Beschreibung Die Erfindung betrifft ein multiparalleles Verfahren zum schnellen Auffinden geeig- neter Chromatographieparameter zur Trennung biologischer Moleküle.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein multiparalleles Chromatographie-System zur Methodenentwicklung zur Reinigung von Proteinen und anderen Biomolekülen. Das System nutzt Kavitäten von Multi-Well-Platten (z. B. 96-Well-Platten), die mit Chro- matographiegelen befüllt sind und besteht aus diversen Startpuffern, in dem die zu chromatographierenden Proben gelöst werden und mit denen die Gele equilibriert sind und Lösungen zum Desorbieren (Eluieren) der an die Gele gebundenen Biomo- leküle.

Für die Entwicklung von chromatographischen Fraktionierungsschritten zur Reini- gung von Biomolekülen werden gegenwärtig im wesentlichen drei verschiedene

Chromatographie-Systeme von den Firmen Amersham Bioscience (Äkta-Systeme : http ://www1. amershambiosciences. com), Applied-Biosystems (BioCADe 700E Workstation, www. appliedbiosystems. com) und BioRad (BioLogic DuoFlow, www. bio-rad. com) verwendet. Mit diesen Systemen können nacheinander eine Rei- he von Parametern variiert werden, um geeignete Bedingungen für die Reinigung von Biomolekülen zu finden. Diese Suche nach den geeigneten Parametern zur Reinigung und Fraktionierung von beispielsweise Biomolekülen wie Proteinen, Pep- tiden, Nukleinsäuren etc. ist zeitintensiv und in der Regel ineffektiv. So lehren Erfah- rungswerte aus der biotechnologischen/medizinischen/chemischen Praxis, dass bei der Suche nach geeigneten Chromatographiebedingungen eine Vielzahl von chromatographischen Medien sowie eine Vielzahl von chromatographischen Eluti- onsparametern in möglichst kurzer Zeit auf ihre Brauchbarkeit getestet werden müssen, um aus den gewonnenen Daten effektive Reinigungs-bzw. Fraktionie- rungsschritte abzuleiten. Hierbei stellte sich heraus, dass diese Ziele sich mit den oben genannten Systemen (Versuche mit dem Äkta-System) nur mit einem hohen zeitlichen und finanziellen Aufwand erreichen lassen.

Aus der WO 01/77662 A2 ist ein Verfahren zum Auffinden von geeigneter Chroma- tographiebedingungen bekannt, bei dem keine Multiwell-Platten zum Einsatz kom- men.

Die WO 99/24138 A1 beschreibt ein Verfahren, bei dem in den Kavitäten einer Multiwell-Platte unterschiedliche Chromatographie-Medien angeordnet sind. Diese Medien werden zur Analyse biologischer Substanzen im Rahmen sogenannter"As- say"genutzt.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es daher Aufgabe der Erfindung eine effektivere und leicht zu handhabendere Methode zur geeigneten Auswahl von Chromatographieparametern zum Aufbau von Reinigungs-bzw. Fraktionierungs- schritten von biologischen Proben zu schaffen. Ferner ist es Ziel der Erfindung ein geeignetes Computer-Programm zur Erfassung und Interpretation der Ergebnisse der Chromatographie zur Verfügung zu stellen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale.

Im Sinne der Erfindung werden unter"biologischer Probe"gereinigte oder ungerei- nigte Proteine, Peptide, Nukleinsäuren aller Art, Kohlenhydrate, Lipide, niedermole- kulare Metaboliten oder Gemische derselben verstanden. Dies beinhaltet insbeson- dere-aber nicht ausschließlich-komplexe Proteingemische von humanem, tieri- schen oder pflanzlichen Geweben oder Zellen sowie Zellen von Mikroorganismen.

Die"biologische Probe"wird im folgenden auch mit"Biomolekülen"bezeichnet.

Im Sinne der Erfindung werden unter Chromatographiemedien zweierlei Arten ver- standen : a) Materialien, Verbindungen oder Substanzen, die die biologische Probe zu binden vermögen. Dies sind beispielsweise (aber nicht ausschließlich) alle Arten von lonenaustauscher (Anionionenaustauscher, Kationenaustau- scher), Metallaffinitätschromatographiemedien, Reversed-Phase-Materialien, Gele für die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), Hydroxyla- pathit-Medien (HAP) Affinitätchromatographie-Medien mit Liganden jeglicher Art, aber auch Gele mit magnetischen Eigenschaften (Magneto-Beads, be- schichtet oder unbeschichtet). Besonderes Merkmal derartiger Gele ist die Fähigkeit, die biologische Probe zu binden, wobei diese durch geeignete Elutionsmittel (Lösungen) von der bindenden Substanz auch wieder befreit werden können muss. b) Materialien, Verbindungen, Substanzen oder Lösungen, die die biologische Probe nicht zu binden vermögen. Dies sind beispielsweise (aber nicht aus- schließlich) organische und/oder anorganische Säuren, Basen, Salze, deren Derivate oder Lösungsmittel aller Art einschließlich wäßriger Lösungen. Be- sonderes Merkmal derartiger Lösungen und Substanzen (im weiteren Eluti- onslösungen genannt) ist die Fähigkeit zur Desorption (Elution) der biologi- schen Probe von dem Chromatographie-Gel, das heißt, zur Verschiebung der Gleichgewichte der Bindung der biologischen Probe an das Chroma- tographie-Gel in der Weise, dass die an das Chromatographie-Gel gebunde- nen Biomoleküle nach Zugabe der Elutionslösung keine bzw. nur noch ge- ringe Affinitäten zum Chromatographie-Gel haben.

Die Erfindung ist für die automatisierte Suche nach geeigneten Chromatographie- medien und den zugehörigen Puffer-und Elutionsbedingungen zur Reinigung von Peptiden und Proteinen, aber auch anderen Biomolekülen aus Homogenaten (Roh- extrakten) geeignet. Die Erfindung basiert auf der Absorption von Biomolekülen an Gelpartikel, an die sogenannte stationäre Phase. Eine biologische Probe, bestehend aus Biomolekülen wie Proteinen, Peptiden etc., gelöst im Startpuffer (mobile Pha- se), wird mit Gelpartikeln vermischt (sogenanntes Batch-Verfahren) und nach defi- nierten Inkubationszeiten wird der flüssige Überstand, in dem sich die Biomoleküle befinden, die keine Affinität zum gewählten Gel unter den gewählten Bedingungen haben, von den Gelpartikeln entfernt. Die Gelpartikel werden anschließend mit Startpuffer gewaschen, um die nicht bindenden Moleküle möglichst weitgehend zu entfernen. Im nachfolgenden Schritt werden die an die Gelpartikel absorbierten Biomoleküle durch ein geeignete Elutionslösung (mobile Phase) von den Gelparti- kein wieder in Lösung gebracht, um nach Eintritt in die mobile Phase (Desorption bzw. Elution) und Abtrennung von den Gelpartikeln diversen Analysen-und Nach- weissystemen (Photometer, Bioassays, etc. ) zugeführt werden zu können. Auf diese Weise lassen sich unterschiedlichste Chromatographieparameter wie z. B. Gelme- dien, Puffer, pH, Lösungsmittelzusätze oder Substanzen zur Stabilisierung von Bio- molekülen ermitteln.

Die Erfindung kann automatisiert durchgeführt werden, so dass die Ergebnisse aus der z. B. aus einer 96-Well-Chromatographie manuell oder mittels einem Computer- programm ausgewertet, übersichtlich dargestellt und für die Interpretation vorberei- tet werden können. Die gewonnenen Daten werden in der Weise interpretiert, dass als Resultate der Interpretation Vorschläge für die chromatographische Reinigung von (beispielsweise) Proteinen aus Proteinextrakten einer biologischen Probe her- vorgehen. Als chromatographische Modi sind Frontal-Chromatographie, Displace- ment-Chromatographie oder Gradienten-Chromatographie möglich. Die Reinigung des Zielproteins kann auch mehrere verschiedene, sich aneinander anschließende Chromatographien (Kombinationen von Chromatographien) einschließen.

Die Erfindung sieht ferner einen Kit vor, in dem das erfindungsgemäße Verfahren Anwendung findet. Dieser dient der wirtschaftlichen Verwertung und kann bestimm- te Chromatographiemuster in Form ausgewählter Chromatographiemedien für un- terschiedlichste Anwendungszwecke (in Abhängigkeit der zu untersuchenden biolo-

gischen Probe) beinhalten und dementsprechend ausgerüstet sein. Hierzu können die Multi-Well-Platten bereits vorgefertigt sein mit Chromatographiemedien zur Bin- dung der biologischen Probe (Gruppe B-Materialien) und einem Set von unter- schiedlichsten Chromatographiemedien (Lösungen jeglicher Zusammensetzung) zur Elution (Gruppe NB-Materialien).

Das System (Kit) beinhaltet Protokolle zur Durchführung der Experimente im Multi- Weil-Format mit n Kavitäten (n > 1), auf Multi-Well-Platten verteilte, kommerziell- verfügbare Chromatographiemedien, sowie auf Multi-Well-Platten verteilte Eluti- onsmittel, die an die jeweiligen Chromatographiemedien angepasst sind. Das Sys- tem dient der systematischen Suche nach reproduzierbaren chromatographischen Reinigungsschritten für Biomoleküle. Das System ist auf die Kombination von Pipet- tier-Roboter ausgelegt, kann aber auch manuell genutzt werden. Bedingt durch die gewählten verschiedenen Chromatographie-Parameter (z. B. pH-Wert, lonenkon- zentration, etc. ) werden unterschiedliche Populationen von Biomolekülen an die Gele in den verschiedenen Kavitäten binden. Wird beispielsweise als Chroma- tographiegel ein Anionenaustauschergel benutzt, werden an das Gel in B1 (Fig. 1, die Lösung in der Kavität B1 hat einen pH von 4 und eine NaCI-Konzentration von 50 mmol/l) Biomoleküle binden, die bei pH 4 noch ausreichend viele negative La- dungen besitzen, also einen niedrigen isoelektrischen Punkt haben. Die niedrige NaCI-Konzentration bewirkt, das bereits Biomoleküle mit niedriger Affinität an das Gel binden. In der Kavität G11 (Fig. 1, die Lösung in der Kavität G11 hat einen pH von 7 und eine NaCI-Konzentration von 750 mmol/l) können Biomoleküle mit einem wesentlich höheren isoelektrischen Punkt erwartet werden. Gleichzeitig werden, bedingt durch die hohe NaCI-Konzentration nur Biomoleküle mit sehr hoher Affinität an die Gelpartikel binden, die überwiegende Mehrzahl der Biomoleküle wird in Lö- sung bleiben. Das System wird auch Protokolle enthalten, um die an den Gelparti- kein konzentrierten Biomoleküle weiter analysieren zu können, z. B. über die Prote- inbestimmung oder die Elektrophorese.

Vorteile der Erfindung mithin bestehen in folgendem : Im Vergleich zu den kommerziell verfügbaren Methoden ermöglicht die Er- findung durch den Parallel-Ansatz im Multi-Well-Format das Auffinden ge-

eigneter Chromatographiemedien und der zugehörigen Elutionsmittel in sehr viel kürzerer Zeit als bisher.

Die Suche nach geeigneten Bedingungen zur chromatographischen Reini- gung bzw. Fraktionierung von Biomolekülen kann auch mit Rohextrakten durchgeführt werden. Für die Versuche müssen die Biomoleküle durch Ho- mogenisierungsschritte lediglich in Lösung gebracht werden und die Hom- genate durch einfache Zentrifugation von Partikeln befreit werden. In diesem Punkt ist die Erfindung anderen Methoden wie der Festphasen-Extraktion oder der Säulen-Chromatographie deutlich überlegen, da in beiden Fällen ein Verstopfen der Säulen droht.

'Die bei Festphasen-Extraktionssystemen nachteiligen, in der Regel sehr kurzen Zeiten, in denen die Biomoleküle mit der stationären Phase des Chromatographiemediums in Kontakt treten können, können zur Folge ha- ben, dass keine vollständige Adsorption der Biomoleküle an das Chroma- tographiemedium stattfindet. Diese Gefahr herrscht bei dem hier vorgestell- ten System nicht, da längere Inkubationszeiten gewählt werden können.

Das System bedarf nicht, wie die Festphasen-Extraktion einer Vakuumquelle zum Entfernen der Elutionsmittel. Die mit der Vakuumtechnik verbundenen Probleme wie unvollständiges Absaugen der Elutionsmittel haben deshalb keine Bedeutung.

'Das System kann zur Entwicklung von chromatographischen Reinigungs- schritten von Biomolekülen eingesetzt werden. Die mit dem System gewon- nenen Daten können für die Entwicklung von Chromatographie-Schritten im Frontal-Chromatographie-Modus, im Displacement-Chromatographie-Modus oder im Gradienten-Chromatographie-Modus genutzt werden.

'Das System kann (z. B. in Kombination mit der Massenspektrometrie) für vergleichende Untersuchungen der Biomolekül-Profile ("Profiling") zweier verschiedener Zustände ("Differential Display") herangezogen werden, um Moleküle identifizieren zu können, die für einen definierten Zustand (z. B. krank) charakteristisch sind.

Das System kann als Probenvorbereitung für 2D-Elektrophorese-Strategien genutzt werden.

Es ergeben sich mithin Vorteile für die biotechnologische Industrie und für die Pharma-Industrie durch schnelle Methoden-Entwicklung zur chromatographischen Aufreinigung technologisch/therapeutisch/diagnostisch relevanter Proteine. Für die Proteomforschung (Pharma-Industrie, Biotechnologie, Biomedizinische For- schung) bestehen Vorteile in der Vorfraktionierung von Proteinen für die Proteoma- nalyse ; grundsätzlich aber wird eine schnelle Methoden-Entwicklung zur chroma- tographischen Aufreinigung interessierender Proteine geschaffen.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten.

Die Erfindung ist in den anliegenden Zeichnungen dargestellt und wird nachfolgend näher beschrieben ; es zeigt Figur 1 die schematische Darstellung einer 96 Well Platte, hier belegt mit 96 diversen Startpuffern für die multiparallele Kationenaustausch-Chromatographie ; Figur 2 die Darstellung der Ergebnisse einer multiparal- lelen Chromatographie eines Proteingemisches zum Auffinden geeigneter Parameter für die chroma- tographische Reinigung von 4 verschiedenen Zielpro- teinen. Die Grafik gibt die absoluten Ausbeuten der verschiedenen Zielproteine wieder (in %, bezogen auf die eingesetzte Menge des jeweiligen Proteins), nämlich von Ribonuclease A (oben links), Cytochrom C (oben rechts), Lysozym (unten links) and Myoglo- bin (unten rechts), in den Eluaten des multiparallelen Chromatographie-Systems.

Figur 3 : die Darstellung der Ergebnisse einer multiparal- lelen Chromatographie eines Proteingemisches zum Auffinden geeigneter Parameter für die chroma- tographische Reinigung von 4 verschiedenen Zielpro-

teinen. Die Grafik gibt die spezifischen Ausbeuten der verschiedenen Zielproteine wieder (in %, bezogen auf die Gesamtmenge aller Proteine in jeweils einer Kavität.

Figur 4 : ein typisches Chromatogramm einer analyti- schen Reversed-Phase-Chromatographie zur Quanti- fizierung der individuellen Proteine des Proteingemi- sches, bestehend aus Ribonuklease A (Rib), Cytoch- rom C (Cyt C), Lysozym (Lys) und Myoglobin (Myo).

Abs. Ausb. : Absolute Ausbeute bzw. Wiederfindungs- rate : Dieser Wert bezieht sich auf die ursprünglich auf die Kationenaustauch-Säule injizierte Menge des je- weiligen Proteins (= 100 %).

Figur 5 : eine Eichgerade, erstellt mit dem Reversed- Phase-HPLC-System (Figur 4), zur Bestimmung der Proteinkonzentration von Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin : Abhängigkeit der detek- tierten Peakfläche von der injizierten Proteinmenge.

Figur 6 : ein Chromatogramm der Kationenaustausch- Gradienten-Chromatographie eines Proteingemi- sches bestehend aus Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin gelöst in dem Probenauf- tragpuffer mit pH 3 und 0 mM NaCI (Parametersatz aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chroma- tographie-System).

Figur 7 : ein Chromatogramm der Kationenaustausch- Gradienten-Chromatographie eines Proteingemi- sches bestehend aus Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin gelöst in einem Probenauf- tragpuffer mit pH 4 und 500 mM Na1 (Parametersatz

aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chroma- tographie-System).

Figur 8 : ein Chromatogramm der Kationenaustausch- Gradienten-Chromatographie eines Proteingemi- sches bestehend aus Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin gelöst in einem Probenauf- tragpuffer mit pH 6 und 0 mM NaCI (Parametersatz aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chroma- tographie-System).

Figur 9 : ein Chromatogramm der Kationenaustausch- Gradienten-Chromatographie eines Proteingemi- sches bestehend aus Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin gelöst in einem Probenauf- tragpuffer mit pH 7 und 200 mM NaCI (Parametersatz aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chroma- tographie-System).

Figur 10 eine Darstellung der Ergebnisse eines 32-Well-Matrix-multiparallelen Kationenaustausch- Chromatographie-Experiments zur Ermittlung von Pa- rametern zur chromatographischen Reinigung von Enzymen mit Angiotensin-Konversions-Enzym- ähnlicher Aktivität aus einem Proteinextrakt von Nie- rengewebe vom Schwein : Spezifische Enzymaktivitä- ten (Quotient aus absoluter Enzymaktivität (bestimmt mit der MES-Methode : Anal Biochem. 290,324-9, 2001) und der Proteinkonzentration) der Eluate (Einstufenelution mit 2 moi/) NaCI) der 32 Fraktionen eines 32-Well-Matrix-Kationenaustausch- Chromatographie-Experiments in einer 96-Deep- Well-Platte ; zum schnellen Erkennen der Fraktionen

mit der höchsten spezifischen Aktivität ist dieser Fraktion einer schwarzer Hintergrund zugeordnet.

Figur 11 eine Darstellung der Ergebnisse eines 12-Well-Matrix-Chromatographie-Experiments zur Ermittlung von Parametern zur chromatographischen Reinigung von Enzymen mit Angiotensin- Konversions-Enzym-ähnlicher Aktivität aus einer akti- ven Fraktion aufgereingt aus Nierengewebe vom Schwein : Spezifische Enzymaktivitäten (bestimmt mit der MES-Methode ; berechnet aus Proteinkonzentra- tionen und absoluter Enzymaktivität) der Eluate der 12 Fraktionen verschiedener Chromatographie- Medien (HAP : Hydroxyl-Apathit-Gel, HIC : Hydropho- be-Interaktionschromatographie-Gel, Chelat : Gel für die Immobilisierte-Metal-Affinitäts-Chromatographie). Zum schnellen Erkennen der Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität ist dieser Fraktion ein schwarzer Balken zugeordnet.

Figur 12 ein Chromatogramm einer Hydrophoben- Interaktions-Chromatographie einer aktiven Fraktion aufgereingt aus Nierengewebe vom Schwein ent- sprechend dem in Figur 11 gezeigten Parametersatz.

Dargestellt sind Profile der Proteinkonzentrationen und der spezifischen Enzymaktivitäten von ACE- ähnlichen Enzymen.

Figur 13 die Proteinkonzentrationen der Fraktionen einer Multi-Well-Kationenaustausch-Chromatographie mit Stufengradienten-Elution. Gradientenstufe 1 : 0,5 mol/1 NaCI ; Gradientenstufe 2 : 2 mol/I NaCI. UCE : Urotensin-generierende Aktivität.

Die Erfindung wird anhand von verschiedenen Fraktionierungsversuchen von Proteingemischen dargestellt.

Die Figur 1 zeigt beispielhaft eine 96 Well-Platte (Multi-Well-Platte), die durch Spal- ten (X-Richtung) und Zeilen (Y-Richtung) als Matrix definiert ist, wobei unterschiedli- che Chromatographiemedien ortsabhängig auf den durch die Matrix definierten Mat- rizenpunkten der Platte angeordnet sind, deren einzelne Kavitäten mit jeweils glei- chen Mengen Chromatographiegel belegt sind (z. B. mit einem Kationenaustau- schergel), aber individuelle Kombinationen von pH-Werten und Kochsalz- Konzentrationen besitzen. Kavität B1 zeigt im Beispiel der Fig. 1 einen pH von 4,5 und eine NaCI-Konzentration von 0,05 mol/l. Kavität G12 hätte einen pH von 7,0 und eine NaCI-Konz. von 1 mol/l.

Im ersten Fraktionierungsexperiment wird mit dem multiparallelen Chroma- tographiesystem ein Gemisch bekannter Proteine (Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin) fraktioniert (Fig. 2 und Fig. 3) und die Übertragbarkeit der gewonnenen Ergebnisse auf die Gradientenchromatographie gezeigt (Fig. 6-9).

Dargestellt sind die absoluten Ausbeuten (Fig. 2) bzw. die spezifischen Ausbeuten (Fig. 3) der verschiedenen Proteine, die in den Eluaten nach paralleler Chroma- tographie mit den unterschiedlichen Parametern gemessen werden. Um die Zu- sammensetzung der an das Gel gebundenen Proteine zu quantifizieren, werden die Eluate des multiparallelen Chromatographiesystems mit einer Reversed-Phase- Chromatographie analysiert. Figur 4 zeigt eine typische Reversed-Phase-HPLC- Trennung des Systems, mit der die Quantifizierung durchgeführt wurde. Das Chro- matogramm stammt von der Trennung des Proteingemisches vor der Prozessierung mit dem multiparallelen Chromatographie-System. Mit dem Reversed-Phase-HPLC System wird für jedes Protein eine Eichgerade erstellt (Figur 5). Zur Bestimmung der Eichgeraden zur Quantifizierung der individuellen Proteine werden verschiedene definierte Mengen der individuellen Proteine injiziert. Zur Erstellung der Eichgerade werden die Peakflächen der Proteine gegen die Proteinkonzentrationen aufgetra- gen.

Um die Übertragbarkeit der mit dem multiparallelen Chromatographie-System ermit- telten Parameter auf die Gradienten-Chromatographie zu zeigen, werden einige Parameter-Sätze (für den Probenbeladungs-Puffer) herausgesucht (pH 3 mM + NaCI ; pH 3 + 0 mM NaCI ; pH 4 + 0 mM NaCI ; pH 6 + 0 mM NaCI ; pH 7 + 200 mM NaCI) und das Proteingemisch unter diesen Bedingungen chromatographiert (Fig. 6- 9). Die resultierenden Fraktionen der verschiedenen Gradienten-Chromatographien werden wiederum mit der Reversed-Phase-HPLC (Fig. 4) untersucht, um die Aus- beuten der individuellen Proteine des Gemisches zu bestimmen.

Der Fig. 3 ist zu entnehmen, dass die Ribonuklease A mit der höchsten spezifischen Ausbeute zu gewinnen ist, wenn das Proteingemisch in einem Puffer pH 3 und 0 mM NaCI auf den Kationenaustauscher aufgetragen wird. Ein Blick auf das Ergebnis in Fig. 2 verrät, dass unter diesen Bedingungen mit einer Koelution von Cytochrom C und Lysozym zu rechnen ist. Das Chromatogramm der Gradientenchroma- tographie der Proteinmischung, betrieben mit einem Puffer pH 3 und 0 mM NaCI als Start-und Probenaufgabepuffer, bestätigt die Erwartung. Ribonuklease eluiert zu- sammen mit Lysozym, unter dem Einfluß des Gradienten konnte Cytochrom C so- gar noch von den anderen Proteinen abgetrennt werden.

Fig. 7 zeigt das Chromatogramm der Trennung des Proteingemisches mit einem Puffer pH 4 und 500 mM NaCI als Start-und Probenaufgabepuffer. Unter diesem Parametersatz wurde die höchste spezifische Ausbeute im Eluat des multiparallelen Chromatographie-Experiments für Myoglobin gefunden. Auf den ersten Blick schei- nen die Ergebnissen in Fig. 3 und Fig. 7 widersprüchlich. Erwartet wird nach Blick auf Fig. 3, dass Myoglobin mit höherer spezifischer Ausbeute auch durch die Gra- dientenchromatographie gewonnen werden kann. Stattdessen wurde Myoglobin während der Gradientenchromatographie komplett verloren. Die Ursache kann zum Teil der Fig. 2 entnommen werden sowie der Analyse der Myoglobin-Konzentration im Überstand der multiparallelen Chromatographie nach dem Auftragen des Prote- ingemisches. Hier zeigte sich eine signifikante Differenz zwischen der aufgetrage- nen Menge Myoglobin und der Summe aus der Menge des im Eluat wiedergefunde- nen Myoglobins und des Myoglobins im Überstand. Diese Differenz deutet auf eine irreversible Bindung des Myoglobins an das Gel. Die irreversible Bindung des My- oglobins konnte durch die Beobachtung verifiziert werden, dass das Gel nach Eluti- on mit NaCI rötlich gefärbt bleibt und erst durch intensives Waschen mit Natronlau-

ge wieder entfärbt werden kann. In der Gradientenchromatographie kommt dieser Effekt noch deutlicher zum Tragen, da für diese Trennungen typischerweise Gel- mengen eingesetzt werden, die das ca. 10 fache der aufgetragenen Probe binden können. Aus diesem Beispiel leitet sich die Grundregel ab, dass chromatographi- sche Parameter zu vermeiden sind, bei denen im multiparallelen Chromatographie- Experiment größere Differenzen zwischen aufgetragener Menge und der Summe der Ausbeuten im Eluat und im Überstand berechnet wurden. Die absoluten Aus- beuten in Fig. 2 weisen darauf hin, dass der Parametersatz pH 4 und 500 mM NaCI für die Reinigung der übrigen Proteine ebenfalls ungeeignet ist, was aus dem Gra- dientenchromatgramm (Fig. 7) ebenfalls hervorgeht.

Unter dem Parametersatz von pH 6 und 0 mM NaCI ergeben sich für die Reinigung für Myoglobin über die Gradientenchromatographie weitaus bessere Ergebnisse (Fig. 8), die sich auch aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chromatographie- System vorhersagen lassen : Bei pH 6 ist kein Myoglobin im Eluat nachweisbar (Fig. 2), im Gegensatz zu den anderen Proteinen der Mischung, die unter pH 6 mit relativ hoher Affinität binden. Aus den Daten ergibt sich, dass Myoglobin sich mit hoher spezifischer Ausbeute über eine Frontal-Chromatographie über den im Experiment eingesetzten Kationenaustauscher mit einem Puffer von ph 6 reinigen läßt. Diese Schlußfolgerung wird von dem Chromatogramm in Fig. 8 bestätigt. Myoglobin eluiert in einer homogenen Fraktion im Durchbruch der Säule.

Eine hohe spezifische Ausbeute für Lysozym versprechen die Ergebnisse der multi- parallelen Chromatographie bei einem Puffer mit einem pH von 7 und 200 mM NaCI (Fig. 3). Die mit diesem Parametersatz durchgeführte Gradientenchromatographie bestätigt die Erwartung. Kurz nach dem Anstieg des Gradienten ist eine Fraktion zu finden, die fast zu 100 % reines Lysozym enthält.

Um zu zeigen, dass die Methode auch für komplexe Proteinmischungen unbekann- ter Zusammensetzung geeignet ist, wurde eine Fraktionierungsversuchsreihe mit einem Proteinextrakt aus Schweine-Nieren durchgeführt. Wie in den unten genann- ten Beispielen gezeigt, werden hierzu Aliquots des Gewebeextrakts auf eine Multi- Well-Platte verteilt, in deren Kavitäten sich jeweils gleiche Mengen eines Kationene-

naustauschergels befinden. Die einzelnen Kavitäten unterscheiden sich in Bezug auf den pH-Wert und in Bezug auf die lonenstärke. Das Ergebnis der Trennung wird über eine Bestimmung der Proteinkonzentration der an das Gel gebundenen Protei- ne der einzelnen Kavitäten erhalten.

Die Figur 10 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der spezifischen Aktivität der Fraktionen der Multi-Well-Kationenaustauschchromatographie entsprechend dem Ausführungsbeispiel 2. Für das Finden geeigneter Bedingungen für die Aufreinigung eines gesuchten Proteins können die Daten, die in Fig. 10 dargestellt sind, nach folgenden Regeln genutzt werden : 1. Die gewählte Chromatographie (hier Kationenaustauschchromatographie) kann dann als günstiger initialer Schritt zum Konzentrieren genutzt werden, wenn das gesuchte Protein, hier detektiert über seine enzymatische Aktivität, in einer Fraktion eluiert, in der eine im Vergleich zu den anderen Fraktionen niedrige Proteinkonzentration zu finden ist (z. B. Fig. 10 in der Fraktion pH 3, 500 mmol/l NaCI ; ), wenn also die spezifische Aktivität einen besonders ho- hen Wert erreicht.

2. Sollte die absolute Aktivität eines gesuchten Proteins in einer Fraktion zu finden sein, in der eine im Vergleich zu den anderen Fraktionen sehr hohe Proteinkonzentration vorkommt, sollten andere Chromatograpiemedien wie Anionenaustauscher darauf geprüft werden, ob das gesuchte Protein sich mit höherer spezifischer Aktivität wiederfinden lässt.

3. Liegt der unter Punkt 2 beschriebene Fall vor und es ist kein anderer Para- metersatz zu finden, die die unter Punkt 1 beschriebenen Kriterien erfüllt, dann sollte der 2. Ansatz (Multi-Well-Chromatographie mit Stufengradienten- Elution) genutzt werden, um geeignete Bedingungen zur Reinigung des ge- suchten Proteins zu finden.

Neben dem Vorteil der Multi-Well-Chromatographie, in sehr kurzer Zeit eine große Zahl verschiedener Chromatographie-Parameter auf ihre Brauchbarkeit prüfen zu können, wird in der Fig. 10 ein weiterer Vorteil sichtbar, der mit bisherigen Gradien- ten-Chromatographie-Techniken nur mit großem Aufwand aufspürbar wäre, nämlich

die Phänomene, die bei dem Puffer mit dem pH Werte 3. Hier sind bei Salzkonzent- rationen von jeweils 500 mmoi/i NaCI Maxima in der spezifischen Aktivität zu sehen, die hier nicht erwartet werden. Der Erwartung entspricht, dass die Konzentration der an den Kationenaustauscher gebundenen Proteine bei einer Startkonzentration von 0 memo)/) Salz am höchsten ist und die Konzentration der gebundenen Proteine mit steigender Salzkonzentration der Startlösung abnimmt. Das Auftreten der oben be- schriebenen Maxima kann damit erklärt werden, dass die höheren Salzkonzentrati- onen hydrophobe Wechselwirkungen (unabhängig von den elektrostatischen Wech- selwirkungen) zwischen Proteinen und dem Gel begünstigen, was zu einer verstärk- ten Absorption von Proteinen an das Gel führt. Es handelt sich hier also um Phäno- mene, die mit nicht-idealen Chromatographie-Mechanismen (Schlüter H, Zidek W. J.

Chromatogr. 639.17-23 (1993)) bezeichnet werden können, was bedeutet, dass (in diesem Fall) nicht nur elektrostatische Wechselwirkungen auf die Bindung der Pro- teine an die stationäre Phase sondern auch andere Wechselwirkungen (hier hydro- phobe Wechselwirkungen) einen maßgeblichen Einfluss haben und damit vorteilhaft für die Trennung genutzt werden können. Phänomene dieser Art lassen sich durch empirische Strategien finden, das heißt, je mehr Parameter variiert werden können, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, die notwendigen Parameter zu finden und vorteilhaft nutzen zu können.

Die Figur 11 zeigt zum 3. Ausführungsbeispiel spezifische Enzymaktivitäten von Renin-ähnlichen Enzymen der Fraktionen der Multi-Well-Chromatographie mit ver- schiedenen HIC-, Hdroxylapathit-und IMAC- (Immobilisierte Metall- Affinitätschromatographie-) Gelen. Gesucht wurde nach einem Parametersatz, mit dem eine aufgereinigte aktive Protein-Fraktion aus Schweinenierenextrakt mit einer Gradientenchromatographie weiter gereinigt werden kann. Figur 12 gibt das Chro- matogramm einer Hydrophoben-Interaktions- (HIC)-Gradientenchromatographie wieder, die aus den Parametersätzen der multiparallelen Chromatographie des Ex- periments, dargestellt in Figur 11, abgeleitet wurde (Phenyl-HIC-Chromatographie). Die enzymatisch aktive Fraktion eluiert im Bereich des Gradienten, was zeigt, dass die Vorhersage zutrifft, dass das gesuchte Zielenzym sich unter den in Fig. 11 be- schriebenen Bedingungen an eine Phenyl-HIC-Säulen binden und chroma- tographieren läßt.

Die Figur 13 zeigt Proteinkonzentrationen der Fraktionen einer Multi-Well- Kationenaustausch-Chromatographie mit Stufengradienten-Elution. Gradientenstufe 1 : 0,5 mol/l NaCI ; Gradientenstufe 2 : 2 mol/l NaCI. UCE : Urotensin-generierende Aktivität. Es ist erkennbar, dass eine Urotensin-bildende Aktivität (UCE-Aktivität) lediglich in der Fraktion nachweisbar war, bei der der Proteinextrakt bei pH 8 auf das Gel aufgetragen wurde und die mit 2 mot/1 NaCI eluiert wurde. Es ist deutlich zu erkennen, dass mit 0,5 mol/1 (bei pH 4,5 bis 8) die höchsten Proteinmengen eluier- bar sind. Die UCE-Aktivität eluiert in der Chromatographie mit dem pH 8-Puffer je- doch erst nach Elution mit einer 2 molaren Salzkonzentration. Dieses Ergebnis ist für die Aufreinigung des UC-Enzyms von großem Vorteil, da das UCE in einer Frak- tion mit niedriger Proteinkonzentration eluiert und auf diese Weise eine große Men- ge der begleitenden Proteine (ca. 95 % der ursprünglich aufgetragenen Protein- menge) abgetrennt werden können.

1. Ausführungsbeispiel : Multiparallele Kationenaustausch-Chromatographie eines Gemisches von 4 Modell- Proteinen in 32 Wells mit verschiedenen Startbedingungen (Variation der pH-Werte (Ziffernreihe,"Zeilen) und der Salzkonzentration (Buchstabenreihen,"Spalten)) und einstufiger Elution.

Als Modellproteine werden Ribonuclease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin zusammengemischt (1250 ug pro Protein). Pro Kavität werden je 100. ul Katione- naustauscher-Gel (Fractogel EMD (M) S04- (Merck) auf 32 Kavitäten verteilt. Als Äquilibrierungspuffer (je 40 mM) werden für den Kationenaustauscher die folgenden Puffer vorbereitet (X-Richtung der Deep Well-Matrix) : Tabelle 1 : Puffer für die miltiparallele Kationenaustausch-Chromatographie Puffer (je 40 mM) pH Zitronensäure 3 Ameisensäure 4 Essigsäure 5 Malonsäure 6 MES (2- (N-Morpholino) Ethansulfonsäure) 6,5 Phosphatpuffer 7 Phosphatpuffer7, 5 HEPER

NaCL wird in Y-Richtung der Deep Well-Matrix den Puffern zugemischt, so dass in den Kavitäten NaCI-Konzentrationen von 0 mM NaCI, 100 mM NaCI, 200 mM NaCI, 500 mM NaCI entstehen. Parallel wird eine 32-Well-Matrix-Pufferplatte mit den ent- sprechen Puffern ohne Gel angesetzt. Die Gele werden 3mal mit je 300 uL des je- weiligen Äquilibrierungspuffer (aus der 32-Well-Matrix-Pufferplatte, Tabelle 1) gewa- schen. Aliquots des Proteingemisches werden in dem jeweiligen (200 ul) Proben- aufgabepuffer (Tabelle 1) gelöst und auf die Gele in den verschiedenen Kavitäten aufgetragen. Nach dem Waschen mit den passenden Puffern (Tabelle 1) werden die Proteine mit 3 x 100 ul einer 2 M NaCI Lösung eluiert. Die Zusammensetzung der Eluate wird mit einem Reversed-Phase-HPLC-System quantifiziert (Figur 4 und Fi- gur 5). In der Abb. 4 wurden 100 ul des Proteingemisches (je Protein 50 lug), gelöst in 0,1% TFA, über eine Reversed-Phase-Säule (TSKgel Super-Octyl 4,6 mm ID x 5,0 cm L ; Tosohaas Biosep) getrennt. Als HPLC-System wird eine SMART-Anlage benutzt (Fa. Amersham). Die mobile Phase besteht aus 0,1% TFA in destilliertem Wasser (Lösung A) und 0, 1% TFA in Acetonitril (Lösung B). Die Chromatographie wird mit einem Fluss von 1 ml/min und einem Gradienten von 23 % bis 44 % Lösung B in 12,3 min durchgeführt. Die Absorption wird in Abhängigkeit von der Zeit bei 214 nm gemessen. In Abb. 5 sind die Eichgeraden zur Bestimmung der Proteinkonzent- ration von Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin dargestellt.

Zur Demonstration der Übertragbarkeit der Parameter, gewonnen mit der multiparal- lelen Chromatographie, werden die Gemische mit dem gleichen Kationenaustau- schergel, das für die multiparallele Chromatographie eingesetzt wurde, im Gra- dientchromatographiemodus chromatographiert. Es wurde eine selbst gestopfte Kationenaustauschersäule (HR10/30 mit 2 ml Fractogel EMD so3- (M), Merck) ver- wendet. Die mobile Phase bestand aus 40 mM Zitronensäurepuffer, pH 3 ohne NaCI (Puffer A) und 40 mM Zitronensäurepuffer, pH3 mit 2 M NaCI (Puffer B). Die Chro-

matographie wurde bei einer Flussrate von 2,0 ml/min. Der Gradient hatte eine Stei- gung von 0% bis 75% Puffer B in 90 min. Die Zusammensetzung der Fraktionen mit UV-Absorption wurden mit der Reversed-Phase-HPLC analysiert (Figur 4). Die Er- gebnisse sind in den Tabellen in der Figur 4 gelistet. In den Figuren 7 bis 9 werden folgende Äquilibrierungs-und Probenaufgabe-Puffer (jeweils Puffer A) eingesetzt.

40 mM Ameisensäure, pH 4 und 500 mM NaCI (Fig. 7), 40 mM Malonsäure, pH 6 und 0 mM NaCI (Fig. 8), 40 mM Phosphatpuffer, pH 7 und 200 mM NaCI. Als Puffer B werden jeweils den Puffern A 2 M NaCI zugesetzt.

2. Ausführungsbeispiel : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Multi-Well-Kationenaustausch-Chromatographie mit verschiedenen Staffbedingun- gen (Variation der pH-Werte (Ziffernreihe,"Zeilen") und der Salzkonzentration (Buchstabenreihen,"Spalten)) und einstufiger Elution.

A. Probengewinnung : Herstellung von Proteinextrakten aus der Niere von Schweinen : Für die Herstellung von Proteinextrakten werden Nieren von Schweinen verwendet.

Direkt nach ihrer Entnahme im Schlachthof werden diese in physiologischer Koch- salzlösung (0,9 % NaCI-Lösung) bis zur weiteren Verarbeitung gekühlt. Das Nieren- gewebe wird (bei Temperaturen von 4 bis 6°C) in ca. 1 cm3 große Stücke geschnit- ten, in vorgekühlte Lyophilisationsgefäße gefüllt, in Flüssigstickstoff eingefroren und über Nacht bei-80°C gelagert. In der Lyophilisationsanlage (Typ 2040 der Fa. Snij- ders Tilbug, Holland) werden die Gewebestücke ca. eine Woche 1 Woche vollstän- dig getrocknet. Die wasserfreien Gewebestücke werden dann mit einer Getreide- mühle (Varius, der Fa. Messerschmidt) auf feinster Stufe pulverisiert. 2 g des Pul- vers werden in 20 mi Puffer (10 mM Phosphat-Puffer, pH 7,3) gelöst. Hierfür wird ein Homogenisator (Ultra Turrax T 25 der Fa. Jahnke-Kunkel) verwendet.

B. Vorbereitung des Kationenaustauscher-Gels (Fractogel EMD-S03 ; Merck, Darmstadt) und Durchführung der Multi-Well-Kationenaustausch- Chromatographie mit einstufiger Elution :

Das Gel (bei einer Befüllung von 300 J !/Kavität : ca. 0,3 ml x 100 = 30 ml) wird mit dem 5-fachen Gelvolumen mit 2 molarer wässriger NaCI-Lösung und anschließend mit dem 10fachen Gelvolumen Wasser gewaschen. Die Leitfähigkeit nach dem letz- ten Waschvorgang sollte dem des Wassers entsprechen.

Anschließend wird das Gel (300 l/Kavität) auf 32 Kavitäten einer 96-Deep-Well- Platte (2,2 mi) verteilt und je 1000 pI Puffer (40 mmoi/i) bezeichnet mit A bis H in der Tabelle 2, in die Kavitäten der Reihen 1 bis 8 zugegeben, so dass sich jeweils in einer Reihe (bezeichnet mit einem Buchstaben) der 96-Well-Platte ein und derselbe Puffer mit identischem pH-Wert befindet. Anschließend werden in die Kavitäten je- wei ! s 400 u) der Salzlösungen (NaCI, in mol/1 (Endkonzentration) : 1 : 0 ; 2 : 100 ; 3 : 200 und 4 : 500) pipettiert, so dass beispielsweise alle Kavitäten der Bezeichnung 2 die Salzkonzentration von 100 moi/1 beinhalten. Parallel werden eine oder mehre- re Kopien der Puffer gemäß des oben genannten Pipettierschemas angelegt, mit dem später die individuellen Kavitäten gewaschen werden.

Nach dem Equilibrieren werden in jede der 32 Kavitäten jeweils 300 ul der protein- haltigen Probe (Proteinextrakt, siehe oben unter A. ) gegeben.

Tabelle 2 : Puffer für den Kationenaustauscher Microtiterplatte Puffer (40 mM Endkonzentration) pH Reihe A Zitronensäure 3 Ameisensäure 4 C Essigsäure 5 D Malonsäure 6 E MES (2- (N-Morpholino)-ethansulfonsäure) 6, 5 F Phosphorsäure 7 G Phosphorsäure 7,5 H HEPES 8

Nach der Zugabe der Probe werden Probe und Gel suspendiert und 10 min inku- biert. Danach wird die 96-Well Platte zentrifugiert (Speed-Vac Zentrifuge : 1 min).

Der Überstand wird auf eine 96-Well Platte kopiert und für Analysen (Proteinkonz.

Best., Aktivität, etc. ) aufgehoben. Die 32 verschiedenen individuellen Proben-Gel- Suspensionen in der 96-Well-Platte werden mit den entsprechenden, individuellen Pufferlösungen (jeweils 300 NI, die Puffer werden aus einer 96-Deepwell-Platte ko- piert, in der sich entsprechend dem oben angegebenen Schema die individuellen Lösungen befinden) suspendiert, um die 32 Gele zu waschen, anschließend zentri- fugiert und die überstehende Lösung abpipettiert und verworfen, um die nicht- bindenden Proteine zu entfernen. Dieser Vorgang wird 2 mal wiederholt. Nach dem Waschen werden die bindenden Proteine eluiert, indem in die Kavitäten eine 2 mo- lare NaCI-Lösung (pro Kavität 100 ul) zupipetiert wird. Nach der Zentrifugation (1 min) werden die Eluate auf ein oder mehrere 96-Well-Platten kopiert, um die indivi- duellen Proben der nachfolgenden Analytik zugänglich zu machen.

Die Analytik der Fraktionen der Multi-Well-Chromatographie-Fraktionen kann die Bestimmung der Protein-Konzentration, der Enzymaktivität, dem Nachweis einer Proteineigenschaft, z. B. mit einem Antikörper, sowie die Zusammensetzung der Fraktion (Elektrophorese, 2D-Elektrophorese) umfassen.

Die Vorteile dieser Versuchsausführung liegen darin, auf diese Weise im Idealfall (d. h. wenn das gesuchte Protein eine hohe Affinität zum Säulenmaterial hat) Chro- matographie-Bedingungen zu finden, unter denen das gesuchte Protein bindet, je- doch ein Großteil der begleitenden Proteine nicht binden und auf diese Weise deren Abtrennung gelingt. Hat das gesuchte Protein lediglich eine schwache Affinität, las- sen sich Bedingungen finden, bei denen das gesuchte Protein nicht bindet, jedoch ein großer Teil der nicht interessierenden Proteine. Die Resultate können dann für eine Frontal-Chromatographie benutzt werden. Auf diese Weise lassen sich somit Chromatographie-Parameter (Chromatographiemedien, pH, Puffer, Salzkonzentrati- onen, Zusätze) zum Konzentrieren von Proteinen auffinden, insbesondere aus Roh- extrakten, ferner kann das chromatographische Verhalten eines unbekannten, ge- suchten Proteins ermittelt werden und letztlich können Bindungskapazitäten be- stimmt werden.

3. Ausführungsbeispiel :

Multi-Well-Chromatographie mit verschiedenen Chromatographiegelen (Hydropho- <BR> <BR> <BR> be-Interaktions- (HIC)-Gele, Hydroxylapathit-Gele, Metallaffinitätschromatographie- Gele) und einstufiger Elution.

A. Probengewinnung : Herstellung von Proteinextrakten aus der Niere von Schweinen : Siehe hierzu oben unter 1. Ausführungsbeispiel, Ziffer A.. Der Proteinextrakt wurde anschließend über eine Kationenaustauschersäule im Self-Displacementverfahren chromatographiert. Als Äquilibrierungs-und Probenaufgabe-Puffer wurden die in Fig. 10 ermittlelten Parameter genutzt : Die Pobe wurde in einem 40 mM Puffer mit einem pH von 3 und einem Zusatz von 500 mM NaCI glöst und auf die Self- Displacement-Säulen aufgetragen. Die resultierenden Fraktionen wurden nach An- giotensin-II generierenden Aktivitäten durchsucht. Die Fraktion mit der höchsten spezifischen Aktivität wurde als Probe für den nun folgenden Versuch eingestezt.

B. Vorbereitung der HIC-Gele (Fractogel EMD Phenyl (S) Merck ; Fractogel EMD Propyl 650 (S), Merck ; Octyl Sepharose 4 Fast Flow Amersham Bioscience ; Butyl Sepharose 4 Fast Flow, Amersham Bioscience), HAP-Gele (Hydroxyl-Apathit-Gel, BioRad) und des Chelat-Gels (Gel für die Immobili- sierte-Metal-Affinitäts-Chromatographie, Amersham Bioscience), Durchfüh- rung der Multi-Well-HIC-Chromatographie : Die Gele (bei einer Befüllung von 500 Kavität : ca. 0,5 mi x 8 = 4 ml) werden mit dem 10-fachen Gelvolumen Wasser gewaschen. Anschließend werden die Gele (50 u)/Kavität) in die Kavitäten 1A bis 4A (HIC-Gele), 5A (HAP-Gel) und 6A-12A (Che- lat-Gel) einer 96-Deep-Well-Platte (2,2 ml) verteilt. Zu den Gelen werden je 1000 ul Puffer (Tabelle 2) in die Kavitäten der Reihen 1A bis 12A zugegeben, so dass sich jeweils in den Kavitäten der 96-Well-Platte beziffert mit 1 bis 12 die Puffer entspre- chend der Tabelle 2 befinden. Parallel werden eine oder mehrere Kopien der Puffer gemäß Tabelle 2 angelegt, mit dem später die individuellen Kavitäten gewaschen werden. In jede der 8 Kavitäten werden jeweils 50 ul der proteinhaltigen Probe (Pro- teinkonzentration 0,3 ug/ul ; Proteinextraktgewinnung, siehe oben unter A. ) gegeben.

Tabelle 2 : Puffer für die Multiparallele-Chromatographie Reihe Beladungspuffer (Chelat) PH Gel Äquilibrierungs-u. Probenaufgabe-Puffer Elutionspuffer 1 2 M NaCl, 0. 1 M NaHCO3 8, 3 7,5 µl Phenyl HIC 0.1 M NaHCO3 8,3 2 2 M NaCl, 0. 1 M NaHCO3 8,3 4 ul Propyl HIC 0.1 M NaHCO3 8,3 3 2 M NaCl, 0. 1 M NaHCO3 8, 3 6 µL Octyl 0.1 M NaHCO3 8,3 4 2 M NaCl, 0. 1 M NaHCO3 8,3 20 µL Butyl 0.1 M NaHCO3 8,3 5 40 mM Kaliumphosphat 7 50 ul HAP 40 mM Kaliumphosphat + 500 mM 6 100 mM Calciumchlorid 40 ul ! Ca- ! MAC 20 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCI 7. 2 100 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 3 7 100 mM Magnesiumchlorid 40 ut Mg-) MAC 20 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 7.2 100 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 3 8 100 mM Nickelsulfat 40 ul Ni-) MAC 20 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 7.2 100 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 3 9 100 mM Cobaltchlorid 40 ul Co-IMAC 20 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 7. 2 100 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 3 10 100 mM Kupfersulfat 40 ul Cu-IMAC 20 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 7.2 100 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 3 11 100 mM Zinkchlorid 40 ul Zn-IMAC 20 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 7.2 100 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl 3 12 100 mM Eisensulfat 40 ul Fe-IMAC 100 mM Natriumacetatpuffer 1 M NaCl 7.7

100 mM Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCI | 3 | Nach dem Probenauftrag (15 ug, gelöst im Äquilibrierungspuffer) werden die Gele 2malig mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und anschließend die bindenden Prote- ine mit 3fachen Gelvolumen Elutionspuffer eluiert. Die Eluate werden auf eine 96- Well Platte kopiert und für Analysen (Proteinkonz. Best., Aktivität, etc. ) eingesetzt.

Die Bestimmung der Angiotensin-Konversionsenzym-ähnlichen Enzymaktivität er- folgte wie in Jankowski et al. 2001 beschrieben (Jankowski, J. et al. (2001) Anal Biochem. 290,324-9). Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt.

Der Vorteil dieser Anwendung liegt u. a. darin, dass für die Planung einer Gradiente- elution (kontinuierlicher bzw. Stufen-Gradient), einer Frontalchromatographie oder einer Displacement-Chromatographie mit diesem System die Parameter'erkundet werden können, unter denen das Zielprotein mit hohen absoluten bzw. spezifischen Ausbeuten chromatographisch aufgereinigt werden kann. Für dieses Ausführungs- beispiel kann es ferner vorteilhaft sein, Ergebnisse aus dem Ausführungsbeispiel 1 in den experimentellen Ansatz einfließen zu lassen, z. B. das dort ermittelte optimale Gel oder eine geeignete Startbedingung zu verwenden.

Die Überprüfung der Übertragbarkeit der Ergebnisse aus dem oben beschriebenen multiparallelen Chromatographie-Experiment auf die Gradienten-Chromatographie wird mit dem folgenden Experiment überprüft. Eine Säule wird mit einem HIC-Gel gefüllt (Fractogel EMD Phenyl (S) Merck. Säulenvolumen : 2.5 mL, Durchmesser : 1 cm, Höhe : 3 cm) und mit dem Puffer A (0.1 M NaHCO3 pH 8.3) mit einer Flußrate von 1 ml/min equilibriert. Als Probe wird nach der Equilibrierung einer enzymatisch- aktiven Fraktion aus Schweine-Nieren-Protein-Extrakt, gewonnen über eine Katio- nenaustausch-Displacement-Chromatographie, mit einer Proteinmenge von 3 mg, in 1 ml Puffer A gelöst und auf die Säule injiziert. Puffer B besteht aus Puffer A, dem 2 M NaCI zugesetzt sind. Der Gradient wird von 0 auf 100 % B in 10 Säulenvolumi- na entwickelt.

4. Ausführunqsbeispiel :

Im folgenden werden einige Beispiele für unterschiedliche Parameter und deren Variationen gegeben, die bei derAuswahl geeigneter Chromatographiebedingungen von Bedeutung sind (für verschiedene Multi-Well-Chromatographien) 1. Variation der Salz-Anionen zum Eluieren der Biomoleküle vom Anionenaus- tauscher : Cl04-, SCN, p-tosyl, I-, Br, N03-, CI-, H2P04-, CH3C00-, F- 2. Variation der Zusätze zur Stabilisierung der Biomoleküle wie z. B. : Glycerol, Sucrose, Natriummolybdat, Ethylenglycol, Urea, Guanidiniumchloride, Be- tain, Taurin, DTE, DTT, Monothioglycerol, Detergentien, Polyethylenglykol (PEG), Chloroform, Methanol, H20, Proteaseinhibitoren (EDTA, EGTA, PMSF, DFP, Benzamidine, Aprotinin, Pefabloc SC, TLCK, TPCK, Phosphor- amidon, Antipain, Leupeptin, Pepstatin A, Hirudin).

3. lonenaustausch-Chromatographie-Medien (Beispiele) : Tabelle 3 Gel Matrix DEAE-Sephadex A-25 Dextrane DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25 QAE-Sephadex A-50 DEAE-Sepharose CL-6B Agarose, cross-linked DEAE-Trisacryl M Copolymer 3 DEAE-Sephacel Cellulose, beaded DE 51 Cellulose DE 52 DE 53 DE 92 QA 52 QA 92 Express-lon D Express-lon Q DEAE A-200 Cellufine Cellulose DEAE A-500 Cellufine DEAE A-800 Cellufine DEAE-Spherodex M Dextran-coated DEAE-Spherodex LS Silica DEAE Thruput Agarose Q Thruput DEAE-Sepharose FF Agarose

4. Hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC) : Variation der Hydrophobizität des Gels (z. B. Butyl-Sepharose < Octyl- Sepharose < Phenyl-Sepharose) Variation der Gelmatrix Variation von pH Werten Variation von Salzen gemäß der Hofmeister-Reihe Zusätze von organischen Lösungsmitteln zum Startpuffer bzw. zur Eluti- onslösung 5. Metallaffinitätschromatographie (IMAC) : Variation der Metallionen : Ca2+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, La3+, Mn2+, Ni2+, Zon2+ Variation der komplexierenden Gruppe (Chelat) des Gels (z. B. ) : Imino- diessigsäure (IDA), Tris (carboxymethyl) ethylendiamin (TED), Nitrilotries- sigsäure (NTA).

Variation des Startpuffers (z. B. ) : 0,5 bis 2 M NaCI.

Variation der Gelmatrix.

Variation der Elution : a) pH Gradient (variation der pH-Werte in Richtung sinkender pH-Werte). b) Elution mit einem kompetitiven Liganden (z. B.

Ammonium chloride, Sulfat, Imidazol, oder Histamin). c) Elution mit Che- laten (EDTA, EGTA).

6. Hydroxylapatit : Variation des Startpuffers (Phosphatpuffer) 7. Reversed-Phase (RP) : Variation des Startpuffers : a) Variation der Konzentration organischer Lösungsmittel (A- cetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol), b) Variation von lonenpaarreagenzien (z. B. Trifluoressigsäure (TFA), Triethylammoniumacetat (TEAA), etc. ) Variation der Elutionsparameter a) Art der organischen Lösungsmittel (Acetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol) b) Konzentrationen der organischen Lösungsmittel c) Zusammensetzung der organischen Lösungsmittel Variation der Geleigenschaften a) Hydrophobizität des Gels (z. B. C4, C8, C18) b) Matrix des Gels (Silica oder Polymer) c) poröse Gele, nicht poröse Gele 8. Affinitätschromatographie :

Variation der Gele (Gele mit Farbstoffliganden, Gele mit immobilisierten Biomolekülen (Coenzymen etc.) Variation der Startpufferbedingungen (pH, lonenstärke) Variation der Elutionsbedingungen (Elution mit kompetitiven Liganden, Elution durch Variation der lonenstärke oder des pHs) 5. Ausführungsbeispiel : Multi-Well-Kationenaustauch-Chromatographie mit Stufengradienten-Elution A. Probengewinnung : Herstellung von Proteinextrakten aus der Niere von Schweinen : Siehe hierzu oben unter 1. Ausführungsbeispiel, Ziffer A.. Die Homogenisation des gefriergetrockneten Nierenextrakts wurde hier im jeweiligen Startpuffer durchge- führt : Als Startpuffer (je 20 mmo/l) wurden verwendet : (1) Citrat-Puffer, pH 3 ; (2) Citrat-Puffer pH 3,5 ; (3) Formiat-Puffer pH 4 ; (4) Succinat-Puffer pH 4,5 ; (5) Essig- säure pH 5 ; (6) Malonat-Puffer pH 5,5 ; (7) Malonat-Puffer pH 6 ; (8) Phosphat-Puffer pH 7 ; (9) HEPES-Puffer pH 7,5 ; (10) HEPES-Puffer pH 8. Für jeden Ansatz wurden ca. 200 mg Nierengewebe-Pulver in 3 mi Puffer gelöst.

B. Vorbereitung des Kationenaustauscher-Gels (Fractogel EMD-S03 ; Merck, Darmstadt) und Durchführung der Multi-Well-Kationenaustausch- Chromatographie mit Stufengradienten-Elution : Das Gel (bei einer Befüllung von 500 Kavität : ca. 0,5 ml x 100 = 50 ml) wird mit dem 5-fachen Gelvolumen mit 2 molarer wässriger NaCI-Lösung und anschließend mit dem 10-fachen Gelvolumen Wasser gewaschen. Die Leitfähigkeit nach dem letzten Waschvorgang sollte dem des Wassers entsprechen. Anschließend wird das Gel (500 pl/Kavität) auf die 10 Kavitäten einer 96-Deep-Well-Platte (2,2 mi) verteilt und je 1000 ul Puffer (20 mmol/l) der unter A. angegebenen Puffer ( (1) Citrat-Puffer, pH 3 ; (2) Citrat-Puffer pH 3,5 ; (3) Formiat-Puffer pH 4 ; (4) Succinat-Puffer pH 4,5 ; (5) Essigsäure pH 5 ; (6) Malonat-Puffer pH 5,5 ; (7) Malonat-Puffer pH 6 ; (8) Phos-

phat-Puffer pH 7 ; (9) HEPES-Puffer pH 7,5 ; (10) HEPES-Puffer pH 8. ) in die Kavitä- ten der Reihen 1 bis 10 zugegeben. Parallel werden die Puffer gemäß des oben genannten Pipettierschemas in Deepwell-Platten gefüllt, mit dem später die Gele gewaschen werden.

In jede der 96 Kavitäten werden jeweils 10 mg der proteinhaltigen Proben, gelöst im jeweiligen Startpuffer (1 bis 10 ; Proteinextrakt, siehe oben unter A. ) gegeben. Nach der Zugabe der Probe werden Probe und Gel suspendiert und 10 min inkubiert. Da- nach wird die 96-Well Platte zentrifugiert (Speed-Vac Zentrifuge : 1 min). Der Über- stand wird auf eine 96-Well Platte kopiert und für Analysen (Proteinkonz. Best., Ak- tivität, etc. ) aufgehoben. Die 10 verschiedenen individuellen Proben-Gel- Suspensionen in der 96-Well-Platte werden mit den entsprechenden, individuellen Pufferlösungen (jeweils 500 ul, die Puffer werden aus einer 96-Deepwell-Platte ko- piert, in der sich entsprechend dem oben angegebenen Schema die individuellen Lösungen befinden) suspendiert, um die Gele in den 10 Kavitäten zu waschen, an- schließend zentrifugiert und die überstehende Lösung abpipettiert und verworfen, um die nicht-bindenden Proteine zu entfernen. Dieser Vorgang wird 5 mal wieder- holt.

Nach dem Waschen werden die bindenden Proteine eluiert, indem in die Kavitäten 600 pl einer jeweils 0,5 molaren NaCI-Lösung zupipetiert wird. Nach der Zentrifuga- tion (1 min) werden die Eluate auf eine 96-Well-Platten kopiert, um die individuellen Proben der nachfolgenden Analytik zugänglich zu machen.

Nach der Elution mit der 1. Gradientenstufe werden die noch bindenden Proteine eluiert, indem in die Kavitäten 600 ut einer jeweils 2 molaren NaCI-Lösung zupipe- tiert wird. Nach der Zentrifugation (1 min) werden die Eluate auf eine 96-Well- Platten kopiert, um die individuellen Proben der nachfolgenden Analytik zugänglich zu machen.

Für den Enzymassay werden aus den Eluaten 470 ul abgenommen und mit 100 ul eines 100 mM NaHCO3~Kopplungspuffers gemäß der Vorschrift zur Immobilisierung von Proteinen an BrCN-aktivierte Sepharose (Amersham-Bioscience) gemischt, so dass ein pH-Wert von 8,3 erreicht wird. Dieses Gemisch zu 200 ul BrCN-aktivierten Sepharose Beads geben, und diese bei 4°C über Nacht inkubiert. Anschließend

folgten Deaktivierungsschritte mit Glycin sowie Wasch-Schritte, gemäß der Vor- schrift zur Immobilisierung von Proteinen an BrCN-aktivierte Sepharose (Amers- ham-Bioscience). Der Nachweis der Enzymaktivität eines Urotensin generierenden Enzyms (UCE) erfolgte nach Jankowski et al. 2001. Für die Bestimmung der Prote- in-Konzentration (nach Bradford ; Kit von Pierce) der Eluate werden jeweils 10 ul abgenommen.

6. Ausführuncjsbeispie) : Entsalzung bzw. Umpufferung von Fraktionen der MULTI-Well-Chromatographie Verschiedene Analyse-Techniken erfordern Protein-Fraktionen, die in definierten Puffern vorliegen. Um eine schnelle Entsalzung bzw. Umpufferung von maximal 96 Proben zu ermöglichen wurde ein Protokoll für diese Zwecke entwickelt. Ein 96- Deepwell-Platte mit einem Filter (20 um, Macherey & Nagel) wird mit einem Größe- nausschlußgel ae 1000, ul/Kavität, Biogel P6, BioRad) gefüllt. Das Größe- nausschlußgel sollte mit einem Puffer equilibriert sein, der elektrostatische Wech- selwirkungen zwischen Proteinen und dem Gel unterbindet. In einer Versuchsreihe wurde festgestellt, dass eine Umsalzung einer Proteinlösung von 2 mol/1 NaCI auf 0,29 mot/1 NaCI gelingt, wenn auf die mit 1000 ul Gel gefüllten Kavitäten 350 ul Pro- be aufgetragen werden. Die Entsalzung geschieht durch Zentrifugation der Probe durch das Größenausschlußgel. Bei diesem Versuchsansatz wurde eine Protein- ausbeute von 79 % erzielt. Die Salzkonzentration im Eluat kann auf 0,2 mot/1 redu- ziert werden, wenn das Probenvolumen der umzupuffernden Probe auf 300 ul redu- ziert wird. Die Proteinausbeute sinkt in diesem Fall jedoch auf 67 %.