L'invention concerne un procédé pour la mise en évidence et la mesure de la migration des kératinocytes dans un substrat à base de fibrine. La reproductibilité du test permet de l'utiliser pour l'évaluation de diverses conditions biologiques, chimiques ou physiques sur la capacité migratoire des cellules .

Les kératinocytes représentent plus de 90 % des cellules de l'epiderme humain. Le renouvellement permanent de l'epiderme est assuré par les kératinocytes situés dans la couche basale. Dès qu'ils ont quitté celle-ci, ils perdent la capacité de se diviser et ils se différencient pour former la couche cornée. Au contact de glycoprotéines de la membrane basale, les kératinocytes établissent des structures d'adhérence forte (les hémidesmosomes) qui les rendent immobiles latéralement. Par contre en cas de réépithélialisation de plaies, les kératinocytes basaux entrent en contact avec d'autres molécules comme la fibronectine, le collagène, la thrombospondine ... qui induisent une importante mobilité latérale de ces kératinocytes et favorisent ainsi la cicatrisation.

Différentes techniques sont utilisées pour étudier la migration cellulaire : - l'observation au microscope couplé à une caméra vidéo permet de suivre le déplacement des cellules de manière continue (le procédé est coûteux et nécessite un matériel complexe comprenant un mini-incubateur à CO2 placé sous un microscope équipé d'une caméra) .

- la mesure de la migration à partir d'expiants insérés dans des gouttes d'agarose ("agarose drop explant") ou dans des "chambres de Boyden" (migration au travers de membranes poreuses) ne permettent qu'une évaluation collective de migration et de prolifération cellulaires. le déplacement individuel de cellules a été observé sur des lamelles de verre recouvertes de particules d'or colloïdal, avec des cellules 3T3

(G.Albrecht-Buehler - Cell 11, 1977, 395) : les cellules migrent en ingérant les particules d'or, ce qui laisse une

trace visible de leur déplacement (après fixation au formaldéhyde, les cellules sont photographiées au microscope en champ noir ; les traces de migrations apparaissent en noir dans le champ brillant de particules d'or) ; ce test a reçu le nom de "phagokinetic track assay" . Il a pu être reproduit avec des kératinocytes à condition de recouvrir la couche d'or colloïdal d'une matrice de collagène IV (Y.Ando et P.J.Jensen J.Invest Dermmat .100, 1993, 633) . Ce test permet d'étudier l'influence de divers facteurs de croissance, cytokines ou hormones sur la migration des cellules.

La Demanderesse a mis au point un nouveau procédé d'observation de la migration des kératinocytes dans des conditions plus physiologiques que celles décrites précédemment (c'est à dire sans phagocytose de particules d'or) et plus particulièrement en situation proche de celle de la réépithélialisation d'une blessure.

Quand une blessure cutanée se produit, le premier événement qui intervient est la formation d'un caillot de fibrine dont la fonction est d'arrêter le saignement. Ensuite les kératinocytes migrent sous ce caillot, à partir de la couche basale des bords de la blessure.

Par analogie avec ce mécanisme, la Demanderesse a déjà décrit (brevets FR 2 639 958 et EP 0 373 044) l'utilisation d'un support à base de fibrine pour la culture de kératinocytes, ladite culture étant directement utilisable comme greffon. Dans ce système, la présence d'une antiprotéase, en particulier 1 'aprotinine, est indispensable pour empêcher la dégradation du substrat de fibrine par les protéases des cellules et du sérum. La Demanderesse a maintenant montré que le même substrat, mais dépourvu d'aprotinine, permet d'observer la migration des kératinocytes, inoculés à faible densité cellulaire (environ 10-3 cells/cm^) en présence d'une faible quantité de sérum. Dans des conditions identiques, les fibroblastes du derme humain ne présentent aucune mobilité.

Le comportement des kératinocytes n'est pas homogène

- une fraction des cellules (65 %) est immobile ou présente un déplacement inférieur au diamètre d'une cellule,

- l'autre fraction des cellules (35 %) se déplace en dégradant le substrat de fibrine et en y laissant l'empreinte de son passage sous forme de galeries cylindriques ou hélicoïdales. La taille de ces galeries est assez constante : en moyenne 19- 20 μm de longueur et un peu plus d'une cellule de diamètre (12-15 μm) par heure.

Les kératinocytes en migration ont un aspect sphérique et leur mouvement comprend une rotation, soit dextrogyre soit lévogyre (en moyenne 50 % de chaque type) , comme on peut l'observer sur les photographies des empreintes dans la fibrine.

En absence de sérum, les kératinocytes ne migrent pas. Le sérum apporte probablement la quantité de plasminogene (qui sera activé en plasmine) nécessaire à la dégradation de la fibrine en présence des protéases cellulaires .

La Demanderesse a tiré parti de ce phénomène pour mettre au point un procédé d'évaluation de la migration des kératinocytes à la fois simple, rapide et ne nécessitant pas d'équipement sophistiqué, et qui permet ainsi d'étudier l'effet de divers facteurs ajoutés au milieu de culture des cellules ainsi que de diverses conditions physiques, biologiques ou chimiques. Ce test est ainsi particulièrement avantageux pour des études à but dermatologique ou cosmétologique .

Le procédé selon l'invention comprend :

- l'utilisation de plaques multipuits pour cultures de cellules ou de lamelles pour observation microscopique, recouvertes d'une fine couche transparente de fibrine réticulée en présence de thrombine ;

- l'utilisation, pour former ladite couche de fibrine, d'un concentré de fibrinogène approprié pour former une colle biologique, dépourvu d'antiprotéase exogène ; - l'inoculation des kératinocytes à très faible densité cellulaire, de préférence de l'ordre de 10-^ cellules par cm^ ; l'incubation en milieu de culture pour kératinocytes

additionné de 1 à 10 % de sérum, en absence d'antiprotéase exogène (en particulier en absence d'aprotinine) , pendant 20 à 24 heures à 37°C ;

- l'élimination du milieu de culture et la fixation des kératinocytes au formaldéhyde ;

- l'observation au microscope, éventuellement après photographie, d'un nombre de champs statistiquement significatif et le comptage des kératinocytes ayant migré et l'évaluation de la longueur de l'empreinte de leur migration. Le procédé selon l'invention peut être utilisé avantageusement pour étudier l'effet sur la migration des kératinocytes :

- de facteurs physiologiques comme les hormones, les cytokines ou toute molécule susceptible d'en influencer le métabolisme ; - de molécules d'intérêt thérapeutique du type des facteurs favorisant la cicatrisation ;

- de molécules d'intérêt cosmétologique comme des facteurs de protection contre les rayonnements, la température ou toute condition physique ou chimique délétère pour l'epiderme. Le procédé selon l'invention peut aussi être utilisé pour étudier l'effet de conditions physiques, chimiques ou biologiques (comme le contact avec des cellules nourricières) susceptibles d'affecter le métabolisme des kératinocytes.

Le procédé selon l'invention peut encore être utilisé pour étudier l'état biologique des kératinocytes afin de diagnostiquer tout état pathologique comme une déficience en facteur de cicatrisation ou un état de transformation néoplasique.

La mise en oeuvre du procédé pour l'évaluation de différentes conditions de culture sera mieux comprise dans les exemples qui suivent. Ceux-ci ne constituent pas une limitation de la portée de l'invention.

La figure 1 est décrite dans l'exemple 1,3.

Exemple I - Mise au point du test. Choix des cellules. 1. Préparation du substrat.

Le substrat de fibrine réticulée est préparé à

partir d'une préparation commerciale de colle biologique (Biocol® - Thrombine humaine fournie par Biotransfusion-Lille- France) . Le concentré de fibrinogène lyophylisé de cette préparation est un concentré de protéines plasmatiques humaines comprenant plus de 70 % de fibrinogène, du Facteur XIII et de la fibronectine (EP 0 305 243) . La quantité lyophilisée dans un flacon de 5 ml est reconstituée dans 10,8 ml d'eau bidistillée stérile. La thrombine humaine lyophilisée, dosée à 500 U NIH/ml est diluée avec du sérum physiologique pour obtenir une concentration finale de 5 à 10 U/ml. Les deux composants sont reconstitués en moins de 15 minutes à température ambiante ; ils sont injectés simultanément sur le fond des puits de culture (plaque multipuits pour culture cellulaire, distribuée par exemple par Nunc®) à l'aide du mélangeur fourni dans la trousse de BiocolΦ-thrombine . Chaque puits de culture de 35 mm de diamètre reçoit 0,25 ml de chacun des deux constituants. En quelques minutes il se forme un réseau uniforme de fibrine transparente, prête à l'emploi, d'une épaisseur moyenne de 50 à 100 μm.

2. Cellules.

Les kératinocytes proviennent d'une culture fraîchement préétablie. Des kératinocytes provenant de différentes parties du corps (16 prélèvements) ont été utilisés entre les passages 2 et 7, avec des résultats semblables, indépendamment de l'âge du donneur. Par contre des cellules primaires (fraîchement isolées et non établies en culture) ne présentent pas de capacité de migration dans la fibrine . Les cultures de kératinocytes trypsinisées et diluées en milieu de culture sont ensemencées à une densité de 10^ cellules par puits de 35 mm de diamètre. Elles sont incubées à 37°C en milieu de culture contenant 10 % de sérum foetal bovin, en absence d 'antiprotéase exogène et en absence de couche nourricière de cellules 3T3.

3. Observation de la migration des cellules.

Après 24 heures d'incubation à 37°C, le surnageant

O 97/25617 6 PC17FR97/00020

des cultures est jeté et les cellules adhérentes au substrat sont fixées avec une solution à 3,7 % de formaldéhyde pour être observées au microscope. On utilise un objectif de grossissement 10. Des mesures statistiquement valables sont obtenues par observation de 18 champs microscopiques pris au hasard (6 champs par boîte et 3 boîtes par condition expérimentale, c'est-à-dire pour un point sur un graphique) .

Quand on applique le test à l'évaluation du rôle d'un facteur de croissance (ou toute autre molécule), celui-ci est additionné dans le milieu de culture des cellules, sans période de préincubation.

Un résultat typique après 24 heures d'incubation est présenté sur la figure 1 : la photo A montre un fibroblaste humain les photos B et C montrent un kératinocyte immobile et un très peu mobile les photos D à F montrent des kératinocytes très mobiles .

En particulier la photo F montre l'empreinte hélicoïdale régulière laissée dans la fibrine par la migration de la cellule.

Exemple TI - Reproductibilité du test.

4 lots de Biocol® ont été utilisés et les kératinocytes d'une culture préétablie ont été ensemencés, comme décrit plus haut, et incubés à 37°C pendant 24 heures. La proportion de cellules mobiles est similaire pour les 4 lots :

lots de Biocol® de cellu île s mobi .les 0730 23 0960 31 0830 28 0870 30 moyei nne : 28 %

Avec un type cellulaire choisi la reproductibilité du test est

O 97/25617 PC17FR97/00020

excellente et permettra donc d'analyser l'influence de divers facteurs physiques ou chimiques.

Exemple TTI - Variabilité de la migration cellulaire

Différents types de kératinocytes migrent plus ou moins fort, mais au sein d'une lignée le pourcentage de cellules qui migrent est bien reproductible.

3 lignées de kératinocytes ont été testées au quatrième et cinquième passages en culture, dans les conditions décrites plus haut.

Culture (code de laboratoire) % de cellules mobiles

(moyenne de 7 expériences)

YF29 V 44 YE1 IV 31 AFL1 IV 14

De manière surprenante, on a observé que des kératinocytes immortalisés ou néoplasiques (provenant de carcinomes à cellules squameuses) ont pratiquement perdu leur capacité migratoire. Cette observation peut être corrélée à la faible tendance métastasique de ces cellules.

Cette observation souligne l'intérêt diagnostic potentiel du test selon l'invention.

Exemple IV - Etat de différenciation des kératinocytes

Les kératinocytes ont été ensemencés sur le substrat de fibrine à partir d'une même culture établie depuis 5, 6, 7 et 10 jours. On constate que la mobilité des kératinocytes est inversement proportionnelle à l'âge de la culture

jours de culture % de cellules de YF29 V mobiles

5 50

6 35

7 18

10 5

D'autre part, on observe que des kératinocytes fraîchement isolés ne migrent pas et ne dégradent pratiquement pas la fibrine pendant les 2 premiers jours suivant la mise en culture.

48 heures plus tard leur migration est de 6μm/heure et après quelques passages en culture, leur migration est de 48μm/heure. Ce résultat coïncide avec l'observation, in vivo, du début de la cicatrisation d'une blessure après plus d'un jour, les cellules devant passer du stade "établies" à un stade "hyperprolifératif" .

Exemple Y - Mise e_π évidence d≤ l'effet de_s facteurs de croissance Différentes souches de kératinocytes ont été ensemencées sur le substrat de fibrine avec ou sans apport d'EGF ("epidermal growth factor") à 10 ng/ml. La proportion moyenne de cellules mobiles est doublée en présence d'EGF (moyenne de 3 expériences) : % de cellules mobiles souches sans EGF avec EGF

YF 29 34 69

YE 1 26 47

AFL 1 14 51

De plus la proportion de cellules mobiles augmente avec la concentration d'EGF.

Dans un test réalisé avec des kératinocytes provenant d'une culture jeune, non confluente, on a observé le résultat suivant : concentration % de kératinocytes en EGF (ng/ml) mobiles

0 21

0,1 43 1 57

10 64

De plus l'EGF augmente la vitesse de migration parce que la longueur des empreintes dans la fibrine est significativement plus longue.

Exemple VT - Mise e_Q évidence d'effets négatifs s_u_r La migration-

Le même test permet d'étudier l'effet inhibiteur de certains facteurs sur la migration des kératinocytes . A titre d'exemple on a mesuré la migration (en présence et en absence d'EGF) en présence de 3 concentrations de thrombine :

thrombine Ul/ml % de kératinocytes mobiles sans EGF avec EGF

0 36 54

10 28 47

30 11 24

100 12 24

La thrombine inhibe la mobilité ; cet effet est moins marqué en présence d'EGF.