L'invention se rapporte à une nouvelle souche de microalgue appartenant au genre Monodus, particulièrement adaptée à la production d'acides gras en mode de culture mixotrophe.

Cette nouvelle souche de Monodus est utile pour produire de ΙΈΡΑ (acide éicosapentaénoïque) en mode mixotrophe, notamment en présence d'un apport discontinu de lumière sous forme de flashs.

Préambule

Il est rappelé que les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.

Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins, qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres.

La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont strictement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matière organique ne leur est pas favorable et tend même à inhiber leur croissance.

Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre-elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à- dire en exploitant la matière organique.

D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.

Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme co-existent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6 :87-102].

A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que celles-ci recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639:153-171].

Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.

Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés de la série des omégas 3 (AGHI ou PUFA-u>3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA, C20:5 ω3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6 ω3) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques [Horrocks L.A. et al. (2000) Health Benefits of DHA. Pharmacol. Res. 40: 211-225].

Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, intégration dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive.

De nouvelles sources d'EPA et de DHA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés. Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante, et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol.

Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt.

La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Il existe des variations importantes parmi les différentes espèces des différentes classes composant ces phylums en ce qui concerne la teneur des microalgues en acides gras polyinsaturés. Par ailleurs, les proportions relatives d'EPA et de DHA dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture.

Les principales microalgues d'intérêt, productrices d'EPA et de DHA sont des espèces marines. Cependant, parmi les centaines de milliers d'espèces de microalgues marines, seul un faible nombre présentent une teneur élevée de ces deux acides gras à la fois et une capacité suffisante à être cultivée in vitro. Les espèces d'intérêt sont principalement des Bacillariophytes (ou diatomées) issues du phytoplancton marin. Elles se caractérisent généralement par une production active d'EPA, mais souvent par des teneurs assez faibles en DHA.

Bien que riches en acide α-linolénique (C18:3 UJ3), les microalgues d'eau douce ne contiennent généralement pas d'EPA, ni de DHA. Les seules microalgues d'eau douce capables d'en produire semblent à ce jour faire partie de la famille des Pleurochloridaceae, notamment chez les espèces du genre Monodus [Pencreac'h et al. (2004) Les microalgues marines : source alternative d'EPA et de DHA, Lipides, 11(2) :118-222].

Les demandes de brevet japonais JP9252764 et JP60087798 décrivent ainsi des souches de Monodus subterraneus cultivées en mode autotrophe pouvant accumuler une quantité d'EPA allant jusqu'à 3,8 % de leurs poids sec. Ces souches ont été cultivées en conditions de laboratoire, c'est-à-dire dans des milieux de culture inorganiques, en flacons ou en bioréacteurs de faible capacité volumétrique avec un apport lumineux continu.

Dans la perspective d'une exploitation industrielle, un tel mode de culture s'avère inadapté. En effet, pour être rentable, la production de biomasse doit pouvoir être réalisée dans des photo-bioréacteurs fermés de grande dimension. Or, un tel mode de culture est difficile à réaliser en mode autotrophe, car lorsque la densité des cellules augmente dans le milieu de culture, les cellules ont de plus en plus de difficulté à capter la lumière provenant de l'extérieur du réacteur. Il est alors nécessaire de brasser activement le milieu de culture, ce qui nécessite une importante dépense énergétique.

Une alternative à la culture en mode autotrophe serait de pratiquer les cultures en mode hétérotrophe, c'est-à-dire en l'absence de lumière avec un apport d'énergie sous forme de substrats carbonés, ou bien, en mode mixotrophe, c'est-à-dire avec un apport de lumière de moindre intensité et en présence d'un apport de substrat organique.

Cependant, les souches de Monodus existantes, ainsi que les procédés de culture s'y rapportant, sont très peu adaptés aux cultures en mode mixotrophe, et encore moins hétérotrophe, de ce genre de microalgues.

Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de microalgue du genre Monodus, cultivables en mode mixotrophe, permettant, dans les conditions de la présente invention, une production optimale d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA.

Une souche (FCC 757) représentative des nouvelles souches de Monodus ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, le 27 mai 2011 sous le numéro d'accession CCAP 843/3.

Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement discontinu, notamment sous forme de flashs.

L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures, perçue généralement comme stressante pour les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Monodus une production élevée d'acides gras polyinsaturés. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle d'acides gras polyinsaturés, en particulier d'EPA, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes de culture autotrophes.

Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.

Description détaillée

La présente invention a donc pour objet un procédé d'enrichissement de microalgues du genre Monodus en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en EPA, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une microalgue du genre Monodus en mode mixotrophe.

La culture en mode mixotrophe de cette microalgue s'effectue préférentiellement en présence d'au moins 5 mM, de préférence au moins 10 mM, plus préférentiellement au moins 20 mM, et encore plus préférentiellement plus de 50 mM d'un substrat carboné. L'homme du métier sait déterminer les concentrations maximales du substrat carboné à utiliser. Généralement la culture en mode mixotrophie de cette microalgue peut s'effectuer en présence de 10-200mM, de préférence entre 20 et 50mM de substrat carboné. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante du substrat carboné dans le milieu de culture. L'homme du métier sait déterminer les concentrations du substrat carboné à ajouter à la culture pour maintenir une concentration constante du substrat carboné dans le milieu de culture. Généralement, la culture peut s'effectuer ainsi avec des concentrations cumulatives de substrat carboné de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM.

Le substrat carboné comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol. Un substrat carboné particulièrement préféré est l'acétate de sodium.

Le substrat carboné contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention.

Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre de nouvelles souches de microalgues du genre Monodus (Phylum: Xanthophycées, Ordre: Mischococcales, Famille: Pleurochloridaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans un milieu minéral, par exemple le milieu BG11 [Allen, M. M. & Stanier, R.Y. 1968. Growth and division of some unicellular blue-green algae. J. Gen. Microbiol. 51 : 199-202] dans lequel est ajouté un substrat carboné. De préférence, le substrat carboné comprend du glycérol, dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM. Ces nouvelles souches de Monodus peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention décrit plus loin.

Une souche représentative des souches de Monodus selon l'invention est la souche FCC 757 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, le 27 mai 2011 , sous le numéro CCAP 848/3. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives d'EPA quand elles sont cultivées en mode mixotrophe.

Selon les analyses taxonomiques en cours, la souche CCAP 848/3 appartiendrait à l'espèce Monodus subterraneus. Néanmoins, compte tenu de sa filiation avec d'autres espèces de Monodus, l'invention porte sur toute espèce de microalgue du genre Monodus ayant un caractère mixotrophe, telle que décrite dans la présente demande.

A la connaissance du demandeur, les souches de Monodus isolées selon l'invention sont les premières décrites comme pouvant produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives d'EPA pouvant représenter plus de 10 % des lipides totaux contenus dans les microalgues.

La biomasse obtenue est par ailleurs généralement de 10 à 50 %, plus souvent de 20 à 40 %, supérieure à celle de la même culture effectuée en mode autotrophe.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Monodus en mode mixotrophe, notamment en vue de produire des acides gras polyinsaturés, tels que ΙΈΡΑ.

Ce procédé de culture s'avère particulièrement avantageux lorsqu'on cultive les microalgues en présence d'un apport lumineux variable ou discontinu, autrement dit lorsque le flux de lumière apporté aux algues en culture est variable ou discontinu au cours du temps.

Contrairement aux idées reçues, il est apparu qu'un éclairement variable ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer en partie, par le fait que, dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement.

Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.

Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs, c'est-à-dire sur des périodes de courtes durées. Les phases successives d'éclairement sont alors généralement comprises entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.

Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, et que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de lumière peut être périodique, cyclique, voire aléatoire.

Selon l'invention, l'éclairement peut varier de manière continue, c'est- à-dire que l'intensité lumineuse n'est pas constante et varie en permanence au cours du temps (dpmol(photons)/dt≠ 0).

Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.

L'invention vise, en particulier, un procédé de culture de microalgues du genre Monodus, caractérisé en ce que lesdites algues sont cultivées dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude égale ou supérieure à 10 pmol. m ^'2 , s ^"1 à raison de plusieurs fois par heure, de préférence égale ou supérieure à 50 pmol.m ^"2 . s ^"1 , plus préférentiellement égale ou supérieure à 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Le point commun de ces différents modes d'éclairement, discontinu ou variable, réside dans le fait que, selon l'invention, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 ), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement supérieure à 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 , préférentiellement supérieure ou égale à 20 pmol. m ^"2 . s ^"1 , plus préférentiellement supérieure ou égale à 50 μητιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Autrement dit, l'intensité lumineuse atteint, chaque heure, de préférence plusieurs fois dans l'heure, une valeur haute et basse, dont la différence est égale ou supérieure à celle indiquée ci-dessus. De préférence, ladite intensité lumineuse atteint successivement les valeurs 50 μηηοΙ. m ^"2 , s ^"1 et 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 à chaque heure, plus préférentiellement les valeurs 0 et 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 , plus préférentiellement encore les valeurs 0 et 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 .

Il est rappelé que 1 pmol. m ^"2 , s ^"1 correspond à 1 μΕ m ^"2 , s ^"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.

L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.

Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA.

Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches de Monodus à caractère mixotrophe, similaires à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés.

Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs des étapes suivantes : - la culture de différentes souches du genre Monodus dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie préférentiellement d'une amplitude égale ou supérieure à 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 à raison d'au moins une fois par heure;

- le maintien de ladite culture sur plusieurs générations;

- l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.

Pour réaliser le criblage des souches, différentes souches de Monodus peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et aux substrats carbonés, offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'EPA).

Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'un pool de microalgues diversifié et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue ou variable avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.

Le procédé de culture selon l'invention se caractérise plus particulièrement en ce que la culture des souches s'effectue sur plusieurs générations, de préférence en mode mixotrophe, et en ce qu'on récolte les cellules chargées en lipides. L'invention a donc également pour but la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Monodus à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier ΙΈΡΑ.

Les méthodes d'extraction sélective de ΙΈΡΑ et du DHA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:911-917].

L'invention porte également sur les microalgues du genre Monodus enrichies en acides gras polyinsaturés, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 30 %, souvent plus de 40 % et parfois même plus de 50 % d'EPA en poids sec.

Exemple

Culture des souches de Monodus en bioréacteur

Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 23°C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au minimum = 100 rpm et au maximum = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité, ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés par un automate dédié et supervisé par station informatique.

Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée en continue à 100 μΕ m-2 s-1. Pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu BG11 supplémenté avec 10mM en NaHCO ₃ . Le carbone organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est l'acétate de sodium à des concentrations entre 20 mM et 50 mM. Le substrat organique carboné est rajouté au milieu de culture en mode « fed-batch ».

Suivi des cultures

La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage à l'étuve sous vide, 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée).

Concernant la quantification des lipides totaux, 10 ⁷ cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:911-917].

Lumière en flash

L'apport de la lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des puises entre 10 et 100 uE. L'intensité lumineuse du système flash utilisé en mixotrophie est égale à celle utilisée en autotrophie (témoin).

Souche Monodus Mixotrophie Mixotrophie

Subterraneus en flash

Biomasse (% par rapport + 250% + 300%

à l'autotrophie)

Lipides totaux +20% +35%

(% par rapport

à l'autotrophie)

EPA (% par rapport +10% +40%

à l'autotrophie)