Die folgende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Trehalose aus Lösun¬ gen, bei welchem die Trehalose mit Hilfe eines Adsorbens angereichert wird.

Das Disaccharid Trehalose (α-D-Glucopyranosyl-α-D-Glucopyranosid) besteht aus zwei Glucose-Molekülen, die über a,a- 1,1-Bindung miteinander kovalent verknüpft sind. Treha- lose ist aufgrund ihrer anwendungstechnisch interessanten Eigenschaften von zunehmender Bedeutung für die Industrie. Ein wichtiger Anwendungsbereich ist die Stabilisierung von Proteinen und Peptiden, beispielsweise von Enzymen und Impfstoffen. Bevorzugte Ver¬ wendung findet Trehalose in der Lebensmittelindustrie. Trehalose wird auch als Ersatzstoff für Saccharose aufgrund ihrer reduzierten Süße und ihrer geschmackskonservierenden Ei- genschaften eingesetzt. Darüber hinaus wirkt Trehalose bei Gefrier- und Trocknungsvor¬ gängen stabilisierend. Ein weiteres Anwendungsgebiet liegt im Kosmetikbereich.

Die Herstellung von Trehalose erfolgt bevorzugt auf enzymatischem Wege oder durch Fer¬ mentation mit Hilfe geeigneter Mikroorganismen (Schiraldi, C, et al. (2002). Trehalose Production: Exploiting Novel Approaches. Trends in Biotechnology, vol. 20 (10), Seiten 420-425). Häufig entsteht Trehalose auch als Nebenprodukt bei Fermentationen, die der Herstellung anderer Substanzen dienen (HuIl, S.R., Gray, J.S.S., et al. (1995). Trehalose as a Common üidustrial Fermentation Byproduct. Carbohydrate Research, vol. 266, Seiten 147- 152). Insbesondere bei Fermentationen entstehen, anders als bei chemischen Synthesen, starke verunreinigte Lösungen, die beispielsweise Zellen, Proteine, Lipide, oder andere Zu¬ cker enthalten können.

Die Trehalose muss also aus solchen stark verunreinigten Lösungen angereichert und, je nach Verwendungszweck, weiter gereinigt werden.

Im Stand der Technik sind verschiedene Anreicherungs- und Reinigungsverfahren für Tre¬ halose bekannt.

US 5,759,610 beschreibt ein Verfahren zur Aufreinigung von Trehalose aus Kulturen von Mikroorganismen, umfassend die Schritte Filtration und Zentrifugation, Behandlung mit Aktivkohle, Deionisierung, Reinigung mit Ionenaustauschern, Konzentration zu sirupartigen Produkten, weitere Aufreinigung durch Säulenchromatographien wie Ionenaustauschersäu¬ len-Chromatographie, Aktivkohle-Chromatographie und Silicagelsäulen-Chromatographie, sowie Präzipitieren mit organischen Lösungsmitteln wie Alkohol und Aceton und Filtrieren über geeignete Membranen, und Fermentation durch Hefe oder alkalische Behandlung, um etwaige verbliebene Saccharide zu entfernen oder abzubauen. Für eine weitere Aufreinigung werden beispielsweise Kühlungskristallisation oder Sprühtrocknung vorgeschlagen. Eine Adsorption von Trehalose an ein Adsorbens erfolgt nicht.

JP 07000190 (Tadashi, W., et al.) beschreibt die Isolierung von Trehalose aus festen Rück¬ ständen von Brauerei-Fermentationen. Dabei wird der Rückstand mit Alkohol extrahiert und/oder mit Ultraschall behandelt, um die Trehalose aus dem Rückstand zu extrahieren. Ferner wird das im Rückstand vorhandene Enzym Trehalase durch Hitzebehandlung inakti¬ viert. Die Reinigung erfolgt unter anderem über Ionenaustauschersäulen und eine Aktivkoh¬ lesäule. Die Trehalose wird dabei an den Säulen nicht adsorbiert.

US 5,441,644 beschreibt ein Verfahren, bei welchem Trehalose aus einer Fermentationsbrü- he gereinigt wird. In dem Verfahren erfolgt unter anderem eine Ultrafiltration und eine Ent¬ färbung mit Hilfe von Aktivkohle. Die Trehalose wird dabei an der Aktivkohle nicht adsor¬ biert.

Ein Nachteil der genannten Verfahren scheint zu sein, dass die jeweiligen Adsorbentien lediglich zur Adsorption der unerwünschten Fremdstoffe verwendet werden, nicht jedoch die Trehalose selbst adsorbieren. Da die Extraktions- und Reinigungsschritte an die unter¬ schiedlichen Fremdstoffe angepasst sein müssen, sind sie kompliziert und im industriellen Maßstab nur schwierig anzuwenden. Insbesondere gilt dies für die Reinigung aus Fermenta¬ tionsbrühen, in welchen der Gehalt an Trehalose gewöhnlich weniger als 15 % des Tro- ckengewichtes beträgt (Schiraldi et al. (2002), Trehalose Production: Exploiting Novel Ap- proaches. Trends in Biotechnology, vol. 20 (10), Seite 421).

Gemäß einem anderen Verfahren wurde Trehalose als Nebenprodukt einer Fermentation durch sequenzielle Chromatographie über Aktivkohle und Bio-Gel P-2 gereinigt (HuIl, S.R., Gray, J.S.S., et al. (1995). Trehalose as a Common Industrial Fermentation Byproduct. Car- bohydrate Research, vol. 266, Seiten 147-152). Bei dem Verfahren handelt es sich aber le¬ diglich um ein Nachweisverfahren, nicht jedoch um ein Verfahren, das für die Anwendung im industriellen Maßstab geeignet ist.

US 5,441,644 erwähnt neben dem oben beschriebenen Verfahren ein weiteres Verfahren aus dem Stand der Technik, bei welchem eine trehalosehaltige Acetonitril-Lösung einer Silica- gel-Chromatographie unterworfen wird. In der Schrift wird erwähnt, dass diese chroma- tographischen Verfahren für die Trehalose- Anreicherung oder -Reinigung im industriellen Maßstab jedoch nicht geeignet sind.

Buttersack et al. (Specific Adsorption from Aqueous Phase on Apolar Zeolites, Progress in Zeolite and Microporous Materials, vol. 105, p. 1723-1730, 1997) beschreiben die Bindung bestimmter Mono- und Disaccharide an ausgewählte FAU-, PEA-, und MFI-Zeolithe. Für einzelne Disaccharide wurden dabei sehr unterschiedliche Adsorptionseigenschaften gefun¬ den. Trehalose wurde nicht untersucht.

In einer weiteren Arbeit beschreiben Buttersack et al. die Bindung von Disacchariden an unterschiedliche Y-Zeolithe und dealuminierte Y-Zeolithe (Buttersack et al. (1994). Adsorp¬ tion of Glucose and Fructose containing Disaccharides on Different Faujasites. Studies in Surface Science and Catalysis, vol. 84, p. 1363-1371). Dabei betonten sie die Bedeutung des Fructose-Restes in den untersuchten Disacchariden für die Adsorption an die Zeolithe. Tre¬ halose wurde nicht untersucht und weist auch keinen Fructose-Rest auf.

Ein Nachteil der bisherigen Adsorbentien ist, dass sie sehr allgemeine Adsorptionseigen¬ schaften haben und nicht für das jeweilige Verfahren maßgeschneidert werden können.

Daher besteht Bedarf an Verfahren zur Anreicherung von Trehalose aus Lösungen unter Verwendung besserer Adsorbentien, insbesondere an Adsorbentien, die sich auf das jeweili¬ ge Verfahren maßschneidern lassen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein sol¬ ches Verfahren zur Verfügung zu stellen, insbesondere für den Einsatz in chromatographi- sehen Verfahren. Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das eine Anreicherung von Trehalose aus Fermentationsbrühen, insbesondere aus Fermentationsbrühen aus der Lysin-Produktion, ermöglicht.

Die Lösung der Aufgabe geht aus von dem bekannten Verfahren zur Anreicherung von Tre- halose aus Lösungen mit Hilfe eines Adsorbens. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dann dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorbens ein Alumosilicat ist.

Gegenüber den nach Stand der Technik verwendeten Adsorbentien (z.B. Aktivkohlen und Ionenaustauschern) bieten Alumosilicate, insbesondere Zeolithe, den Vorteil, dass eine grö- ßere Anzahl von Varianten hergestellt werden kann und dadurch das Adsorbens besser auf das Trennproblem maßgeschneidert werden kann. Trehalose kann durch eine Vielzahl von bekannten Verfahren hergestellt werden. Traditio¬ nell wird Trehalose durch fermentative Verfahren erzeugt, wobei mittlerweile auch enzyma- tische Produktionsverfahren etabliert sind (Schiraldi, C, et al. (2002) Trehalose Production: Exploiting Novel Approaches. Trend in Biotechnology, vol. 20 (10), p. 420-425). In Mikro- Organismen wurden 3 enzymatische Hauptrouten zur Trehalose-Synthese entdeckt: (1) ein Phosphorylase-System in Pilzen und Hefe, (2) ein Glucosyltransferase-Hydrolase-System in mesophilen und extremophilen Bakterien und (3) eine Trehalose-Synthase-katalysierte Transglycosiüerung von Maltose zu Trehalose (z.B. JP 09098779, KR99029104).

Der Begriff der Anreicherung ist dem Fachmann bekannt. Gemäß der vorliegenden Erfin¬ dung bezieht sich der Begriff der Anreicherung insbesondere auf die Erhöhung des Anteils von Trehalose im Verhältnis zu unerwünschten Fremdstoffen. Typischerweise entspricht dies dem Anteil von Trehalose am Trockengewicht des Produktes.

In der bevorzugten Ausführungsform bezieht der Begriff der Anreicherung auch die Reini¬ gung von Trehalose mit ein. Der Begriff der Reinigung ist dem Fachmann bekannt Im vor¬ liegenden Zusammenhang ist es insbesondere Ziel einer Reinigung, eine Reinheit von Tre¬ halose zu erreichen, bei der Trehalose im Wesentlichen frei von anderen Substanzen ist. Insbesondere ist damit Trehalose in kristalliner Form gemeint.

Wirtschaftlich sinnvoll ist ein Anreicherungs- oder Reinigungsverfahren nur dann, wenn auch die Ausbeute befriedigend ist. Daher ist es ein weiteres Ziel des vorliegenden Verfah¬ rens, sowohl eine hohe Anreicherung als auch eine hohe Ausbeute zu erreichen.

Im Hinblick auf die Lösung gibt es bezüglich der Lösungsmittel keine besonderen Ein¬ schränkungen, in Frage kommen beispielsweise Wasser oder Acetonitril. Vorzugsweise ist die Lösung eine wässrige Lösung.

Ein Adsorbens im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine feste oder gelartige Substanz, auf deren Oberfläche die Adsorption einer anderen Substanz stattfindet. Der Begriff der Oberfläche bezieht sich dabei auch auf die Innenfläche einer dreidimensionalen Matrix, beispielsweise die inneren Oberflächen des dreidimensionalen Gerüstes eines Zeoliths.

Beispiele für Adsorbentien im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Silicagel (Kieselgel), Aktivkohle und Alumosilicate. Alumosilicate (Aluminosilicate) sind dem Fachmann bekannt. Der Begriff der Alumosilica- te umfasst beispielsweise säureaktivierte Bentonite (Bleicherden) und Zeolithe.

Säureaktivierte Bentonite (Bleicherden) sind Bentonite, deren Smektite (quellfähige Tonmi- nerale) durch Säurebehandlung partiell aufgelöst wurden und die somit eine hohe Oberflä¬ che und ein großes Mikroporenvolumen aufweisen. Bentonite sind Tone, die durch die Verwitterung vulkanischer Asche (Tuffe) entstanden sind und aus den Mineralen Montmo- rillonit und Beidelleit (Mineralgruppe der Smektite) bestehen.

Besonders bevorzugte Alumosilicate im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Zeolithe. In diesem Zusammenhang können auch solche Zeolithe unter die Erfindung fallen, die kein Aluminium enthalten.

Zeolithe sind eine weit verbreitete Gruppe von kristallinen Silicaten, und zwar von wasser- haltigen Alkali bzw. Erdalkali- Alumosilicaten der allgemeinen Formel M2/ZO • Al2O3 • x SiO2 • y H2O, wobei M = I- oder mehrwertiges Metall (meist ein Alkali oder Erdalkali- Kardion) H oder NH4U. a., z = Wertigkeit des Kations, x = 1,8 bis etwa 12 und y = 0 bis etwa 8. Das stöchiometrische Verhältnis von SiO2 zu Al2O3 (Modul) ist eine wichtige Kenngröße der Zeolithe.

Die Kristallgitter der Zeolithe bauen sich aus SiO4 - und AlO4 -Tetraedern auf, die über Sau¬ erstoffbrücken verknüpft sind. Dabei entsteht eine räumlich Anordnung gleich gebauter (Adsorptions-) Hohlräume, die über - untereinander gleich große - Porenöffnungen bzw. Kanäle zugänglich sind. Derartige Kristallgitter vermögen als Sieb zu wirken, welches Mo- leküle mit kleinerem Querschnitt als die Porenöffnungen in die Hohlräume des Gitters auf¬ nimmt, während größere Moleküle nicht eindringen können. Zeolithe werden daher auch als Molekularsiebe bezeichnet. Für die Adsorption spielen auch elektrostatische Wechsel¬ wirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und andere zwischenmolekulare Kräfte eine Rol¬ le. Viele chemische und physikalische Eigenschaften der Zeolithe sind abhängig vom Al- Gehalt.

Der Begriff der Zeolithe gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich sowohl auf natürli¬ che als auch auf synthetische Zeolithe.

Die natürlich vorkommenden Zeolithe sind durch hydrothermale Umwandlung aus vulkani¬ schen Gläsern bzw. Tuff- haltigen Ablagerungen entstanden. Nach ihren Kristallgittern las¬ sen sich die natürlichen Zeolithe einteilen in Faser-Zeolithe (beispielsweise Mordenit, MOR), Blätter-Zeolithe, und die so genannten Würfel-Zeolithe (beispielsweise Faujasit, FAU, und Offretit, OFF). Die unterschiedlichen Zeolithe werden üblicherweise mit Codes aus drei Buchstaben belegt (z.B. MOR, FAU, OFF).

Zur Herstellung der synthetischen Zeolithe geht man von Siθ2-haltigen (z.B. Wassergläser, Kieselsäure-Füllstoffe, Kieselsole) und von Al2θ3-haltigen (z.B. Aluminiumhydroxide, A- luminate, Kaoline) Substanzen aus, die zusammen mit Alkalihydroxiden (meist NaOH) bei Temperaturen von über 50° in wässriger Phase zu den kristallinen Zeolithen umgesetzt wer¬ den.

Für den technischen Einsatz als Adsorptionsmittel können synthetische Zeolithe weiteren Modifizierungen unterworfen werden.

Vorzugsweise sollte der Zeolith eine Porengröße von mindestens 7 Ä aufweisen. Porengrö- ße und Polarität des Zeoliths haben Einfluss auf das Verteilungsgewicht z.B. verschiedener Zucker, wodurch sich z.B. die Trenneigenschaft bei einer chromatographischen Verwen¬ dung ergibt. Aluminiumarme Zeolithe sind in der Regel polarer und damit vorrangig zur Adsorption von Zuckern geeignet.

Wie bereits beschrieben, können Zeolithe gut auf ein Trennproblem maßgeschneidert wer¬ den. Durch die primäre Herstellung kann die Porengröße beeinflußt werden, die Polarität ist dann über eine Nachbehandlung durch Reduzierung des Aluminiumgehaltes variierbar.

Bevorzugte Zeolithe gemäß der vorliegenden Erfindung sind FAU, BEA und OFF. Jeweils vorteilhafte Eigenschaften unterschiedlicher Zeolithe im Rahmen der vorliegenden Erfin¬ dung sind aus Beispiel 1 ersichtlich. Besonders bevorzugt ist OFF.

Die Anreicherung mit Hilfe des Alumosilicates kann grundsätzlich auf zwei verschiedene Weisen erfolgen. Das Alumosilicat kann entweder die unerwünschten Fremdstoffe adsorbie- ren, so dass die Trehalose in der Lösung verbleibt, oder es kann die Trehalose adsorbieren, so dass die unerwünschten Fremdstoffe in der Lösung verbleiben. In beiden Fällen ist es bevorzugt, wenn die Adsorption möglichst selektiv erfolgt.

Als Adsorber können Festbett-, Moving-bed- und Fluidized-bed-Adsorber zur Anwendung kommen. Die Adsorption kann batchweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. In der Ausfiihrungsform, in der die Trehalose an das Alumosilicat adsorbiert wird, ergibt sich eine Reihe von Vorteilen. Die Zahl der notwendigen Aufarbeitungsschritte zur Isolie¬ rung von Trehalose wird durch selektive Anreicherung der Trehalose reduziert (im Gegen¬ satz zu bisherigen Verfahren zur Isolierung von Trehalose, bei denen die häufig sehr unter- schiedlichen unerwünschten Fremdstoffe Schritt für Schritt abgetrennt werden). Die Anzahl der Nebenprodukt-/Abfallströme wird im Vergleich zum schrittweisen Abtrennen der uner¬ wünschten Fremdstoffe reduziert. Die Trehalose liegt aufgrund selektiver Adsorption bereits nach einem primären Anreicherungsschritt mit dem Alumosilicat in hoher Reinheit vor. Durch die verringerte Anzahl von Aufarbeitungsschritten und die reduzierte Anzahl von Nebenprodukt-/Abfallströmen werden die Herstellungskosten reduziert. Ferner kann auch vergleichsweise gering konzentrierte Trehalose durch selektive Anreicherung kostengünstig angereichert werden.

Bevorzugte Alumosilicate sind in dieser Ausführungsform daher Alumosilicate, insbesonde- re Zeolithe, an die Trehalose adsorbiert, vorzugsweise mit hoher Selektivität gegenüber in der Lösung vorhandenen unerwünschten Fremdstoffen binden.

Nach Adsorption der Trehalose an das Alumosilicat kann als weiterer Schritt die Trehalose vom Alumosilicat eluiert werden. Das Eluieren geschieht beispielsweise durch Elution mit Methanol, Ethanol, Wasser, heißem Wasser (50-100 0C), heißem Methanol (50-65 0C), hei¬ ßem Ethanol (50-80 °C), oder anderen geeigneten Elutionsmitteln, beispielsweise Methy¬ lenchlorid, Acetonitril, NMP (N-Methyl-2-pyrrolidon), DMSO (Dimethylsulfoxid), nieder- kettige Ketone oder niederkettige Ether. Niederkettig bedeutet in diesem Zusammenhang eine Kettenlänge von bis zu ClO, bevorzugt bis zu C6, besonders bevorzugt bis zu C4.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Trehalose, bei welchem das Adsorbens im Rahmen einer chromatographischer Auftrennung eingesetzt wird. Bei chromatographischen Verfahren kann die Trehalose über das unter¬ schiedliche Laufzeitverhalten gegenüber anderen in der Lösung vorhandenen Substanzen abgetrennt werden. Dabei entstehen Fraktionen mit Eluaten, die die Trehalose enthalten.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff der Chromatographie alle bekann¬ ten und geeigneten chromatographischen Trennverfahren, beispielsweise Festbett- Chromatographie, moving bed-Chromatographie und simulated moving bed- Chromatographie. Die Chromatographie kann batchweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Eine kontinuierliche Chromatographie kann beispielsweise mit Hufe eines Conti- nuous Rotating Annular Chromatograph (CRAC), eines True Moving Bed Chromatograph (TMBC) oder in eines Simulated Moving Bed Chromatograph (SMB) durchgeführt werden.

Aus dem die Trehalose enthaltenden Eluat kann eine weitere Anreicherung oder Reinigung mittels weiterer geeigneter und dem Fachmann bekannter Verfahren erfolgen.

Beispielsweise kann eine weitere Anreicherung oder Reinigung von Trehalose durch Fäl¬ lung erfolgen. Dabei können entweder gewünschte Wertstoffe oder unerwünschte Fremd¬ stoffe ausgefällt werden. Die Fällung kann unter anderem durch Zugabe eines weiteren Lö- sungsmittels, Zugabe von Salzen oder die Variation der Temperatur eingeleitet werden. Der entstehende Niederschlag von Feststoffen kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren abgetrennt werden.

Beispielsweise können Feststoffe durch Filtration, wie Druck- und Vakuumfiltration, abge- trennt werden. Möglich sind beispielsweise Kuchen-, Tiefen- und Cross-flow-Filtrationen. Bevorzugt wird die Cross-flow-Filtration. Besonders bevorzugt wird dabei die Mikrofiltra- tion zur Abtrennung von Feststoffen > 0,1 μm.

Eine weitere Möglichkeit zur Abtrennung von Feststoffen besteht in Sedimentation und/oder Zentrifugation. Zur Zentrifugation können verschiedenartige Bauformen eingesetzt werden, beispielsweise Röhren- und Korbzentrifugen, im speziellen Schub-, Stülpfilterzent¬ rifugen und Tellerseparatoren.

Als weiterer Anreicherungs- oder Reinigungsschritt kann eine Behandlung mit Aktivkohle oder mit Ionenaustauschern (Anionenaustauschern und/oder Kationenaustauschern) durch¬ geführt werden. Solche Verfahrensschritte sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise US 5,441,644, US 5,858,735, und EP 0 555 540 Al).

Weitere Möglichkeiten zur Anreicherung, insbesondere zur Reinigung, bestehen in der An- Wendung von Mikro- und Ultrafiltration (beispielsweise als Kuchen-, Tiefen- und Cross- flow-Filtrationen) sowie in der Reversosmose. Dabei können u.a. mikroporöse, homogene, asymmetrische und elektrisch geladene Membranen eingesetzt werden, die nach bekannten Verfahren erzeugt werden. Typische Werkstoffe für Membtranen sind Celluloseester, Ny¬ lon, Polyvinylchlorid, Acrylnitril, Polypropylen, Polycarbonat und Keramik.

Der Einsatz der Membranen kann beispielsweise als Plattenmodul, Spiralmodul, Rohrbün¬ del und Hohlfasermodul erfolgen. Daneben ist die Verwendung flüssiger Membranen mög- lich. Die Trehalose kann sowohl feedseitig angereichert und über den Retentatstrom abge¬ führt als auch feedseitig abgereichert und über den Filtrat-/Permeatstrom abgeführt werden.

Zur weiteren Anreicherung von Trehalose, insbesondere der Reinigung und Konfektionie- rung, können verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden eingesetzt werden.

Ein bevorzugtes Verfahren ist dabei die Kristallisation. Kristallisation kann beispielsweise durch Kühlung, Verdampfung, Vakuumkristallisation (adiabate Kühlung), Reaktionskristal¬ lisation und Aussalzen erreicht werden. Die Kristallisation kann z.B. in gerührten und unge- rührten Kesseln, im Direkt-Kontakt- Verfahren, in Verdampfungskristallisatoren, in Vaku¬ umkristallisatoren absatzweise oder kontinuierlich z.B. in Zwangsumlauf-Kristallisatoren (Swenson forced-circulation crystaller) oder Wirbelschicht-Kristallisatoren (Oslo-type). Auch fraktionierte Kristallisation ist möglich.

Die Kristallisation von Trehalose ist dem Fachmann grundsätzlich vertraut und ist, ein¬ schließlich der Kristallisation aus wässrigen Lösungen, ausführlich beschrieben worden (siehe auch Spalten 4 und 5 in US 5,441,644). So kann die Kristallisation beispielsweise durch vorherige Ultrafiltration erleichtert werden.

Eine besonders typische Methode zur Kristallisation von Trehalose ist die Kühlungskristal¬ lisation aus geeigneten Lösungsmitteln, beispielsweise Ethanol, Methanol, Wasser, Methy¬ lenchlorid, Acetonitril, NMP, DMSO, niederkettige Ketone oder niederkettige Ether. Nie- derkettig bedeutet in diesem Zusammenhang eine Kettenlänge von bis zu ClO, bevorzugt bis zu C6, besonders bevorzugt bis zu C4.

Eine andere Kristallisationsmethode ist die Fällungskristallisation. Dabei liegt die Trehalose beispielsweise in Wasser vor und wird dann durch Zugabe eines Lösungsmittels geringerer Löslichkeit, beispielsweise eines niederkettigen Alkohols oder eines niederkettigen Ketons, ausgefällt. Niederkettig bedeutet in diesem Zusammenhang eine Kettenlänge von bis zu ClO, bevorzugt bis zu C6, besonders bevorzugt bis zu C4.

Die Kristallisation kann durch Zugabe geringer Mengen von Trehalose-Kristallen beschleu¬ nigt werden, wobei die Trehalose-Kristalle als Kristallisationskeime dienen.

Weitere Verfahren zur weiteren Anreicherung von Trehalose, insbesondere zur Reinigung und Konfektionierung, ist die Trocknung. Es existieren Verfahren zur Konvektionstrock- nung wie z.B. Trockenöfen, Tunneltrockner, Bandtrockner, Scheibentrockner, Jettrockner, Wirbelschichttrockner, belüftete sowie rotierende Trommeltrockner, und Sprühtrocknung. Ein bevorzugtes Verfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Sprühtrockung. Weitere Verfahren nutzen die Kontakttrocknung, wie z.B. Schaufeltrockner. Ebenso kann Wärmestrahlung (Infrarot) wie auch dielektrische Energie (Mikrowellen) zur Trocknung genutzt werden. Einen weiteren Bereich stellt die Vakuum- bzw. Gefriertrocknung dar. Möglich ist auch die Eindampfung, d.h. eine Trocknung, die zu einer Anreicherung, aber nicht notwendigerweise bis zur Trockne führt.

Ein weiteres Verfahren zur weiteren Anreicherung von Trehalose, insbesondere zur Reini- gung und Konfektionierung, ist die Nanofiltration. Dabei wird die Trehalose ganz oder teil¬ weise auf der Retentatseite zurückgehalten und damit angereichert.

Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass die genannten weiteren Anreicherungsschritte so¬ wohl vor als auch nach der erfindungsgemäßen Behandlung mit dem Alumosilicat erfolgen können.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung von Trehalose aus Lösungen, die der enzymatischen Trehalose-Synthese ent¬ stammen. Enzymatische Trehalose-Synthese ist dem Fachmann bekannt (siehe beispielswei- se Schiraldi et al. (2002), Trehalose Production: Exploiting Novel Approaches. Trends in Biotechnology, vol. 20 (10), Seite 421-425, sowie US 5,919,668 und EP 0 990704 A2).

In einer weiteren Ausführungsform sind die Lösungen Fermentationsbrühen.

Fermentationsbrühen im Sinne der vorliegenden Erfindung entstehen bei der Kultur von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen, insbesondere von Mikroorganismen (beispiels¬ weise Bakterien, Hefen oder andere Pilze).

Bevorzugte Mikroorganismen bei der Synthese von Trehalose sind Saccharomyces spec, insbesondere Saccharomyces cerevisiae; Bacillus spec; Candida spec, insbesondere Candi¬ da fermentii; Escherichia coli; Corynebacterium spec, insbesondere Corynebacterium glu- tamicum, Corynebacterium acetoacidofϊrum (z.B. ATCC 13870), Corynebacterium lilium (z.B. ATCC 15990) und Corynebacterium melaseccola (z.B. ATCC 17965); Pseudomonas spec; Nocardia spec; Brevibacterium spec, insbesondere Brevibacterium lactofermentum (z.B. ATCC 13869), Brevibacterium flavum (z.B. ATCC 14067), und Brevibacterium diva- ricatium (z.B. ATCC 21642); Arthrobacter spec, insbesondere Arthrobacter sulrareis (z.B. ATCC 15170), Arthrobacter citoreus (z.B. ATCC 11624); Aspergillus spec; Streptomyces spec; Microbacterium spec, insbesondere Mikrobacterium ammoniaphylum (z.B. ATCC 15354); Pichia spec; Filobasidium spec, insbesondere Filobasidium floriforme.

Weitere geeignete Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt, siehe beispielsweise Miyazaki, J.-L, et al. (1996)., Trehalose acumulation by a basidiomycotinous yeast, Filo¬ basidium floriforme. Journal of Fermentation and Bioengineering, vol. 81 (4), Seiten 315- 319.

Varianten dieser Stämme, die durch Mutation oder gentechnische Modifikation abgeleitet sind, oder die eine verstärkte Trehalose-Synthesefähigkeit haben, sind auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar.

Die Kultur der Mikroorganismen kann auch unter Zugabe geeigneter Antibiotika erfolgen, beispielsweise zum Induzieren der Trehalose-Synthese durch Zugabe eines ß-Lactam-Ring- Antibiotikums.

Die Fermentationsbrühe enthält dabei zunächst sowohl die Zellen, als auch das Kulturmedi¬ um. Je nach Art der Fermentation kann ein signifikanter Teil der Trehalose intrazellulär akkumulieren. In diesem Fall ist es sinnvoll, die verwendeten Zellen aufzuschließen und die Trehalose mit geeigneten Verfahren zu extrahieren. Geeignete Verfahren, beispielsweise Ultraschall-Behandlung, Behandlung mit Detergentien, alkalische Lyse, und/oder Extrakti¬ on mit Alkohol oder Trichloressigsäure sind dem Fachmann bekannt (JP 07 000 190, US 5,441,644)

In den Fermentationsbrühen finden sich in der Regel erhebliche Mengen an Feststoffen, die vorzugsweise zunächst abgetrennt werden sollten.

Der Begriff der Feststoffe umfasst im vorliegenden Zusammenhang auch Zellen und zellulä¬ re Bestandteile wie Nukleinsäuren und Proteine. Zur Abtrennung von Feststoffen, insbeson- dere von zellulären Bestandteilen, ist es vorteilhaft, diese zunächst zu agglomerieren. Das kann mit beliebigen geeigneten Verfahren erfolgen, allerdings sollte dabei ein Abbau der Trehalose (beispielsweise durch Hydrolyse) weitgehend vermieden werden. Geeignete Me¬ thoden umfassen beispielsweise Alkali-Behandlung, beispielsweise Ca(OH)2-Behandlung, oder Erhitzen. Vorteilhafterweise werden dabei auch möglicherweise vorhandene Enzyme mit Trehalase- Aktivität inaktiviert. Die Abtrennung der Feststoffe kann dann mit dem Fachmann bekannten geeigneten Verfah¬ ren erfolgen. Beispiele für solche Verfahren wurden bereits oben genannt.

Das vorliegende Verfahren ist auch geeignet, Trehalose aus Lösungen, insbesondere Fer- mentationsbrühen, anzureichern, in denen Trehalose in geringen Konzentrationen vorliegt, insbesondere weniger als 15 Gewichtsprozent gemessen am Trockengewicht der Fermenta¬ tionsbrühe.

Typischerweise beträgt die Konzentration von Trehalose zwischen 3 und 8 Gew.-% gemes- sen am Trockengewicht der Fermentationsbrühe. Nach Abtrennung eines anderen Wertpro¬ duktes, beispielsweise Lysin, kann der Massenanteil der Trehalose auf 10-20 Gew.-% ge¬ messen am Trockengewicht der verbleibenden Fermentationsbrühe steigen. Geht man auch von einer Abtrennung der Biomasse als unlösliche Bestandteile aus, dann beträgt die Kon¬ zentration der Trehalose 20-40 Gew.-% gemessen am Trockengewicht der Fermentations- brühe.

Daher betrifft eine weitere Ausführungsform der Erfindung auch ein Verfahren zur Anrei¬ cherung von Trehalose aus Fermentationsbrühen in denen Trehalose in einer Konzentration weniger als 15 Gewichtsprozent gemessen am Trockengewicht der Fermentationsbrühe vor- liegt.

Bei vielen Fermentationen entstehen mehrere Wertprodukte. Häufig entsteht auch Trehalose als weiteres Wertprodukt. Ein Problem liegt jedoch darin, dass Anreicherungs- oder Reini¬ gungsverfahren für fermentativ hergestellte Substanzen speziell an das jeweilige Wertpro- dukt angepasst ist (wie beispielsweise Reinigung über Ionenaustauscherchromatographie bei Aminosäuren oder organischen Säuren), Nach der Anreicherung des ersten Wertproduktes liegen andere Wertprodukte wie Trehalose nämlich in einer Umgebung vor, die die Anrei¬ cherung der weiteren Wertprodukte erschwert. Ein Beispiel sind hohe Ionenkonzentrationen nach Elution von Aminosäuren von Ionenaustauschermatrices). Das ist im Fall von Trehalo- se besonders problematisch, da Trehalose keine speziellen chemischen Eigenschaften hat (wie beispielsweise geringe Löslichkeit in wässrigen Lösungen oder elektrische Ladung), die sich zu einer einfachen Anreicherung eignen. Daher wird die Trehalose häufig mit dem Abfallstrom aus der Fermentation entsorgt.

Es ist daher eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Trehalose als weiteres Wert¬ produkt aus Fermentationsbrühen aufzuarbeiten, aus denen vorher oder nachher ein erstes Wertprodukt aufgearbeitet wurde oder wird. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Anreicherung von Trehalose als einem weiterem Wertprodukt aus Fermentationsbrühen, aus denen mindestens ein erstes Weitprodukt gewonnen wurde oder wird, enthaltend die Schritte Abtrennen von Feststoffen und Anreicherung der Trehalose mit Hilfe eines Adsor- bens, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorbens ein Alumosilicat ist.

Das vorliegende Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass es gegenüber den Eigenschaften der Lösung, in der die Trehalose vorliegt, in besonderem Maße tolerant ist. Daher kann das erfϊndungsgemäße Verfahren auch eingesetzt werden, wenn die Trehalose in einer Umge- bung vorliegt, die die Anreicherung normalerweise erschweren würde.

Umgekehrt wird die Lösung, in der die Trehalose vorliegt, mit dem vorliegenden Verfahren besonders schonend behandelt, so dass auch nach der Anreicherung der Trehalose ein weite¬ res Wertprodukt gewonnen werden kann.

Daher kann die Gewinnung der Trehalose vor, nach, oder gleichzeitig mit dem ersten Wert¬ produkt geschehen.

Wertprodukte im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise organische Säuren, proteinogene und nicht proteinogene Aminosäuren, Nucleotide und Nucleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Co- Faktoren, Speicherstoffe wie beispielsweise PHA (Polyhydroxyalkanoate) oder PHB (PoIy- hydroxybutyrate), sowie Proteine und Peptide (beispielsweise Enzyme).

Ein bevorzugtes erstes Wertprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäure Lysin.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf die von Alumosilicaten, insbesondere Zeolithen, in einem der Verfahren, die in dieser Beschreibung oder den Ausführungsbeispie- len genannt sind.

In den Ausführungsbeispielen werden weitere Verfahren gezeigt, die geeignet sind, Treha¬ lose aus Fermentationsbrühen aufzureinigen, aus welchen vorher ein anderes Wertprodukt gewonnen wurde.

Die Zeichnungen und Beispiele dienen der näheren Illustration der Erfindung. Die anliegenden Zeichnungen zeigen in

Fig. 1 die Selektivität (s) von Zeolithen für Saccharose (sac) und Maltose (malt) relativ zu Trehalose (tre).

Fig. 2 die Selektivität (s) für Saccharose (sac) und Maltose (malt) relativ zu Trehalose, in Bezug zur Porengröße (p) ausgewählter Zeolithe

Bestimmung der Porengröße: Raumfüllende atomzentrierte Kugeln werden ver- wendet, um die van der Waals- Volumina für die Atome darzustellen, wobei die Radien der Kugeln den van der Waals-Radien entsprechen, wie sie im MSI Pro¬ gram Materials Studio definiert sind. Ein Vergrößerungsfaktor von 0,9 wird auf die van der Waals-Radien der Atome in der Zeolith-Pore angewendet und ein Helium Atom wird dann im Zentrum der Pore platziert. Der Vergrößerungsfak- tor für den Helium van der Waals-Radius wird von Hand optimiert, bis das ver¬ größerte raumfüllende Volumen des Helium- Atoms mit den raumfüllenden Vo¬ lumina der Zeolith-Pore in Kontakt kommt. Dieser Helium- Vergrößerungsfaktor wird als Vergrößerungsfaktor der Pore (Porengröße) verwendet.

Fig. 3 die Selektivität (s) für Kohlenwasserstoffe in Bezug zur Porengröße (p) ausge¬ wählter Zeolithe

Beispiel 1

Um die Diffusion von Zuckern in verschiedenen Zeolithen quantitativ zu vergleichen, wer¬ den theoretische Berechnungen durchgeführt. Dabei werden konventionelle molekulardy¬ namische Simulationen entlang einer Diffusionskoordinate durchgeführt. Dabei wird die Diffusionskoordinate durch eine kleine treibende Kraft bestimmt, die entlang der Achse der weitesten Pore beziehungsweise des weitesten Kanals angelegt wird. Dies simuliert den Effekt eines Konzentrationsgradienten.

Zunächst wird untersucht, ob die Simulation qualitativ richtige Ergebnisse liefert. Dazu werden die errechneten Diffusionszeiten für Maltose und Saccharose in FAU und BEA mit experimentellen Messungen verglichen. Gemäß den Berechnungen diffundiert Maltose deutlich langsamer als Trehalose und Saccharose durch FAU (siehe Tabelle 1). Dies ist in Übereinstimmung mit den experimentellen Daten, die zeigen, dass Maltose eine deutlich niedrigere Adsorptionsfähigkeit hat als Saccharose.

Für BEA wird errechnet, dass Saccharose im Rahmen der verwendeten Zeitskala überhaupt nicht durch den Zeolithen wandert (siehe Tabelle 2). Dieser Effekt (keine Adsorption) ist ein allgemeines Kennzeichen für andere 1-2 Fru-Disaccharide, die experimentell gemessen wrrden. Aus diesen Ergebnissen für BEA und FAU wird geschlossen, dass die Berechnung qualitativ korrekte Vorhersagen für die relative „Löslichkeit" von Maltose und Saccharose in FAU und BEA liefert.

Zunächst wird eine Liste von Kandidaten für geeignete Zeolithen zur Trennung von Treha- lose, von Maltose und Saccharose gebildet (Tabelle 1).

Tabelle 1: Tatsächliche Zusammensetzung Berechnete Zusammensetzung DON [Si6401283.2(Cp*)2 CoFo.75(OH)o.25) Si64O128 EMT Na21(18-CrOWn-O)n[Al21Si75O192] Al21Si75O192 CFI [Si32O64] Si32Oö4 MOR Na8[Al8Si4OO96J^H2O Si4OO96 MAZ (Na2,K2,Ca,Mg)5[AlioSi26θ72].28H20 Al10Si26O72 OFF (Ca,Mg)i.5K[AUSii4O36].14H2O Si18Os6 FAU (Na25Ca5Mg)29[Al58Si134O384]^O H2O Al96Si96O384 BEA Nan[AlnSi64-11Oi28] Si64Oi28

Molekulardynamische Simulationen werden dann mit diesen Zeolithen für alle 3 Zucker durchgeführt. Auf diese Weise kann die relative Selektivität der Zucker im Hinblick auf die Diffusion durch die entsprechenden Kanäle berechnet werden.

Die molekulardynamischen Kraftfeldsimulationen werden in einem mikrokanonischen En¬ semble bei 298 K durchgeführt. Die relativen Zeiten werden für Moleküle gemessen, die durch eine elektrostatische Kraft durch eine Pore in der Zeolithenstruktur getrieben werden. Die Kraft wird dadurch generiert, dass die Koordinaten eines geladenen Heliumatoms auf der gegenüberliegenden Seite der Pore des Moleküls fixiert werden, wobei das Molekül dann gleichmäßig auf jedem Atom mit einer entsprechenden Gegenladung beladen wird. Zum Beispiel wird den 5 Atomen der Trehalose, die dem Helium am nächsten sind, jeweils eine Ladung von -0,3 q zugeordnet, während das Heliumatom eine Ladung von +1,5 q hat. Die verbleibenden Atome in dem System sind ungeladen. Die Selektivität in Fig. 1 wird gemäß der folgenden Formel berechnet:

Selektivität = ?7>eftαtoe , wobei tZucker= 8000 ps, wenn tZucker > 8000 ps t Z. ucter

Die errrechneten Diffusionszeiten für die Zucker sind in Tabelle 2 aufgelistet.

Tabelle 2:

Trehalose Saccharose Maltose FAU 1500 2400 8000 BEA 1500 8000 3900 DON 2400 4400 2700 EMT 5100 4500 3000 CFI 1700 1200 1200 MOR 2400 1600 1950 MAZ 1800 1700 1800 OFF 2000 8000 8000

Eine graphische Darstellung der Selektivität ist in Fig. 1 dargestellt. Aus Fig. 1 wird deut¬ lich, dass die einzelnen Zeolithe unterschiedliche Fähigkeiten haben, Trehalose aus einer Mischung von Zuckern zu trennen. Am vielseitigsten scheint OFF (Offretit) zu sein, wel¬ ches kein Aluminium enthält und Trehalose deutlich gegenüber den anderen beiden Zuckern bevorzugt. FAU und BEA zeigen ebenfalls eine hohe relative Selektivität für Trehalose, zeigen aber auch eine gewisse Selektivität für Saccharose und Maltose.

Beispiel 2 Anreicherung von Trehalose durch Fällung mit Calciumhydroxid, Zentrifugation anschlie- Bender Aktivkohlebehandlung und Trocknung des Rückstandes

1 L Lysin-Fermentationsbrühe werden nach Abtrennung des Lysins auf einem Ionentau- scher mit 250 g festem Calciumhydroxid versetzt. Nach 4-stündigem Rühren wird die Sus¬ pension in einer Laborzentrifuge 10 min mit 3000 g zentrifugiert. Durch dieses Vorgehen werden aus der tief braunen Fermentationsbrühe 800 mL eines gelblich gefärbten Überstands gewonnen, der 7,6 g der ursprünglich eingesetzten 8 g Trehalose enthält. Zur weiteren Rei¬ nigung dieses Überstandes werden 400 g pulverisierte Aktivkohle zugegeben. Nach 12- stündiger Inkubation bei RT wird die Aktivkohle über einen Faltenfilter abgetrennt. Dabei werden 650 mL eines leicht gelblichen Filtrats gewonnen, welches insgesamt 6,3 g Trehalo- se enthält. Abschließend wird das Filtrat gefriergetrocknet. Der verbliebende Rückstand von 9,7 g hat einen Trehalosegehalt von 64,9 Gew%.

Beispiel 3 Anreicherung von Trehalose durch Fällung mit Calciumhydroxid, Filtration, anschließender Aktivkohlebehandlung und Trocknung des Rückstandes

Im Gegensatz zu Beispiel 2 werden nach der Calciumhydroxidfällung die gebildeten Fest¬ stoffe durch Filtration abgetrennt. Dadurch werden 730 mL eines gelblich gefärbten Filtra- tes gewonnen. Das weitere Vorgehen erfolgt analog zu Beispiel 2, wodurch 8,7 g Trocken¬ rückstand mit 66,2 Gew% Trehalosegehalt gewonnen werden können.

Beispiel 4 Anreicherung von Trehalose durch thermisch induzierte Fällung, Cross-Flow-Filtration, anschließende Aktivkohlebehandlung und Trocknung des Rückstandes

Beispiel 5 Anreicherung von Trehalose durch Fällung mit Calciumhydroxid, Zentrifugation anschlie¬ ßender Aktivkohlebehandlung und Trocknung des Rückstandes (Brühe aus neuer Aufarbei¬ tung)

I L Lysin-Fermentationsbrühe werden nach Abtrennung des Lysins auf einem Ionentau- scher (Trehalosegehalt: 11 g/L) mit 100 g festem Calciumhydroxid versetzt. Nach 4- stündigem Rühren wird die Suspension in einer Laborzentrifuge 10 min mit 3000 g zentri- fugiert. Zu den hierdurch erhaltenen 800 mL eines dunkelbraun gefärbten Überstands wer¬ den 20 g Aktivkohle gegeben und 19 h bei RT inkubiert. Die Aktivkohle wird durch Filtra- tion abgetrennt. Das Filtrat enthält 8.9 g Trehalose. Durch Eindampfen im Vakuum werden 72.6 g eines dunkelbraunen, klebrigen Rückstands mit einem Trehalosegehalt von 10.4 Gew.-% erhalten.

Beispiel 6 Anreicherung von Trehalose durch Adsorption auf Aktivkohle und Desorption mit Metha¬ nol 100 mL einer Trehalose enthaltenden Feπnentationsbrühe (Gehalt 9.76 g/L) werden mit 10 g Aktivkohle (CPG 12x40) 16 h bei RT geschüttelt. Nach Absaugen über eine Schlitz- siebnutsche wird die Aktivkohle mit 100 mL Methanol 60 h bei RT geschüttelt. Nach erneu¬ tem Abfiltrieren wird das Filtrat am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der brau- ne Rückstand von 1.1 g enthält 300 mg Trehalose (27 Gew.-%).

Beispiel 7 Anreicherung von Trehalose durch Adsorption auf Aktivkohle und Desorption mit Ethanol unter Kühlungskristallisation

300 mL einer Trehaloselösung (Gehalt 9.25 g/L) werden mit 20 g Aktivkohle 18 h bei RT geschüttelt. Nach Absaugen über eine Schlitzsiebnutsche wird die Aktivkohle mit 300 mL Ethanol versetzt und 15 h unter Rückfluß gerührt. Die Aktivkohle wird heiß abfiltriert und das Filtrat auf 0-5 °C abgekühlt, wobei die Trehalose auskristallisiert. Nach Absaugen wer- den 1.3 g Trehalose als leicht graue Kristalle erhalten, das Filtrat wird am Rotationsver¬ dampfer bis zur Trockne eingeengt und enthält 0.1 g Trehalose als weiße Kristalle.

Die Aktivkohle wird nach der Filtration 16 h bei RT mit 300 mL MeOH geschüttelt, abfilt¬ riert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt, dadurch werden weitere 0.5 g Tre- halose als fast weiße Kristalle erhalten.

Beispiel 8 Anreicherung von Trehalose durch Adsorption auf Kieselgel und Desorption mit Methanol

100 mL einer Trehalose enthaltenden Fermentationsbrühe (Gehalt 14 g/L) werden mit 10 g Kieselgel (MR3482) 19 h bei RT geschüttelt. Nach Absaugen über eine Glasfilternutsche wird das Kieselgel mit 100 mL Methanol 16 h bei RT geschüttelt. Nach erneutem Abfiltrie¬ ren wird das Filtrat am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der braune Rückstand von 1.5 g enthält 110 mg Trehalose (7 Gew.-%).