préférence choisi parmi le groupe comprenant ou consistant en VP16, VP48, VP64, VP160, p65 et Rta. Selon un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à VP64 (alors nommée dCas9-VP64). Selon un second mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à p65 (alors nommée dCas9-p65). Selon un troisième mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à Rta (alors nommée dCas9-Rta).

Dans un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à deux domaines de transactivation, de préférence choisis parmi le groupe comprenant ou consistant en VP16, VP48, VP64, VP160, p65 et Rta.

Dans un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à trois domaines de transactivation, de préférence choisis parmi le groupe comprenant ou consistant en VP16, VP48, VP64, VP160, p65 et Rta. Selon un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à VP64, p65 et Rta (alors nommée dCas9-VPR) (Chavez et al., 2015. Nat. Methods. 12(4):326-8). Selon un mode de réalisation, le gène codant pour une protéine Cas9 modifiée est inséré dans un vecteur, de préférence un plasmide, permettant son expression dans une cellule pluripotente, de préférence une cellule pluripotente humaine. Des exemples de vecteurs incluent, mais ne sont pas limités à, pcDNA, p-Shuttle, ou équivalents. Selon un mode de réalisation, le gène codant pour la protéine dCas9-VP64 est inséré dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, le vecteur permettant l'expression de la protéine dCas9-VP64 est le vecteur pcDNA-dCas9-VP64 (Addgene #47107).

Selon un mode de réalisation, le gène codant pour la protéine dCas9-VPR est inséré dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, le vecteur permettant l'expression de la protéine dCas9-VPR est le vecteur SP-dCas9-VPR (Addgene #63798).

Selon un premier mode de réalisation, l'expression de la protéine Cas9 modifiée dans les cellules souches pluripotentes comprend l'introduction dans lesdites cellules d'un vecteur permettant l'expression d'une protéine Cas9 modifiée, de préférence une protéine dCas9, de préférence la protéine dCas9-VP64 ou la protéine dCas9-VPR.

Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend :

a) l'introduction dans des cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ; et b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase. Selon un mode de réalisation, l'étape b) est réalisée avant, concomitamment ou après l'étape a).

Selon un second mode de réalisation, le vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque comprend en outre le gène codant pour une protéine Cas9 modifiée tel que décrit ci-dessus.

Ainsi, selon ce mode de réalisation, ledit au moins un ARNgs et la protéine Cas9 modifiée sont exprimés à partir du même vecteur. Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend l'introduction dans des cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5, et l'expression de la protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase.

Selon un troisième mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes utilisées dans la présente invention expriment de manière stable une protéine Cas9 modifiée telle que décrite ci-dessus.

Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend l'introduction dans des cellules souches pluripotentes exprimant une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.

Les techniques permettant de mettre au point une lignée cellulaire exprimant stablement une protéine d'intérêt sont connues de l'homme du métier. En particulier, ces méthodes incluent, mais ne se limitent pas à, la transfection stable, la transfection transitoire, l'infection par vecteur rétroviral.

Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes utilisées dans la présente invention expriment de manière stable la protéine dCas9-VP64. Selon un autre mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes utilisées dans la présente invention expriment de manière stable la protéine dCas9-VPR.

Selon un quatrième mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes utilisées dans la présente invention comprennent un système d'expression permettant d'induire l'expression de la protéine Cas9 modifiée par lesdites cellules. Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend :

a) l'introduction dans des cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ; et b) l'induction de l'expression d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, dans les cellules souches pluripotentes comprennent un système d'expression permettant d'induire l'expression de la protéine Cas9 modifiée par lesdites cellules.

Selon un mode de réalisation, l'étape b) est réalisée avant, concomitamment ou après l'étape a).

Selon un autre mode de réalisation, l'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est réalisée par administration d'au moins un plasmide ou vecteur comprenant une séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.

Selon un mode de réalisation, la séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est associée avec des éléments appropriés permettant de contrôler sa transcription, tels qu'un promoteur, un amplificateur, et optionnellement un terminateur ; et optionnellement sa traduction.

Dans un mode de réalisation, le plasmide ou le vecteur comprend une séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque sélectionné parmi G AT A4, MEF2C et TBX5.

Dans un mode de réalisation, le plasmide ou le vecteur comprend une séquence codant pour au moins 2 facteurs de transcription spécifiques du tissu cardiaque, de préférence sélectionnés parmi GATA4, MEF2C et TBX5. Dans un mode préféré de réalisation, le plasmide ou le vecteur comprend une séquence codant pour au moins 3 facteurs de transcription spécifiques du tissu cardiaque, de préférence sélectionnés parmi GATA4, MEF2C et TBX5. Dans un autre mode de réalisation, l'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est réalisée par administration de 2 plasmides ou vecteurs ou plus, comprenant chacun une séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.

Dans un mode particulier de l'invention, l'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est réalisée par administration de 3 plasmides ou vecteurs distincts, comprenant chacun une séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence GATA4, MEF2C et TBX5 respectivement.

Dans un mode de réalisation, la séquence est une séquence ADN ou ARN.

Selon un mode de réalisation, le vecteur est un vecteur d'expression. Tel qu'utilisé dans l'invention, le terme « vecteur d'expression » signifie un véhicule par lequel la séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est introduite dans une cellule hôte (dans le cas de la présente invention, une cellule souche pluripotente), de manière à transformer la cellule hôte et à promouvoir l'expression de la séquence (par exemple la transcription ou la traduction).

Selon un mode de réalisation, le vecteur est un vecteur viral. Dans un mode de réalisation, les vecteurs viraux incluent, mais ne se limitent pas à, un adénovirus, un rétrovirus, un virus de l'herpès et un virus AAV (adeno-associated virus). De tels vecteurs viraux peuvent être produits par des procédés connus par l'homme du métier.

Selon un autre mode de réalisation, l'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est réalisée par culture des cellules souches pluripotentes dans un milieu de culture comprenant ledit au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.

Dans un mode de réalisation, ledit au moins un facteur de transcription est ajouté dans le milieu de culture après culture des cellules dans un milieu ne contenant pas de facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence pendant au moins 6 heures, 12 heures, 24 heures, 36 heures, ou 48 heures. Dans un autre mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont directement cultivées dans un milieu de culture comprenant au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.

Dans un mode de réalisation, au moins 2 facteurs de transcription spécifiques du tissu cardiaque sont ajoutés dans le milieu de culture, de préférence sélectionnés parmi G AT A4, MEF2C et TBX5. Dans un mode de réalisation, les 3 facteurs G AT A4, MEF2C et TBX5 sont ajoutés au milieu de culture.

Dans un mode de réalisation, lesdits au moins 2 facteurs de transcription, de préférence 3 facteurs, sont ajoutés simultanément dans le milieu de culture. Dans un autre mode de réalisation, lesdits au moins 2 facteurs de transcription, de préférence 3 facteurs, sont ajoutés séquentiellement dans le milieu de culture.

Selon un mode de réalisation, l'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque par un système dérivé du système CRISPR/Cas9 utilise un ARN guide spécifique (ARNgs). Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend en outre l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un ARN guide spécifique (ARNgs) dirigé contre la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence contre la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5. Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend en outre l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5. Dans la présente invention, les termes « dirigé contre la région promotrice du gène » ou « complémentaire de la région promotrice du gène » se disent d'un ARNgs dirigé contre ou complémentaire de la totalité ou d'une partie, de préférence d'une partie, de la région promotrice dudit gène. Préférentiellement, les ARNgs de la présente invention sont dirigés ou sont complémentaire de régions situées dans les mille paires de bases en amont du site de démarrage de la transcription du gène cible.

Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention comportent entre 10 et 40 nucléotides, préférentiellement entre 10 et 30 nucléotides, préférentiellement entre 15 et 25 nucléotides, préférentiellement 20 nucléotides.

Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention comportent 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucléotides. Selon la présente invention, le terme « complémentaire » signifie complémentaire d'au moins 80% de la région promotrice ciblée, de préférence à au moins 85%, plus préférentiellement à au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%.

Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires de la région promotrice du gène GATA4. Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend l'introduction dans les cellules souches pluripotentes de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou plus, ARNgs complémentaires de la région promotrice du gène GATA4. Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires d'au moins une séquence de la région promotrice du gène GATA4 choisie parmi SEQ ID Nos : 9-13, de préférence parmi SEQ ID NOs : 10- 13 , ou toute séquence présentant au moins 75 %>, de préférence au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité avec une des séquences SEQ ID Nos : 9-13, de préférence avec une des séquences SEQ ID NOs : 10-13.

Au sens de la présente invention, le terme « identité », lorsqu'il est utilisé dans une relation entre les séquences de deux ou plusieurs séquences nucléotidiques, se réfère au degré de parenté entre ces séquences nucléotidiques, tel que déterminé par le nombre de correspondances entre les chaînes de deux bases ou plus. Selon l'invention, « l'identité » correspond ainsi à un pourcentage d'identité entre deux (ou plus de 2) séquences. Ce pourcentage est défini comme le nombre de positions pour lesquelles les bases sont identiques lorsque les séquences sont alignées de manière optimale, divisé par le nombre total de bases de la plus petite des 2 séquences. Les différences entre les séquences peuvent être réparties au hasard et sur toutes leurs longueurs.

Deux séquences sont dites alignées de manière optimale lorsque le pourcentage d'identité est maximal. Par ailleurs, comme cela apparaîtra de manière claire à l'homme du métier, il peut être nécessaire de faire appel à des ajouts de positions lacunaires (des « gaps ») de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut donc être déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est alors calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Préférentiellement, les méthodes de détermination de l'identité sont conçues pour donner la plus grande concordance possible entre les séquences comparées.

Le pourcentage d'identité peut être déterminé par un modèle mathématique particulier ou par un programme d'ordinateur (généralement désigné par le terme « d'algorithme »). Des méthodes de calcul de l'identité entre des séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples non limitatifs de telles méthodes incluent celles décrites dans les documents suivants : Arthur M. Lesk, Computational Molecular Biology: Sources and Methods for Séquence Analysis (New- York : Oxford University Press, 1988) ; Douglas W. Smith, Biocomputing: Informatics and Génome Projects (New- York: Académie Press, 1993) ; Hugh G. Griffîn and Annette M. Griffin, Computer Analysis of Séquence Data, Part 1 (New Jersey: Humana Press, 1994) ; Gunnar von Heinje, Séquence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit (Académie Press, 1987) ; Michael Gribskov and John Devereux, Séquence Analysis Primer (New York: M. Stockton Press, 1991) ; et Carillo et al., 1988. SIAMJ. Appl. Math. 48(5) : 1073-1082. Des méthodes de détermination de l'identité ont été décrites dans des programmes d'ordinateurs accessibles au public. Des exemples préférés de méthodes utilisant des programmes d'ordinateurs incluent, sans y être limités, le progiciel GCG, incluant GAP (Devereux et al., 1984. Nucl. Acid. Res. 12(1 Pt l):387-395 ; Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, et FASTA (Altschul et al, 1990. J. Mol. Biol. 215(3) :403-410). Le programme BLASTX est disponible auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et d'autres sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894 ; Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215(3) :403-410). L'algorithme de Smith- Waterman, qui est bien connu de l'homme du métier, peut également être utilisé pour déterminer le pourcentage d'identité entre deux séquences.

Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires de la région promotrice du gène MEF2C. Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend l'introduction dans les cellules souches pluripotentes de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 (ou plus) ARNgs complémentaires de la région promotrice du gène MEF2C. Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires d'au moins une séquence de la région promotrice du gène MEF2C choisie parmi le groupe consistant en SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24, ou toute séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité avec une des séquences SEQ ID NOs : 14 ; 15 ; 23 et 24. Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires d'au moins une séquence de la région promotrice du gène MEF2C choisie parmi SEQ ID NO : 14 et SEQ ID NO : 15, ou toute séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité avec une des séquences SEQ ID NOs : 14-15.

Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires de la région promotrice du gène TBX5. Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend l'introduction dans les cellules souches pluripotentes de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ARNgs complémentaires de la région promotrice du gène TBX5. Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires d'au moins une séquence de la région promotrice du gène TBX5 choisie parmi SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17, ou toute séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité avec une des séquences SEQ ID Nos : 16-17. La présente invention concerne donc également une séquence ARN complémentaire d'une séquence d'acide nucléique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 9-17 et 23-24, de préférence parmi SEQ ID NOs : 10-17 et 23-24. La présente invention concerne également une séquence ARN complémentaire d'une séquence d'acide nucléique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 9-17, de préférence parmi SEQ ID NOs : 10-17. Selon un mode de réalisation, la séquence ADN codant au moins pour un ARNgs tel que décrit ci-dessus est insérée dans un vecteur permettant son expression dans une cellule souche pluripotente, de préférence un plasmide. Selon un mode de réalisation, la séquence ADN encodant au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus est insérée dans un vecteur, sous contrôle d'un promoteur reconnu par l'ARN Polymérase III, de préférence un promoteur humain reconnu par l'ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SK ou Hl .

Dans un mode de réalisation, le vecteur comprend en outre un site de clonage simple et optionnellement une séquence polyT. Des exemples de séquences polyT bien connues de l'homme du métier incluent, mais ne se limitent pas à, TATTTAT, et TATTTAA, AATTTAT.

Selon un mode particulier de réalisation, la séquence ADN codant au moins pour un ARNgs tel que décrit ci-dessus est insérée dans un vecteur pSPgRNA (Addgene #47108).

Selon un mode de réalisation, entre 1 et 20 séquences d'ADN codant un ARNgs sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 séquences d'ADN codant un ARNgs sont insérées dans un vecteur. La présente invention concerne donc également un vecteur ou un plasmide comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice d'un gène codant pour un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque tel que décrit ci-dessus, de préférence sélectionnées parmi les séquences SEQ ID NO : 9-17 et 23-24, de préférence sélectionnées parmi les séquences SEQ ID NO : 9-17. Dans un mode de réalisation, la séquence d'acide nucléique est une séquence ADN.

Dans un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend plusieurs séquences ADN distinctes codant pour des ARNgs distincts complémentaires de la région promotrice d'un même gène. Dans un autre mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend des séquences ADN distinctes codant pour des ARNgs distincts complémentaires de régions promotrices de différents gènes. Dans un autre mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend plusieurs séquences ADN distinctes codant pour des ARNgs distincts complémentaires de la région promotrice d'un même gène et des séquences ADN codant pour des ARNgs complémentaires de régions promotrices de différents gènes.

A titre d'illustration, le vecteur de l'invention peut comprendre 2 séquences ADN, codant pour deux ARNgs distincts complémentaire de la région promotrice du gène GATA4. Dans un autre exemple illustratif, le vecteur de l'invention peut comprendre 2 séquences ADN codant pour deux ARNgs distincts complémentaire de la région promotrice du gène G AT A4, et une séquence ADN codant pour un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène TBX5.

Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins une séquence (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins deux séquences (par exemple 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins trois séquences (par exemple 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10 ou 11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins quatre séquences (par exemple 4, 5, 6, 7, 8 , 9,

10 ou 11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins cinq séquences (par exemple 5, 6, 7, 8 , 9, 10 ou 11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins six séquences (par exemple 6, 7, 8 , 9, 10 ou

11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins sept séquences (par exemple 7, 8 , 9, 10 ou 11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins huit séquences (par exemple 8 , 9, 10 ou 11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins 9 séquences (par exemple 9, 10 ou 11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins 10 séquences (par exemple 10 ou 11 séquences) sélectionnées parmi SEQ ID NOs :

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend les 11 séquences SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend les 8 séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 14, 15, 16, 17, 23 et 24. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend les 6 séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 16, 17, 23 et 24.

Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins une séquence (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins deux séquences (par exemple 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins trois séquences (par exemple 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins quatre séquences (par exemple 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins cinq séquences (par exemple 5, 6, 7, 8 ou 9 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins six séquences (par exemple 6, 7, 8 ou 9 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins sept séquences (par exemple 7, 8 ou 9 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend au moins huit séquences (par exemple 8 ou 9 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend les 9 séquences SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Selon un mode de réalisation, le vecteur de l'invention comprend les six séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 14, 15, 16 et 17.

Selon un mode de réalisation, chaque séquence d'ADN codant pour un ARNgs est sous contrôle d'un promoteur reconnu par l'ARN Polymérase III distinct, de préférence un promoteur humain reconnu par l'ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SK ou Hl .

Selon un autre mode de réalisation, toutes les séquences d'ADN codant pour un ARNgs sont sous contrôle d'un promoteur unique reconnu par l'ARN Polymérase III, de préférence un promoteur humain reconnu par l'ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SK ou Hl .

Selon un mode de réalisation, toutes les séquences d'ADN codant pour un ARNgs sont espacées d'une courte région comprenant un motif de coupure de l'ARN. Dans un mode de réalisation, le motif de coupure comprend de 5 à 20 nucléotides, de préférence de 7 à 15 nucléotides, de préférence 10 nucléotides. Selon un mode de réalisation, toutes les séquences d'ADN codant pour un ARNg spécifique sont suivies d'une séquence ADN codant pour un ARNg constant.

Dans la présente invention, le terme « ARNg constant » se réfère à un ARN palindromique formant une structure dite « en épingle à cheveux » ou tige-boucle. Dans un mode de réalisation, le vecteur comprend dans le sens 5 ' vers 3 ' un promoteur U6, la séquence codant pour un ARNgs, la séquence codant pour un ARNg constant, une séquence polyT et un motif de coupure.

Selon le mode de réalisation dans lequel le vecteur comprend 2 séquences ADN codant pour deux ARNgs distincts, le vecteur comprend alors dans le sens 5' vers 3' un promoteur U6, la séquence codant pour le premier ARNgs, la séquence codant pour un ARNg constant, une séquence polyT, un motif de coupure ; et un promoteur U6, la séquence codant pour le second ARNgs, la séquence codant pour un ARNg constant, une séquence polyT et un motif de coupure. Ceci s'applique également aux vecteurs comprenant 3 séquences ADN codant pour des ARNgs distincts ou plus.

Selon un mode de réalisation, au moins une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 est insérée dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, deux séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, trois séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, quatre séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, cinq séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, six séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, sept séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, huit séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, neuf séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, dix séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les onze séquences SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les dix séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur.

Selon un mode de réalisation, au moins une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 est insérée dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, deux séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, trois séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, quatre séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, cinq séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, six séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, sept séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, huit séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les neuf séquences SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les huit séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur, sous contrôle de promoteurs distincts, de préférence, de promoteurs reconnus par TARN Polymérase III, de préférence de promoteurs humains reconnus par Γ ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SK ou Hl .

Selon un mode de réalisation, les séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 16, 17, 23 et 24 sont insérées dans un vecteur, sous contrôle de promoteurs distincts, de préférence, de promoteurs reconnus par TARN Polymérase III, de préférence de promoteurs humains reconnus par l'ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SK ou Hl .

Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend donc l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend donc l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'un vecteur comprenant une séquence ADN codant pour au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus.

Un autre objet de l'invention est une population de cellules souches pluripotentes permettant l'expression d'au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus. Dans un mode de réalisation, la population de cellules souches pluripotentes comprend un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5. Dans un mode de réalisation, plus de 50%, de préférence plus de 60, 70, 80, 85, 90, 95% ou plus des cellules de la population de cellules souches pluripotentes de l'invention comprennent un vecteur tel que décrit ci-dessus.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches embryonnaires.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches pluripotentes induites. Les procédés permettant l'obtention d'iPSC sont bien connus de l'homme du métier. En particulier, les iPSC peuvent être obtenues à partir de cellules somatiques humaines transfectées avec les facteurs de transcription Oct3/4, Sox2, Klf4 et c-Myc (Takahashi et al, 2007. Cell. 131(5):861-72), Oct3/4, Sox2, Nanog et Lin28 (Yu et al, 2007. Science. 318(5858): 1917-20) ou avec les gènes Oct3/4, Sox2 et Klf4 (Nakagawa et al. , 2008. Nat. Biotechnol. 26(1) : 101 -6). Les iPSC peuvent être obtenues à partir d'une large variété de cellules telles que, par exemple, les fïbroblastes, les lymphocytes B, les kératinocytes ou les cellules de la membrane méningée (Patel et al, 2010. Stem Cell Rev. 6(3):367-80). Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention pourra comprendre une étape de mise en culture de cellules souches pluripotentes telles que décrites ci-dessus, dans un système de culture adhérent et dans un milieu de culture sans sérum. Ces conditions de culture diffèrent de celles utilisées pour la formation de corps embryoïdes qui requiert l'utilisation de systèmes de culture non adhérents afin de permettre aux cellules souches de s'agréger.

Des exemples de systèmes de culture adhérente susceptibles d'être utilisés dans le procédé selon l'invention incluent, de façon non limitative, un système de culture en monocouche adhérente ou un système de culture sur cellules nourricières. Le système de culture peut se présenter sous toute forme adaptée au procédé selon l'invention, en particulier sous forme de flacon, plaque multi-puits ou boîte.

Selon un mode de réalisation, le système de culture adhérente est un système de culture sur cellules nourricières qui favorisent la prolifération et/ou contrôlent la différenciation des cellules avec lesquelles elles sont co-cultivées. De préférence, ces cellules nourricières stimulent la prolifération des cellules en culture sans induire leur différenciation. Elles sont fréquemment irradiées afin de prévenir leur prolifération et l'envahissement de la culture d'intérêt. Les cellules nourricières susceptibles d'être utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent être aisément choisies par l'homme du métier parmi les différents types connus tels que, par exemple, les fîbroblastes embryonnaires de souris (cellules MEF), les fîbroblastes embryonnaires humains (HEF), ou les cellules épithéliales humaines de la trompe de Fallope, de préférence en présence d'un inhibiteur de la voie de signalisation FGF, tel que SU5402 (Mohammadi et al., 1997 ^' . Science. 276(5314):955-60).

Selon un mode de réalisation, le système de culture adhérent est un système de culture en monocouche adhérente. Ce système comprend un support solide, par exemple du verre ou du plastique, généralement revêtu d'une matrice ou d'un substrat favorisant l'adhérence des cellules. Le substrat peut être un substrat protéique constitué de facteurs d'attachement et favorisant l'adhésion des cellules au support. Ces facteurs d'attachement peuvent notamment être choisis parmi la poly-L-lysine, le collagène, la fîbronectine, la laminine ou la gélatine. Les matrices ou substrats favorisant l'adhérence des cellules sont bien connus de l'homme du métier et de nombreuses variétés sont disponibles dans le commerce. Ces matrices comprennent, par exemple, les matrices de type Matrigel™, Geltrex ^® ou d'autres matrices comprenant une ou plusieurs protéines d'ancrage telles que le collagène, la laminine, la fïbronectine, l'élastine, des protéoglycanes, des aminoglycanes ou la vitronectine. Les matrices 3D de type hydrogel peuvent également être utilisées.

Les cellules souches pluripotentes peuvent être cultivées dans un milieu de maintenance sans sérum permettant de propager et maintenir les cellules dans un état indifférencié.

Dans la présente invention, le terme « milieu de maintenance » se réfère à un milieu de culture contenant les facteurs FGFP et/ou TGFp, et permettant la culture et la prolifération de cellules souches pluripotentes sans induire leur différenciation. De nombreux milieux de maintenance sont disponibles dans le commerce et sont bien connus de l'homme du métier (Chen et al, 2011. Aging Cell. 10(5):908-11). Selon un mode de réalisation, le milieu de maintenance peut être, par exemple, les milieux mTESRl™ et mTESR2™ (STEMCELL Technologies), le milieu E8 (Life Technologies) ou le milieu hPSC (Promocell).

Selon un mode de réalisation, les cellules sont de préférence repiquées régulièrement afin d'empêcher la culture d'atteindre la confluence, c'est-à-dire de recouvrir l'ensemble de la surface disponible. En effet, la confluence peut induire un arrêt de la prolifération et des changements métaboliques non souhaités. Selon un mode de réalisation, l'étape d'introduction de vecteurs dans les cellules souches pluripotentes s'effectue à un pourcentage de confluence variant de 60 à 90%, de préférence de 70 à 80%.

Les cellules peuvent être repiquées en utilisant des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Elles peuvent notamment être détachées de la matrice ou du support par l'action d'enzymes telles que la collagénase IV ou un milieu de détachement cellulaire commercial tel que TrypLE™ Express (Life Technologies), récupérées par centrifugation, dissociées mécaniquement et réensemencées dans un nouveau système de culture. Selon un mode de réalisation, l'introduction d'un vecteur (permettant l'expression des ARNgs ou de la Cas9 modifiée) dans les cellules souches pluripotentes est réalisée par transfection, nucléofection, lipofection, microinjection, ou électroporation.

Selon un mode de réalisation, une quantité de vecteur variant de 1 ng à 50 μg, de préférence de 100 ng à 5 μg, encore plus préférentiellement de 180 ng à 1 μg est utilisé.

Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend deux étapes de transfection par un vecteur permettant l'expression de un ou plusieurs ARNgs (vecteur ARNgs) et par un vecteur de transfection par un vecteur permettant l'expression de la Cas9 modifiée (vecteur Cas9), et un ratio molaire vecteur ARNgs:vecteur Cas9 variant de 10: 1 à 1 : 10, de préférence de 1 : 1 à 1 :5, encore plus préférentiellement de environ 1 :3 est utilisé.

Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend une étape de transfection par un vecteur permettant l'expression d'un ou plusieurs ARNgs (vecteur ARNgs) et de la Cas9 modifiée (vecteur Cas9). Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de maintenance. Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de maintenance avant et/ou lors de l'introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs et/ou l'expression de la Cas9 modifiée. Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de maintenance pendant au moins 6 heures, de préférence au moins 12 heures, 24 heures, 36 heures, 2 jours, 5 jours ou 7 jours avant l'introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs et/ou l'expression de la Cas9 modifiée.

Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de différenciation. Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de différenciation lors de et/ou après l'introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs et/ou l'expression de la Cas9 modifiée. Dans la présente invention, le terme « milieu de différenciation » se réfère à un milieu de culture ne contenant pas les facteurs FGFP et/ou TGFp, et permettant la différenciation des cellules souches pluripotentes. Selon un mode de réalisation, le milieu de maintenance peut être, par exemple, le milieu E5 ou E6 (Life Technologies). Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de différenciation pendant au moins 6 heures, de préférence au moins 12 heures, 24 heures, 36 heures, 2 jours, 5 jours ou 7 jours ou 14 jours ou plus après l'introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs et/ou l'expression de la Cas9 modifiée. Dans un autre mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de différenciation pendant au moins 15, 20 ou 25 jours ou plus après l'introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs et/ou l'expression de la Cas9 modifiée. Dans un autre mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de différenciation pendant au moins 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 jours ou plus après l'introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs et/ou l'expression de la Cas9 modifiée.

Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de maintenance avant et pendant et 1 ou 2 jours après les étapes d'introduction de vecteurs, et dans un milieu de différenciation par la suite.

Dans un mode de réalisation, que ce soit en milieu de maintenance ou de différenciation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées à 37°C dans une atmosphère à 95% d'humidité et 5% de CO2.

Préférentiellement, le milieu de maintenance et/ou le milieu de différenciation est/sont supplémenté(s) d'au moins un inhibiteur de la Rho-associated protein kinase ou ROCK, afin de prévenir l'anoïkose des cellules. Des exemples d'inhibiteurs de ROCK incluent, sans y être limités : AT13148, Fasudil, GSK429286A, Ripasudil, RKI-1447, Thiazovivine et Y-27632.

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ; b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;

c) l'introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d'un vecteur permettant l'expression d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR ;

d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence 24 à 48h après la dernière des étapes b) et c).

Selon ce mode de réalisation, l'étape c) peut être réalisée avant, concomitamment ou après l'étape b).

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ; b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5, et l'expression d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR ;

c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence 24 à 48h après l'étape b).

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture dans un milieu de maintenance de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR : b) l'introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;

c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence 24 à 48h après l'étape b).

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture dans un milieu de maintenance de cellules souches pluripotentes comprenant un système d'expression inductible d'une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR ;

b) l'introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;

c) l'induction de l'expression de la protéine Cas9 modifiée par lesdites cellules ; et d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence 24 à 48h après la dernière des étapes b) et c). Selon ce mode de réalisation, l'étape c) peut être réalisée avant, concomitamment ou après l'étape b).

Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend en outre une étape de traitement pharmaco logique des cellules souches pluripotentes.

Tel qu'utilisé dans la présente invention, le terme « traitement pharmacologique » se réfère à l'introduction dans le milieu de culture des cellules souches pluripotentes (ou la mise en contact des cellules souches pluripotentes) d'au moins un agent pharmacologique de différenciation.

Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend en outre avant, concomitamment et/ou après l'étape d'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, la mise en contact des cellules souches pluripotentes avec au moins un agent pharmacologique de différenciation.

Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec l'agent pharmacologique avant l'introduction d'un vecteur selon l'invention. Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec l'agent pharmacologique pendant l'introduction d'un vecteur selon l'invention. Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec l'agent pharmacologique après l'introduction d'un vecteur selon l'invention.

Dans un mode de réalisation, la mise en contact avec l'agent pharmacologique consiste en l'addition dans le milieu de culture des cellules souches pluripotentes d'au moins une molécule pharmacologique utilisée pour induire la transformation mésodermique de cellules pluripotentes.

Dans un mode de réalisation, ladite au moins une molécule pharmacologique est ajoutée dans le milieu de maintenance. Dans un mode de réalisation, ladite au moins une molécule pharmacologique est ajoutée dans le milieu de différenciation. Dans un mode de réalisation, ladite au moins une molécule pharmacologique est ajoutée dans le milieu de maintenance et dans le milieu de différenciation.

Les molécules pharmacologiques utilisées dans la différenciation des cellules souches pluripotentes pour induire leur transformation mésodermique, de préférence leur transformation cardiomyocytaire, sont bien connues de l'homme du métier. Ces molécules pharmacologiques peuvent par exemple moduler des voies de signalisations, notamment les voies des Smad (activine/nodal, TGFp, BMP), GSK3 et/ou Wnt.

Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique consiste en l'addition d'au moins un inhibiteur de la glycogen synthase kinase 3 ou GSK3. Des exemples d'inhibiteurs de GSK3 comprennent, sans y être limités, CHIR90021, Alsterpaullone, AZD1080, 3F8, A1070722, AR-A014418, BIO, BIO-acetoxime, Cazpaullone, CHIR98014, CHIR98023, Dibromocantharelline, HMK-32, 10Z-Hymenialdisine, Indirubin-3'-oxime, Kenpaullone, L803, L803-mts, Lithium carbonate, Manzamine A, MeBIO, Meridianins, NP00111, NP031115, NSC693868, Palinurine, SB216763, SB415286, TC-G 24, TCS2002, TCS21311, TDZD-8, Tideglusib, Tricantine, et TWS119. De préférence, l'inhibiteur de GSK3 est CHIR90021.

Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique consiste en l'addition d'au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt. Des exemples d'inhibiteurs de la voie de signalisation Wnt comprennent, sans y être limités, IWP2, IWP4, IWR1, IWR4, C59, et XAV939. De préférence, l'inhibiteur de Wnt est IWP2.

Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique consiste en l'addition d'au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et d'au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2). Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique consiste en l'addition de CHIR90021, de préférence à une concentration d'environ 6 μΜ, et de IWP2, de préférence à une concentration d'environ 5 μΜ.

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;

b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;

c) l'expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR, soit (i) par introduction dans lesdites cellules d'un vecteur permettant l'expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, soit (ii) par induction d'un système inductible permettant l'expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, ledit système inductive étant préalablement compris dans lesdites cellules ;

d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation ;

l'étape c) pouvant être réalisée avant, concomitamment ou après l'étape b).

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ; b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;

c) l'expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR, soit (i) par introduction dans lesdites cellules d'un vecteur permettant l'expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, soit (ii) par induction d'un système inductible permettant l'expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, ledit système inductive étant préalablement compris dans lesdites cellules ;

d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;

l'étape c) pouvant être réalisée avant, concomitamment ou après l'étape b).

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;

b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;

c) l'induction de l'expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR, soit (i) par introduction dans lesdites cellules d'un vecteur permettant l'expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, soit (ii) par induction d'un système inductible permettant l'expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, ledit système inductive étant préalablement compris dans lesdites cellules ;

d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;

l'étape c) pouvant être réalisée avant, concomitamment ou après l'étape b).

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR dans un milieu de maintenance supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;

b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ; c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation.

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR dans un milieu de maintenance ;

b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;

c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2).

Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :

a) la culture de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d'activité nucléase, de préférence dCas9-VPR dans un milieu de maintenance supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;

b) l'introduction dans les cellules souches pluripotentes d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;

c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2).

Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec ledit au moins un agent pharmacologique pendant au moins 2h, 4h, 8h, 12h, 16h, 20h, 24h, 36h, 48h, 60h, ou 72h. Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique est réalisé pendant 1 jour ou plus. Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique est réalisé pendant 2 jours ou plus.

Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d'obtenir une population de cellules comprenant plus de 50% de cardiomyocytes différenciés, de préférence plus de 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de cardiomyocytes différenciés.

Les cardiomyocytes différenciés peuvent être caractérisés par les marqueurs suivants : expression de la troponine T cardiaque (cTnT, encodée par le gène TNNT2), de la Troponine I cardiaque, de la chaîne lourde de la myosine 7 (MYH7, encodée par le gène MYH7), de la chaîne légère régulatrice de la myosine ventriculaire (MLC-2v, encodée par le gène MYL2), de la chaîne lourde de la myosine 11 (MYH11, encodée par le gène MYH11), du gène Iroquois Homeobox 4 (IRX4), de gènes codant pour les protéines typiques du cycle calcique d'un cardiomyocyte (Serca2a, Phospholamban, de l'alpha-actinine 2 (ACTN2, encodée par le gène AC77V2).

Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d'obtenir une population de cellules dont le niveau d'expression d'au moins un marqueur sélectionné parmi cTnT, ACTN2, MLC-2v et MYH11 est supérieur, de préférence supérieur de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou plus, au niveau d'expression dudit marqueur dans des cellules souches pluripotentes. Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d'obtenir une population de cellules dont le niveau d'expression d'au moins un marqueur sélectionné parmi cTnT, ACTN2, MLC-2v et MYH11, de préférence cTNT, est supérieur d'au moins 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%), ou 20%) ou plus, au niveau d'expression dudit marqueur dans des cellules souches pluripotentes. Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d'obtenir une population de cellules dont le niveau d'expression d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, autre que GATA4, MEF2C et/ou TBX5, est supérieur, de préférence supérieur de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%> ou plus, au niveau d'expression dudit facteur dans des cellules souches pluripotentes.

Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d'obtenir une population de cellules dont le niveau d'expression d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque sélectionné parmi BOP, CRP1, CRP2/SmLIM, CRP3/MLP, CSRP3, dHAND, eHAND, GATA5, GATA6, HAND2, ISL1, MEF2A, MEF2B, MEF2D, MESP1, MESP2, NKX2-5, POP3, TBX1, TBX2, TBX3, TBX18, TBX20, TEF-1, TEF-3, TEF-5, TINMAN, UNC-120/SFR est supérieur de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%o, 30%) ou plus, au niveau d'expression dudit facteur dans des cellules souches pluripotentes.

Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d'obtenir une population de cellules dont le niveau d'expression du facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque NKX2-5 est supérieur d'au moins 5%>, 10%>, 15%>, 20%>, 25%> ou 30%> ou plus, au niveau d'expression dudit facteur dans des cellules souches pluripotentes. Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d'obtenir une population de cellules dont le niveau d'expression du facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque NKX2-5 est de 5%> à 30%> supérieur, de préférence de 10%> à 25 %> supérieur, de préférence de 10%o à 20%o supérieur, au niveau d'expression dudit facteur dans des cellules souches pluripotentes.

Le procédé de différenciation de l'invention a pour avantage de permettre l'expression de troponine. En particulier, cet avantage est obtenu même sans mise en contact avec au moins un inhibiteur de GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.

Cet avantage du procédé de l'invention est accru lors de la mise en contact avec au moins un inhibiteur de GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt. En effet, il a été montré par les inventeurs que l'introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence un vecteur permettant l'expression d'au moins un ARNgs complémentaire de chaque région promotrice de GATA4, MEF2C et TBX5, et le transfert dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt, ont un effet synergique sur la formation de cellules exprimant la troponine.

Un autre avantage du procédé de l'invention est la formation de cellules différenciées dont la morphologie est caractéristique des cardiomyocytes.

Les inventeurs ont également démontré que les cardiomyocytes obtenus par le procédé de différenciation de l'invention sont stimulables, ou en d'autres termes qu'ils présentent des potentiels d'action. En outre, les cardiomyocytes obtenus par le procédé de différenciation de l'invention ne présentent pas de potentiel d'action spontané.

Dans un mode de réalisation, l'ADP90 (90% de la durée du potentiel d'action) des cardiomyocytes obtenus par le procédé de différenciation de l'invention est d'au moins 150 ms, de préférence d'au moins 200 ms. Selon un mode préféré de réalisation, l'ADP90 des cardiomyocytes obtenus par le procédé de différenciation de l'invention est d'au moins 250 ms ou 300 ms.

Les inventeurs ont également montré que les cardiomyocytes obtenus par le procédé de différenciation de l'invention présentent un potentiel de repos. Selon un mode de réalisation, le potentiel de repos des cardiomyocytes obtenus par le procédé de différenciation de l'invention va de -100 mV à -30 mV, de préférence de -95 mV à -45 mV, de préférence de -90 mV à -40 mV. Selon un mode de réalisation, le potentiel de repos des cardiomyocytes obtenus par le procédé de différenciation de l'invention est en moyenne d'environ -75 mV. Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend en outre une étape de sélection ou de tri sélectif des cardiomyocytes différenciés. Des exemples non limitatifs de méthodes qui peuvent être utilisées pour sélectionner ou trier des cellules incluent le tri par clonage, par cytofluorimétrie de flux ou encore par colonnes d'immunoaffînité ou immunomagnétiques utilisant des anticorps spécifiques des marqueurs de surface des cardiomyocytes tels que SIRPA (également appelé Tyrosine-protein phosphatase non- receptor type substrate 1, SIRP alpha ou CD 172a).

Des marqueurs de surface des cardiomyocytes incluent, mais ne sont pas limités à, ADPvBl (récepteur β-l adrénergique) et ADRB2 (récepteur β-l adrénergique). Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes différenciés n'expriment pas les marqueurs de surface CD31 et/ou CD34.

Cependant, de façon avantageuse, le procédé de différenciation de l'invention est caractérisé en ce qu'il ne comprend pas d'étapes de purification, de sélection positive, ou de clonage d'un type cellulaire spécifique. Par sélection positive, il faut comprendre toute étape permettant de trier les cellules sur la base d'au moins une caractéristique particulière et notamment l'expression d'un marqueur cellulaire.

Il a été montré en particulier, que le procédé de différenciation de l'invention, contrairement aux procédés décrits dans l'état de la technique, permet d'obtenir une population de cardiomyocytes comprenant un fort pourcentage de cardiomyocytes, sans étape de sélection. L'absence d'étapes de clonage, de purification ou de sélection positive, permet d'améliorer nettement le rendement final obtenu.

En outre, le procédé de différenciation de l'invention présente l'avantage de réduire significativement le délai d'obtention des cardiomyocytes. Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cardiomyocytes de l'invention permet d'obtenir une population comprenant plus de 50% de cardiomyocytes différenciés, de préférence plus de 60%, 70%>, 80%>, 85%>, 90%> ou 95%> de cardiomyocytes différenciés, en environ 7 jours, ou en 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 jours.

Dans un mode de réalisation, les cellules obtenues par le procédé de l'invention peuvent en outre être soumises à un procédé de différenciation supplémentaire. Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permettrait une première maturation des cellules qui serait complété par un procédé de différenciation supplémentaire. Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation supplémentaire peut être le procédé de l'invention ou un autre procédé de différenciation. Les autres procédés de différenciation de cellules en cardiomyocytes sont connus de l'homme du métier.

L'invention concerne également des cardiomyocytes, ou une population de cardiomyocytes, susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention. Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes sont des cardiomyocytes différenciés.

Dans un mode de réalisation, la population de cardiomyocytes comprend plus de 50% de cardiomyocytes différenciés, de préférence plus de 60%, 70%>, 80%>, 85%, 90% ou 95% de cardiomyocytes différenciés.

Dans un mode de réalisation, la population de cardiomyocytes ne comprend substantiellement que des cardiomyocytes différenciés. Dans un mode de réalisation, la population de cardiomyocytes ne comprend substantiellement plus de cellules souches pluripotentes non différenciées.

Dans un mode de réalisation, la population de cardiomyocytes comprend d'autres types cellulaires que les cardiomyocytes. Dans un autre mode de réalisation, la population de cardiomyocytes ne comprend pas d'autres types cellulaires que les cardiomyocytes.

Les méthodes de caractérisation des cardiomyocytes différenciés sont bien connues de l'homme du métier.

Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention présentent une activité contractile périodique spontanée. Les méthodes pour mesurer la contractilité sont bien connues de l'homme de métier (GoBmann et al., 2016. Cell. Physiol. Biochem. 38: 1182-1198). L'activité contractile des cardiomyocytes peut notamment être observée lorsque les cardiomyocytes sont cultivés dans un environnement adéquat, en particulier dans un environnement avec une concentration de calcium Ca ²⁺ et une balance d'électrolyte adéquate. Dans ces conditions, les cardiomyocytes peuvent présenter une contractilité périodique le long d'un axe de la cellule, suivie d'un relâchement de la contraction. Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention présentent un ADP90 (90% de la durée du potentiel d'action) d'au moins 200 ms. Selon un mode préféré de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention présentent un ADP90 d'au moins 250 ms ou 300 ms.

Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention présentent un potentiel de repos. Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention présentent un potentiel de repos allant de -100 mV à - 30 mV, de préférence de -95 mV à -45 mV, de préférence de -90 mV à -40 mV. Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention présentent un potentiel de repos en moyenne d'environ - 75 mV.

Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention présentent au moins un phénotype sélectionné parmi cTnT ⁺ , ACTN2 ⁺ , MLC-2v ⁺ , MYH11 ⁺ , ADRB1 ⁺ , ADRB2 ⁺ , CD31 et CD34 ^" .

Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention présentent une morphologie caractéristique des cardiomyocytes.

L'invention porte en outre sur l'utilisation des cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention dans la préparation de produits de thérapie cellulaire.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation des cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention dans le traitement de pathologies cardiaques. Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes tels que décrits ci-dessus peuvent administrés à un sujet souffrant d'une maladie cardiaque.

Des exemples de maladies cardiaques incluent, mais ne sont pas limitées à, l'insuffisance cardiaque, incluant l'infarctus du myocarde, la cardiomyopathie, la cardiopathie ischémique, la cardiopathie hypertensive, la cardiopathie valvulaire, une maladie cardiaque congénitale et toute autre condition provoquant une insuffisance cardiaque congestive.

L'invention porte également sur l'utilisation des cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention comme outil de recherche.

Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes selon l'invention peuvent être utilisés pour tester des agents pharmacologiques ou thérapeutiques tels que des médicaments.

L'invention porte en outre sur une méthode de traitement de maladies cardiaques comprenant l'administration de cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d'être obtenus par le procédé de différenciation de l'invention.

Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes sont administrés par injection chez le sujet, de préférence par injection directement dans le cœur. Dans un autre mode de réalisation, les cardiomyocytes sont transplantés chirurgicalement sous forme d'un implant, d'un transplant ou d'un greffon chez le sujet.

Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes sont administrés dans la région cardiaque, par exemple dans la région de l'infarctus.

Dans un mode de réalisation, le nombre de cardiomyocytes administrés va de 10 ⁶ à 10 ¹⁰ cellules, de préférence de 10 ⁷ à 10 ⁹ cellules.

L'invention concerne également un kit pour la mise en œuvre du procédé de différenciation telle que décrite ci-dessus.

Selon un mode de réalisation, le kit comprend :

un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 tel que décrit ci-dessus ; un vecteur permettant l'expression d'une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase ; et

optionnellement, au moins un agent de différenciation supplémentaire, de préférence, au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.

Selon un mode de réalisation, le kit comprend :

un vecteur permettant l'expression d'au moins un AR gs complémentaire de la région promotrice du gène d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 tel que décrit ci-dessus ;

une lignée de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée ; et

optionnellement, au moins un agent de différenciation supplémentaire, de préférence, au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.

Selon un mode de réalisation, le kit de l'invention comprend en outre un milieu de maintenance et/ou un milieu de différenciation.

BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

La figure 1 est un histogramme montrant l'expression des gènes MyoDl (en gris clair) et Ascii (en gris foncé) après transfection d'iPSC avec 4 vecteurs d'expression permettant l'expression chacun d'un ARNgs ciblant les gènes MyoDl et Ascii d'une part, et un vecteur permettant l'expression de la GFP (contrôle positif GFP), un vecteur permettant l'expression de dCas9 comportant une seul transactivateur VP64 (VP64), un vecteur permettant l'expression de VP64m4 ou un vecteur permettant l'expression de dCas9 comportant 3 transactivateurs VP65, p65 et Rta (VPR) d'autre part. Une transfection sans plasmide a également été réalisée (contrôle négatif sans plasmide). La figure 2 est un histogramme montrant une comparaison de différentes conditions de transfection : (1) 500 ng SP-dCas9-VPR (permettant l'expression de dCas9 comportant les 3 transactivateurs VP65, p65 et Rta) + 350 ng pSPgRNA multiplex MyoDl (permettant l'expression de 4 ARNgs ciblant le gène MyoDII) ; (2) 1 μg SP-dCas9-VPR + 700 ng pSPgRNA multiplex MyoDl ; (3) 250 ng SP-dCas9-VPR + 180 ng pSPgRNA multiplex MyoDl ; et (4) 500 ng SP-dCas9-VPR + 500 ng pSPgRNA multiplex MyoDl. Une transfection sans plasmide (contrôle négatif sans plasmide) et avec un vecteur permettant l'expression de GFP (contrôle positif GFP) ont également été réalisés. La figure 3 est un histogramme montrant l'efficacité d'activation du facteur GATA4 après transfection par un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part et 1, 2, 3 ou 4 vecteurs permettant l'expression chacun d'un ARNgs dirigé contre la région promotrice du gène GATA4 d'autre part (nommés respectivement 1 ARNgs, 2 ARNgs, 3 ARNgs et 4 ARNgs). Une transfection sans plasmide (contrôle négatif sans plasmide) et avec un vecteur permettant l'expression de la GFP (contrôle positif GFP) ont également été réalisés.

La figure 4 est un ensemble de quatre histogrammes montrant l'expression de GATA4 (A), MEF2C (B), Isll (C) et Nkx2.5 (D), après transfection d'un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part, et soit d'un vecteur permettant l'expression d'un ARNgs ciblant la région promotrice du gène GATA4 (deuxième paire d'histogrammes, GATA4), soit d'un vecteur permettant l'expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes GATA4, MEF2C et TBX5 (troisième paire d'histogrammes, GMT) d'autre part. Une transfection avec un plasmide vide a également été réalisée (première paire d'histogrammes, vide). L'expression des marqueurs a été mesurée 4 jours (gris foncé) et 8 jours (gris clair) après transfection.

La figure 5 est un ensemble de deux histogrammes, montrant l'expression de GATA4 (en noir) et MEF2C (en gris), 4 jours (A) et 8 jours (B) après transfection d'un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part, et soit de 4 vecteurs permettant l'expression chacun d'un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène G AT A4 (GATA4) ; ou soit de trois concentrations croissantes (10 μg, 20 μg et 30 μg) d'un vecteur unique permettant l'expression de plusieurs ARNgs ciblant la région promotrice des gènes GATA4, MEF2C et TBX5 (GMT1 , GMT2 et GMT3 respectivement) d'autre part.

La figure 6 est un ensemble de deux histogrammes, montrant la surexpression de GATA4 (en noir) et MEF2C (en gris), 4 jours après la transfection d'un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part, et d'un plasmide vide ou d'un vecteur permettant l'expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes G AT A4, MEF2C et TBX5 (GMT) d'autre part (A) ; ainsi que l'expression de cTnT (TNNT2) 14 jours après la transfection d'un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR et du vecteur GMT (B). La figure 7 est un ensemble de deux histogrammes, montrant la surexpression de GATA4 (en noir), MEF2C (en gris clair) et TBX5 (en gris foncé), 4 jours après la transfection d'un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part, et d'un plasmide vide (J4 vide) ou d'un vecteur permettant l'expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes GATA4, MEF2C et TBX5 (J4 GMT) d'autre part (A) ; ainsi que l'expression de cTnT (TNNT2) 7 jours après la transfection d'un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part, et d'un plasmide vide ou du vecteur GMT d'autre part, combiné à une approche pharmaco logique : CHIR90021 (6 μΜ) appliqué entre J2 et J4 puis IWP2 (5 μΜ) entre J4 et J6 (nommé Chir J2 IWP2 J4) ; CHIR90021 (6 μΜ) et IWP2 (5 μΜ) appliquées en même temps entre J2 et J4 (nommé Chir J2 IWP2 J2) ; IWP2 (5 μΜ) appliqué seul entre J2 et J4 (nommé IWP2 J2) ou IWP2 (5 μΜ) appliqué seul entre J4 et J6 (nommé IWP2 J4).

La figure 8 est un ensemble d'images et de graphiques, montrant l'efficacité de la différenciation par l'approche GMT combinée à une stimulation pharmaco logique dans les 4 conditions suivantes : vecteur vide seul (CTL), vecteur vide et CHIR90021 (6 μΜ) et IWP2 (5 μΜ) appliquées en même temps entre J2 et J4 (CTL + Chir J2 IWP2 J2), vecteur permettant l'expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes G AT A4, MEF2C et TBX5 seul (GMT) ; et vecteur GMT et CHIR90021 (6 μΜ) et IWP2 (5 μΜ) appliquées en même temps entre J2 et J4 (GMT + Chir J2 IWP2 J2). A : Aspect des cellules à J7 dans les 4 différentes conditions. Magnification : 20x. B-C : Expression de cTNT par analyse en cytométrie sur deux lignées iPS différentes, lignée 31.3 (B) et lignée 5.5 (C). Gris clair : cellules cTNT ^" ; gris foncé : cellules cTNT ⁺ . Le pourcentage de cellules cTNT ⁺ est indiqué dans chaque condition.

La figure 9 est un ensemble de graphiques montrant l'analyse par qPCR de la cinétique d'expression à J4, J8, J14 des 3 gènes GATA4 (A), MEF2C (B) et TBX5 (C) en utilisant le vecteur multiplex, et l'effet de leur surexpression sur l'expression des gènes NKX2.5 (D) et TNNT2 (E).

La figure 10 est un ensemble de graphiques montrant la quantification de troponine T par cytométrie de flux après la transfection de cellules par un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part, et d'un plasmide vide (A, B) ou d'un vecteur permettant l'expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes G AT A4, MEF2C et TBX5 (GMT) d'autre part (C, D). Les cellules sont dissociées et re-ensemencées 2 jours plus tard, puis traitées avec du DMSO (contrôle) (A, C) ou par une approche pharmacologique : CHIR90021 (6 μΜ) et IWP2 (5 μΜ) appliqués à Jl après réensemencement (soit 3 jours après transfection) (nommé CHIR Jl IWP2 Jl) (B, D). Les tracés typiques de cytométrie en flux montrent un contrôle IgG négatif en gris clair et cTnT + en gris foncé. (E) Dot plot de quantification de troponine T dans les 4 groupes décrits ci-dessus (N=4 ; *** p<0,001 * p<0,05).

La figure 11 est un ensemble de photographies montrant l'immunofluoresence de cardiomyocytes différenciés 14 jours après la transfection de cellules par un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part et d'un vecteur permettant l'expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes GATA4, MEF2C et TBX5 (GMT) d'autre part, puis traitées par une approche pharmacologique (CHIR90021 6 μΜ et IWP2 5 μΜ). (A) DAPI, (B) troponine, (C) actinine.

La figure 12 est un ensemble de photographies montrant l'immunofluoresence de cardiomyocytes différenciés 14 jours après la transfection de cellules par un vecteur vide (A), après le traitement par une approche pharmacologique (CHIR90021 6 μΜ et IWP2 5 μΜ) (B), après la transfection de cellules par un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part et d'un vecteur permettant l'expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes GATA4, MEF2C et TBX5 (GMT) d'autre part (C), ou après la transfection de cellules par un vecteur permettant l'expression de dCas9-VPR d'une part et d'un vecteur permettant l'expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes GATA4, MEF2C et TBX5 (GMT) d'autre part puis traitées par une approche pharmacologique (CHIR90021 6 μΜ et IWP2 5 μΜ) (D).

EXEMPLES

Les exemples suivants qui illustrent non-limitativement l'invention. Exemple 1 : Sélection du transactivateur dCas9

Dans un premier temps, une comparaison directe de deux versions de dCas9 a été faite afin de sélectionner une version optimale de transactivation dans un modèle cellulaire.

Deux différentes versions de dCas9 ont été étudiées. La première version correspond à une version humanisée et mutée (D10A, H840A) de Cas9 de Streptococcus pyogenes, et fusionnée au domaine transactivateur VP64, permettant de remplacer son activité nucléase par une activité de transactivation. Le transactivateur VP64 correspond à 4 copies en tandem de VP16 (Herpès simplex viral protein 16), connectées entre elles par des liaisons glycine-sérine (pcDNA-dCas9-VP64, Addgene #47107). Ce module VP16 est un outil classique de biologie moléculaire mais l'activité transactivatrice est souvent limitée. La seconde version (nommée VPR) correspond à Cas9 de Streptococcus pyogenes fusionnée à plusieurs domaines transactivateurs en C-terminal, dont VP64 mais aussi p65 et Rta (SP-dCas9-VPR, Addgene #63798).

Ces deux transactivateurs ont été comparés directement en utilisant des ARN guides rapportés dans la littérature, ciblant les gènes MyoDl et Ascii (Perez-Pinera et al., 2013. Nat. Methods. 10:973-976). Des fragments d'ADN codant pour ces ARN guides (4 pour chaque gène ; SEQ ID Nos : 1-4 pour MyoDl ; SEQ ID Nos : 5-8 pour Ascii), de 20 paires de bases (pb) chacun (Eurogentec), ont été clonés dans des vecteurs d'expression indépendants (pSPgRNA, Addgene #47108). Les séquences de ces fragments d'ADN contiennent de surcroît la séquence CACC en 5' de l'amorce sens et CAAA en 5' de l'amorce antisens, correspondant aux séquences cible de l'enzyme de restriction Bbsl.

Après hybridation, les amorces sont clonées dans le plasmide pSPgR A linéarisé par Bbsl. Quatre vecteurs d'expression pSPgRNA (500 ng chacun) sont ainsi transférés en plus du vecteur d'expression (1 μg) pcDNA-dCas9-VP64 ou SP-dCas9-VPR dans des iPSC. Par la suite toutes les expériences de nucléofection ont été réalisées sur des iPSC.

L'expression des gènes Ascii et MyoDl a été suivie par qPCR (Figure 1). On observe qu'en comparaison à une dCas9 comportant un seul transactivateur VP64, dCas9-VPR permet une expression du gène MyoDl équivalente et une expression d'Ascll 7 fois plus importante. Par rapport aux contrôles, le système permet une augmentation de l'expression des gènes ciblés d'un facteur 4 à 15.

Exemple 2 : Multiplexage des ARNgs par la technique du Golden Gâte

Lors de la nucléofection telle que présentée dans l'exemple 1, un total de 5 vecteurs d' expression est nécessaire pour activer le système : le vecteur comportant la dCas9-VPR et 4 vecteurs indépendants codant chacun pour un ARNgs. Le fait de multiplier les vecteurs ne facilite pas la reproductibilité des résultats, puisqu'il est fort probable que certaines cellules ne reçoivent pas la totalité des vecteurs lors des conditions de transfection multiples. Ainsi, la construction d'un plasmide qui permettrait d'exprimer l'ensemble des ARNgs en un seul temps pourrait permettre de simplifier l'approche.

Afin d'y remédier, nous avons utilisé la technique du Golden Gâte qui consiste à multiplexer plusieurs vecteurs plasmidiques pour ne former qu'un seul et unique vecteur codant pour plusieurs ARN guide. Cette technique s'appuie sur la faculté des enzymes de restriction de type II (Bbsl) à reconnaître un motif nucléotidique et à cliver à l'extérieur de ce motif. On peut donc, en choisissant des amorces pertinentes, concaténer avec la même enzyme plusieurs fragments d'ADN.

Pour tester ce système, nous avons réalisé le dessin des quatre amorces à l'aide de l'éditeur NEB Golden Gâte vl .0 Assembly Tool (NEB). Après amplification par PCR du vecteur de base pSPgRNA ainsi que des différents inserts, la réaction de ligation et de digestion se fait en une seule et même étape. Ainsi, un vecteur dit « multiplex » est généré.

Dans un premier temps, afin de valider cette nouvelle approche, nous avons utilisé les 4 ARNgs préalablement utilisés pour transactiver MyoDl (Séquence ADN complémentaire : SEQ ID Nos : 1-4). Afin de valider la nouvelle construction, quatre conditions de nucléofections ont été testées :

a) Condition 1 : 500 ng SP-dCas9-VPR + 350 ng pSPgRNA multiplex MyoDl, ratio molaire 2/1 ;

b) Condition 2 : 1 μg SP-dCas9-VPR + 700 ng pSPgRNA multiplex MyoDl, ratio molaire 2/1 ;

c) Condition 3 : 250 ng SP-dCas9-VPR + 180 ng pSPgRNA multiplex MyoDl, ratio molaire 2/1 ;

d) Condition 4 : 500 ng SP-dCas9-VPR + 500 ng pSPgRNA multiplex MyoDl, ratio molaire 3/1.

L'expression du gène MyoDl a été suivie par qPCR (Figure 2). On observe une expression largement stimulée avec la condition 2 (1 μg SP-dCas9-VPR et 700 ng pSPgRNA multiplex MyoDl), similaire à celle obtenue avec la transfection individuelle des 4 vecteurs pSPgRNA codant séparément pour un ARNgs (Figure 1).

Exemple 3 : Dessin de 4 nouveaux ARNgs de Gata4

Suite à ces résultats préparatoires, nous ciblons à présent le gène Gata4, un facteur de transcription essentiel dans l'initiation de la formation du mésoderme pré-cardiaque. Le dessin des fragments d'ADN codant pour les ARNgs de Gata4 a été réalisé à l'aide de l'éditeur CRISPR-ERA (Stanford University, California). Les ARNgs ont été choisis sur la base des données de Génome Browser (UCSC, California), rapportant les régions promotrices et activatrices des gènes. Les amorces dessinées se situent dans les mille paires de bases en amont du site de démarrage de la transcription du gène Gata4.

Quatre positions différentes ont été retenues dans les zones prédites comme étant des zones activatrices (SEQ ID Nos : 9, 11, 12 et 13). Le clonage est identique à celui décrit précédemment (4 vecteurs pSPgRNA codant séparément chaque ARNgs, nommés Gata-1 à Gata-4).

Quatre conditions de nucléofections ont été testées, comprenant 1 (Gata-2), 2 (Gata-2 et Gata-1), 3 (Gata-2, Gata-1 et Gata-4) ou 4 (Gata-2, Gata-1, Gata-4 et Gata-3) vecteurs pSPgRNA ciblant Gata4, avec pour chaque condition, 500 ng de vecteur et 1 μg de chacun des quatre guides.

L'expression du gène Gata4 a été suivie par qPCR (Figure 3). Les résultats bruts montrent une augmentation d'expression par un facteur 4, obtenu au mieux après transfert de 2 vecteurs pSPgRNA. Les résultats relatifs représentent un ajustement d'expression pour tenir compte des différences théoriques du niveau de transfection de l'ensemble des plasmides (d'une double transfection pour la condition 1 pSPgRNA à une quintuple transfection pour la condition 4 pSPgRNA).

Après ajustement, le maximum d'activation semble être obtenu avec un minimum de

2 pSPgRNA. Exemple 4 : Création d'un vecteur d'expression multiplexé Gata4, Mef2c et Tbx5

Afin d'activer un programme cardiogénique complet, nous ciblons à présent 3 facteurs de transcription clés de la formation du mésoderme pré-cardiaque et de la génération des cardiomyocytes : Gata4, Mef2c et Tbx5.

Selon les résultats précédents, il est décidé d'utiliser 2 ARNgs par gène ciblé afin de procéder à leur transactivation. De plus, l'objectif est de créer un vecteur multiplex permettant l'expression des 2 ARNgs pour les 3 gènes cibles (soit un total de 6 ARNgs). Ce nouveau vecteur permettrait ainsi d'obtenir en un temps, l'activation simultanée de

3 gènes différents.

Pour développer cette approche, la technique du Golden Gâte est utilisée pour créer le vecteur multiplexé contenant chacun des fragments d'ADN codant pour les ARNgs contre les trois gènes de la cardiogenèse Gata4, Mef2c et Tbx5 (Séquence ADN complémentaire : SEQ ID Nos : 10-11 pour Gata4 ; SEQ ID Nos : 14-15 pour Mef2c ; SEQ ID Nos : 16-17 pour Tbx5). L'approche est identique à celle décrite précédemment.

L'activité du nouveau système est testée de manière similaire aux précédentes expérimentations. Trois conditions de nucléofection sont comparées : transfection par un vecteur pSPgRNA vide (contrôle négatif), transfection par le vecteur pSPgRNA multiplex GMT (ou système GMT, pour Gata4/Mef2c/Tbx5) et transfection par les quatre vecteurs pSPgRNA codant chacun pour un ARNgs ciblant Gata4.

L'analyse par qPCR a montré une augmentation forte de l'expression de Gata4 et Mef2c avec le système GMT (Figures 4A et 4B). De manière intéressante, nous avons pu observer que l'utilisation de vecteurs codant pour les ARNgs contre Gata4 permet une légère augmentation de l'expression de Mef2c, un facteur de transcription activé secondairement par l'activation de Gata4. Ceci suggère que la surexpression du gène cible Gata4 se traduit par une activation fonctionnelle d'un programme d'expression cardiogénique. De même, nous avons mesuré le niveau d'expression de Isll et Nkx2.5, deux facteurs de transcription impliqués plus tardivement dans la formation des cardiomyocytes et non ciblés directement par nos systèmes (Figures 4C et 4D). Nous avons ainsi pu observer une augmentation nette de leur niveau d'expression, et ceci notamment avec le système GMT. Exemple 5 : Mise au point d'un nouveau protocole de différenciation basée sur l'approche de transactivation spécifique d'un programme cardiogénique

Définition des milieux de culture

Dans un premier temps, différentes conditions de nucléofection pour le transfert du matériel génique (plasmides SP-dCas9-VPR et pSPgRNA multiplex GMT ou pSPgRNA multiplex vide) ont été étudiées. L'utilisation d'un plasmide codant pour la GFP a servi de témoin positif de nucléofection (fourni par le kit Human Stem Cell Nucleofector ^® Kit 1). Dans une première expérience, les iPSC ont été maintenues en milieu mTesrl pendant 7 jours après la nucléofection. L'observation des cultures montre une hyperprolifération des iPSC dans ce milieu riche en facteurs de maintien de la pluripotence. Il est donc très probable que ce milieu induit une sélection privilégiée des cellules de types pluripotentes au dépend des cellules en cours de différenciation.

Dans une seconde expérience, nous avons reproduit les mêmes conditions de nucléofection, mais les cellules n'ont été maintenues en milieu mTesrl que pendant 48 heures, avant d'être placées dans un milieu pauvre de type B27 sans insuline. Nous avons observé une mortalité très importante des cellules, ne permettant pas d'analyses complémentaires.

Finalement, nous avons modifié les conditions de milieu de culture en conservant une première phase de 48 heures en milieu mTesrl, suivie d'un milieu nourricier neutre proposé pour la différenciation des cardiomyocytes (milieu essential E6, Thermo Fischer). Dans ces conditions, nous n'avons pas observé de surmortalité ou d'hyperprolifération des cellules.

Ce protocole de 48 heures en milieu mTesrl après nucléofection, suivi d'un passage en milieu essentiel E6, a donc été sélectionné pour la suite des expérimentations.

Définition des concentrations de vecteurs d'expression

Nous avons comparé 3 différentes concentrations du plasmide pSPgRNA multiplex GMT afin d'établir les meilleures conditions de surexpression des gènes d'intérêt dans les cellules de type iPS.

Dans cette première expérimentation, nous avons comparé les 5 groupes suivant :

a) Contrôle : 5μg SP-dCas9-VPR + 5 μg pSPgRNA vide ;

b) Gâta : 5 μg SP-dCas9-VPR + 3 μg de chacun des pSPgRNA Gata-1 à Gata-4 ; c) GMT 1 : 10 μg SP-dCas9-VPR + 10 μg pSPgRNA multiplex GMT ;

d) GMT2 : 20 μg SP-dCas9-VPR + 20 μg pSPgRNA multiplex GMT ;

e) GMT3 : 30 μg SP-dCas9-VPR + 30 μg pSPgRNA multiplex GMT. L'expression des gènes Gata4 et Mef2c a été mesurée par qRT-PCR 4 et 8 jours après la transfection des cellules souches pluripotentes confluentes à 70-80% (Figure 5). On observe un effet du vecteur pSPgRNA multiplex GMT dose-dépendant, la transfection de 20 μg et 30 μg des plasmides étant associée à une augmentation plus importante et homogène de l'expression des gènes cibles, notamment 8 à 10 fois plus importante que la condition contrôle (vide) et 3 fois plus importante que la condition GMT1.

En revanche, la condition GMT3, associée à l'augmentation la plus importante d'expression, montre une différence limitée avec la condition GMT2. Ainsi les conditions d'utilisation du vecteur pSPgRNA multiplex GMT et du plasmide SP-dCas9-VPR à la dose de 200 ng^L (20 μg dans un volume de 100 μί) et en ratio 3: 1 (ratio molaire) est retenue par la suite.

Effet sur la surexpression GMT

Dans cette expérimentation, les iPSC ont été nucléofectées selon le protocole préalablement établi. Deux conditions ont été comparées :

a) Vide : 5 μg SP-dCas9-VPR + 5 μg pSPgRNA vide ;

b) GMT : 20 μg SP-dCas9-VPR + 20 μg pSPgRNA multiplex GMT.

Les cellules ont été conservées en milieu mTesrl pendant 48 heures, puis placées en milieu E6. Une partie des cellules a été lysée 48 heures plus tard (soit à J4 après la nucléofection) pour contrôler l'augmentation d'expression des gènes cibles dans la manipulation (Figure 6A). Une autre partie des cellules a été maintenue pendant 12 jours (soit jusqu'à J14 après la nucléofection) en milieu E6, afin d'observer l'apparition de cellules de type cardiomyocytes.

À l'issue de ces 14 jours, les cellules ont été lysées et l'expression de la troponine T cardiaque (cTnT, encodée par le gène TNNT2) a été mesurée par qRT-PCR (Figure 6B), montrant une augmentation d'environ 33% de l'expression de cTnT par rapport à la condition contrôle.

Exemple 6 : Optimisation de l'effet GMT par combinaison à une approche pharmacologique Nous avons testé l'effet de deux molécules pharmaco logiques utilisées dans la différenciation des iPSC pour induire la transformation mésodermique. Le premier (CHIR90021) est un inhibiteur de la glycogen synthase kinase 3 ou GSK3 ; et le second (IWP-2) est un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt. Dans les protocoles connus de différenciation d'iPSC en cardiomyocytes, ces molécules sont utilisées successivement afin de pouvoir manipuler des voies de signalisation clé de la cardiogenèse. La molécule CHIR90021 est appliquée dans les 3 premiers jours pour amorcer la différenciation des cellules pluripotentes puis la molécule IWP-2 est appliquée pendant 2 jours (de J3 à J5) pour induire la différenciation vers les progéniteurs cardiaques.

Compte-tenu des différences liées à la nucléofection des iPSC et de la nécessité de les réensemencer après cette nucléofection, nous avons décidé de respecter une fenêtre de 48 heures pendant laquelle les cellules sont remises en milieu mTesrl sans stimulation pharmacologique (selon les conditions décrites dans l'exemple précédent).

Par la suite, nous avons dessiné 4 protocoles de stimulation pharmacologique (tous les quatre sur milieu essentiel E6) :

a) Protocole 1 dit « successif » (Chir J2 IWP2 J4) : CHIR90021 (6 μΜ) appliqué entre J2 et J4 ; IWP2 (5 μΜ) appliqué entre J4 et J6 ;

b) Protocole 2 dit « accéléré » (Chir J2 IWP2 J2) : CHIR90021 (6 μΜ) et IWP2 (5 μΜ) appliquées en même temps entre J2 et J4 ;

c) Protocole 3 dit « monothérapie précoce » (IWP2 J2) : IWP2 (5 μΜ) appliqué seul entre J2 et J4 ;

d) Protocole 4 dit « monothérapie tardive » (IWP2 J4) : IWP2 (5 μΜ) appliqué seul entre J4 et J6. Ces différents protocoles ont été testés sur des cellules transfectées avec SP-dCas9-VPR + pSPgRNA multiplex GMT (ratio 3: 1) ; et des cellules-contrôle transfectées avec SP-dCas9-VPR + pSPgRNA vide (ratio 3: 1) selon les conditions préalablement décrites. Un échantillon de cellules a été récolté à J4 pour juger de l'efficacité de l'approche GMT (iPSC en milieu mTesrl pour 48 heures puis en milieu E6 pour 48 heures) (Figure 7A). Finalement, les cellules ont été lysées 7 jours après la nucléofection et l'expression génique a été mesurée par qRT-PCR (Figure 7B). Les résultats montrent tout d'abord une très bonne efficacité de l'approche GMT avec une surexpression d'un facteur supérieur à 10 des 3 gènes cibles Gata4, Mef2c et Tbx5 (Figure 7A). La comparaison de l'expression de la troponine T cardiaque (cTnT) 7 jours après la nucléofection identifie l'effet synergique de la combinaison GMT/stimulation pharmaco logique (Figure 7B). Dans les groupes contrôles, seul le protocole pharmaco logique dit « successif » (Chir J2 IWP2 J4) est associé à une augmentation de l'expression du gène TNNT2 codant la troponine T cardiaque, ce qui corrobore les résultats décrits dans la littérature suite à l'application successive des deux molécules.

Cependant, cet effet est très nettement amplifié lorsque les iPSC ont été nucléofectées avec pSPgRNA multiplex GMT, comme le montre la multiplication d'un facteur 6 du niveau d'expression. Surtout, alors qu'en condition contrôle, la stimulation pharmacologique dite « accéléré » (Chir J2 IWP2 J2) n'augmente pas l'expression de TNNT2, cette même stimulation combinée au système GMT produit l'augmentation la plus importante de l'expression de TNNT2, avec une augmentation d'un facteur 57. Il faut noter que l'administration d'IWP2 seul ne se traduit pas par une augmentation d'expression de TNNT2 et ceci, quel que soit le temps d'administration (J2 ou J4) ou la présence ou non du système GMT.

Exemple 7 : Nouveau schéma expérimental de différenciation par approche GMT combinée à une stimulation pharmacologique

A l'issue de l'ensemble de ces expériences de mise au point, le protocole final suivant a été établi :

Les iPSC sont cultivés et mises en expansion dans un milieu mTesrl sur un lit matrigel pendant au moins 7 jours. Pour réaliser la nucléofection, les iPSC sont détachées en utilisant 0.025% Trypsin-EDTA (Promocell) et resuspendues dans 100 du mélange comprenant 82 de solution 1 et 18 de solution supplément du Human Stem Cell Nucleofector ^® Kit 1, auquel est ajouté 20 μ de chaque plasmide SP-dCas9-VPR + pSPgR A multiplex GMT. La nucléofection est effectuée à l'aide du Nucleofector™ 2b Device (Lonza, programme A-013).

Par la suite, les cellules nucléofectées sont rensemencées sur des plaques avec lit matrigel et maintenues pendant 48 heures en milieu mTesRl avec addition d'un inhibiteur de la Rho-associated protein kinase ou ROCK (Y-27632, Tocris) pour prévenir leur anoïkose et de Penicillin-Streptomycin (Life technologies).

A J2, le milieu est changé et remplacé par du Essential E6 (Life technologies) avec supplémentation en CHIR90021 (6 μΜ) and IWP2 (5 μΜ). À J4, les cellules sont remises en milieu de différenciation Essential E6 sans molécules pharmaco logiques.

Ce protocole a été testé sur deux lignées d'iPSC différentes (lignées 31.3 et 5.5) et la différenciation en cardiomyocytes a été monitorée par microscopie (Figure 8A), par immuno fluorescence (résultats non montrés) et en fonction du niveau d'expression de cTnT mesuré par cytométrie (Figure 8B-C).

L' immuno fluorescence est réalisée 7 jours après nucléofection. Les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde (Sigma- Aldrich, #HT5012-1CS) pendant 10 minutes à température ambiante puis perméabilisées et les sites antigéniques aspécifïques sont bloqués pendant 45 minutes dans un tampon de blocage (PBS contenant 2% BSA et 0.5% Triton-X-100). Les cellules sont ensuite incubées avec un anticorps anti-cTnT (rabbit polyclonal anti-cardiac Troponin T antibody Abcam, #ab45932 ; dilution 1/500). Puis les cellules sont lavées 3 fois au PBS et incubées 45 minutes à température ambiante avec l'anticorps secondaire couplé au fluorochrome Alexa Fluor 488 (dilution 1/1000) et du DAPI (dilution 1/1000). Les images sont acquises au microscope à épifluorescence (Nikon Epifluorescence Microscope).

La cytométrie est réalisée en parallèle de l'immunofluorescence. Les cellules sont détachées et dissociées utilisant 0.025% Trypsin-EDTA (Promocell) puis centrifugées 5 minutes à 200 g. Les cellules sont ensuite fixées avec du paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich, #HT5012-1CS) pendant 10 minutes à température ambiante, puis perméabilisées avec un mélange méthanol-eau 90/10 (v:v) froid pendant 15 minutes à 4°C. Les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS puis incubées pendant 45 minutes à l'obscurité avec l'anticorps anti-cTnT (Anti-cardiac Troponin T-APC, recombinant human IgGl mouse rat, clone REA400 MiltenyiBiotec, #130-106-689) ou l'isotype contrôle interne (CTL-I APC, Monoclonal REA Control (I) antibody human, clone REA293 MiltenyiBiotec, #130-104-615). Les cellules sont lavées et resuspendues dans du PBS contenant 0.5% BSA. Les cellules sont analysées par le MACSQuant® Analyzer 10 (MiltenyiBiotec, #130-096-343) et les résultats retraités à l'aide du logiciel FlowJo. Les résultats montrent une formation accélérée et massive de cellules exprimant cTnT dans les conditions combinant le système GMT et l'addition pharmacologique de CHIR90021 et IWP2 pendant 2 jours (entre J2 et J4 après nucléofection). Ces résultats sont observés dès le 7 ^eme jour après nucléofection. Les résultats sont reproduits dans deux lignées d'iPSC différentes (Figure 8B-C), démontrant la reproductibilité entre lignées de l'approche.

Exemple 8 : Schéma expérimental de différenciation par approche GMT combinée à une stimulation pharmacologique à J3

Matériel & Méthodes

Différenciation des iPS Afin de pouvoir sélectionner les cellules ayant intégré le vecteur plasmidique et dans le but de purifier ainsi que d'enrichir la population cellulaire, le gène rapporteur de la GFP a été inséré dans le vecteur pSPgRNA multiplex GMT. L'expression des guides de ce vecteur est comparable à la version sans GFP.

Les iPSC ont été cultivés et mises en expansion dans un milieu mTesrl sur un lit matrigel pendant au moins 7 jours. Pour réaliser la nucléofection, les iPSC ont été détachées et dissociées en utilisant l'enzyme accutase 50 μΕ/cm ² (Life Technologies) et resuspendues dans 100 du mélange comprenant 82 de solution 1 et 18 de solution supplément du Human Stem Cell Nucleofector ^® Kit 1 , auquel est ajouté 20 μg de chaque plasmide SP-dCas9-VPR + pSPgRNA multiplex GMT-GFP. Un contrôle est réalisé avec un vecteur vide. La nucléofection a été effectuée à l'aide du Nucleofector™ 2b Device (Lonza, programme A-013).

Par la suite, les cellules nucléofectées ont été rensemencées sur des plaques avec lit matrigel et maintenues pendant 48 heures en milieu mTesRl avec addition d'un inhibiteur de la Rho-associated protein kinase ou ROCK (Y-27632, Tocris) pour prévenir leur anoïkose et de Penicillin-Streptomycin (Life technologies).

A J2 post nucleofection, les cellules ont été détachées en utilisant l'enzyme accutase 50 μΕ/cm ² (Life Technologies) puis centrifugées à 200g pendant 5 min. Le culot cellulaire a été resuspendu dans 1 mL de PB S (1.10 ⁶ cellules/mL et 1 μΐ _^ de marqueur de viabilité Live/Dead Fixable Aqua DeadCell Stain Kit (Molecular Probes) puis incubé pendant 30 minutes à l'abri de la lumière et à +4°C. Après cette incubation, les cellules ont été centrifugées à 200g pendant 5 minutes à température ambiante. Les cellules ont été ensuite resuspendues dans un tampon de FACS froid contenant 0.5% de BSA et 2% d'EDTA dans du PBS. Les cellules GFP ont été triées grâce à un analyseur-trieur INFLUX 500 (Cytopeia racheté par BD BioSciences). Après le tri cellulaire, les cellules GFP+ ont été ensemencées de nouveau sur des plaques P24 sur lite de matrigel a raison de 15 000 cellules/cm ² en milieu conditionné (milieu des iPS de 24h + mTesRl) avec addition d'inhibiteur Rock (Y-27632, Tocris) et Penicillin-Streptomycin (Life technologies).

A J3 post nucleofection, le milieu a été changé et remplacé par du TeSR™-E6 (Stemcell technologies) supplémenté en CHIR90021 (6 μΜ) et IWP2 (5 μΜ). Un contrôle est réalisé par la culture en milieu TeSR™-E6 (Stemcell technologies) supplémenté en DMSO. A partir de J5 jusqu'au J14 le milieu des cellules a été remplacé tous les deux jours par du TeSR™-E6 non supplémenté.

PCR quantitative L'expression génique relative a été déterminée en utilisant une PCR quantitative en temps réel en deux étapes. L'ARN total a été isolé 4, 7 et 14 jours après l'électroporation avec le kit RNA Mini PureLink® (Life Technologies, #12183018A) et une reverse transcription a été réalisée en utilisant le kit SuperScript IV Reverse Transcriptase (Life Technologies). L'expression des gènes G AT A4, MEF2C, TBX5, NKX2.5 et TNNT2 a été quantifiée avec sondes spécifiques Taqman et Taqman Univeral master Mix II sur le LightCycler® 480 II (Roche). La différence d'expression des gènes a été déterminée selon la méthode de comparaison des Ct (ddCT) et normalisée avec le gène de ménage GAPDH. Cytométne de flux

La cytométrie a été réalisée 14 jours après la nucléofection. Les cellules ont été détachées et dissociées en utilisant le Kit Miltenyi Multi Tissu Dissociation Kit 3 (Miltenyi), puis centrifugées 5 min à 200g. Le culot cellulaire a été resuspendu dans 1 mL de PBS (1.10 ⁶ cellules/mL) et 1 μΐ _^ de marqueur de viabilité Live/Dead Fixable Aqua DeadCell Stain Kit #L34957 (Molecular Probes) puis incubé pendant 30 minutes à l'abri de la lumière et à +4°C. Après incubation, les cellules ont été centrifugées à 200g pendant 5 minutes à température ambiante. Les cellules ont été ensuite fixées et perméabilisées avec le kit Inside Stain Kit (Miltenyi). Les cellules ont été lavées avec du PBS puis incubées pendant 10 min dans l'obscurité avec l'anticorps anti-Troponine T cardiaque (Anti-Cardiac Troponin T-APC, recombinant human IgGl mouse rat, clone REA400 MiltenyiBiotec, #130-106-689) ou l'isotype contrôle interne (CTL-I APC, Monoclonal REA Control (I) antibody human, clone REA293 MiltenyiBiotec, #130-104-615). Après incubation, les cellules ont été centrifugées à 200g pendant 5 minutes à température ambiante. Les cellules ont été ensuite resuspendues dans un tampon de FACS froid contenant 0.5% de BSA et 2% d'EDTA dans du PBS puis analysées sur un analyser BD LSRFORTESSA (BD BioSciences) et les résultats traités à l'aide du logiciel FlowJo.

Immunofluorescence

Une immunofluorescence a été réalisée en parallèle de la cytométrie. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich, #HT5012-1CS) pendant 10 min à température ambiante puis perméabilisées et les sites antigéniques aspécifïques ont été bloqués pendant 45 min dans un tampon de blocage (PBS contenant 2% BSA et 0.5% Triton-X-100). Les cellules ont été ensuite incubées avec un anticorps anti-Troponine T cardiaque (rabbit polyclonal anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam, #ab45932 ; dilution 1/500). Puis les cellules ont été lavées 3 fois au PBS et incubées 45 min à température ambiante avec l'anticorps secondaire couplé au fluorochrome Alexa Fluor 488 (dilution 1/1000) et du DAPI (dilution 1/1000). Les images ont été acquises au microscope à épifluorescence (Nikon Epifluorescence Microscope) puis traitées avec le logiciel Image J. Résultats

PCR quantitative

La surexpression simultanée de GATA4, MEF2C et TBX5 se traduit par une activation secondaire de l'expression de NKX2.5 et TNTT2 indiquant l'amorçage efficace de la différentiation en cardiomyocytes (Figure 9). Cytométne en flux

Les résultats de cytométrie de flux (Figure 10) montrent également une formation accélérée et massive de cellules exprimant la troponine dans les différentes conditions : le système GMT seul (Figure 10C), l'addition pharmacologique de CHIR90021 et IWP2 seule (Figure 10B) et le système GMT combiné aux agents pharmacologiques (Figure 10D).

En outre, le système GMT combiné aux agents pharmacologiques a un effet synergique (+50.8, Figure 10D) sur la production de cellules exprimant la troponine, par rapport aux agents seuls (+16.0, Figure 10B) et au système GMT seul (+5.76, Figure 10C). Ces résultats sont également présentés dans la Figure 10E. Immunofluorescence

Les résultats d'immunofluorescence confirment ceux de cytométrie de flux, avec la formation de cellules exprimant la troponine (Figure 11). Exemple 9 : Morphologie des cellules différenciées par le procédé de l'invention

Le protocole de différenciation est identique à celui de l'exemple 8.

Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich, #HT5012-1CS) pendant 10 min à température ambiante puis perméabilisées et les sites antigéniques aspécifïques ont été bloqués pendant 45 min dans un tampon de blocage (PBS contenant 2% BSA et 0.5% Triton-X-100). Les cellules ont été ensuite incubées avec un anticorps anti-actinine (Souris) (#A7811-2ML Sigma) dilué au l/1000 ^ème . Puis les cellules ont été lavées 3 fois au PBS et incubées 45 min à température ambiante avec les anticorps secondaires Alexa Fluor MS488 Chèvre anti-souris (Life technologies Al 0667) dilué au l/1000 ^eme ainsi qu'avec du colorant Hoechst. Les images ont été acquises au microscope à épifluorescence (Nikon Epifluorescence Microscope) puis traitées avec le logiciel Image J.

Les résultats montrent que le vecteur vide ou l'addition seule d'agents pharmacologiques n'induisent pas la formation de cellules ayant une morphologie de cardiomyocytes (Figure 12A et B). En revanche, la seule nucléofection avec le vecteur GMT induit une morphologie cellulaire typique des cardiomyocytes (Figure 12C). Cette morphologie particulière est conservée avec un protocole de différenciation combinant le système GMT et l'addition d'agents pharmacologiques.

Cette expérience montre ainsi l'intérêt du procédé de différenciation de l'invention.