Bei einer speziellen Form der amperometrischen Analyse wird an einer Arbeitselektrode Wox die reduzierte Form eines zu detektierenden Stoffes Ared zu dessen oxidierter Form Aox oxi- diert und an einer benachbarten Arbeitselektrode Wred wieder zu Ared reduziert. Dieser Vorgang, der als sog. Redox- (Re) cyc- lings bezeichnet wird (Literatur : K. Aoki et al., J. Electro- anal. Chem., 256 (1988), Seiten 269 bis 282, 0. Niwa et al., Anal. Chem., 65 (1993), Seiten 1559 bis 1563), führt zu einer Signalverstärkung. Für ein solches Verfahren ist insbesondere eine Sensoranordnung mit elektrisch ansteuerbarem Array ent- sprechend der WO 00/62048 A geeignet. Neben den Arbeitselekt- roden sind dabei weitere Hilfselektroden vorhanden, die aber kein Redox-Potential erfassen können.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren anzugeben und zugehörige Vorrichtungen der eingangs genannten Art zu schaffen, bei denen die Messungen bei elektrochemischen Ana- lyseverfahren verbessert und vereinfacht werden, bzw. bei de- nen die Messanordnungen kostengünstiger herstellbar sind.

Die Aufgabe ist bezüglich des Verfahrens erfindungsgemäß durch die Maßnahmen des Patentanspruches 1 und bezüglich der Vorrichtung durch die Merkmale des Patentanspruches 5 gelöst.

Weiterbildungen der Erfindung sind in den abhängigen Verfah-

rens-und/oder Sachansprüchen angegeben. Weiterhin enthalten die Patentansprüche auch bevorzugte Anwendungen der angegebe- nen Anordnungen mit erfindungsgemäßem Elektrodensystem.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein an sich bekanntes Redox- (Re) cycling zur Verstärkung von Auswertesignalen für ein elektrochemisches Analyseverfahren durchgeführt, bei dem nunmehr erstmalig ein genau definiertes Redox-Potential zur Auswertung genutzt wird. Mit der Erfindung wird also insbe- sondere eine Referenzelektrode definiert, an der stromlos, d. h. hochohmig das Redox-Potential abgegriffen und der weite- ren Signalverarbeitung zugeführt wird.

Referenzelektroden werden zwar bereits häufig bei elektroana- lytischen Verfahren (siehe z. B. W. Buchberger"Elektrochemi- sche Analyseverfahren"Spektrum Akademischer Verlag Heidel- berg (1998), Berlin) benutzt, die ein vom Analyten unabhängi- ges stabiles Bezugspotential liefern müssen. Eine klassische Referenzelektrode ist z. B. die Ag/AgCl-Elektrode, die aus folgender Anordnung besteht : el. Leiter/Silber/Silberchlorid/KCl-Lösung/Diaphragma Solche Referenzelektroden sind relativ komplex aufgebaut und benötigen Volumina von einigen cm3.

Viele elektroanalytische Verfahren werden heutzutage mit Hil- fe der Technologien der Mikroelektronik und Mikrosystemtech- nik miniaturisiert (Volumina wenige mm3), wobei jedoch die Möglichkeiten der Miniaturisierung von Referenzelektroden be- grenzt sind. Es kann z. B. eine Ag/AgCl-Schicht in Dünnfilm- technik ausgeführt werden und anstelle eines KCl-Lösungs- Volumens eine definierte Chlorid-Ionen-Konzentration dem Ana- lyten zugefügt werden. Eine solche Referenzelektrode (sog.

Elektrode 2. Art) wird in der DD 301 930 A9 für eine Mikro- Mehrelektrodenanordnung benutzt.

Bei mikroelektroanalytischen Verfahren ist jedoch der Einsatz von Ag/AgCl-Schichten i. allg. unerwünscht. Gründe dafür sind

eine unvermeidbare Kontaminationsgefahr, fehlende Prozesskom- patibilität und hohe Kosten. Insofern sind die vom Stand der Technik bekannten Referenzelektroden für ein Redox- (Re) cyc- ling ungeeignet, so dass dort bisher darauf verzichtet wird.

Bei Realisierung der Erfindung beinhalten die zugehörigen An- ordnungen eine besondere Platzierung der Referenzelektrode im Elektrodensystem und zwar so, dass symmetrische Verhältnisse aller Messelektroden zur Referenzelektrode vorliegen. Dabei ist an sich bekannt und wird vorausgesetzt, dass ein sog. Re- dox-Paar, d. h. ein Gemisch aus oxidierter und reduzierter Form einer Substanz A, ggf. einer Verbindung, an einer elekt- rochemisch aktiven (Edel)-Metallelektrode in Lösung ein sog.

Redox-Potential ausbildet, das exakt definiert ist. Dieses Redox-Potential lässt sich durch Realisierung der hochohmigen Referenzelektrode stromlos messen und zur Auswertung nutzen.

Unter einer elektrochemisch bzw. katalytisch aktiven Elektro- de wird in vorliegendem Zusammenhang verstanden, dass sowohl die oxidierte Form der Substanz auf dem Elektrodenmaterial chemisorbiert wird, um einen Elektronenaustausch zu ermögli- chen. Diese Forderung wird insbesondere von Edelmetallen, wie Gold (Au), Platin (Pt) od. dgl., aber ggf. auch von anderen Materialien, beispielsweise Kohlenstoff, erfüllt, sofern sie eine Redox-Reaktion ermöglichen.

Für einen Sensor auf der Basis des Redox- (Re) cycling- Verfahrens braucht man Arbeitselektroden Wred und WOXT eine Gegenelektrode C und eine Referenzelektrode R. Ggf. genügt eine Arbeitselektrode, wenn die Gegenelektrode auch die Funk- tion einer Arbeitselektrode einnimmt. Bei den einzelnen er- findungsgemäßen Anordnungen wird die Referenzelektrode hin- sichtlich der Potentialmessung besonders vorteilhaft ausges- taltet und platziert. Vorzugsweise sind alle Elektroden aus dem gleichen Material, insbesondere einem Edelmetall, wie z. B. Gold, ausgebildet.

Daraus ergibt sich ein entscheidender Vorteil bei der Her- stellung solcher Strukturen auf der Basis der Halbleitertech- nologie. Die Verwendung von klassischen Referenzelektrodenma- terialien wie z. B. Silber/Silberchlorid entsprechend der DD 301 930 A ist in der Halbleitertechnologie problematisch.

Eine Einführung von Silber/Silberchlorid in einem halbleiter- technologischen Prozess würde ein hohes Kontaminationsrisiko für die Standard-Halbleiterprozesse bedeuten und Kompatibili- tätsproblem sowie hohe Herstellungskosten bewirken. Die er- findungsgemäße Ausführung der Referenzelektrode in derselben Technologie wie die der anderen Elektroden, d. h. Arbeits-und Gegenelektroden, vermeidet diese Probleme und verringert die Herstellungskosten.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbei- spielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentan- sprüchen. Es zeigen jeweils in schematischer Darstellung Figur 1 eine Anordnung für das Redox- (Re) cycling, aus der insbesondere die erfindungsgemäße Platzierung der Re- dox-Referenzelektrode hervorgeht, Figur 2 die Draufsicht auf ein Elektrodensystem mit zwei Ar- beitselektroden, Gegenelektrode und Referenzelektrode zur Verwendung bei der Anordnung gemäß Figur 1, Figur 3 eine Abwandlung von Figur 2 mit nur einer Arbeits- elektrode, Gegenelektrode und Referenzelektrode, Figur 4 die Draufsicht auf ein Elektrodensystem mit parallel kreisförmig ausgebildeten Elektrodenfingern und Figur 5 den Querschnitt durch ein Substrat mit Arbeitselek- troden und einer Referenzelektrode an der Oberfläche und einer Verarbeitungsschaltung im Innern eines Halbleiters.

Bei einem elektrochemischen Analyseverfahren wird ein sog.

Redox- (Re) cycling angewandt. Das Redox- (Re) cycling ist ein bekannter zyklischer Prozess zur Verstärkung von Signalen,

wozu ein Aufbau gemäß Figur 1 dient. Es ist eine Substanz A vorhanden und ersichtlich, dass die oxidierten Spezies Aox an den Arbeitselektroden WRed reduziert werden und dass die redu- zierten Spezies ARed dagegen an den Arbeitselektroden Wox oxi- diert werden. Die Arbeitselektroden WRed und Wox werden auch als Redox-Elektroden für ein sog. Redox-Paar aus den Spezies ARed und Ao, bezeichnet.

Im Einzelnen zeigt Figur 1 einen Schnitt durch einen Teil ei- ner Elektroden-Anordnung mit jeweils mehreren Arbeitselektro- den 2,2 und 3,3 sowie einer Referenzelektrode 5, die sich auf einem Substrat 1 befinden. Das Redox- (Re) cycling führt in den Bereichen der einzelnen Arbeitselektroden 2,2 und 3,3 zu den angegebenen Reaktionen, so dass sich ein Redox- Potential ausbildet. Die Referenzelektrode 5 ist am hochohmi- gen Eingang eines in Figur 1 nicht dargestellten Messverstär- kers angeschlossen, sodass die Spezies Aox und ARed, die von beiden Seiten an die Referenzelektrode 5 herandiffundieren, ein Redox-Potential ausbilden, das sich gemäß der Nernst'schen Gleichung ergibt zu : E = Eo + RT/zF * ln (C (Aox)/C (ARed)) (1) Dabei bedeuten E : Redox-Potential R : Gaskonstante T : absol. Temperatur z : Anzahl der Redox.-Elektronen F : Faraday-Konstante C : Konzentration der Spezies (Aox) und (ARed) Die Erfassung und Auswertung eines solchen Redox-Potentials mittels geeigneter elektrochemischer Messtechnik zwecks Ver- wendung als Referenzpotential beim Redox- (Re) cycling erfor- dert eine hochohmige Referenzelektrode. Mitentscheidend für die Funktion eines solchen Referenzelektroden-Prinzips ist die Tatsache, dass das Redox-Potential nicht von den absolu-

ten Konzentrationen der oxidierten und reduzierten Spezies abhängt, sondern von deren Aktivitäten, d. h. chemischem Kon- zentrations-Verhältnis C (Aox)/C (ARed). Bei einem laufenden, sich im Gleichgewicht befindlichen Redox- (Re) cycling-Prozess ist dieses Konzentrationsverhältnis A (Aox)/C (ARed) gleich 1.

Als Beispiel für ein Redox-Paar sei p-Aminophenol/Chinon- imin genannt : p-Aminophenol Chinonimin Am entsprechenden Redox-Prozess sind 2 Elektronen sowie 2 H+- Ionen beteiligt.

Dieses System kommt z. B. bei Enzym-gekoppelten Nachweisreak- tionen zum Einsatz. Dabei wird das Enzym"Alkalische Phospha- tase"als Label-bzw. Verstärkungs-Substanz eingesetzt. Alka- lische Phosphatase ist in der Lage, p-Aminophenyl-Phosphat in p-Aminophanol und Phosphat zu spalten : O, OH PO O- Alk. Phosphatase p OH H H ) N-H'N-H iN-H iN-H H H H H p-Aminophenyl-Phosphat Das entstehende p-Aminophenol wird am Elektroden-System oxi- diert bzw. das Redox-Paar p-Aminophenol/Chinonimin zykli-

siert. Zu Beginn einer solchen, auf Redox- (Re) cycling basie- renden Nachweisreaktion liegt theoretisch noch kein Chinon- imin, sondern nur kleine Mengen von p-Aminophenol vor, so dass das Konzentrationsverhältnis des Redoxpaars p-Amino- phenol/chinonimin deutlich von 1 verschieden sein würde und gem. Nernst'scher Gleichung eine Verschiebung des Redoxpoten- tials zur Folge haben würde.

Vorteilhaft für die Funktion der Referenzelektrode ist nun aber die Tatsache, dass das Enzym-Substrat p-Aminophenyl- phosphat stets teilhydrolysiert vorliegt und somit Spuren (ca. 0,1 %) von p-Aminophenol vorliegen, die ihrerseits teil- oxidiert sind somit kleine Konzentrationen des Redox-Paares p-Aminophenol/Chinonimin vorliegen.

Aufgrund der logarithmischen Beziehung in Gleichung (1) erge- ben sich selbst bei erheblichen Konzentrationsunterschieden von oxidierter und reduzierter Form nur verhältnismäßig klei- ne Abweichungen des Redox-Potentials.

Letzteres wird an folgendem Beispiel erläutert : Unter der An- nahme, dass das p-Aminophenol/Chinonimin Verhältnis nicht 1, sondern 100/1 wäre, d. h. nur 1 % des p-Aminophenols zu Chi- nonimin oxidiert wäre, so ergäbe sich aufgrund der Nernst'schen Gleichung ein Unterschied des Redox-Potentials und somit der Referenzelektroden-Spannung von lediglich ca.

60 mV. Somit würde eine Abweichung von 60 mV für die beiden Arbeitselektroden resultieren. Der Vorgang des Redox-Recyc- lings wird durch diese Abweichung kaum gestört, da die Span- nungs-Differenz zwischen den beiden Arbeitselektroden (WoX und WRed) ca. 400 mV beträgt und aufgrund des Betriebs der Elektroden im Diffusionsgrenzstrom Variationen dieser Größen- ordnung (60 mV) einen zu vernachlässigenden Einfluss haben.

Das Redox- (Re) cycling wird zumindest in Gang kommen, wodurch sich das Verhältnis von p-Aminophenol und Chinonimin gleich 1 nähert und somit auch die Abweichungen der Referenzelektro- denspannung gegen Null gehen.

Der Einsatz der erfindungsgemäßen Redox-Referenzelektrode ist nicht auf die besondere Situation des Systems p-Aminophenol/ Chinonimin beschränkt. Sie kann für alle enzymgekoppelten Re- dox- (Re) cycling-Prozesse eingesetzt werden. Zur Stabilisie- rung des Redox-Referenzelektrodenpotentials kann man dem En- zymsubstrat eine kleine definierte Menge des beteiligten oder auch beliebigen Redoxpaares zusetzen. Eine kleine Menge des Redoxpaares würde über dessen Konzentrationsverhältnis (= 1) das Redoxpotential festlegen, ohne den analytischen Nachweis zu verfälschen, da die analytische Information aus dem enzymgekoppelten, zeitlichen Anstieg der Konzentrationen gewonnen wird und nicht von deren Anfangskonzentration ab- hängt.

Man kann die erfindungsgemäße Redox-Referenzelektrode auch auf andere, nicht enzymgekoppelte Analyseverfahren anwenden.

Ein erstes Beispiel ist die Messung des Sauerstoff-Partial- druckes PO2. Eine bekannte Methode beruht auf der Reduktion von Sauerstoff (02) und Umsetzung entsprechend Gleichung (2) zu OH-an einer katalytisch aktiven Edelmetallkathode.

1/2 °2 + H20 + 2 e----> 2 OH- (2) Wird an einer Anode, die als zweite Arbeitselektrode ausge- führt ist, ein oxidierendes Potential aufgeprägt, das aus- reicht um das gebildete OH-wieder zu 02 zu oxidieren, wird ein Redox- (Re) cycling-Prozess in Gang gesetzt. Anstelle einer zweiten Arbeitselektrode kann auch die Gegenelektrode verwen- det werden an welcher das nötige Potential durch den Potenti- ostaten automatisch eingestellt wird. Auch hier kann mit ei- ner Redox-Referenzelektrode das zur Auswertung nötige Refe- renzpotential abgegriffen werden.

Ein weiteres Beispiel ist eine Glukosemessung. Dazu wird Glu- kose mit Sauerstoff (02) in Glukonsäure umgesetzt und über einen zyklisierten Prozess Wasserstoffperoxid (H202) erzeugt,

wobei durch Redox- (Re) cycling ebenfalls ein Referenz- Potential zur Auswertung gemessen werden kann.

Figur 2 zeigt eine Ausführungsform für ein Vier-Elektroden- System, bestehend aus den beiden Arbeitselektroden WOX und WRed, die hier speziell als sog. Interdigital-Elektroden 20 und 30 ausgeführt sind, einer Gegenelektrode C, die aus Sym- metriegründen mit zwei elektrisch verbundenen Teilelektroden 41,42 ausgebildet ist, sowie einer Referenzelektrode R.

Unter"Interdigitalelektrode"wird im vorliegenden Zusammen- hang eine Elektrode mit fingerartigen Elektrodenteilen be- zeichnet, wobei zwei Interdigitalelektroden mit den jeweili- gen Fingern kammartig ineinandergreifen können. Dies bedeu- tet, dass die Arbeitselektrode 20 parallele Finger 21,22, ..., 25,... und die Arbeitselektrode 30 parallele Finger 31, 32,..., 35,... enthält.

Die Referenzelektrode 50 ist als eine"Fingerelektrode"mit einem einzelnen Finger 55 ausgebildet und derart in der Dop- pelkammstruktur der Arbeitselektroden 20 und 30 angeordnet, dass der Finger 55 sowohl einem Finger"25 als Teil der Ar- beitselektrode 20 als auch einem Finger"35 als Teilbereich- bereich der Arbeitselektrode 30 benachbart ist. Aus dem De- tail-Ausschnitt der Figur 2 ergibt sich weiterhin eine kon- stante Beabstandung des Referenzelektrodenfingers 55 von die- sen Teilbereichen der Arbeitselektroden 20 und 30. Damit lie- gen exakt symmetrische Verhältnisse vor.

Wie vorstehend erläutert, besteht die Anordnung gemäß Figur 2 aus vier Elektroden, d. h. zwei Arbeitselektroden Wox und WRed, einer Referenzelektrode R in erfindungsgemäßer Platzierung und einer bzw. zwei Gegenelektroden C, die aber elektrisch miteinander kontaktiert sind und insofern eine einzige Elekt- rode darstellen. Eine solche Anordnung mit zwei Arbeitselekt- roden wurde in der Praxis zur Erfassung von Redox-Potentialen erprobt.

In Figur 3 ist die Anordnung gemäß Figur 2 insoweit abgeän- dert, dass anstelle der zweiten Arbeitselektrode 30 aus Figur 2 die Gegenelektrode verwendet wird. D. h., neben der Arbeits- elektrode W, die entsprechend der Arbeitselektrode 20 mit Fi- guren 21,22,..., 25,... ausgebildet ist, hat die Gegen- elektrode 40 eine identische Form mit einzelnen Fingern 41, 42,..., 45,..., wobei in diesem Fall die Arbeitselektrode W und die Gegenelektrode C mit ihren Fingern 21,22,25,... bzw. 42,42,45,... kammartig ineinandergreifen. Der Finger 55 der Referenzelektrode 50 ist den beiden Fingern 25 und 45 der Elektroden 20 und 40 exakt gleich beabstandet.

In der Figur 4 ist eine Elektrodenanordnung dargestellt, die von prinzipiellem Aufbau aus der DE 196 10 115 AI vorbekannt ist. Die Elektrodenanordnung gemäß Figur 4 hat ebenfalls zwei Arbeitselektroden Wox und WRed mit einzelnen Fingern, die hier kreisförmig parallel ausgebildet sind. Dies bedeutet im Ein- zelnen, dass von zwei parallelen und radialen Elektrodenan- schlüssen 120 und 130 einzelne Finger 121,122,... und ein- zelne Finger 131,132,... jeweils gegenläufig parallel ko- axial verlaufen und insgesamt eine Kreisfläche abdecken. Eine solche Elektrodenanordnung ist flächenmäßig kompakt. Um den kreisförmigen Aufbau ist eine ringförmig ausgebildete Gegen- elektrode 140 angeordnet.

Darüber hinaus ist in Figur 4 nunmehr ebenfalls eine Refe- renzelektrode 50 mit einem einzelnen Finger 55 vorhanden, der parallel zwischen den Anschlüssen 120 und 130 der Arbeits- elektroden Wox und WRed radial zum Gesamtsystem verläuft. Der Finger 55 bei der Referenzelektrode ist also Teilbereichen der Arbeitselektroden WRed und Wo, gleichermaßen benachbart und diesen Teilen gleich beabstandet. Dies bedeutet insbeson- dere, dass der Finger der Referenzelektrode nicht in das Zentrum der Anordnung hineinragt.

In Figur 5 ist ein Aufbau im Wesentlichen entsprechend Figur 1 dargestellt, die jeweils wieder mehrere Arbeitselektrode Wox und WRed, eine zugehörige Referenzelektrode R sowie eine Gegenelektrode C auf einem Substrat zeigt, das hier mit 10 bezeichnet ist. Als Substrat 10 dient beispielsweise Silizi- um, das kristallographisch orientiert ist und gleichermaßen Träger von elektrischen Schaltelementen zur messtechnischen Auswertung und/oder Verstärkung der Redox-Potentiale ist.

Dargestellt sind Verstärker 15 bis 17 und Rückkopplungswider- stände 18, wobei insbesondere der hochohmige Operationsver- stärker 15 für die Funktionsweise der Referenzelektrode R von Bedeutung ist, um eine stromlose Messung des Redox-Potentials zu ermöglichen. Die Referenzelektrode R liegt am hochohmigen Eingang des Verstärkers 15, wobei deren Ausgang an die Gegen- elektrode C angeschlossen ist. Über den anderen Eingang des Verstärkers 15 wird das Soll-Referenzpotential URef vorge- wählt.

Mit den weiteren Operationsverstärkern 16 bzw. 17 lässt sich bei Anschluss an die Arbeitselektrode Wox und dem zugehörigen Potential Uox der Spannungsabfall U = R. I" messen und bei Kenntnis des Widerstandswertes R vom Rückkopplungswiderstand 18 die Größe Iox bestimmen. Gleiches gilt für IRed an der Ar- beitselektrode Wred.

Zur Realisierung der Anordnung gem. Figur 3 wird nur eine Ar- beitselektroden-Interdigitalelektrode polarisiert und der daraus resultierende elektr. Strom gemessen. Die zweite In- terdigitalelektrode wird als Gegenelektrode beschaltet, d. h. die Polarisierung dieser Elektrode wird über den Ausgang des Potentiostaten automatisch eingestellt.

Die Anordnung gemäß Figur 5 lässt sich in einfacher Weise zu einem ein-oder zweidimensionalen Array erweitern. Statt Si- lizium sind für das Substrat auch andere Materialien, bei- spielsweise Kunststoff, Glas oder Keramik, möglich. In diesem

Fall ist die Auswerteschaltung aus diskreten Bauelementen aufgebaut.

Wesentlich ist in Figur 5, dass die Referenzelektrode unmit- telbar in eine Auswerteschaltung eingebunden ist, die entwe- der analog oder digital aufgebaut sein kann. Durch die unmit- telbare Anbindung der Referenzelektrode an den hochohmigen Eingang des Verstärkers ist eine weitgehend störungsfreie Messung des Redox-Potentials mittels vorhandener elektroche- mischer Messsignale möglich.

Dies ist von besonderer Bedeutung, weil die sog. Austausch- stromdichten des Redoxpaares an der"ultramicro"Referenz- elektrode sehr'klein sind, d. h. diese Referenzelektrode ist sehr hochohmig und weist eine sehr kleine Kapazität auf. Der Eingang des Verstärkers muss deshalb sehr hochohmig sein, so- wie eine sehr kleine Eingangskapazität aufweisen. Diese For- derung wird z. B. besonders gut von einem MOS-Transistor er- füllt, der direkt unterhalb der Elektrode platziert ist.

Insgesamt bildet das Elektrodensystem mit dem zugehörigen Substrat für elektrochemische Analyseverfahren eine komplette Messanordnung, die außer zum im Einzelnen anhand eines kon- kreten Beispiels beschriebenen Redox- (Re) cycling auch zum Er- fassen von enzymgekoppelten Nachweisreaktionen geeignet ist.