(PSII)

La présente invention se rapporte à un procédé pour dissocier une solution aqueuse comprenant :

- une première oxydation éiectrochimique de la solution aqueuse en présence de lumière puisée, laquelle lumière puisée est générée à partir d'une première source d'énergie lumineuse à une valeur de fréquence de pulsion de pulsion prédéterminée, par une composition enzymatique à base d'un premier complexe enzymatique PSII, isolé d'un deuxième complexe enzymatique PS!, avec production d'oxygène, d'électrons libres et de protons libres dans la solution aqueuse,

- une capture desdits électrons libres et desdits protons libres, et

une capture séparée d'oxygène.

Eventuellement, la lumière puisée est une lumière cohérente, c'est-à-dire générée par un !aser.

Un tel procédé est connu par exemple du document Biochimica et Biophysica Acta 1817 (2012) 1028-1212, de Sheleva et Messinger, qui divulgue l'oxydation électrochimique de l'eau en présence de lumière.

Ce procédé trouve tout particulièrement son application dans le cadre de la production d'énergie renouvelable à partir de la lumière solaire.

Le PSII est un complexe moléculaire enzymatique photosensible comprenant des pigments (chlorophylle) qui est te siège de l'hydrolyse de l'eau dans les chîoroplastes présent dans le cytoplasme de cellules végétales selon la réaction suivante :

h v, PSII

2H ₂ 0 → 0 ₂ + 2H ⁺ + 2e -

, où hv correspond à un photon de lumière, par exemple de lumière solaire, H ₂ 0 est l'eau, H ⁺ représente un proton libre et e- représente un électron libre. Le complexe enzymatique PSIi, de par sa fonction d'hydrolyseur, produit, à partir de lumière, d'une part de l'oxygène, et, d'autre part, des électrons libres et des protons libres est d'un intérêt particulier dans le cadre de son utilisation pour la production, par l'intermédiaire d'une cathode, d'un carburant propre qu'est l'hydrogène gazeux (sous forme de gaz sous conditions standards de température et de pression). En effet, la cathode permet de recombiner les e- et les H ⁺ (réaction de réduction des protons) pour former de i'hydrogène. C'est dans cette optique que ce complexe enzymatique est un acteur prometteur de production d'un carburant propre, c'est-à-dire dont la combustion n'est pas associée à la production de C0 ₂ , à partir d'énergie naturelle : la lumière, qui de surcroît, constitue une source d'énergie quasi-inépuisabie.

Dès lors, l'hydrogène gazeux, résultant de la réduction des protons libres qui s'associent aux électrons libres, se combine à l'oxygène résultant de la réaction d'hydrolyse afin de réaliser une réaction de combustion qui résulte en une production, d'une part, d'énergie et, d'autre part, d'eau qui peut être à nouveau hydrolysée par le complexe PSIl, de sorte qu'un cycle de l'eau est formé, constituant ainsi une source quasi- inépuisabie de carburant propre. De plus, l'oxydation assistée par le complexe PSil permet la formation d'oxygène et d'hydrogène in situ, et répond à une question actuellement problématique de conditionnement de l'hydrogène qui, puisqu'il est formé in situ, ne nécessite plus d'être stockés sous des formes conditionnement contraignantes telles que celles connues actuellement : volumes importants, pressions importantes, etc.

Selon le document Biochimica et Biophysica Acta 1817

(2012) 1028-1212, il y a absorptions successives de photons de lumière par les pigments du PSII. A chaque absorption correspond une réaction chimique d'oxydo réduction qui prend place dans le complexe enzymatique PSII. Il est par ailleurs connu de l'état de la technique que, de manière exclusive, l'absorption successive de quatre photons de lumière par les pigments du PSII autorise la réalisation successive de quatre réactions d'oxydoréduction formant un cycle photochimique (cycle de Kok) à l'origine de l'oxydation de l'eau en oxygène, d'une part, et en protons libres et électrons libres, d'autre part.

Par ailleurs, il est connu de l'état de la technique que l'activité du complexe PSII est entre autre régulée par celle du complexe PSI.

L'activité du PSII est mesurée par la vitesse de production d'oxygène dans l'eau, plus cette vitesse est élevée, plus le rendement de la réaction d'oxydation de ('eau par le PSII est élevé, c'est-à-dire plus la quantité en oxygène produite est élevée.

II est en effet connu que, ta présence du complexe PSI, de part sa fonction dans le mécanisme de production d'énergie par photosynthèse, consomme les protons et électrons libres destinés indirectement par la suite à la réaction de synthèse des sucres par polymérisation du C0 ₂ .

II est donc avantageux que le complexe PSII soit isolé du complexe PSI pour que la réaction d'oxydation de l'eau augmente en rendement. En pratique, le complexe PSII est isolé du système PSI, ce dernier étant remplacé par un capteur (dispositif, produit, matériau) ou un groupe de capteurs d'électrons et de protons qui présente la propriété de ne pas inhiber l'activité du PSII. A titre exemplatif, le capteur d'électrons et de protons peut aussi être une cathode permettant la réduction des protons en hydrogène gazeux.

Par te terme « isolé », on entend au sens de l'invention que le complexe PSI n'est pas en mesure de coopérer avec le complexe enzymatique PSli.

Dans le procédé susmentionné, l'activité du PSII est principalement limitée par la concentration et la nature des capteurs d'électrons et des capteurs de protons ou des capteurs d'électrons et de protons qui, par exemple, réagissent avec les protons libres et les électrons libres pour subir une réduction. Cet aspect est d'ailleurs souligné dans l'article de Sheleva et Messinger mentionné au début et dans lequel les auteurs démontrent l'efficacité des turnovers pour un complexe enzymatique PSII en fonction de la nature chimique des capteurs d'électrons.

Par le terme « turnovers », il faut entendre le nombre d'étape de chaque cycle de Kok bouclé par unité de temps, étant entendu qu'un cycle de Kok complet comprend quatre turnovers successifs puisque associé à l'absorption consécutive de quatre photons de lumière.

Lors de l'interaction de la lumière avec le complexe enzymatique, une première séparation de charge S ₀ → Si a lieu et est suivie par trois autres séparations de charges Si→ S ₂ , S ₂ → S ₃ , et S ₃ → S ₄ . A chacune de ces séparations de charge est associée une réaction d'oxydoréduction du cycle de Kok avec, lorsque le cycle est bouclé, formation d'oxygène et de protons libres ainsi que d'électrons libres, et le retour du complexe de l'état S ₄ vers l'état S ₀ .

En particulier, les auteurs démontrent qu'une des quatre réactions d'oxydoréduction du cycle de Kok : la réaction de réduction, régie par la réactivité du capteur d'électrons, est l'étape limitante du cycle de Kok.

Aussi, Sheleva et Messinger laissent entendre que le rendement du complexe enzymatique PS!I pourrait être optimisé en choisissant une valeur de fréquence de pulsion de pulsion prédéterminée qui est une fréquence de pulsion propre de la lumière puisée associée une vitesse prédéterminée de réaction de réduction qui prend place dans l'environnement immédiat du groupement capteur d'électrons du complexe enzymatique PSII.

De cette façon, à un capteur d'électrons spécifique correspond une fréquence de pulsion spécifique : il s'agit donc d'optimiser la fréquence de pulsion de la lumière puisée en fonction de la vitesse de réaction de réduction sur le site réducteur du complexe enzymatique PSII et donc en fonction de la nature chimique du capteur d'électrons afin de disposer du nombre le plus élevé possible de turnovers par unité de temps, et donc du nombre de cycles de Kok par unité de temps.

Malheureusement, si le procédé de l'état de l'art avance des conclusions prometteuses en ce qui concerne une voie d'optimisation du fonctionnement du complexe enzymatique PSM, il n'en reste pas moins limité à une contrainte majeure en la nécessité de disposer d'une source de lumière d'énergie constante dans le temps et suffisante pour saturer le cycle de Kok du complexe enzymatique PSII, le niveau d'énergie de la source lumineuse étant régie par la nature physico-chimique du complexe enzymatique PSII, en particulier par la composition chimique des groupements capteurs et donneurs d'électrons.

L'invention a pour but de pallier cet inconvénient de l'état de la technique en procurant un procédé de dissociation d'une solution aqueuse rentable, tout en permettant d'exploiter à l'échelle industrielle une source d'énergie lumineuse est non-contrôlée, comme par exemple l'énergie solaire ou d'origine électrique renouvelable, et la transformer en hydrogène et en oxygène produit in situ de façon à pouvoir disposer d'une source de combustible et d'une source de comburant qui pourraient être directement utilisées par exemple sur place.

Pour résoudre ce problème, il est prévu suivant l'invention, un procédé tel qu'indiqué au début, caractérisé en ce que ladite énergie lumineuse présente une valeur d'énergie variable dans le temps et en ce que ledit procédé comprend en outre une étape de modulation de ladite valeur de fréquence de pulsion prédéterminée de ladite lumière puisée à une valeur de fréquence de pulsion suffisante pour obtenir un premier rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse qui soit supérieur d'un facteur compris entre 1 ,01 et 100,00 à un deuxième rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse obtenu pour une deuxième oxydation éîectrochimique en présence de lumière continue, lesquelles lumières puisées et lumières continues présentent une longueur d'onde prédéterminée égale et une puissance prédéterminée égale.

Ainsi, avec ie procédé selon la présente invention, pour une irradiation du complexe enzymatique PS II à ladite valeur de fréquence de pulsion suffisante, on assure aisément la production d'oxygène et d'hydrogène qui, en comparaison à une mise en œuvre du procédé en présence de lumière continue à puissance égale, est caractérisée par un rendement étonnement bien plus élevé.

En effet, bien que ce phénomène ne soit pas encore bien compris, il a été observé de manière tout à fait surprenante qu'en modulant la quantité d'énergie lumineuse variable dans le temps sous forme d'une énergie lumineuse puisée à une fréquence de pulsion présentant la valeur de fréquence de pulsion suffisante, la vitesse de production d'oxygène lors de l'oxydation de l'eau et donc l'activité du PSII sont augmentées pour une valeur d'énergie totale incidente donnée, comme démontré dans les exemples de la présente demande.

A contrario, Sheleva et Messinger, qui utilisent différentes valeurs prédéterminées de fréquence de pulsion pour stimuler le complexe enzymatique, doivent toutefois s'assurer qu'un nombre prédéterminé et constant de puises soit généré et que chaque puise présente la même énergie, de sorte que l'énergie totale fournie au système soit constante dans le temps. Aussi, pour une fréquence de pulsion prédéterminée, l'homme de métier qui voudrait mettre en œuvre ce procédé devrait alors s'assurer que le complexe enzymatique a bien été irradié par le nombre prédéterminé de puises et doit donc ajuster la durée d'irradiation en fonction de la fréquence de pulsion choisie pour assurer une valeur d'énergie totale incidente constante.

Cet aspect du procédé de l'état de l'art est tout particulièrement contraignant dès lors qu'il s'agit de mettre en place industriellement ce procédé de l'état de la technique par exemple, en tirant profit de la lumière du soleil pour produire de l'hydrogène et de l'oxygène. A titre ii!ustratif, dans l'exemple du tableau 2 présenté dans les résultats relatifs à la présente invention, la vitesse maximale de production en oxygène par unité d'énergie mesurée en présence de lumière puisée est au moins 20 fois plus élevée que la vitesse mesurée lors de la mise en oeuvre du procédé d'hydrolyse de l'eau en présence d'une lumière continue, et ce pour une même valeur prédéterminée de puissance lumineuse fixée à 555mW.

En effet, dans fe cadre de ta présente invention, il a été observé que pour un puise suffisamment intense et court (de façon à pouvoir saturer le cycle de Kok en lui fournissant l'énergie minimale suffisante pour l'activé et induire la dissociation électrochimique de l'eau), une première séparation de charge (S ₀ → S-i ) prend place dans le complexe enzymatique, le nombre de premières séparations de charge est régi par la valeur de fréquence de pulsion suffisante de la lumière puisée.

Le choix de la valeur de fréquence de pulsion suffisante est déterminé par : (i) le profil d'absorption lumineuse du complexe enzymatique et donc par la longueur d'onde de la lumière puisée ; (ii) ainsi que par la valeur d'énergie de l'énergie de la lumière incidente.

Aussi, lorsque la valeur d'énergie de l'énergie lumineuse est plus élevée, la valeur suffisante de fréquence de pulsion est plus élevée, à l'inverse, lorsque ia valeur d'énergie de l'énergie lumineuse est plus faible, la valeur suffisante de fréquence de pulsion est plus faible.

Ainsi, le nombre de puise varie de sorte que la valeur d'énergie de chaque puise soit suffisante pour créer la première séparation de charge (S ₀ → S-i) dans le complexe enzymatique. La valeur d'énergie de chaque puise dépend de la valeur d'énergie de l'énergie lumineuse et du choix de la valeur suffisante de fréquence de pulsion pour obtenir le rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse revendiqué.

Le procédé selon l'invention constitue donc une alternative de mise en œuvre plus simple que celle du procédé divulgué dans i'état de l'art puisqu'il ne requiert pas ie contrôle à la fois de l'énergie appliquée au système et de la fréquence de pulsion avec laquelle cette énergie est appliquée mais seulement de la fréquence de pulsion de la lumière puisée.

Avantageusement, avant ladite étape d'oxydation électrochimique de ladite solution aqueuse, le procédé comprend une étape d'extraction dudit complexe enzymatique PSII de chloroplastes ou de tylakoïdes de chloroplastes.

Dans une forme de réalisation particulière, le procédé selon l'invention comprend, après l'étape d'extraction dudit PSIÎ, une étape de purification dudit complexe enzymatique PSII pour former une composition enzymatique sensiblement concentrée en PSII.

De préférence, lesdits chloroplastes ou tylakoïdes de chloroplastes sont des chloroplastes ou tylakoïdes de chloroplastes de végétaux de la famille des Chenopodiaceae, de préférence du genre Spinacia ou de la famille des Characeae, de préférence des algues procaryotes ou eucaryotes.

Alternativement, ledit complexe PSII est un complexe de synthèse résultant d'une étape de fabrication synthétique dudit complexe enzymatique PSII, ladite étape de fabrication étant réalisée préalablement à l'étape d'oxydation de la solution aqueuse.

Dans une forme de réalisation particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, ladite capture des électrons libres et des protons libres est effectuée par un médiateur de transport d'électrons choisi , par exemple parmi le groupe constitué des dérives de la quinone, de préférence parmi la 2,6-diméthyiebenzoquinone, la 2,6-dichloro-p- benzoquinone, et la 1 ,4-benzoquinone, ou un de leurs mélanges.

Eventuellement, ladite lumière puisée est émise à une fréquence de pulsion comprise entre 1 Hz et 100MHz, de préférence comprise entre Hz et 3000Hz, dans une gamme de longueurs d'ondes comprise entre 400nm et 700nm, de préférence entre 500nm et 680nm, à une puissance comprise entre 1 mW et 800mW, de préférence entre 500 et 700mW.

Dans une forme de réalisation particulière, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite oxydation de l'eau est réalisée à un pH compris entre 4 et 8, de préférence entre 6 et 7.

La mise en œuvre du procédé selon l'invention dans une gamme de pH comprise entre 6 et 7 assure une activité enzymatique optimale du complexe PSI I .

D'autres formes de réalisation du procédé selon l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.

L'invention a aussi pour objet une utilisation de lumière puisée, laquelle lumière puisée générée à partir d'une première source d'énergie lumineuse à une valeur de fréquence de pulsion prédéterminée, pour réaliser une oxydation électrochimique de l'eau en présence de lumière au moyen d'un système biochimique photosensible comprenant :

- une composition enzymatique à base d'un premier complexe enzymatique PSil, isolé d'un deuxième complexe enzymatique PSI, agencé pour oxyder de l'eau en oxygène et pour libérer conjointement des électrons libres et des protons libres dans l'eau, - un premier capteur desdits électrons libres et un deuxième capteur desdits protons libres, ou un troisième capteur desdits électrons libres et desdits protons libres, qui peut être par exemple une cathode, et

- un quatrième capteur d'oxygène qui peut être par exemple un récipient de stockage d'oxygène.

caractérisée en ce que ladite énergie lumineuse présente une valeur d'énergie variable dans le temps et en ce que ladite valeur de fréquence de pulsion prédéterminée de ladite lumière puisée est modulée à une valeur de fréquence de pulsion suffisante pour obtenir un premier rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse qui soit supérieur d'un facteur compris entre 1 ,01 et 100,00 à un deuxième rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse obtenu pour une deuxième oxydation électrochimique en présence de lumière continue, lesquelles lumières puisées et lumières continues présentent une longueur d'onde prédéterminée égale et une puissance prédéterminée égale.

Avantageusement, ledit complexe enzymatique PSIl est extrait de chloroplastes ou de tyiakoïdes de chloroplastes.

De préférence, ledit complexe enzymatique PSIl est purifié pour former une composition enzymatique sensiblement concentrée en PSIl.

Dans un mode préférentiel d'utilisation, les chloroplastes ou tyiakoïdes de chloroplastes sont des chloroplastes ou tyiakoïdes de chloroplastes de végétaux de la famille des Chenopodiaceae, de préférence du genre Spinacia ou de la famille des Charaœae, de préférence des algues procaryotes ou eucaryotes.

En particulier, ledit complexe enzymatique PSIl est un complexe enzymatique de synthèse.

Alternativement, ledit capteur d'électrons libres et de protons libres est un médiateur de transport d'électrons choisi parmi le groupe constitué, par exemple, des dérives de la quinone, de préférence parmi la 2,6-diméthylebenzoquinone, la 2,6-dichloro-p-benzoquinone, et la 1 ,4- benzoquinone, ou un de leurs mélanges.

Particulièrement, ledit médiateur est présent dans l'eau à une concentration comprise entre 1 μ et 1 M. De préférence, le PSIl est déposé sur un substrat. La concentration en PSIi est dans ce cas de figure au moins supérieure à 1 M, ledit substrat jouant alors le rôle d'anode, siège de l'oxydation de l'eau contenue dans la solution aqueuse.

De préférence ledit médiateur est présent dans l'eau à une concentration comprise entre 10μ et 1 mM et dans laquelle ledit PSIl est présent dans l'eau à une concentration comprise entre 1 pg Chl/ml et 1 g Chl/ml, de préférence entre 20pg Chl/m! et 200pg Chi/ml. Au sens de l'invention, les concentrations en PSIl sont traditionnellement exprimées par rapport à la concentration en chlorophylle totale (Chl). Par concentration en chlorophylle totale, il faut entendre au sens de l'invention la concentration en chlorophylles A et B.

Préférentiellement, ladite lumière puisée est émise à une fréquence de pulsion comprise entre 1 Hz et 100MHz, de préférence comprise entre 1 Hz et 3000Hz, dans une gamme de longueurs d'ondes comprise entre 400nm et 700nm, de préférence entre 500nm et 680nm, à une puissance comprise entre 1 mW et 800mW, de préférence entre 500 et 700mW.

De manière avantageuse, l'utilisation de lumière puisée selon l'invention est caractérisée en ce que ladite oxydation de l'eau est réalisée à un pH compris entre 4 et 8, de préférence entre 6 et 7.

D'autres formes de réalisation de l'utilisation de la lumière puisée suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.

La présente invention concerne aussi un dispositif pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention, lequel dispositif comprend :

- une source d'énergie lumineuse destinée à produire une lumière puisée dont l'énergie lumineuse présente une valeur d'énergie variable dans le temps ;

- un modulateur de fréquence de pulsion de ladite lumière puisée ;

- un réacteur de dissociation d'une solution aqueuse comprenant une phase aqueuse, lequel réacteur est agencé de sorte que ladite solution puisse être irradiée par ladite lumière puisée lorsque cette dernière est générée ;

- une composition enzymatique en solution dans ladite phase aqueuse, laquelle composition enzymatique comprend un premier complexe PSI!, isolé d'une deuxième complexe enzymatique PSI, laquelle composition enzymatique est agencée pour, sous l'action de la lumière puisée, oxyder électrochimique ladite solution aqueuse pour produire de l'oxygène, des électrons libres et des protons libres dans la solution aqueuse ; - un premier moyen de capture de l'oxygène ;

- un deuxième moyen de capture des électrons libres et des protons libres.

D'autres formes de réalisation du dispositif suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non-limitatif et en faisant référence aux exemples décrits ci-dessous.

La figure 1 illustre les spectres d'absorption du PSH avant et après purification selon une méthode d'extraction du complexe PSII à partir de chloroplastes de l'épinard.

La figure 2 illustre une courbe d'évolution de la vitesse maximale de production d'oxygène obtenue par le procédé selon l'invention en présence de lumière cohérente continue d'une longueur d'onde de 673nm, en fonction de la valeur de l'énergie lumineuse par seconde.

La figure 3 illustre une courbe d'évolution de la de ia vitesse maximale de production d'oxygène obtenue par le procédé selon l'invention en présence de lumière cohérente puisée à 800Hz (puises de durée de 9,2ps) d'une longueur d'onde de 673nm, en fonction de la valeur de l'énergie lumineuse par seconde.

La figure 4 illustre les courbes d'évolution de la vitesse maximale de production d'oxygène obtenues par le procédé selon l'invention en présence de lumière cohérente continue, ou de lumière cohérente puisée à 800Hz (puises de durée de 1 ,5ps), d'une longueur d'onde de 673nm, en fonction de la valeur de l'énergie lumineuse par seconde.

La figure 5 illustre les courbes d'évolution de rendement énergétique maximal de production d'oxygène obtenues par le procédé selon l'invention en présence de lumière cohérente continue, ou de lumière cohérente puisée à 800Hz (puises de durée de Ι ,δμε), d'une longueur d'onde de 673nm, en fonction de la valeur de l'énergie lumineuse par seconde.

La figure 6 illustre les courbes d'évolution de rendement énergétique maximal de production d'oxygène obtenues par le procédé selon l'invention en présence de lumière cohérente continue, ou de lumière cohérente puisée à 800Hz (puises de durée de 1 ,5ps), d'une longueur d'onde de 673nm, en fonction de la valeur de l'énergie lumineuse par seconde (l'énergie étant exprimée à l'échelle logarithmique).

Le dispositif employé pour mettre en œuvre le procédé selon la présente invention, dont les performances sont illustrées dans les exemples qui suivent, comprend :

- une source d'énergie lumineuse destinée à produire une lumière puisée dont l'énergie lumineuse présente une valeur d'énergie variable dans le temps ;

- un modulateur de fréquence de pulsion de ladite lumière puisée ;

- un réacteur de dissociation d'une solution aqueuse comprenant une phase aqueuse, lequel réacteur est agencé de sorte que ladite solution puisse être irradiée par ladite lumière puisée lorsque cette dernière est générée ;

- une composition enzymatique en solution dans ladite phase aqueuse, laquelle composition enzymatique comprend un premier complexe PSII, isolé d'une deuxième complexe enzymatique PSI, laquelle composition enzymatique est agencée pour, sous l'action de la lumière puisée, oxyder électrochimique ladite solution aqueuse pour produire de l'oxygène, des électrons libres et des protons libres dans la solution aqueuse ;

- un premier moyen de capture de l'oxygène ;

- un deuxième moyen de capture des électrons libres et des protons libres.

En fonctionnement, la lumière puisée est générée à une première fréquence de pulsion prédéterminée et la source de lumière puisée est orientée de façon à ce que la lumière puisée irradie les photoenzymes dans la solution aqueuse.

L'irradiation du complexe enzymatique en suspension dans la induit une réaction d'oxydation de l'eau contenue dans le réacteur par l'intermédiaire du complexe enzymatique PSII avec production d'oxygène qui est captée par le premier moyen de capture qui est par exemple une électrode de type Clark immergée dans la phase aqueuse, les électrons libres et les protons libres sont quant à eux captés par le deuxième moyen de capture qui est un capteur d'électrons, par exemple de ia diméthylebenzoquinone (DMBQ) ou de la 2,5-dichloro-p-benzoquinone (DCBQ).

La valeur d'énergie de l'énergie lumineuse variant avec le temps, le modulateur de fréquence de pulsion de la lumière puisée, laquelle lumière puisée est associée à cette énergie lumineuse variable, permet lorsqu'il est en fonctionnement de moduler la valeur de fréquence de pulsion prédéterminée de cette lumière puisée à une valeur de fréquence de pulsion suffisante pour obtenir un premier rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse qui soit supérieur d'un facteur compris entre 1 ,01 et 100,00 à un deuxième rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse obtenu pour une deuxième oxydation électrochimique en présence de lumière continue, lesquelles lumières puisées et lumières continues présentent une longueur d'onde prédéterminée égale et une puissance prédéterminée égale.

De préférence, le premier rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse qui soit supérieur d'un facteur compris entre 1 ,01 et 80,00 à un deuxième rendement de production d'oxygène par unité d'énergie lumineuse obtenu pour une deuxième oxydation électrochimtque en présence de lumière continue, lesquelles lumières puisées et lumières continues présentent une longueur d'onde prédéterminée égale et une puissance prédéterminée égale. Par les termes « fréquence de pulsion », il faut entendre dans la présente invention la fréquence avec laquelle est modulée la valeur d'énergie de l'énergie lumineuse émise à une longueur d'onde prédéterminée ou dans une gamme de longueurs d'onde prédéterminée.

Exemple 1 : préparation de la composition enzvmatique à base de PSII

Comme mentionné précédemment, il y a lieu d'éliminer le complexe PSI qui inhibe l'activité du complexe PSII et donc limite la formation d'oxygène.

Des chloroplastes de répinard {Spinacia oleraœa) sont extraits en accord avec la procédure développée par Barthélémy et co. (Journal of Photochemistry and Photobiology B : Bio!ogy, 1997, volume 39, pages 213-218), et ensuite extraits des membranes thylakoïdiennes et dissociés du complexe PSI présent dans ces membranes, le complexe PSIi selon la méthode de Berthold et co, voir Febs Letters, 1981 , volume 134, numéro 2, pages 231 -234.

Par rapport à la procédure de Barthélémy, dans le procédé selon l'invention, on fait mention des modifications suivantes:

- la concentration absolue en Triton® X 100 est maintenue constante dans l'échantillon d'une solution aqueuse en ajustant la concentration de chlorophylle à 200pg/ml avant d'ajouter 25mg de Triton® X 100 pour 1 mg de chlorophylle à l'échantillon, et

- le second traitement au Triton® X 100 est exclu et remplacé par un rinçage des particules PSII dans un tampon ES-NaOH 20mM

(comprenant 15mM de NaCI et 5mM de MgCI ₂ ) à pH = 6,5 et une suspension de ces particules dans un tampon MES-NaOH 20mM (comprenant 1 5mM de NaC!, 5mM de MgCI ₂ , et 0,5M de sucrose) à pH = 6,5.

Le PSII obtenu par la méthode de Bertold et co. modifiée, telle que décrite ci-dessus, est ensuite conservé à -80°C après congélation dans de l'azote liquide à une température de -196°C (77K) pendant une période de 10sec.

Selon la méthode d'extraction modifiée décrite ci-dessus, le PSII de l'épinard est isolé du complexe PSI présent dans le chloroplaste. En effet, comme !e montre la figure 1 , le pic d'absorption apparaissant à 735nm correspond à celui du complexe PSI tandis que le pic d'absorption à 685nm correspond au complexe PSII, ce pic diminuant d'valeur d'énergie d'un facteur 5 après purification selon la méthode du présent exemple, ce qui correspond à une diminution d'un facteur 5 de la concentration en PSI.

Exemple comparatif 1 : mesure de la vitesse maximale de production d'oxygène avec le complexe PSII en lumière continue et en lumière puisée monochromatique à 673nm

Un système de photo hydrolyse constitué d'une cellule, de volume de 2,5ml, dons les parois sont munies de hublots vitrés, dans laquelle est placée une suspension de PSII dans une solution aqueuse à un pH tampon de 6,5, contenant de la diméthylebenzoquinone (DMBQ) ou de la 2,5-dichloro-p-benzoquinone (DCBQ).

La cefluîe est illuminée par un faisceau de lumière laser à 673 nm, en mode continu ou en mode puisé. Les caractéristiques du laser sont reprises dans les tableaux 1 a (DMBQ) et 1 b (DCBQ).

Par les termes « lumière puisée » ou « mode puisé », il est entendu au sens de l'invention une lumière intermittente, c'est-à-dire dont la valeur d'énergie prend alternativement une première valeur nulle et une deuxième valeur prédéterminée non-nulle à une fréquence de pulsion prédéterminée, par exemple de 800Hz, ce qui signifie que la valeur d'énergie passe 800 fois par seconde de la valeur nulle à la valeur non- nulle prédéterminée par la puissance de la lumière. Tableau 1a : Caractéristiques du laser utilisé pour le système PSIl-DMBQ

Paramètres Spécifications

Type de laser VCSEL

Longueurs d'onde d'émission laser 671 nm à 15°C

676nm à 35°C

Largeur spectrale < 2nm FWHM

Mode d'opération continu ou puisé

Puissance moyenne 550mW (mode continu et puisé)

Puissance crête > 700mW (mode puisé)

Taux de répétition de 1 Hz à 3000Hz (mode puisé)

Durée de l'impulsion 9,2ps (mode puisé)

Sortie optique collimatée, linéaire, ou focalisée

Tableau 1b : Caractéristiques du laser utilisé pour le système PSIl-DCBQ

Paramètres Spécifications

Type de laser VCSEL

Longueurs d'onde d'émission laser 671 nm à 15°C

676nm à 35°C

Largeur spectrale < 2nm FWHM

Mode d'opération continu ou puisé

Puissance moyenne 642mW (mode continu et puisé)

Puissance crête 555mW (mode puisé)

Taux de répétition de 1 Hz à 5000Hz (mode puisé)

Durée de l'impulsion 1 ,5ps (mode puisé)

Sortie optique collimatée, linéaire, ou focalisée La vitesse de l'augmentation de la concentration en oxygène sous illumination a été mesurée à 25°C en utilisant une électrode de type Clark dans une solution tampon aqueuse de concentration 25mM MES- NaOH (pH = 6,5) et 1 mM de DMBQ.

La figure 2 illustre une courbe d'évolution de la vitesse maximale de production d'oxygène (en μηηοΐββ) pour 25 g de chlorophylle (Chl), traités par la méthode selon l'exemple 1 , par mi de solution aqueuse et par minute (min). La courbe est obtenue en présence de lumière cohérente continue d'une longueur d'onde de 673nm, en fonction de la valeur de l'énergie lumineuse par seconde (en mJ/sec).

La figure 3 illustre une courbe d'évolution de la vitesse maximale de production d'oxygène (en μιηοΐβε) pour 25μg de chlorophylle (Chl), traités par la méthode selon l'exemple 1 , par mi de solution aqueuse et par minute (min). La courbe est obtenue en présence de lumière cohérente puisée à 800Hz d'une longueur d'onde de 673nm, en fonction de la valeur de l'énergie lumineuse par seconde (en mJ/sec).

L'analyse des figures 2 et 3 permet de constater, par exemple, que disposant d'une puissance lumineuse de 500mW, la quantité d'énergie par seconde en lumière continue équivaut à 500mJ/sec. A cette quantité d'énergie en lumière continue correspond une vitesse de production d'oxygène K(0 ₂ ) de 7 0 ^"2 Chl ml min).

En présence d'une lumière puisée, à une puissance de 500mW, émise à une fréquence de pulsion de 100Hz, c'est-à-dire une énergie de 5mJ/sec, correspond une vitesse de production d'oxygène K(0 ₂ ) (par énergie) de 0,01535 μmΌ\esf(25μg Chl ml min) par 500 mJ/sec, soit une augmentation d'un facteur 21 ,9 du rendement de l'énergie, par rapport à la vitesse mesurée en présence d'une lumière continue. Les résultats de la confirmation expérimentale de cette analyse sont repris tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : comparaison de la vitesse de production d'oxygène en présence de lumière puisée ou continue, d'une puissance de 555 mW à

673 nm.

*μ οΙββ/(25μ9 Chl ml min mJ)

L'analyse des figures 4 à 6, et en particulier des figures 5 et 6, permet de démontré que le rendement énergétique en mode puisé est augmenté d'un facteur at!ant de 1 ,03 à 61 ,75 en fonction de la fréquence de pulsion et donc de la quantité d'énergie par seconde, en comparaison à mise en œuvre du procédé en présence de lumière continue à puissance égale.

Les résultats de la figures 5 sont reportés dans le tableau 3 suivant :

Tableau 3

par rapport à la lumière continue à une énergie de 642 mJ/s H doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux modes de réalisation décrits ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées dans le cadre des revendications annexées.