以下、本発明の好適な実施形態について� ��細に説明する。

 先ず、本発明にかかる用語について説明� ��る。

 本発明における「PKC-iota」とは、由来と� �る生物種は特に限定されず、例えば、ヒト� �サル、マウス、ラット、イヌ又はウサギ由� �のPKC-iotaが挙げられる。中でも、評価される 化合物の投与対象がヒトであることから、ヒ トPKC-iota遺伝子であることが好ましい。

 また、本発明に係るPKC-iota遺伝子には、PK C-iotaと同等の生理機能を有し、キナーゼ活性 を有するものであれば1又は2以上の塩基の置� ��、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含ま� ��る。ここで、当該遺伝子としては、かかる� ��ンパク質をコードする遺伝子であればその� ��列は特に制限されないが、相同性が90%以上( 例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、99%以� �)であることが好ましい。

 また、本発明に係るPKC-iota遺伝子には、PK C-iota遺伝子とストリンジェントな条件下でハ イブリダイズする核酸も含まれる。ここで、 「ストリンジェントな条件でハイブリダイズ する」とは、二つの核酸断片が、Molecular Clon ing:A Laboratory Manual、第2版、コールドスプリ� ��グハーバー(1989)、9.47-9.62及び11.45-11.61に記� �されたハイブリダイゼーション条件下で、� �互にハイブリダイズすることを意味する。� �り具体的には、例えば、約45℃にて6.0×SSCで� ��イブリダイゼーションを行った後に、50℃� �て2.0xSSCで洗浄する条件が挙げられる。スト� ��ンジェンシー選択のため、洗浄工程におけ� ��塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーと� ��ての約2.0xSSC、50℃から、高ストリンジェン� ��ーとしての約0.2×SSC、50℃まで選択すること ができる。さらに、洗浄工程の温度を低スト リンジェンシー条件の室温、約22℃から、高� ��トリンジェンシー条件の約65℃まで上昇さ� �ることができる。

 また、本発明に係るPKC-iotaタンパク質に� �、PKC-iotaと同等の生理機能を有し、キナーゼ 活性を有するものであれば1又は2以上のアミ� ��酸の置換、欠失、付加又は挿入があるもの� ��含まれる。ここで、当該タンパク質の配列� ��特に制限されないが、相同性が80%以上であ� ��ことが好ましく、90%以上(例えば、91、92、93 、94、95、96、97、98、99%以上)であることがよ� ��好ましい。

 本発明者らは、PKC-iotaの発現を阻害する� �とにより変異型p53又はPI3キナーゼを有する� �胞の増殖が抑制されることを見出した。p53� �はPI3キナーゼの発現量は細胞の癌化と密接� �関連があることが知られている。従って、PK C-iotaの発現量や活性を測定することにより、 p53又はPI3キナーゼに異常を有する癌の検出を することが可能となる。また、PKC-iotaの発現� ��とp53の変異又はPI3キナーゼの発現量ととの� ��に相関があることから、p53又はPI3キナーゼ� ��発現量の異常を原因とするp53又はPI3キナー� ��の機能異常による細胞の癌化とPKC-iotaの発� �又は活性とは密接な関係を示す。従って、PK C-iotaを創薬の標的としてPKC-iotaに作用する化� ��物等を探索することにより、抗癌剤を得る� ��とが可能となる。

 ここで、本発明に係る「p53の機能異常」� ��は、p53遺伝子における塩基の欠失(例えばナ ンセンス変異)、置換(例えば、ミスセンス変� ��、ポイントミューテーション)、挿入、フレ ームシフト等を原因とするものが考えられる が、本発明の対象としては、機能異常の原因 は特に限定されず、これらのいずれが機能異 常の原因であってもよい。

 また、p53の機能異常の具体例としては、p 53タンパク質の転写活性が低下又は活性化す� ��場合や、転写が全く起こらない場合が挙げ� ��れるが、活性には異常を認めないがコード� ��れる遺伝子には変異を生じている場合も含� ��れる。具体的には、例えば、p53との関与が� ��唆されているLi-Fraumeni Syndrome(Science、第250� �、1233頁、1990年)、肝細胞癌(Nature、第350巻、3 77頁、1991年)、骨原性肉腫(Proc Natl Acad Sci US A、第84巻、7716頁、1987年)、横紋筋肉種(Proc Na tl Acad Sci USA、第87巻、5863頁、1990年)、結腸� ��(Science、第244巻、217頁、1989年)、肺癌(Science� ��第246年、491頁、1989年)、グリア芽細胞腫(Am.� �J. Hum. Genet.、第47巻(suppl.)、A4、1990年)、食� �癌(Proc Natl Acad Sci USA、第87巻、9958頁、1990� ��)、膀胱癌(Science、第252巻、706頁、1991年)、� �平上皮癌(Proc Natl Acad Sci USA、第88巻、10124� ��、1991年)、子宮頚癌(Lancet、第339巻、1070頁、 1992年)、肺癌(Proc Natl Acad Sci USA、第89巻、72 62頁、1992年)、白血病・リンパ腫(J Clin Invest. 、第90巻、653頁、1992年)が挙げられる。

 また、本発明に係る「PI3キナーゼの機能� ��常」とは、PI3キナーゼ遺伝子における塩基� ��欠失(例えばナンセンス変異)、置換(例えば� ��ミスセンス変異、ポイントミューテーショ� ��)、挿入、フレームシフト等を原因とするも のが考えられるが、本発明の対象としては、 機能異常の原因は特に限定されず、これらの いずれが機能異常の原因であってもよい。

 また、PI3キナーゼの機能異常の具体例と� ��ては、PI3キナーゼの活性が低下又は活性化� ��る場合や、リン酸化が全く起こらない場合� ��挙げられるが、活性には異常を認めないが� ��ードされる遺伝子には変異を生じている場� ��も含まれる。具体的には、例えば、子宮内� ��癌、腸癌、乳がん、卵巣癌、が挙げられる� ��

 本発明における「被検組織」とは、癌の� ��査対象となる生体から抽出可能な組織であ� ��、p53の関与を検討する必要のある癌組織や� ��癌診断の必要があると認められる組織であ� ��ばその種類は特に限定されない。かかる組� ��の例としては、ヒトの各種組織のほか、例� ��ば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭� ��部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫� ��口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺� ��、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大� ��癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道� ��、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、� ��巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性� ��患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫� ��、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部� ��腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄� ��形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫が� ��われる組織が挙げられる。

 また、本発明における「被検細胞」も同� ��に、癌の検査対象となる生体から抽出可能� ��組織であり、p53の関与を検討する必要のあ� ��癌組織由来の細胞や、癌診断の必要がある� ��認められる組織由来の細胞であればその種� ��は特に限定されない。かかる細胞の例とし� ��は、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳� ��瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴� ��経鞘腫、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺� ��、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食� ��癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫� ��、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、� ��臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌� ��絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣� ��細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色� ��、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血� ��、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リン� ��浮腫が疑われる細胞が挙げられる。

 (1)化合物の評価
 PKC-iota遺伝子又はタンパク質を用いて、PKC-i otaに作用する化合物の評価をすることができ る。PKC-iotaに対する作用を検出する方法とし� ��、被検化合物のPKC-iotaに対する特異的結合(� ��えば、酵素活性の阻害を生じる結合)を検出 する方法、被検化合物の接触によって変化し た遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当 該接触によって生じた細胞内情報伝達物質の 活性又は発現レベルを測定する方法が挙げら れる。以下、順に説明する。

 先ず、被検化合物のPKC-iotaに対する特異� �結合を検出することにより、被検化合物を� �価する方法について説明する。

 本発明の第1の化合物の評価方法は、PKC-iota� ��伝子を導入し、PKC-iotaを発現する細胞を調� �する工程と、当該細胞に被検化合物を接触� �せる工程と、当該PKC-iotaに対する当該被検化 合物の特異的結合を検出する工程と、を含む ことを特徴とする。
本発明の化合物の評価方法において、被検化 合物としては特に制限はなく、具体的には、 例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合 物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、 並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブ ラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上 清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植 物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出 物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることが できる。上記被験試料は必要に応じて適宜標 識して用いることができる。標識としては、 例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げること ができる。また、上記被験試料に加えて、こ れらの被験試料を複数種混合した混合物も含 まれる。

 また、「特異的結合」とは、PKC-iotaと被� �化合物との結合であって、被検化合物がPKC-i otaに結合することにより、PKC-iotaの活性及び/ 又は発現に影響を与えるような結合をいう。

 また、PKC-iota遺伝子を発現する細胞は、� �業者が公知の方法で調製すればよく、具体� �な方法としては特に制限はないが、例えば� �下の方法によることができる。すなわち、PK C-iota遺伝子又はその一部からなる核酸を好適 なプロモーター及び転写調節エレメントを含 む発現ベクターにクローニングし、クローニ ングされた核酸を有するベクターを宿主細胞 に導入することにより調製する。ここで、前 記ベクターとしては、発現ベクターとして利 用可能なものであれば特に限定されないが、 例えば、pCMV-Tag、pcDNA3.1、pBlueBacHis2、pCI-neo、p cDNAI、pMC1neo、pXT1、pSG5、pEF1/V5-HisB、pCR2.1、pET1 1、λgt11又はpCR3.1が挙げられる。

 次に、PKC-iota遺伝子又はその一部からな� �核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞� �導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝� �の発現に通常使用されるものであれば特に� �定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞� �微生物のいずれであってもよく、具体的に� �、例えば、COS1、COS7、CHO、NIH/3T3、293、Raji、C V11、C1271、MRC-5、CPAE、HeLa、293T又はSf9が挙げ� �れる。また、発現ベクターを宿主細胞に導� �する方法としては、公知の方法であれば特� �限定されないが、具体的には、例えば、エ� �クトロポレーション、リン酸カルシウム法� �DEAE-デキストラン法、リポフェクション法又 は遺伝子銃が挙げられる。

 次に、このようにして調製したPKC-iotaを� �現する細胞に被検化合物を接触させる。接� �させる方法としては特に制限はなく、PKC-iota が細胞内に発現した状態であれば、細胞の培 養液や細胞を含む緩衝液に被験試料を添加す ることにより行うことができる。

 また、上記のようにして調製したPKC-iotaを� �現する細胞を破砕又は可溶化した後、細胞� �出液を用いてPKC-iotaと被検化合物の接触を行 うこともできる。細胞の破砕方法としては、 例えば、ホモジナイザーで細胞を押しつぶす 方法、超音波による破砕を挙げることができ る。また、細胞の可溶化方法としては、例え ば、可溶化剤(例えば、TritonX-100、コール酸ナ トリウム、NP-40)を含む緩衝液に細胞を懸濁し 、氷上で静置する方法を挙げることができる 。
被験試料がタンパク質の場合には、例えば、 当該タンパク質をコードするDNAを含むベクタ ーを、PKC-iotaが発現している細胞へ導入する� ��とにより接触させてもよい。

 PKC-iotaと被検化合物との結合は、例えば� �結合した化合物に付された標識による検出(� ��えば、結合量を放射活性や蛍光強度による� ��出)のほか、PKCiotaが基質タンパク質(例えば� ��BAD、LLGL2)又は基質ペプチドをリン酸化する� ��応を被検化合物が阻害することを指標とし� ��検出(例えば、リン酸化量を放射活性や蛍光 強度を用いた検出)、また、被検化合物のPKC-i otaへの結合によって生じたシグナル伝達の阻 害(例えば、BAD等の基質タンパク質のリン酸� �、アポトーシスの誘導)を指標に検出するこ� ��ができる。基質としてBADを用いる場合、BAD� ��おいてリン酸化を受ける部位は112番目、136� ��目及び155番目のアミノ酸であることが本発� ��者らによって見出されている。従って、当� ��部位を含んだBADの部分ペプチドを基質とし� ��使用することもできる。

 PKC-iotaと被検化合物との結合を検出し、� �検化合物非存在下において同様に反応を行� �た対照区の結果と比較した結果、結合によ� �PKC-iotaの活性が阻害されている場合には、当 該被検化合物はPKC-iota阻害剤として機能する� ��

 また、本発明の第2の化合物の評価方法は 、PKC-iota遺伝子を導入し、PKC-iotaを発現する� �胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合� �を接触させる工程と、当該接触により生じ� �細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程� �、当該活性と被検化合物を接触させない場� �の細胞内情報伝達物質の活性とを比較する� �程と、を含むことを特徴とする。

 本評価方法においては、第1の化合物の評 価方法と同様にして調製した細胞を用い、細 胞に披検化合物を接触させることにより接触 により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測 定する。

 ここで、細胞内情報伝達物質としては、� ��報伝達パスウェイにおいてPKC-iotaの下流に� �置し、PKC-iotaの発現や活性によってその発現 や活性に影響を受ける分子であれば特に限定 されず、例えば、BAD(Accession No. NM_032989.1:配� ��番号3及び4)、LLGL2(Accession No. NM_001031803:配� �番号5及び6)、HMGB3(Accession No. NM_005342:配列番 号7及び8)、NFIB(Accession No. NM_005596:配列番号9� ��び10)、PXDN(Accession No. NM_012293:配列番号11及� ��12)、CLDN12(Accession No. NM_012129:配列番号13及� �14)、RPIA(Accession No. NM_144563:配列番号15及び16 )、AKT3(Accession No. NM_005465:配列番号17及び18)� �びSNF1LK(Accession No. NM_173354:配列番号19及び20) を挙げることができる。

 細胞内情報伝達物質の活性の測定は、当� ��物質の種類に応じて適宜好適な条件で行え� ��よい。例えば、転写調節因子であるHMGB3で� �れば、ゲルシフト法や比色法のELISAアッセイ により活性測定を行うことができる。また、 BADであれば、PKC-iotaが活性化していればそれ� ��よってBADの112番目、136番目及び155番目のア� ��ノ酸がリン酸化を受け、脱リン酸化するこ� ��によってBcl-xlの活性を抑制することから、B cl-xlの活性抑制活性を測定することによりBAD� ��活性化状態を測定することができる。

 さらに、本発明の第3の化合物の評価方法 は、PKC-iota遺伝子を導入し、PKC-iotaを発現す� �細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化� �物を接触させる工程と、当該PKC-iotaの発現レ ベル又はPKC-iotaを介した細胞内情報伝達物質� ��発現レベルを測定する工程、を含むことを� ��徴とする。また、化合物の評価を行った結� ��、所望の化合物を選択(スクリーニング)す� �には、接触前と比較して、PKC-iotaの発現レベ ル又はPKC-iotaを介した細胞内情報伝達物質の� ��現レベルを増加又は減少させた被検化合物� ��選択する工程をさらに含んでいてもよい。

 本評価方法においては、第1の化合物の評 価方法と同様にして調製した細胞を用い、細 胞に披検化合物を接触させることにより、接 触により生じたPKC-iota又はPKC-iotaを介した細� �内情報伝達物質の発現レベルを測定する。

 ここで、PKC-iotaを介した細胞内情報伝達� �質としては、情報伝達パスウェイにおいてPK C-iotaの下流に位置し、PKC-iotaの発現や活性に� ��ってその発現や活性に影響を受ける分子で� ��れば特に限定されず、例えば、BAD、LLGL2、HM GB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3又はSNF1LKを挙� �ることができる。

 ここで、当該発現レベルを指標とする場� ��、発現レベルの測定法は特に制限されない� ��、例えば、ノーザンブロッティング、ウェ� ��タンブロッティング又はDNAチップが挙げら� ��る。ここで、本発明における「発現レベル� ��とは、PKC-iotaを介した情報伝達パスウェイ� �に存在するタンパク質をコードする遺伝子� �転写産物の絶対量又は相対量をいう。この� �合、当該遺伝子にはDNA又はmRNAのいずれもが� ��まれる。また、発現の検出対象がタンパク� ��の場合、その「発現レベル」とは、PKC-iota� �介した情報伝達経路上に存在するタンパク� �の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。ま� �、シグナル伝達上の分子の活性を指標にす� �場合、活性測定方法は特に制限されず、測� �の対象となる分子の種類によって好適な方� �を選択すればよい。

 一方、単離されたPKC-iotaタンパク質を化� �物の評価に直接使用することもできる。す� �わち、被検化合物をPKC-iotaタンパク質に接触 させ、次に、接触によって生じたPKC-iotaタン� ��ク質の活性の変化を検出する方法である。

 かかる接触の方法としては特に制限はな� ��、具体的には、例えば、緩衝液(リン酸緩衝 液、Tris塩酸緩衝液、HEPES緩衝液等)等の溶液� �で混合することにより接触させる方法や、PK C-iotaタンパク質をメンブレン上に固定し、メ ンブレン上で被検化合物と接触させる方法が 挙げられる。緩衝液中で接触させる場合の反 応条件としては、特に限定されないが、例え ば、pH5.0~10、好ましくはpH6.5~8.5、さらに好ま� ��くはpH7.0~8.0で、通常、10~50℃、好ましくは20 ~40℃、より好ましくは35~40℃、さらに好まし� ��は37℃の条件下、1分間~24時間、好ましくは5 分間~10時間、より好ましくは10分間~3時間、� �らに好ましくは30分間~1時間インキュベーシ� ��ンすることが挙げられる。

 次に、接触によって生じたPKC-iotaの活性� �変化を検出する。

 タンパク質の活性測定方法としては、使用� ��るタンパク質の性質により所望の方法を選� ��すればよく、具体的には、例えば、PKC-iota� �対する適当な基質を準備し、溶媒中でPKC-iota 、基質及び被検化合物の存在下でキナーゼア ッセイを実施する方法が挙げられる。この場 合、酵素反応の確認は放射性標識されたリン (例えば、 ³² P、 ³³ P)の取り込み等で確認することができる。

 また、PKC-iotaタンパク質の活性を測定す� �際に、基質としてBAD又はLLGL2を用いることも できる。PKC-iotaはBAD及びLLGL2を基質として直� �リン酸化していることを、本発明者らは見� �している。その際、BADであれば、PKC-iotaによ って少なくともBADの112番目、136番目及び155番 目のアミノ酸がリン酸化を受けていることか ら、当該アミノ酸を含む部分ペプチドを基質 として使用することもできる。また、LGLL2で� ��れば、PKC-iotaによって少なくともLLGL2の653番 目のセリンがリン酸化を受けていることから 、当該セリンを含む部分ペプチドを基質とし て使用することもできる。ここで、基質とし て当該部分ペプチドを使用する場合、そのア ミノ酸数は特に限定されないが、BAD及びLGLL2� ��いずれについても、8~50アミノ酸であること が好ましく、10~30アミノ酸であることがより� ��ましく、12~20アミノ酸であることが特に好� �しい。

 BADを基質として使用しPKC-iotaの活性を測定� �る方法としては、公知のリン酸化検出手段� �より行うことができるが、例えば、放射性� �識されたリン(例えば、 ³² P)の取り込みを確認するキナーゼアッセイ、� ��ン酸化BAD抗体を使用したウエスタンブロッ� ��を挙げることができる。リン酸化BAD抗体は� ��公知の方法により作製することができ、例� ��ば、BADの112番目、136番目及び155番目のアミ� ��酸のうち少なくともいずれかのアミノ酸を� ��むペプチド断片を抗原として使用し、公知� ��方法に従ってポリクローナル又はモノクロ� ��ナル抗体を作製すればよい。

 LGLL2を基質として使用しPKC-iotaの活性を測定 する方法としては、公知のリン酸化検出手段 により行うことができるが、例えば、放射性 標識されたリン(例えば、 ³² P、 ³³ P)の取り込みを確認するキナーゼアッセイ、� ��ン酸化LGLL2抗体を使用したウエスタンブロ� �トを挙げることができる。リン酸化LGLL2抗体 は、公知の方法により作製することができ、 例えば、LGLL2の653番目のセリンを含むペプチ� ��断片を抗原として使用し、公知の方法に従� ��てポリクローナル又はモノクローナル抗体� ��作製すればよい。

 以上のように、本発明の化合物の評価方� ��により化合物の評価をした結果、被検化合� ��の存在下におけるPKC-iotaの活性が、被検化� �物の非存在下における結合活性(対照)より低 い値を示した場合には、当該被検化合物は、 本発明に係るPKC-iotaとリガンドとの結合を阻� ��する活性を有するアンタゴニストと判定さ� ��る。アンタゴニストは、PKC-iotaに対するリ� �ンド及びそのアナログが有する生理活性を� �制する。このため、アンタゴニストは、p53� �機能異常に基づき、PKC-iotaを介したシグナル 伝達系の異常などに起因する癌の治療などの ための医薬組成物として有用である。

 また、本発明の化合物の評価方法により、P KC-iotaへの被検化合物結合後の細胞内シグナ� �伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニ� �グを行うことができる。すなわち、本発明� �化合物の評価方法によって複数の被検化合� �を評価することにより、アゴニスト又はア� �タゴニストとして機能する化合物を選択す� �ことができる。かかる選択の結果、被検化� �物非存在下においてリガンド及びそのアナ� �グを作用させた場合の下流へのシグナル伝� �の変化と比較して、その変化が抑制されれ� �、当該被検化合物は、PKC-iotaへの被検化合物 結合後の下流へのシグナル伝達を阻害する化 合物であると判定される。逆に、被検化合物 が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該 化合物は、PKC-iotaへの被検化合物結合後の細� ��内シグナル伝達を促進する化合物であると� ��定される。このようなスクリーニング方法� ��よって選択された化合物は、p53の機能異常� ��起因する癌の治療及び診断に有効である。
(2)PKC-iotaリガンド
 (1)において説明した本発明の化合物の評価� ��法により、PKC-iotaリガンドを単離すること� �できる。かかるリガンドは単独で抗癌作用� �有する薬剤として使用できる。

 PKC-iotaリガンドとなり得る被検化合物と� �ては特に制限はなく、例えば、天然化合物� �有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペ� �チド等の単一化合物、PKC-iotaの抗体、アンチ センス、RNAi又はリボザイムが挙げられる。� �のようなPKC-iotaリガンドとしては、具体的に は、例えば、myristoylated atypical PKC pseudosubstr ate inhibitor peptide(BIOSOURCE社)が挙げられる。

 本発明のPKC-iotaリガンドをヒトや他の動� �の医薬として使用する場合には、これらの� �質自体を直接患者に投与する以外に、公知� �製剤学的方法により製剤化して投与を行う� �とも可能である。例えば、必要に応じて糖� �を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤� �マイクロカプセル剤として経口的に、ある� �は水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得� �液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤� �形で非経口的に使用できる。例えば、薬理� �上許容される担体若しくは媒体、具体的に� �、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、� �濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形� �、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み� �わせて、一般に認められた製薬実施に要求� �れる単位用量形態で混和することによって� �剤化することが考えられる。

 錠剤、カプセル剤に混和することができ� ��添加剤としては、例えば、ゼラチン、コー� ��スターチ、トラガントガム、アラビアゴム� ��ような結合剤、結晶性セルロースのような� ��形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ� ��酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシ� ��ムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッ� ��リンのような甘味剤、ペパーミント、アカ� ��ノ油又はチェリーのような香味剤が用いら� ��る。調剤単位形態がカプセルである場合に� ��、上記の材料にさらに油脂のような液状担� ��を含有することができる。注射のための無� ��組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを� ��いて通常の製剤実施に従って処方すること� ��できる。

 注射用の水溶液としては、例えば生理食� ��水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張� ��、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-� ��ンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、� ��当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体� ��にはエタノール、ポリアルコール、例えば� ��ロピレングリコール、ポリエチレングリコ� ��ル、非イオン性界面活性剤、例えばポリソ� ��ベート80(TM)、HCO-50と併用してもよい。

 油性液としてはゴマ油、大豆油があげら� ��、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ� ��ジルアルコールと併用してもよい。また、� ��衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリ� ��ム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカ� ��ン、安定剤、例えばベンジルアルコール、� ��ェノール、酸化防止剤と配合してもよい。� ��製された注射液は通常、適当なアンプルに� ��填させる。

 患者への投与は、例えば、動脈内注射、� ��脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的� ��経気管支的、筋内的、経皮的、または経口� ��に当業者に公知の方法により行いうる。投� ��量は、患者の体重や年齢、投与方法などに� ��り変動するが、当業者であれば適当な投与� ��を適宜選択することが可能である。また、� ��該化合物がDNAによりコードされうるもので� ��れば、当該DNAを遺伝子治療用ベクターに組� ��み、遺伝子治療を行うことも考えられる。� ��与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症� ��などにより変動するが、当業者であれば適� ��選択することが可能である。

 化合物の投与量は、症状により差異はあ� ��が、経口投与の場合、一般的に成人(体重60k gとして)においては、1日あたり約0.1から100mg� ��好ましくは約1.0から50mg、より好ましくは約 1.0から20mgであると考えられる。

 非経口的に投与する場合は、その1回の投与 量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法に よっても異なるが、例えば注射剤の形では通 常成人(体重60kgとして)においては、通常、1� �当り約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20mg� �より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注射� ��より投与するのが好都合であると考えられ� ��。
(3)癌の分子診断方法
 被検組織におけるPKC-iotaの発現量又は活性� �測定して正常組織におけるPKC-iotaの発現量又 は活性と比較をすることにより、その組織が 癌化しているか否かを予測・診断することが できる。

 本発明の第1の癌の分子診断方法は、被検 組織又は被検細胞における、PKC-iota遺伝子の� ��現量を測定する工程と、当該発現量と正常� ��織又は正常細胞におけるPKC-iota遺伝子の発� �量とを比較する工程と、比較した結果、被� �組織又は被検細胞におけるPKC-iota遺伝子の発 現量が正常組織又は正常細胞におけるPKC-iota� ��伝子の発現量より有意に多いか否かを判断� ��る工程と、を含むことを特徴とする。

 本発明の第1の癌の分子診断方法において 、先ず、被検組織又は被検細胞におけるPKC-io ta遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現� ��の測定の方法としては特に制限はないが、� ��えば、被検組織又は被検細胞から抽出したm RNAを鋳型としてRT-PCRを行う方法、前記遺伝子 がプロットされたマイクロアレイを用いる方 法、ノーザンブロットが挙げられる。ここで 、遺伝子の「発現量」とは、遺伝子転写産物 の絶対量又は相対量をいい、相対量の場合は 、後述する正常組織における発現量との相対 的な比較において当該遺伝子の発現量を決定 すればよい。

 次に、上記の方法により測定した遺伝子� ��発現量と正常組織又は正常細胞における対� ��遺伝子の発現量とを比較する。

 ここで、「正常組織又は正常細胞」とは� ��被検組織又は被検細胞と比較の対象となる� ��織又は細胞であればその由来は特に限定さ� ��ず、健常人由来であっても癌患者由来であ� ��てもよい。また、被検組織の近辺に存在す� ��正常組織又は正常細胞であってもよい。

 本工程においては、被検組織又は細胞に� ��現するPKC-iota遺伝子と正常組織又は細胞に� �現するPKC-iota遺伝子(対応遺伝子)の発現量を� ��較するが、発現量の絶対量を比較してもよ� ��、また、比較による相対値を算出してもよ� ��。

 次に、比較した結果、被検組織又は被検� ��胞における遺伝子の発現量が正常組織又は� ��常細胞における遺伝子の発現量より有意に� ��いか否かを判断する。

 前記の有意差の判断手法としては特に制� ��はないが、当業者に公知の統計学的手法を� ��いて検定すればよい。

 被検組織又は被検細胞と、正常組織又は� ��常細胞における前記遺伝子の発現量の比較� ��結果、有意差をもって被検組織又は被検細� ��において発現が高いと認められた場合には� ��該被検組織又は被検細胞におけるp53又はPI3� ��ナーゼの発現量にに変異を有する可能性が� ��く、p53又はPI3キナーゼの変異に起因して当� ��組織又は細胞が癌化している可能性がある� ��判断できる。

 また、本発明の第2の癌の分子診断方法は 、被検組織又は被検細胞における、PKC-iotaの� ��性を測定する工程と、当該活性と正常組織� ��は正常細胞におけるPKC-iotaの活性とを比較� �る工程と、比較した結果、被検組織又は被� �細胞におけるPKC-iotaの活性が正常組織又は正 常細胞におけるPKC-iotaの活性より有意に多い� ��否かを判断する工程と、を含むことを特徴� ��する。

 PKC-iotaは細胞内で自己リン酸化すること� �より活性化することが知られている。すな� �ち、PKC-iotaのリン酸化状態を測定することに より、その活性化の状態を知ることができる 。

 本発明の第2の癌の分子診断方法において 、先ず、被検組織又は被検細胞における、PKC -iotaの活性を測定する。活性の測定の方法と� ��ては特に制限はないが、例えば、被検組織� ��は被検細胞の抽出液に存在するPKC-iotaを単� �又は抽出液ごと用い、これを適当な基質と� �媒中でリン酸化反応を生じせしめ、その活� �を測定すればよい。この場合、酵素反応の� �認は放射性又は蛍光標識されたリン酸の取� �込み等で確認することができる。

 次に、上記の方法により測定した遺伝子� ��活性と正常組織又は正常細胞におけるPKC-iot aの活性とを比較する。

 活性を比較した結果、被検組織又は被検� ��胞におけるPKC-iotaの活性が正常組織又は正� �細胞におけるPKC-iotaの活性より有意に強いか 否かを判断する。

 前記の有意差の判断手法としては特に制� ��はないが、当業者に公知の統計学的手法を� ��いて検定すればよい。

 被検組織又は被検細胞と、正常組織又は� ��常細胞におけるPKC-iotaの活性の比較の結果� �有意差をもってPKC-iotaの活性が上昇している 場合には、当該組織又は細胞におけるp53又は PI3キナーゼの機能又は発現量にに変異を有す る可能性が高く、p53又はPI3キナーゼの変異に 起因して当該組織又は細胞が癌化している可 能性があると判断できる。

 (4)遺伝子マーカー
 本発明の遺伝子マーカーは、PKC-iota阻害剤� �薬効を予測又は診断する遺伝子マーカーで� �って、当該遺伝子が、BAD、LLGL2、HMGB3、NFIB、 PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSNF1LKからなる群より 選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝 子と実質的に同等の機能を有する遺伝子であ ることを特徴とする。

 本発明の「遺伝子マーカー」とは、評価� ��象となるPKC-iota阻害剤の薬効や生体に対す� �作用の指標となるものをいい、具体的には� �PKC-iota阻害剤の作用によって発現量や活性が 変化する遺伝子又はこれらに関連する物質(� �えば、DNA及びRNA並びにこれらの断片)をいう� ��

 また、本発明の遺伝子マーカーには、BAD� ��LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3又はSN F1LKの一部からなるポリヌクレオチドも含む� �このようなポリヌクレオチドは、BAD、LLGL2、 HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3又はSNF1LK遺伝 子から転写されたRNA、これから産生されるcDN A、ならびにこれらの遺伝子由来の配列を有� �る合成核酸であってもよい。

 本発明者らは、本発明の遺伝子マーカー� ��発現がPKC-iotaの発現を抑制することによっ� �増加又は減少することを確認している。す� �わち、PKC-iotaの発現を抑制することによって 、SNF1LK、CLDN12及びRPIAの3遺伝子は発現が増加� ��、HMGB3、NFIB、PXDN及びAKT3の4遺伝子は発現が� ��少する。また、PKC-iotaのキナーゼ活性依存� �にBADの112番目、136番目及び155番目のアミノ� �、又はLLGL2の653番目のセリンがリン酸化を受 けることも本発明者らにより見出されている ことから、PKC-iotaの活性が阻害されることに� ��りBAD及び/又はLLGL2もリン酸化を受けないか� ��あるいは脱リン酸化される。従って、BAD及� ��/又はLLGL2のリン酸化状態もまたPKC-iota阻害� �の遺伝子マーカーとして使用可能である(BAD� ��びLGLL2のリン酸化の検出については(5)タン� �ク質マーカーの項で述べる。)。

 本発明の遺伝子マーカーは、PKC-iota阻害� �の投与により生体内組織中でその発現が増� �又は減少する。PKC-iota阻害剤の薬効を予測又 は診断する場合には、遺伝子マーカーが発現 している任意の組織における当該遺伝子マー カーの発現量を測定すればよいが、サンプル の入手が容易であるとの観点から血液又は皮 膚組織における発現量を測定することが好ま しい。

 また、本発明の遺伝子マーカーの発現量� ��測定方法としては特に制限はないが、具体� ��には、例えば、ノーザンブロット法、定量� ��RT-PCR法、DNAマイクロアレイによってmRNA量を 測定することによりその発現量を定量するこ とができる。

 ここで、前記ノーザンブロット法に使用す� ��プローブとしては、本発明の遺伝子マーカ� ��であるBAD、LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA 、AKT3又はSNF1LK遺伝子を検出可能なプローブ� �あればよく、具体的には、これらの遺伝子� �塩基配列の部分配列又は全部を使用するこ� �ができる。また、当該プローブの塩基数に� �いても特に制限はないが、少なくとも連続� �る20塩基の長さの核酸であることが好ましく 、より好ましくは40塩基、さらに好ましくは6 0塩基、特に好ましくは80塩基以上のものが使 用される。また、当該プローブは、必要に応 じて検出可能なように標識して用いてもよい 。具体的には、例えば、 ³² P、 ¹⁴ C、 ¹²⁵ I、 ³ H、 ³⁵ S等の放射性同位体で標識されていてもよく� �ビオチン、蛍光色素、酵素、金コロイド等� �標識されていてもよい。

 また、前記定量的RT-PCR法に使用するプラ� ��マーとしては、本発明の遺伝子マーカーで� ��るBAD、LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT 3又はSNF1LK遺伝子を検出可能なプライマーで� �ればよく、その塩基数は特に制限されず、� �ライマーの塩基配列や単離する遺伝子の塩� �配列等によって適宜設定することができる� �、一般に、連続した10~60塩基であることが好 ましく、15~30塩基であることがより好ましい� ��また、その塩基配列は、検出の対象となるB AD、LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3又� �SNF1LK遺伝子の塩基配列に基づいて決定する� �

 また、前記DNAマイクロアレイによって本� ��明の遺伝子マーカーの発現量を測定する場� ��、BAD、LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT 3又はSNF1LK遺伝子のうちの少なくとも一つの� �伝子又は当該遺伝子の部分核酸がスポット� �れたDNAマイクロアレイを準備し、測定を行� �ばよい。

 また、本発明の遺伝子マーカーは、PKC-iot a阻害剤の薬効を予測又は診断するために用� �られる。すなわち、PKC-iota阻害剤を生体に投 与した後、当該遺伝子マーカーの発現量を測 定し、投与前の発現量と比較して発現量が増 加又は減少している場合に、当該阻害剤がPKC -iota特異的に作用し所定の薬効を発揮してい� ��と認定することができる。すなわち、SNF1LK� ��CLDN12及びRPIAの3遺伝子については発現が増� �した場合に、HMGB3、NFIB、PXDN及びAKT3の4遺伝� �については発現が減少した場合にPKC-iota阻害 剤が所定の薬効を発揮すると認定することが できる。具体的には、SNF1LK、CLDN12及びRPIAの3� ��伝子については、PKC-iota阻害剤を投与後、� �発明の遺伝子マーカーの発現が増加してい� �ば、仮にPKC-iota阻害剤の薬効が目に見える状 態(例えば、癌症状の改善)に至っていない場� ��や、癌組織が非常に小さく、X線撮影のよう な従来の診断方法では診断が困難な場合であ っても、阻害剤の薬効が発揮されるであろう と予測できる。一方、SNF1LK、CLDN12及びRPIAの3� ��伝子については、PKC-iota阻害剤を投与後、� �発明の遺伝子マーカーの発現が減少してい� �ば、同様に阻害剤の薬効について予測する� �とができる。また、PKC-iota阻害剤を薬剤とし て開発する段階において健常人を対象に臨床 試験を行う場合、本発明の遺伝子マーカーの 発現量を指標にして当該薬剤の効果を評価す ることが可能となる。

 また、本発明の遺伝子マーカーは、癌の� ��癒成績を判定する際にも使用できる。すな� ��ち、PKC-iota阻害剤を抗癌剤として生体に投� �し癌治療を行った場合、抗癌剤が効いたか� �うかを判定するには実際に癌組織が縮小し� �ことや癌細胞が減少したことを確認する必� �がある。このような確認作業には、X線断層� ��影やX線造影撮影のような放射線を浴びるよ うな検査や、内視鏡やバイオプシーのような 患者の負担を伴う検査が必要となる。しかし 、本発明の遺伝子マーカーによれば、血液や 皮膚のような体組織の一部を極小量採取し、 当該組織における遺伝子マーカーの発現を測 定するだけで検査が完了する。従って、X線� �層撮影、X線造影撮影、内視鏡又はバイオプ� ��ーのような検査に代えて又はこれらの検査� ��予備的な検査として、患者に苦痛や負担を� ��えることなくPKC-iota阻害剤の薬効を判定す� �ことが可能となる。

 (5)タンパク質マーカー
 本発明のタンパク質マーカーは、PKC-iota阻� �剤の薬効を予測又は診断するタンパク質マ� �カーであって、当該タンパク質が、BAD、LLGL2 、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSNF1LKか らなる群より選択されるいずれか一つのタン パク質又は実質的に同等の機能を有すること を特徴とする。

 本発明の「タンパク質マーカー」とは、� ��価対象となるPKC-iota阻害剤の薬効や生体に� �する作用の指標となるものをいい、具体的� �はPKC-iota阻害剤の作用によって発現量や活性 が変化するタンパク質又はこれらに関連する 物質(例えば、部分ペプチド)をいう。

 本発明者らは、これらのタンパク質をコ� ��ドする遺伝子のみならずタンパク質の発現� ��PKC-iota阻害剤の投与によって増加又は減少� �ることを確認している。

 本発明のタンパク質マーカーは、PKC-iota� �害剤の投与により生体内組織中でその発現� �増加又は減少する。PKC-iota阻害剤の薬効を予 測又は診断する場合には、タンパク質マーカ ーが発現している任意の組織における当該タ ンパク質マーカーの発現量を測定すればよい が、サンプルの入手が容易であるとの観点か ら血液又は皮膚組織における発現量を測定す ることが好ましい。

 ここで、本発明のタンパク質マーカーは� ��BAD、LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3� �びSNF1LKからなる群より選択されるいずれか� �つのタンパク質と実質的に同等の機能を有� �るタンパク質を含む。このようなタンパク� �としては、BAD、LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12� �RPIA、AKT3及びSNF1LKタンパク質を構成するアミ ノ酸配列のうち1又は2以上のアミノ酸に置換� ��付加、欠失又は挿入があり、且つ、同等の� ��性を有するものが挙げられる。同等の活性� ��は、BADと実質的に同等の機能を有するタン� ��ク質であればBAD活性を有することをいい、L LGL2と実質的に同等の機能を有するタンパク� �であればLLGL2活性を、HMGB3と実質的に同等の� ��能を有するタンパク質であればHMGB3活性を� �NFIBと実質的に同等の機能を有するタンパク� ��であればNFIB活性を、PXDNと実質的に同等の� �能を有するタンパク質であればPXDN活性を、C LDN12と実質的に同等の機能を有するタンパク� ��であればCLDN12活性を、RPIAと実質的に同等の 機能を有するタンパク質であればRPIA活性を� �AKT3と実質的に同等の機能を有するタンパク� ��であればAKT3活性を、SNF1LKと実質的に同等の 機能を有するタンパク質であればSNF1LK活性を それぞれ有することをいう。

 本発明のタンパク質マーカーの発現量の� ��定方法としては特に制限はないが、具体的� ��は、例えば、ウエスタンブロット法、ELISA� �、プロテインチップによってタンパク質量� �測定することによりその発現量を定量する� �とができる。

 ここで、前記ウエスタンブロット法は当� ��者に公知の方法で行うことができる。具体� ��には、例えば、PKC-iota阻害剤を投与した生� �から採取した組織の総タンパク質をSDS-PAGEに より展開し、ニトロセルロース膜やPVDF膜等� �転写する。その後、当該膜に本発明のタン� �ク質マーカーの抗体を添加、反応させ、さ� �に2次抗体を添加、反応させた後、当該2次抗 体を検出することにより、当該タンパク質マ ーカーを検出すればよい。また、生体から採 取した組織の総タンパク質をタンパク質マー カーの抗体で免疫沈降し、沈降物として得ら れたタンパク質をSDS-PAGEにより展開し、ウエ� ��タンブロット法により検出してもよい。

 前記ウエスタンブロット法に使用する抗� ��としては、本発明のタンパク質マーカーで� ��るBAD、LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT 3及びSNF1LKタンパク質を検出可能な抗体であ� �ばよく、ポリクローナル抗体であってもよ� �モノクローナル抗体であってもよい。かか� �ポリクローナル抗体は当業者に公知の方法� �調製すればよく、例えば下記の方法に従っ� �調製できる。すなわち、例えば、抗原を、� �要に応じてフロイントアジュバント(Freund’s  Adjuvant)とともに、マウス、ラット、ハムス� ��ー、モルモット又はウサギ等の哺乳動物に� ��疫し、当該免疫感作動物から得た血清から� ��得することができる。

 また、前記モノクローナル抗体は、例え� ��、抗原を、必要に応じてフロイントアジュ� ��ントとともに、マウス、ラット、ハムスタ� ��、モルモットまたはウサギ等の哺乳動物に� ��疫する。次に、当該免疫感作動物から得た� ��体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫� ��細胞(ミエローマ細胞)からハイブリドーマ(� ��合細胞)を調製し、ハイブリドーマをクロー ン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対し て特異的親和性を示すモノクローナル抗体を 産生するクローンを選択することによって調 製することができる。さらに具体的には、抗 原を、必要に応じてフロイントアジュバント 哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内又は腹腔 内等に1又は数回注射するかあるいは移植す� �ことにより免疫感作を施す。通常、最初の� �疫から1~14日毎に1~4回程度免疫を行い、最終� ��疫より1~5日程度後に免疫感作された哺乳動� ��から抗体産生細胞を取得する。

 モノクローナル抗体を分泌するハイブリ� ��ーマ(融合細胞)の調製は、定法に従って行� �ことができる。すなわち、上述した方法に� �り免疫感作された哺乳動物から取得される� �臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ま� �くは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、マウ� �、ラット又はヒト等由来の自己抗体産生能� �ないミエローマ細胞との細胞融合させるこ� �により調製する。モノクローナル抗体を産� �するハイブリドーマクローンのスクリーニ� �グは、ハイブリドーマをマイクロタイター� �レート等を用いて培養し、増殖の見られた� �ェルの培養上清の免疫抗原に対する反応性� �、例えばRIAやELISA等の酵素免疫測定法によっ て測定することにより行なうことができる。

 ハイブリドーマからのモノクローナル抗� ��の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、� ��はマウス、ラット、モルモット、ハムスタ� ��またはウサギ等の腹水中等でのインビボで� ��養した後、得られた培養上清、又は哺乳動� ��の腹水から単離することにより行うことが� ��きる。モノクローナル抗体の単離、精製は� ��上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸� ��ンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプ� ��イン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロ� ��トグラフィー(DEAEまたはDE52等)、抗イムノグ ロブリンカラムあるいはプロテインAカラム� �のアフィニティカラムクロマトグラフィー� �供すること等により行うことができる。

 さらに、上述の方法により得られたポリ� ��ローナル抗体又はモノクローナル抗体を用� ��て抗体アレイを調製することも可能である� ��すなわち、上述の抗体をニトロセルロース� ��やPVDF膜等の膜や、ニトロセルロースがコー トされたスライドやガラス基盤に、マイクロ アレイスポッターを用いて固定すればよい。

 また、BADとLGLL2はPKC-iotaによりリン酸化を 受ける。従って、BAD及びLGLL2のリン酸化状態� ��PKC-iotaの活性の指標、すなわちマーカーと� �り得る。BADのリン酸化は、抗リン酸化BAD抗� �を用いたウエスタンブロット法により検出� �ることができる。また、上述した方法で調� �した抗BAD抗体を用いてウエスタンブロット� �行い、BADのバンドを確認した後、当該バン� �が抗リン酸化セリン・スレオニン抗体によ� �検出されるかどうかを確認することによっ� �もBADのリン酸化を確認することができる。LG LL2についても同様にリン酸化を確認すること ができ、LGLL2のリン酸化をマーカーとしてPKC- iotaの阻害活性を検出可能である。

 一方、本発明のタンパク質マーカーであ� ��BAD、LLGL2、HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3� �びSNF1LKの少なくとも一つのタンパク質をニ� �ロセルロース膜やPVDF膜等の膜や、ニトロセ� ��ロースがコートされた基盤やガラス基盤に� ��イクロアレイスポッターを用いて固定する� ��とによりプロテインアレイを調製すること� ��できる。この場合、前記タンパク質を直接� ��定してもよく、タンパク質又は膜若しくは� ��盤との間にリンカーを介して固定してもよ� ��。リンカーを介して固定することにより、� ��ンパク質の立体構造を損なわず活性を維持� ��た状態でプロテインアレイ(マイクロアレイ )を調製することが可能となる。

 また、本発明のタンパク質マーカーは、P KC-iota阻害剤の薬効を予測又は診断するため� �用いられる。すなわち、PKC-iota阻害剤を生体 に投与した後、当該タンパク質マーカーの発 現量を測定し、投与前の発現量と比較して発 現量が増加又は減少している場合に、当該阻 害剤がPKC-iota特異的に作用し所定の薬効を発� ��していると認定することができる。すなわ� ��、SNF1LK、CLDN12及びRPIAの3タンパク質につい� �は発現が増加した場合に、HMGB3、NFIB、PXDN及� ��AKT3の4タンパク質については発現が減少し� �場合にPKC-iota阻害剤が所定の薬効を発揮する と認定することができる。具体的には、SNF1LK 、CLDN12及びRPIAの3タンパク質については、PKC- iota阻害剤を投与後、本発明のタンパク質マ� �カーの発現が増加していれば、仮にPKC-iota阻 害剤の薬効が目に見える状態(例えば、癌症� �の改善)に至っていない場合や、癌組織が非� ��に小さく、X線撮影のような従来の診断方法 では診断が困難な場合であっても、阻害剤の 薬効が発揮されるであろうと予測できる。一 方、HMGB3、NFIB、PXDN及びAKT3の4タンパク質につ いては、PKC-iota阻害剤を投与後、本発明のタ� ��パク質マーカーの発現が減少していれば、� ��様に阻害剤の薬効について予測することが� ��きる。また、PKC-iota阻害剤を薬剤として開� �する段階において健常人を対象に臨床試験� �行う場合、本発明のタンパク質マーカーの� �現量を指標にして当該薬剤の効果を評価す� �ことが可能となる。

 また、本発明のタンパク質マーカーは、� ��の治癒成績を判定する際にも使用できる。� ��なわち、PKC-iota阻害剤を抗癌剤として生体� �投与し癌治療を行った場合、抗癌剤が効い� �かどうかを判定するには実際に癌組織が縮� �したことや癌細胞が減少したことを確認す� �必要がある。このような確認作業には、X線� ��層撮影やX線造影撮影のような放射線を浴び るような検査や、内視鏡やバイオプシーのよ うな患者の負担を伴う検査が必要となる。し かし、本発明のタンパク質マーカーによれば 、血液や皮膚のような体組織の一部を極小量 採取し、当該組織におけるタンパク質マーカ ーの発現を測定するだけで検査が完了する。 従って、X線断層撮影、X線造影撮影、内視鏡� ��はバイオプシーのような検査に代えて又は� ��れらの検査の予備的な検査として、患者に� ��痛や負担を与えることなくPKC-iota阻害剤の� �効を判定することが可能となる。

 (6)癌診断キット
 本発明の癌診断キットは、本発明のタンパ� ��質マーカーを検出可能の抗体を含むことを� ��徴とする。当該抗体は、上述したBAD、LLGL2� �HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSNF1LKか� �なる群より選択されるいずれか一つのタン� �ク質又は実質的に同等の機能を有するタン� �ク質に対するポリクローナル抗体及びモノ� �ローナル抗体をいう。

 本発明の癌診断キットには、本発明のタ� ��パク質マーカーを検出可能な抗体の他、例� ��ば、抗体検出用試薬、抗体検出用2次抗体、 反応に用いるプレートを備えていてもよい。

 本発明の癌診断キットを用いることによ� ��、PKC-iota阻害剤を投与した生体から採取し� �組織(例えば、血液又は皮膚)におけるタンパ ク質マーカーを迅速且つ簡便に検出すること が可能となり、投与前後のタンパク質量を比 較することにより、PKC-iota阻害剤の薬効を予� ��又は診断することが可能となる。

 (7)PKC-iota阻害剤の効果の予測又は診断方法
 先ず、本発明の第1のPKC-iota阻害剤の効果の� ��測又は診断方法について説明する。

 本発明の第1のPKC-iota阻害剤の効果の予測� ��は診断方法は、PKC-iota阻害剤を投与した被� �体由来の組織におけるHMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12� ��RPIA、AKT3及びSNF1LKからなる群より選択され� �少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と実� �的に同等の機能を有する遺伝子を検出する� �出工程と、PKC-iota阻害剤投与前後の発現量を 比較する比較工程を含むことを特徴とする。

 本発明に係る検出工程は、PKC-iota阻害剤� �投与した被検体由来の組織におけるHMGB3、NFI B、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSNF1LKからなる群� �り選択される少なくとも一つの遺伝子又は� �該遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺� �子(すなわち、本発明の遺伝子マーカー)を検 出する工程である。

 ここで、本発明に係る「組織」とは、PKC- iota阻害剤を投与した被験体由来の組織であ� �、検出対象である遺伝子マーカーが発現し� �いる組織であればその組織の種類は限定さ� �ないが、採取が容易であるとの観点より血� �又は皮膚組織であることが好ましい。

 本工程においては、PKC-iota阻害剤を投与� �た生体より前記組織を採取し、そこから遺� �子マーカー測定用のDNAを定法により抽出す� �。抽出するDNAはゲノムDNAであってもよく、� �出したRNAから逆転写反応によって得られたcD NAであってもよい。次に、得られたDNAを用い� ��HMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSNF1LK遺� ��子の検出を行う。検出方法は定量的な手段� ��あれば特に限定されないが、具体的には、� ��えば、PCR法又はマイクロアレイが挙げられ� ��。

 検出工程でHMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AK T3及びSNF1LK遺伝子の検出が完了した後、PKC-iot a阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工� �へと進む。比較工程では、検出工程で検出� �たHMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSNF1LK� �伝子の発現量と、PKC-iota阻害剤を投与する前 の当該遺伝子の発現量とを比較することとな る。比較の結果、PKC-iota阻害剤の投与によっ� ��SNF1LK、CLDN12及びRPIAの3タンパク質について� �発現が増加した場合に、HMGB3、NFIB、PXDN及びA KT3の4タンパク質については発現が減少した� �合には、投与したPKC-iota阻害剤が投与対象で ある人体に当該阻害剤が適切な作用機序で作 用し、投与効果を示していると判断すること ができる。これは癌組織が非常に小さい場合 や、医薬開発の臨床試験段階のように、物理 的な癌組織の大きさだけで薬効を測定するこ とが困難な場合に、PKC-iota阻害剤の薬効を測� ��する方法として非常に有益である。

 次に、本発明の第2のPKC-iota阻害剤の効果� ��予測又は診断方法について説明する。

 本発明の第2のPKC-iota阻害剤の効果の予測� ��は診断方法は、PKC-iota阻害剤を投与した被� �体由来の組織におけるHMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12� ��RPIA、AKT3及びSNF1LKからなる群より選択され� �少なくとも一つのタンパク質又は該タンパ� �質と実質的に同等の機能を有するタンパク� �を検出する検出工程と、PKC-iota阻害剤投与前 後の発現量を比較する比較工程を含むことを 特徴とする。

 本発明に係る検出工程は、PKC-iota阻害剤� �投与した被検体由来の組織におけるHMGB3、NFI B、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSNF1LKからなる群� �り選択される少なくとも一つのタンパク質� �は当該タンパク質と実質的に同等の機能を� �するタンパク質(すなわち、本発明のタンパ� ��質マーカー)を検出する工程である。

 ここで、本発明に係る「組織」とは、PKC- iota阻害剤を投与した被験体由来の組織であ� �、検出対象であるタンパク質マーカーが発� �している組織であればその組織種は限定さ� �ないが、採取が容易であるとの観点より血� �又は皮膚組織であることが好ましい。

 本工程においては、PKC-iota阻害剤を投与� �た生体より前記組織を採取し、そこからタ� �パク質マーカー測定用のタンパク質を定法� �より抽出するか、又は、当該タンパク質を� �む総タンパク質を採取する。具体的には、� �えば、ウエスタンブロット法による検出に� �することができるよう、当該タンパク質を� �む総タンパク質を可溶化サンプルとして調� �し、本工程に係る抽出タンパク質とするこ� �ができる。また、総タンパク質をサンプル� �して、検出対象となるタンパク質の抗体を� �いて免疫沈降を行い、当該タンパク質のみ� �抽出してもよい。

 次に、得られたタンパク質を用いてHMGB3� �NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSNF1LKタンパク� ��の検出を行う。検出方法は定量的な手段で� ��れば特に限定されないが、具体的には、例� ��ば、ウエスタンブロット法又はELISA法が挙� �られる。ここで、ウエスタンブロット法又� �ELISA法による検出には抗HMGB3抗体、抗NFIB抗体 、抗PXDN抗体、抗CLDN12抗体、抗RPIA抗体、抗AKT3 抗体又は抗SNF1LK抗体を用いる必要がある。こ れらの抗体はポリクローナル抗体又はモノク ローナル抗体のいずれであってもよい。また 、これらの抗体は定法により調製することが でき、例えば、先の(5)タンパク質マーカーの 項で述べた方法により調製することができる 。

 また、BADとLGLL2はPKC-iotaによりリン酸化を 受ける。従って、BAD及びLGLL2のリン酸化状態� ��PKC-iotaの活性の指標、すなわちマーカーと� �り得る。BADのリン酸化は、抗リン酸化BAD抗� �を用いたウエスタンブロット法により検出� �ることができる。また、上述した方法で調� �した抗BAD抗体を用いてウエスタンブロット� �行い、BADのバンドを確認した後、当該バン� �が抗リン酸化セリン・スレオニン抗体によ� �検出されるかどうかを確認することによっ� �もBADのリン酸化を確認することができる。LG LL2についても同様にリン酸化を確認すること ができ、LGLL2のリン酸化をマーカーとしてPKC- iotaの阻害活性を検出可能である。

 検出工程でHMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AK T3及びSNF1LKタンパク質の検出が完了した後、P KC-iota阻害剤投与前後の発現量を比較する比� �工程へと進む。比較工程では、検出工程で� �出したHMGB3、NFIB、PXDN、CLDN12、RPIA、AKT3及びSN F1LKタンパク質の発現量と、PKC-iota阻害剤を投 与する前の当該タンパク質の発現量とを比較 することとなる。BAD及びLGLL2の場合はそのリ� ��酸化レベルを比較する。比較の結果、PKC-iot a阻害剤の投与によってSNF1LK、CLDN12及びRPIAの3 タンパク質については発現が増加した場合に 、HMGB3、NFIB、PXDN及びAKT3の4タンパク質につい ては発現が減少した場合には、投与したPKC-io ta阻害剤が投与対象である人体に当該阻害剤� ��適切な作用機序で作用し、投与効果を示し� ��いると判断することができる。また、BAD及� ��LGLL2の場合には、そのリン酸化レベルが低� �している場合にPKC-iota阻害剤が適切な作用機 序で作用し、投与効果を示していると判断す ることができる。これは癌組織が非常に小さ い場合や、医薬開発の臨床試験段階のように 、物理的な癌組織の大きさだけで薬効を測定 することが困難な場合に、PKC-iota阻害剤の薬� ��を測定する方法として非常に有益である。