PRODUITS CHIMIQUES

La présente invention concerne une méthode d'évaluation et de catégorisation du potentiel d' irritation oculaire de produits chimiques.

Pour évaluer l'innocuité de produits chimiques au niveau de l'œil, on connaît le test de Draize qui est un test toxicologique invasif basé sur un protocole d'expérimentation animale, mis au point en 1944 par John H. Draize et Jacob M. Spines, toxicologues de la Food and Drug Administration (FDA) . Le test consiste à tester un produit dans l'oeil d'un animal afin d'évaluer son innocuité oculaire .

En pratique, il consiste à appliquer 0,1 millilitre ou 0,1 gramme d'une substance dans l'oeil d'un animal conscient, souvent un lapin, pendant une à vingt-quatre heures. On observe ensuite, pendant une durée qui peut aller jusqu'à 21 jours, l'éventuelle apparition d'une opacité de la cornée, d'une conjonctivite, d'un oedème, ou encore de sécrétions.

L'utilisation d'animaux en laboratoire dans le cadre du test de Draize est un sujet combattu par les défenseurs des animaux. Au sein de l'Union européenne, l'expérimentation animale est encadrée par la directive 2010/63, qui encourage le développement de méthodes de tests alternatives.

Les produits chimiques sont classifiés selon un système globalisé et mis en place par les Nations Unies connu sous le terme United Nations Globally Harmonized Sytem et concernant les propriétés d'irritation oculaire, les produits sont classés en plusieurs catégories. La catégorie 1 concerne les produits causant des dommages dont on ne constate pas la réversibilité après 21 jours, la catégorie 2A concerne les produits irritants pour les yeux de manière réversible avant 21 jours et la catégorie 2B concerne les produits moyennement irritants pour les yeux de manière réversible avant 21 jours. Les produits non irritants ne sont pas classifiés. La législation Européenne combine les catégories 2A et 2B en une seule catégorie 2 qualifiée d'irritante de manière réversible pour les yeux.

On connaît aussi un procédé pour estimer 1 ' inconfort oculaire ou le potentiel irritant d'un produit chimique tel qu'un produit cosmétique. Ce procédé comprend la culture in vitro d'un modèle d'épiderme, le dépôt du produit que l'on souhaite étudier sur modèle d'épiderme cultivé, et la quantification du nombre de cellules vivantes survivantes afin d'évaluer 1 ' inconfort oculaire ou le potentiel irritant de celui-ci. Un tel procédé, développé en remplacement de l'expérimentation animale, présente l'inconvénient d'être long et coûteux et peu discriminant. De plus cette méthode ne constitue pas une méthode de remplacement intégrale, puisqu'elle ne permet pas de détecter de façon fiable toute la gamme d'irritations intermédiaires . Ainsi, il apparaît qu'il existe un besoin en un test ou méthode permettant d'une part de remplacer le test de Draize et de fournir en particulier une méthode permettant de différencier et de catégoriser rapidement les composés causant une irritation oculaire irréversible à 21 jours de ceux dont les effets sont réversibles avant 21 jours. Les inventeurs de la présente demande se sont donc penchés sur le développement d'un test in vitro pour la détection du potentiel irritant de produits chimiques combinant un modèle cellulaire cornéal à une sélection de marqueurs moléculaires prédictifs et qualitatifs permettant de classifier les composés en 3 catégories, à savoir dommages non réversibles aux yeux 21 jours après application (catégorie 1), dommages réversibles aux yeux 21 jours après application (catégorie 2) et non irritation (no Catégorie) .

De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que la réponse consécutive à l'action d'une substance irritante se fait directement sur un épithélium cornéal reconstruit in vitro, et que le degré d'irritation, et la qualification de cette irritation d'une molécule, peut être déterminé grâce à l'utilisation de biomarqueurs spécifiques de l'irritation oculaire. Il est notable de remarquer, et cela constitue une caractéristique surprenante de la présente méthode, que les marqueurs moléculaires mise en œuvre n'ont jamais été décrits ou divulgués en relation avec l'irritation oculaire.

Les Inventeurs ont mis en évidence qu'un épithélium cornéal reconstruit in vitro constitue un modèle suffisant pour mettre en évidence des biomarqueurs spécifiques de l'irritation oculaire chez l'homme, et que ces biomarqueurs permettent en outre de prédire le degré d' irritation et donc de classifier de manière prédictive les produits testés selon les 3 catégories telles qu' indiquées plus avant . Ainsi, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, comprenant les étapes de: a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon cornéal reconstruit in vitro; b) mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

De préférence, la méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une étape c) de détermination d'un index d'irritation oculaire d'un composé test.

Préférentiellement , la méthode comprend aussi une étape d) de catégorisation dudit composé comme présentant un potentiel d'irritation oculaire selon la valeur de l'index d'irritation oculaire obtenu.

De préférence, la méthode selon la présente invention est une méthode in vitro. Tel qu'utilisé ici, le terme « échantillon cornéal reconstruit in vitro » se réfère à un échantillon de cellules épithéliales de cornée cultivées en milieu de culture défini ou tout modèle utilisant des cellules épithéliales squameuses humaines et présentant une morphologie similaire à la cornée humaine, tels que les modèles de cornée in vitro du type de ceux commercialisés sous la marque EpiOcular®.

Plus particulièrement encore, cet « échantillon cornéal reconstruit in vitro » est un échantillon comprenant, ou constitué par, des cellules épithéliales de cornée immortalisées, cultivées en milieu de culture défini et disposées en couche fine sur une membrane synthétique à l'interface eau-air. De préférence, lesdites cellules épithéliales de cornée immortalisées sont des cellules humaines.

Dans un mode de réalisation particulier, cet « échantillon cornéal reconstruit in vitro » est un échantillon HCE SkinEthic® commercialisé par la société Episkin (Lyon, France) qui est un épithélium de cornée reconstruit constitué de kératinocytes de cornée humaine, particulièrement des cellules transformées pour être rendues immortelles.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous la forme solide, par exemple en poudre .

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous la forme liquide.

Au sens de la présente invention, la mesure de l'expression dudit au moins un gène de l'étape b) permet de déterminer le niveau d'expression dudit gène.

Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc. Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de structure et /ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée.

La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée .

De préférence, dans la méthode selon la présente invention, le niveau d'expression dudit gène est évalué par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau d'expression de l'ARNm dudit gène ou d'un fragment de celui-ci .

Dans un mode de réalisation préféré, l'expression dudit au moins un gène est effectuée par analyse de l'expression de transcrits d'ARNm ou de précurseurs d'ARNm, tel qu'un ARN natif, dudit gène. Ladite analyse peut être réalisée en préparant l'ARNm/ADNc de cellules d'un échantillon biologique d'un patient, et hybridation de l'ARNm /ADNc avec un polynucléotide de référence. L'ARNm/ADNc préparé peut être utilisé dans une analyse par hybridation ou amplification qui inclut, sans s'y limiter, les analyses Southern et Northen, les analyses par PCR (« polymerase chain reaction ») , telle que la PCR quantitative (Taqman) et l'utilisation de sondes (« probes arrays ») telles que les matrices ADN GeneChip® (AFFYMETRIX) .

Avantageusement, l'analyse de l'expression du niveau d'ARNm transcrit dudit au moins un gène implique un procédé d'amplification des acides nucléiques, comme par exemple la RT-PCR (mode de réalisation expérimental décrit dans le Brevet US 4,683,202), la réaction en chaîne par la ligase (BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991), la réplication de séquences auto-entretenue (« self sustained séquence réplication ») (GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990), le système d'amplification transcriptionnelle . (KWOH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989), la « Q-Beta Replicase » (LIZARDI et al., Biol . Technology, vol.6, p: 1197, 1988), la « rolling circle réplication » (U. S. Patent No. 5,854,033) ou toute autre méthode d'amplification d'acides nucléiques, suivie d'une étape de détection des molécules amplifiées par des techniques bien connues de l'homme du métier. Ces modes de détection sont particulièrement utiles pour la détection de molécules d'acides nucléiques en très faibles quantités. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la méthode selon la présente invention comprend une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci.

Telles qu'utilisées ici, les amorces d'amplifications sont définies comme étant une paire de molécules d'acides nucléiques qui peuvent s'apparier respectivement aux régions 3' et 5' d'un gène de façon spécifique (brins positif et négatif, ou inversement) et encadrent une courte région dudit gène. De manière générale, les amorces d'amplification ont une longueur de 10 à 30 nucléotides et permettent l'amplification d'une région d'une longueur comprise entre 50 et 200 nucléotides.

Dans un autre mode de réalisation préféré, la mesure de l'expression dudit au moins un gène est réalisée par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène. Ladite analyse peut être réalisée en utilisant un anticorps (par exemple, un anticorps radiomarqué, marqué avec un chromophore, un fluorophore, ou une enzyme) , un dérivé d'anticorps (par exemple un anticorps conjugué à un substrat ou à une protéine ou un ligand d'une protéine d'un couple ligand/protéine (par exemple biotine-streptavidine) ) ou un fragment d' anticorps (par exemple un anticorps à une seule chaîne, un domaine hypervariable d'un anticorps isolé, etc.) qui se lie spécifiquement au polypeptide codé par ledit gène. Lesdites analyses peuvent être réalisées par de nombreuses techniques à la portée de l'homme du métier incluant, sans s'y limiter, les tests immunologiques basés sur l'utilisation d'activité enzymatique (« enzyme immunoassay » EIA) , les tests immunologiques basés sur l'utilisation d'isotopes radioactifs (RIA) , l'analyse par Western blot et les tests ELISA (« enzyme linked immunoabsorbant assay ») .

Au sens de la présente invention, on entend par « polypeptide » une séquence comprenant au moins deux acides aminés, et les termes « polypeptide », « peptide » et « protéine » peuvent être indifféremment utilisés.

Par « fragment de l'ARNm ou de l'ADNc », on entend une séquence d'au moins 50 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides nucléiques, de préférence d'au moins 200 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides nucléiques, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides nucléiques.

Par « fragment du polypeptide », on entend une séquence d'au moins 50 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides aminés, de préférence d'au moins 200 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides aminés, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides aminés.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins trois gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins quatre gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins cinq gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins six gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins sept gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins huit gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins neuf gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins dix gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASPI, ELN, IL-23R, DLK1,

CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR,

IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins onze gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins douze gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins treize gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61. Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1. Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins trois gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins quatre gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins cinq gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins six gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins sept gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins huit gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins neuf gènes choisis dans le groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme liquide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression des gènes du groupe constitué par : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1. Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins trois gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins quatre gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins cinq gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins six gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins sept gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins huit gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins neuf gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins dix gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins onze gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins douze gènes choisis dans le groupe constitué par : IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Préférentiellement , ladite méthode permet d'évaluer le potentiel d'irritation oculaire d'un composé test, en particulier lorsque la mise en contact du composé test à l'étape a) est réalisée avec le composé test sous forme solide, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression des gènes du groupe constitué par : IL-24, IL- 23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode, lors de l'étape a), le composé test mis en contact avec l'échantillon cornéal reconstruit in vitro est sous la forme liquide ou solide. Lorsque le composé test est liquide, il peut être utilisé pur ou dilué.

Le composé peut être dilué dans un solvant physiologiquement acceptable, tel qu'un tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) par exemple, et est donc présent à une concentration massique comprise entre 0.1 % et 100%. Lorsque le composé est dilué il est présent à une concentration massique comprise entre 10 et 60%, plus particulièrement entre 20 et 50%, plus particulièrement entre 25 et 40% et plus particulièrement encore 30%.

L'étape c) de la méthode comprend la détermination d'un index d'irritation oculaire du composé.

Plus particulièrement, la détermination de l'index d'irritation oculaire du composé comprend l'attribution d'une valeur seuil de surexpression à chaque gène dont l'expression est mesurée.

La valeur seuil de surexpression correspond à un facteur d'augmentation de l'expression du gène lors de la mise en contact avec le composé à tester par rapport à l'expression dudit gène lors de la mise en contact avec un témoin. De préférence, la méthode selon la présente invention comprend en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit gène avec une valeur de référence. Cette valeur de référence peut servir de contrôle positif et/ou négatif . Un contrôle positif peut par exemple être effectué en comparant le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test avec le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé connu comme irritant oculaire.

Par exemple, si le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test est supérieur ou égal au niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé dont le potentiel irritant est connu, on pourra en conclure au potentiel irritant dudit composé.

Un contrôle négatif peut être réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un composé connu comme non irritant comme par exemple l'huile d'olive, le 1, 9- decadiene (CAS # 1647-16-1), le triclobarban (cas # 101- 20-2 ) ou le tampon dans lequel le produit à tester est dissout ou dilué lors de son utilisation dans la méthode.

Dans le cadre de la présente invention, on pourra conclure qu'un composé test présente un potentiel irritant oculaire si une surexpression dudit gène est observée par rapport à son niveau d'expression en l'absence dudit composé test. On entend par « surexpression », un niveau d'expression significativement plus élevé dudit gène par rapport à son niveau d'expression normal. De préférence, on entend par surexpression un niveau d'expression dans un échantillon biologique qui est supérieur à au moins 20% du niveau normal d'expression dudit gène (c'est-à-dire 1,2 fois plus) , de préférence supérieur à au moins 50% du niveau normal d'expression dudit gène (c'est-à-dire 1,5 fois plus) , et de manière particulièrement préférée supérieur d'au moins 90% au niveau normal d'expression dudit gène (c'est-à-dire aussi 1,9 fois plus).

Le « niveau d'expression en l'absence dudit composé test » ou « niveau normal » est le niveau d'expression dudit gène dans un échantillon contrôle correspondant potentiellement à l'échantillon biologique d'un tissu ne présentant pas de réaction de d'irritation ou, de préférence, à la moyenne du niveau d'expression dudit gène dans différents échantillons contrôle non exposé au composé test.

De préférence, l'étape b) est réalisé entre 2 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière encore plus préférée 6 heures après l'étape a) .

Le témoin présentant un niveau d'expression normal consiste à la mise en contact de l'échantillon cornéal reconstruit in vitro avec un liquide physiologiquement acceptable non irritant, tel que par exemple le liquide dans lequel est dissout ou dilué le composé à tester, par exemple un tampon, plus particulièrement par exemple un tampon PBS .

La valeur seuil indiquant une surexpression significative du gène dont l'expression est mesurée peut être comprise en 1,1 et 10, plus particulièrement entre 1,1 et 7, plus particulièrement entre 1,4 et 6, plus particulièrement encore entre 2 et 5, plus particulièrement encore entre 2 et 4.

Comme indiqué plus avant dans un des groupes de gènes sélectionnés, dans le cas de composés test mis en contact à l'étape a) sous la forme liquide, les gènes préférés sont choisis dans le groupe comprenant au moins, ou consistant en, HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 et CCND1. Pour HSP90AA1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement 1,4.

Pour CASP1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1,5.

Pour DLK1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 3 et 8, plus particulièrement environ 5, plus particulièrement encore 5,25.

Pour CLEC4D, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 4, plus particulièrement environ 3,6.

Pour IL-24, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 3 et 8, plus particulièrement environ 6,2.

Pour SLIT2, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1,3. Pour HSPA1A, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 5, plus particulièrement environ 3.

Pour FSHR, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 4, plus particulièrement environ 2,6. Pour IL-1R2, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1,3.

Pour CCND1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1,5.

Comme indiqué plus avant pour un autre groupe de gènes possibles, dans le cas de composés test mis en contact à l'étape a) sous la forme solide, les gènes préférés sont choisis dans le groupe comprenant au moins, ou consistant en, IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4.

Pour IL-24, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,5 et 15, plus particulièrement entre 2 et 10, plus particulièrement 2,3.

Pour IL-24, la valeur seuil de surexpression peut aussi être comprise entre 5 et 15, plus particulièrement 10.

Pour IL-23R, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,5 et 3, plus particulièrement environ 1,9.

Pour DDIT3, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1.5 et 3, plus particulièrement environ 5, plus particulièrement encore 2.

Pour MMP8, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2.5, plus particulièrement environ 1.4. Pour DLK1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 2 et 8, plus particulièrement environ 4.

Pour HAS1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,5 et 5, plus particulièrement environ 3.

Pour CYR61, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,1 et 2, plus particulièrement environ 1.3.

Pour IL-1R2, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,4 et 3, plus particulièrement environ 2.

Pour CLEC4D, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1,5 et 3.5, plus particulièrement environ 2.8.

Pour ICAM2, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 3 et 5, plus particulièrement environ 4.

Pour CASP1, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1.1 et 2, plus particulièrement environ 1.4.

Pour MUC13, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 1.4 et 3, plus particulièrement environ 1.8.

Pour MUC4, la valeur seuil de surexpression est comprise entre 2 et 4, plus particulièrement environ 2.5.

La valeur de seuil de surexpression significative peut, pour chaque gène, être évaluée et déterminée aisément par un homme du métier.

Plus particulièrement encore, la détermination de l'index d'irritation oculaire comprend l'attribution d'une valeur de poids à chaque gène si la valeur seuil de surexpression dudit gène est atteinte suite à la mesure de l'expression.

Ainsi lorsque le seuil de surexpression significative d'un gène donné est atteint, ce gène se voit attribuer une valeur de poids qui peut être différente ou identique selon le gène. Cette valeur de poids peut prendre des valeurs discrètes ou continues, préférentiellement des valeurs discrètes échelonnées entre 1 et 10, à savoir choisies dans le groupe consistant en les valeurs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10. Plus particulièrement, les valeurs discrètes pourront être choisies dans le groupe consistant en les valeurs 1, 2, 3, 4, 5. Plus particulièrement, lesdites valeurs discrètes pourront être 1 ou 2.

A titre illustratif et sans être nullement limitatif, la valeur de poids pourra être limitée à deux valeurs, 1 ou 2, valeur qui sera attribuée au gène lorsque son seuil de surexpression significative sera atteint ou dépassé.

Le choix d' attribuer une valeur de poids plus ou moins élevée dépend de la nature du gène considéré et de son implication qui dans la réponse cellulaire au stress, qui dans la voie métabolique de l' interleukine, qui dans le processus inflammatoire, qui dans la régulation de la croissance cellulaire, qui dans la cicatrisation, qui dans le remodelage cellulaire, par exemple mais aussi de la valeur de seuil de surexpression du gène.

Aussi à titre purement illustratif et pour les gènes ici sélectionnés choisis dans le groupe comprenant, ou consistant en, HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL1R2 et CCND1 ; la valeur de poids pourra prendre un valeur choisie entre 1 et 2. Pour HSP90AA1, la valeur de poids pourra être de 2. Pour CASP1, la valeur de poids pourra être de 2. Pour DLK1, la valeur de poids pourra être de 2. Pour CLEC4D, la valeur de poids pourra être de 2. Pour IL24, la valeur de poids pourra être de 1. Pour SLIT2, la valeur de poids pourra être de 1. Pour HSPA1A, la valeur de poids pourra être de 2. Pour FSHR, la valeur de poids pourra être de 2. Pour IL-1R2, la valeur de poids pourra être de 1. Pour CCND1, la valeur de poids pourra être de 2.

De la même façon, et pour les gènes ici sélectionnés choisis dans le groupe comprenant, ou consistant en, IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13 et MUC4 ; la valeur de poids pourra prendre un valeur choisie entre 1 et 4.

Pour IL-24, avec une valeur seuil surexpression de 2.3, la valeur de poids pourra être de 1.

Pour IL-24, avec une valeur seuil de surexpression de 10, la valeur de poids pourra être de 4.

Pour IL-23R, la valeur de poids pourra être de 4.

Pour DDIT3, la valeur de poids pourra être de 2.

Pour MMP8, la valeur de poids pourra être de 1.

Pour DLK1, la valeur de poids pourra être de 2. Pour HAS1, la valeur de poids pourra être de 2. Pour CYR61, la valeur de poids pourra être de 1. Pour IL-1R2, la valeur de poids pourra être de 4. Pour CLEC4D, la valeur de poids pourra être de 2. Pour ICAM2, la valeur de poids pourra être de 4. Pour CASP1 la valeur de poids pourra être de 2. Pour MUC13, la valeur de poids pourra être de 3. Pour MUC4, la valeur de poids pourra être de 4.

Plus particulièrement, l'index d'irritation oculaire est déterminé par l'addition des valeurs de poids des gènes dont l'expression dépasse la valeur seuil de surexpression. La méthode selon l'invention peut aussi comprendre une étape de catégorisation du composé test comprenant l'attribution d'une catégorie d'irritation au composé test en fonction de la valeur de l'index d'irritation oculaire obtenu . La méthode selon l'invention met ainsi à disposition de l'homme du métier un méthode prédictive permettant de classifier un composé selon son potentiel d' irritation oculaire en suivant la classification Européenne, à savoir non irritant, irritant réversible ou irritant non réversible. Les résultats exposés dans la partie expérimentale de la présente demande démontre cet avantage de l'invention et la supériorité de cette méthode par rapport à celles existantes ressort à l'évidence de ces résultats.

EXEMPLES

Matériels et Méthodes

Modèle d' épithélium de cornée humaine reconstruit (SkinEthic™ HCE)

Le modèle d' épithélium de cornée humaine reconstruit, (SkinEthic™ HCE) a été acheté chez Episkin à Lyon. Le modèle est constitué de cellules épithéliales de cornée humaine immortalisées cultivées dans un milieu défini à la jonction air-liquide. La structure tissulaire obtenue est un épithélium multi-couche similaire à la structure tissulaire naturelle de la cornée humaine comprenant 5 -7 couches pour une surface de 0,5 cm ² . Les cellules polyédriques et les cellules ailées sont également présentes. Le tissu comprend aussi des ultra-structures spécifiques comme les filaments intermédiaires, les hémi- desmosomes matures et les desmosomes. La cytokératine de 65 kD (K3) a également été détectée (Nguyen et al., 2003) . Les tissus sont expédiés sur une couche semi-solide de milieu de culture en agarose. A réception, les tissus sont transférés dans du milieu de maintenance (1 ml/puit) dans des plaques 6 puits et incubés dans une étuve humide à 37°C, 5% CO ₂ . Les tissus sont utilisés 24h plus tard. Produits chimiques

Tous les produits chimiques testés ont été achetés chez Sigma, France. La pureté était de plus de 87% pour tous les produits chimiques testés qui couvraient un large champ des potentiels irritants oculaires possibles.

Préparation des produits chimiques liquides

Les produits liquides sont testés pour leur solubilité dans du tampon PBS (tampon phosphate salin) ou dans de l'huile d'olive. En résumé, 100 μΐ du produit à tester est mélangé à 200 μΐ de PBS ou d'huile d'olive. L'échantillon est mélangé sur un vortex. La turbidité et la séparation de phase éventuelle sont évaluées à l'œil. Les produits sont testés purs ou dilués à 30%. Les produits qui ne sont pas solubles dans le PBS ou l'huile d'olive ne peuvent pas être testé à 30%.

Protocole de traitement pour les produits liquides

La procédure d'application des produits liquides sur les tissus a été optimisée de la façon suivante : les produits chimiques sont testés à deux concentrations 100% et 30%. En résumé, la surface du tissu est humidifiée par l'addition de 20 μΐ de PBS à 37°C et une incubation pendant 10 mn à 37°C / 5% CO ₂ · Les épithéliums cornéens sont ensuite traités topiquement avec 50 ± 2 yL du produit testé (ce qui correspond à 100 yL/cm2) puis incubé pendant 10 mn à température ambiante. Les tissus sont ensuite lavés avec du PBS stérile (2 X 25 ml) à 37°C. Le PBS est déposé sur le rebord de l' insert (pas directement sur le tissu) pour créer un vortex doux qui enlève le produit chimique. Les tissus sur leurs inserts sont ensuite « noyés » dans 5 ml de milieu de maintenance à température ambiante pendant 30 mn afin d'enlever le maximum le produit restant à la surface du tissu. Le milieu est ensuite retiré en tapotant doucement l' insert sur du papier absorbant et on ajoute 50 μΐ de milieu de maintenance à 37°C. Les inserts sont ensuite incubés pendant 6 hr à 37°C / 5% CO ₂ .

Protocole de traitement pour les produits solides

La procédure d'application des produits solides (en poudre) sur les tissus a été optimisée de la façon suivante. Dans un premier temps les produits sont réduits dans la poudre la plus fine possible au moyen d'un mortier. Les produits chimiques sont testés à une seule dose. En résumé, la surface du tissu est humidifiée par l'addition de 20 μΐ de PBS à 37°C et une incubation pendant 10 mn à 37°C / 5% CO ₂ . Les épithéliums cornéens sont ensuite traités topiquement avec 30 ± 2 mg (représentant 60 mg/cm ² ) puis incubé pendant 30 mn à température ambiante. Les tissus sont ensuite lavés avec du PBS stérile (2 X 25 ml) à 37°C. Le PBS est déposé sur le rebord de l' insert (pas directement sur le tissu) pour créer un vortex doux qui enlève le produit chimique. Les tissus sur leurs inserts sont ensuite « noyés » dans 5 ml de milieu de maintenance à température ambiante pendant 30 mn afin d'enlever le maximum le produit restant à la surface du tissu. Le milieu est ensuite retiré en tapotant doucement l' insert sur du papier absorbant et on ajoute 50 μΐ de milieu de maintenance à 37°C. Les inserts sont ensuite incubés pendant 6 hr à 37°C / 5% CO ₂ .

Purification des ARNs totaux

Le procédé de purification des ARNs totaux a été décrit par Cottrez et al., 2015. En résumé, les tissus de cornée sont récupérés avec des pinces et placé dans des tubes pour une congélation rapide dans de l'azote liquide. Les ARNs sont ensuite extraits par la technique du Qiazol (Qiagen, Courtaboeuf, France) avec un kit « RNeasy Mini Kit » selon les instructions du fabricant. En résumé les tissus sont placés dans 1 ml de Qiazol et homogénéisés en utilisant le TissueLyser II (Qiagen, Courtaboeuf, France) avec 2 billes d'acier. Après centrifugation le surnageant est recueilli et 0.2 ml de bromochloro propane (Sigma, France) sont ajoutés, puis l'ensemble est mélangé vigoureusement. L'homogénat est centrifugé à 12' 000 g pendant 15 mn à 4 °C. La phase supérieure (phase aqueuse) est ajoutée à 600 μΐ d'éthanol à 70% et immédiatement mélangée par pipetage. Le mélange est transféré dans une colonne RNeasy spin placée sur un tube de collecte de 2 ml et l'ARN est recueilli selon les instructions du fabricant (Qiagen, Courtaboeuf, France) . Analyse par RT-PCR quantitative

La procédure de RT-PCR quantitative a été décrite par Cottrez et al., 2015. En résumé, la transcription de l'ARN total est réalisée avec 1 yg d'ARN total dans volume final de 20 μΐ en utilisant des « Random Primers » (Invitrogen, France) et la « SuperScript III Reverse Transcriptase » (Invitrogen, France) selon les instructions du fabricant. La RT-PCR quantitative utilise un mélange réactif de PCR : le SYBR Green real time PCR Master Mix (ROCHE, France) avec 0.4 μΜ de chaque primer nucléotidique dans un volume final de 25 μΐ . La réaction est réalisée dans un LC480 System (ROCHE, France). Le programme d'amplification comprend un cycle à 95°C pendant 1 mn, suivi de 40 cycles avec une dénaturation à 95°C pendant 15s, une phase d'hybridation et d'amplification à 60°C pendant 15s, suivi d'une phase d ^x élongation finale à 72°C pendant 40s.

La quantité relative de chaque transcrit est normalisée par rapport à la quantité moyenne d'expression de 5 « housekeeping » gènes (Glucuronidase β-GUSB, vacuolar ATPase-ATP6V0El, H2A Histone Family, Member Y- H2AFY, Glucose- 6-Phosphate Dehydrogenase-G6PD and « non-POU domain containing, octamer-binding »-NONO) .

Analyse des données

Mesure de l'expression de gènes Le taux d'expression des gènes est mesuré par une méthode d'analyse de quantification absolue par la méthode utilisant un algorithme basé sur le maximum de la dérivée seconde développé par Roche. Le taux de surexpression relative (fold increase) est ensuite calculé par rapport aux tissus traités avec du PBS seul.

Définition du modèle de prédiction du test d'irritation oculaire pour les liquides

L'expression de 10 gènes (i.e.: HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, CCND1 (marqués par des étoiles dans la Figure 1) est mesurée dans les modèles d'épithélium cornéen après application soit d'une dose de 100% soit d'une dose de 30% du produit à tester comme indiqué plus haut. Les valeurs de surexpression significative a été fixé pour chacun des gènes à respectivement : 1.4; 1.5; 5.25; 3.6; 6.2; 1.3; 3; 2.6; 1.3 et 1.5. Chaque gène surexprimé reçoit ensuite une valeur fixe de respectivement : 2; 2; 2; 2; 1; 1; 2; 2; 1 ou 2. Un index d' irritation oculaire pour les substances liquides (LU : Liquid Irritation Index) est ensuite calculé par l'addition des valeurs attribuées à chaque gène surexprimé pour une valeur maximale de 17. Lorsque qu'après traitement des tissus par le produit testé la destruction tissulaire est jugée trop importante (l'ARN total collecté représente moins de 10% de la quantité d'ARN collectée dans les tissus traités par le PBS) on attribue une valeur de LU de 20. Le modèle de prédiction et de classification fonctionne de la façon suivante. Chaque produit est testé à 100% et 30% (voir ci-dessus) . Si LU ≥ 10 à 100% et 30%, le produit testé est classé "Cat I". Si LU > 10 à 100% et < 10 à 30%, le produit testé est classé "Cat 2". Si LU < 10 à 100% et 30%, le produit testé est classé "No-Cat".

Définition du modèle de prédiction du test d'irritation oculaire pour les solides

L'expression de 13 gènes (i.e.: IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13, MUC4 (marqués par des étoiles dans la Figure 2)) est mesurée dans les modèles d'épithélium cornéen après application d'une dose de 60 mg/cm ² du produit à tester comme indiqué plus haut. Les valeurs de surexpression significative a été fixé pour chacun des gènes à respectivement : 2.3 et 10 pour l' IL-24; puis pour chacun des autres gène dans l'ordre 1.9; 2; 1.4; 4; 3; 1.3; 2; 2.8 ; 4 ; 1.4 ; 1.8 et 2.5. Chaque gène surexprimé (ou chaque seuil dépassé pour l' IL- 24) reçoit ensuite une valeur fixe de respectivement : 1 ; 4; 4; 2; 1; 2; 2; 1; 4 ; 2 ; 4 ; 2 ; 3 et 4. Un index d'irritation oculaire pour les substances solides (SU : Solid Irritation Index) est ensuite calculé par l'addition des valeurs attribuées à chaque gène surexprimé pour une valeur maximale de 36. Lorsque qu'après traitement des tissus par le produit testé la destruction tissulaire est jugée trop importante (l'ARN total collecté représente moins de 10% de la quantité d'ARN collectée dans les tissus traités par le PBS) on attribue une valeur de SU de 40. Le modèle de prédiction et de classification fonctionne de la façon suivante. Chaque produit est testé à 60 mg/cm ² (voir ci-dessus) . Si SU ≥ 20 le produit testé est classé "Cat I". Si 10 < SU < 20 le produit testé est classé "Cat 2". Si SU < 10 le produit testé est classé "No-Cat".

Critères d' acceptabilité pour les liquides

Deux produits chimiques « contrôle » sont testés en parallèle aux produits testés. Un non-irritant : le 1, 9- decadiene (CAS # 1647-16-1) testé à 100%, et un produit de Catégorie 2 : le 2-methyl-l-pentanol (CAS #105-30-6) testé à 100% et 30%. L'essai est considéré comme valide si les valeurs de LU obtenus pour le 1 , 9-decadiene testé à 100% et le 2-methyl-l-pentanol testé à 30% sont inférieures àlO et si le LU pour le 2-methyl-l-pentanol testé à 100% est >10.

Chaque produit chimique est testé deux fois sur deux lots différents de tissu d'épithélium de cornée. Si ces deux analyses ont donné la même classification le test est considéré comme valide, sinon une troisième ou une quatrième analyse sont effectuées.

Critères d' acceptabilité pour les solides

Deux produits chimiques « contrôle » sont testés en parallèle aux produits testé. Un non-irritant : le triclobarban (cas # 101-20-2 ) et un produit de Catégorie 2 : le naphthalene dione (cas # 83-56-7) . L'essai est considéré comme valide si la valeur de SU obtenus pour le triclobarban est <10 et si la valeur obtenue pour le naphthalene dione est comprise entre 10 et 20.

Chaque produit chimique est testé deux fois sur deux lots différents de tissu d'épithélium de cornée. Si ces deux analyses ont donné la même classification le test est considéré comme valide, sinon une troisième ou une quatrième analyse sont effectuées.

Analyse statistique Statistiques de Cooper

Les valeurs de l'analyse statistique selon Cooper (Sensibilité, Spécificité et Précision) (Cooper et al., 1979) sont calculés pour le test d'irritation oculaire en utilisant comme référence les données de la littérature pour le test de Draize (Barroso et al., 2016) . Une table de contingence 2X2 avec les irritants et les non-irritants comme paramètre est construite en utilisant les résultats obtenus avec le test d'irritation oculaire. Sensibilité, Spécificité et Précision sont ensuite calculés en utilisant les préconisations de Copper . (Cooper et al., 1979) .

Analyse par matrice de confusion

Pour les statistiques utilisant les matrices de confusion et le calcul du Kappa nous avons utilisé les préconisations de Landis et Koch (Landis and Koch, 1977) . Résultats

Sélection des gènes biomarqueurs des mécanismes d' irritation oculaire

Pour identifier les gènes impliqués dans les mécanismes d'irritation oculaire nous avons utilisé un outil d'analyse de données développés en collaboration avec Dieng-Kuntz et coll. (Dieng-Kuntz et al., 2006) . Un premier groupe de 900 gène a été sélectionné. Parmi cet important groupe de gène candidat nous avons sélectionné des gènes dont l'expression est modulée dans des échantillons prélevés à la surface de l'œil humain par un dispositif de collecte d'empreintes conj onctivales (Roy et al., 2013) . Puis nous avons utilisé une analyse de l'expression de gêne obtenu après utilisation d'un groupe de 10 produits chimiques (Table 1 #1-10) appliqué sur le modèle de tissu Skinethic HCE, associé à une recherche par data mining de la littérature existante. Cette analyse nous a permis de définir un groupe de 92 gènes impliqués dans les mécanismes qui aboutissent à une irritation oculaire (Table 2) .

Développement du modèle de prédiction du test d'irritation oculaire pour les liquides

La modification d'expression des 92 gènes que nous avons sélectionnés comme représentant de potentiels candidats biomarqueurs (Table 2) a été analysée après traitement avec 39 produits chimiques (Table 1) . En utilisant un sous- groupe de 29 gènes : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61 (Figure 1) il a été possible de classer les 39 produits chimiques dans l'une des 3 catégories d'irritation oculaire mises en place par le référentiel UN-GHS . Cependant, comme certains des gènes avaient un rôle redondant et pouvaient se substituer entre eux, nous avons pu sélectionner un sous-groupe de 10 gènes permettant de mettre au point un index d' irritation pour les liquides (LU) capable de discriminer les 3 catégories d'irritants. La liste des gènes sélectionnés pour les liquides inclus : HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 and CCND1 (indiqués dans la Figure 1) . Le LU a été élaboré en deux étapes. Nous avons tout d'abord sélectionné une valeur seuil pour chaque gène permettant de mettre en évidence une surexpression significative. Différentes valeurs de seuil ont été testées et les valeurs optimales retenues pour ces 10 gènes ont été respectivement de : 1.4; 1.5; 5.25; 3.6; 6.2; 1.3; 3; 2.6; 1.3 and 1.5. Nous avons ensuite attribué un poids à ces valeurs en fonction de l'importance de la surexpression du gène considéré dans les mécanismes d'irritation oculaire. Chaque gène surexprimé au-dessus de la valeur seuil recevait alors une valeur pondérée de respectivement : 2; 2; 2; 2; 1; 1; 2; 2; 1 et 2. Le LU est ensuite calculé en additionnant les valeurs de poids pour chacun des gènes surexprimés avec un maximum de 17. Lorsque le niveau de destruction tissulaire et jugé trop important (voir Matériels et Méthodes) une valeur de 20 est appliquée. Analyse des résultats obtenus par le test d'irritation oculaire avec les 39 produits liquides testés.

Les prédiction de classification obtenus avec les test d'irritation oculaire sur les 39 produits chimiques (Table 3) ont été comparé à ceux obtenus avec le test de Draize dans une table de contingence 2X2 pour évaluer la prédictivité du test à distinguer dans un premier temps les produits irritants (Cat 1 and Cat 2) des produits non irritants (No-Cat) (Table 4) . Une spécificité, une sensibilité et une précision de 100% ont été obtenus sur ce groupe de 39 produits chimique.

Nous avons ensuite analysé une matrice de confusion contenant 3 classes (Cat 1, Cat 2 and No-Cat, voir Table 5) pour calculer les performances du test à classer les produits selon les normes UN-GHS . Une précision pour l'utilisateur de 91.66%, 93.33% and 100% a été obtenu pour respectivement les produits classé Cat 1, Cat 2 et No-Cat. Avec une précision générale de 95% et un kappa hautement significatif de 0.923.

Ces résultats montrent que le test d' irritation oculaire est très efficace pour classer le potentiel d' irritation oculaire des produits chimiques liquides dans les 3 classes définies par le référentiel UN-GHS. Développement du modèle de prédiction du test d'irritation oculaire pour les solides

Pour les solides nous avons testé 15 produits chimiques (Table 6) . En utilisant le même groupe de 29 gènes : HSP90AA1, COL7A1, NOS3, MMP8, CASP1, ELN, IL-23R, DLK1, CLEC4D, IL-24, CCL22, SLIT2, ICAM2, MUC13, HSPA1A, FSHR, IL-1R2, ALB, CCND1, CXCL1, CXCR1, KL, COL6A2, MUC4, DDIT3, MMP3, HAS1, IRF1, CYR61 (Figure 2) il a été possible de classer les 15 produits chimiques dans l'une des 3 catégories d' irritation oculaire mises en place par le référentiel UN-GHS . Cependant, comme certains des gènes avaient un rôle redondant et pouvaient se substituer entre eux, nous avons pu sélectionner un sous-groupe de 13 gènes permettant de mettre au point un index d' irritation pour les solides (SU) capable de discriminer les 3 catégories d'irritants. La liste des gènes sélectionnés pour les solides inclut : (IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2, CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13, MUC4. Figure 2) . Le SU a été élaboré en deux étapes. Nous avons tout d'abord sélectionné une valeur seuil pour chaque gène permettant de mettre en évidence une surexpression significative. Différentes valeurs de seuil ont été testées et les valeurs optimales retenues pour ces 13 gènes ont été respectivement de 2.3 et 10 pour l' IL-24; puis pour chacun des autres gènes dans l'ordre 1.9; 2; 1.4; 4; 3; 1.3; 2; 2.8 ; 4 ; 1.4 ; 1.8 et 2.5. Nous avons ensuite attribué un poids à ces valeurs en fonction de l'importance de la surexpression du gène considéré dans les mécanismes d'irritation oculaire. Chaque gène surexprimé au-dessus de la valeur seuil recevait alors une valeur pondérée de respectivement : 1; 4; 4; 2; 1; 2; 2; 1; 4 ; 2 ; 4 ; 2 ; 3 et 4. Le SU est ensuite calculé en additionnant les valeurs de poids pour chacun des gènes surexprimés avec un maximum de 36. Lorsque le niveau de destruction tissulaire et jugé trop important (voir Matériels et Méthodes) une valeur de 40 est appliquée.

Analyse des résultats obtenus par le test d'irritation oculaire avec les 15 produits solides testés.

Les prédiction de classification obtenus avec les test d'irritation oculaire sur les 15 produits chimiques solides (Table 7) ont été comparé à ceux obtenus avec le test de Draize dans une table de contingence 2X2 pour évaluer la prédictivité du test à distinguer dans un premier temps les produits irritants (Cat 1 and Cat 2) des produits non irritants (No-Cat) (Table 8) . Une spécificité, une sensibilité et une précision de 100% ont été obtenues sur ce groupe de 15 produits chimique.

Nous avons ensuite analysé une matrice de confusion contenant 3 classes (Cat 1, Cat 2 and No-Cat, voir Table 9) pour calculer les performances du test à classer les produits selon les normes UN-GHS . Une précision pour l'utilisateur de 100% a été obtenue pour les produits classés Cat 1, Cat 2 et No-Cat. Avec une précision générale de 100% et un kappa parfaitement significatif de 1. Ces résultats montrent que le test d' irritation oculaire est très efficace pour classer le potentiel d' irritation oculaire des produits chimiques dans les 3 classes définies par le référentiel UN-GHS. Légende des figures

Figure 1 A, B, C, D: Analyse d'expression génique dans le tissu cornéal humain reconstruit en 3D traité avec différents produits chimiques liquides irritants et non irritant irritants.

La valeur du taux de surexpression (fold increase) pour les 29 gènes indiqués a été représentée pour 4 produits chimiques de catégorie 1 (barre noires, dans l'ordre de gauche à droite acide lactique, methyl thioglycolate, sodium lauryl sulfate (15%), Benzalkonium choride (10%)), 4 produits chimiques de catégorie 2 (barres grises, dans l'ordre de gauche à droite alpha hexyl cinnamaldehyde, acétone, methyl ethyl ketone, 3-chloro propane nitrile) et 4 produits non classés (No category, barres blanches dans l'ordre de gauche à droite : 1,9 decadiene, Glycerol, Tween 20, 2,4 pentanediol) . Chaque produit chimique a été appliqué à 100% (A et B) ou dilué à 30% (C et D) . Les gènes utilisés pour l'exemple sont HSP90AA1, CASP1, DLK1, CLEC4D, IL-24, SLIT2, HSPA1A, FSHR, IL-1R2 and CCND1.

Figure 2 A et B : Analyse d'expression géniques dans le tissu cornéal humain reconstruit en 3D traité avec différents produits chimiques solides irritants et non irritant irritants. La valeur du taux de surexpression (fold increase) pour les 29 gènes indiqués a été représentée pour 5 produits chimiques de catégorie 1 (barre noires, dans l'ordre de gauche à droite, 2 hydroxyisobutyric acide, Hydrochloride de Promethazine, Sodium oxalate, 2,5-dimethyl heanediol, 1- naphthalene acetic acide) , 2 produits chimiques de catégorie 2 (barres grises dans l'ordre de gauche à droite, Naphthalene diol, Camphene) et 8 produits non classés (No category, barres blanches dans l'ordre de gauche à droite Triclocarban, Methylenebis benzotriazol tetramethylbutyl phénol, Pyrimetranyl , Myristil myristate, 4,4' Méthylène bis- (2, 6-di-tert-butylphenol) , 4-bromophenetol, Potassium tetrafluoroborate) . Chaque produit chimique a été appliqué à pur en poudre (30 ± 2 mg (représentant 60 mg/cm ² )) . Les gènes sélectionnés pour l'exemple sont IL-24, IL-23R, DDIT3, MMP8, DLK1, HAS1, CYR61, IL-1R2 CLEC4D, ICAM2, CASP1, MUC13, MUC4.

Table 1 : Liste des produits liquides étudiés

Table 2 : Liste des gènes analysés par RT-PCR Table 3:Résultats de l'analyse des 39 produits liquides testés par le test d'irritation oculaire (TIO) et comparaison avec les résultats obtenus par le test de Draize

Table 4: Mesure de la capacité de prédiction du test d' irritation oculaire pour différencier les irritants oculaires (classés comme Cat 1 ou Cat 2) des non irritants (no Cat) sur un set de 39 produits chimiques

Table 5 : Analyse par matrice de confusion de la capacité de prédiction du test d' irritation oculaire à séparer entre 3 classes d'irritation (Cat 1, Cat 2 and no Cat) selon les recommandations UN-GHS .

Table 6 : Liste des produits chimiques solides étudiés

Table 7:Résultats de l'analyse des 15 produits solides testés par le test d'irritation oculaire (TIO) et comparaison avec les résultats obtenus par le test de Draize

Table 8: Mesure de la capacité de prédiction du test d' irritation oculaire pour différencier les irritants oculaires (classés comme Cat 1 ou Cat 2) des non irritants (no Cat) sur un set de 15 produits chimiques solides

Table 9 : Analyse par matrice de confusion de la capacité de prédiction du test d' irritation oculaire à séparer entre 3 classes d'irritation (Cat 1, Cat 2 and no Cat) selon les recommandations UN-GHS des 15 produits solides.