La présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test et à une trousse pour la mise en œuvre de ladite méthode.

Les industries de la parfumerie, de la cosmétique et de la pharmacie se doivent de rester compétitives et performantes et continuer à proposer régulièrement des produits nouveaux, avec comme contrainte de répondre aux normes de sécurité pour l'homme et son environnement attachées à leur utilisation. Or l'allergie de contact est l'un des risques majeurs associés à l'utilisation de tels produits.

L'allergie cutanée de contact (ou dermatite atopique) est un problème de santé publique majeur chez l'homme. Elle représente une manifestation immunotoxique environnementale sérieuse, contraignante, dont il est important d'anticiper les effets lorsque l'on met sur le marché des produits susceptibles de la provoquer. La sensibilisation cutanée et, par conséquent la manifestation allergique associée, est le résultat dans un premier temps de l'interaction d'une molécule allergénique avec des cellules spécialisées de l'épiderme, les cellules présentatrices de l'antigène (cellules de Langerhans, cellules dendritiques) puis dans un second temps de leurs présentations par ces cellules à des lymphocytes effecteurs T CD4 ⁺ et CD8 ⁺ . Ce sont ces derniers qui sont à la base de la réaction allergique et inflammatoire. Néanmoins, les allergènes, en particulier ceux qui peuvent être présents dans un parfum, sont des petites molécules qui ne peuvent pas être reconnues directement. Leur reconnaissance nécessite leur association préalable avec des protéines du soi. Ainsi, c'est le complexe hétérodimérique néoformé dans la peau qui sera ultérieurement présenté aux cellules T dans les ganglions proximaux. Par conséquent, la faculté d'une molécule chimique (composé de parfum ou ingrédient cosmétique) à s'associer à une protéine de l'utilisateur de ce produit est un préalable obligatoire à l'induction de la réaction pathologique (cutanée) consécutive. Cette réaction pathologique (cutanée) pourra soit être une irritation, soit une sensibilisation, soit dans la majorité des cas, à la fois une irritation et une sensibilisation.

L'irritation est une inflammation réversible des tissus vivants par action chimique au site de contact. Celle-ci se reconnaît par un œdème consécutif à un afflux de fluides dans les tissus, une rougeur, de la chaleur et/ou de la douleur. En réponse à une agression chimique, les kératinocytes de l'épiderme et les fïbroblastes du derme sont stimulés et vont libérer dans la peau des cytokines IL1, TNF alpha, IL6, IL8, ainsi que des médiateurs comme les prostaglandines (PGE2) qui vont initier la réponse inflammatoire.

Les hypersensibilités retardées et immédiates à la base de la sensibilisation impliquent une notion de « mémoire » ce qui souligne leur caractère irréversible contrairement à l'irritation. Dans un cas comme dans l'autre, les mécanismes se déroulent en deux phases :

la première, dite phase de sensibilisation, pendant laquelle l'antigène/allergène est présenté au système immunitaire et en particulier aux lymphocytes T qui enregistrent le signal moléculaire et régulent, via les cytokines produites, les autres populations cellulaires impliquées (lymphocytes B, T CD8, cellules endothéliales, macrophages, mastocytes, kératinocytes etc ..) ;

- la seconde phase, dite la phase effectrice, pendant laquelle différentes populations cellulaires cutanées vont intervenir par l'intermédiaire de médiateurs chimiques responsables des désordres pathologiques. Dans le cas de l'hypersensibilité immédiate, la génération d'anticorps anaphylactiques comme les IgE, en se fixant sur les mastocytes et les basophiles, va conduire à la libération d'histamine, principal vecteur des manifestations allergiques. Dans le cas de l'hypersensibilité retardée, ce sont des cellules T de type cytotoxique (TCD8) qui en détruisant les kératinocytes sont responsables des lésions cutanées.

Ainsi, même si d'un point de vue histologique les dermatites de contact allergiques et irritantes sont très voisines, les conséquences immuno logiques analysées au niveau cellulaire ne sont pas pour autant similaires. Il est par conséquent important de posséder des méthodologies fiables permettant de les distinguer. Une approche prédictive originale est d'autant plus nécessaire qu'actuellement aucune corrélation claire n'a été mise en évidence entre une structure moléculaire donnée et l'allergénécité prise au sens large du terme. Jusqu'à présent, des animaux étaient utilisés pour identifier les molécules sensibilisantes au niveau cutané et le LLNA (local lymph node assay) basé sur la prolifération induite des lymphocytes ganglionnaires après contact avec le sensibilisant a été développé. Ce test a été adopté comme « Testing guideline 429 » par l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) et est considéré encore à ce jour comme le test de référence pour la détermination d'un agent chimique sensibilisant.

Les nouvelles contraintes européennes imposent désormais l'utilisation de méthodes n'utilisant pas d'animaux et il est donc indispensable de mettre au point des méthodes alternatives permettant de déterminer si une composition nouvelle ou un produit nouveau est susceptible de représenter un risque pour l'homme par ses propriétés sensibilisantes. La présente invention est basée sur l'élucidation du changement global en terme d'expression génique à partir de tissus cutanés ou de cellules exposés à des agents toxiques et plus particulièrement des sensibilisants en comparaison avec des irritants ou des tissus/cellules témoins non exposés ou exposés au seul véhicule nécessaire à la solubilisation ou l'application des substances testées.

De manière surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que certains gènes représentent la signature moléculaire de l'action sensibilisante et/ou irritante, permettant ainsi de différencier l'action d'un sensibilisant en comparaison d'un irritant, démontrant ainsi que les toxiques répondant à ces qualificatifs impliquent des voies métaboliques identifiables.

De plus, les Inventeurs ont mis en évidence que certains gènes représentent à la fois la signature moléculaire de l'action sensibilisante et irritante, permettant ainsi de différencier en un seul test le potentiel à la fois sensibilisant et irritant d'un composé.

Par ailleurs, les Inventeurs ont montré que la reconnaissance in vivo d'une substance ne se fait pas au niveau du ganglion drainant, comme cela est généralement admis, mais bien au niveau du tissu où la substance entre en contact avec l'organisme dans le cas présent : la peau. Cela expliquerait pourquoi certaines substances sont sensibilisantes dans un tissu et pas dans un autre comme cela est souvent observé. Il apparaît donc que c'est la réaction du tissu cutané qui instruit le message aux cellules présentatrices de l'allergène : les cellules dendritiques vont alors le transmettre aux lymphocytes T dans le ganglion drainant.

Les Inventeurs ont mis en évidence que la peau constitue un modèle suffisant pour mettre en évidence des biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation et/ou de l'irritation chez l'homme et chez la souris, et qu'il n'est pas nécessaire d'ajouter d'autres types cellulaires si l'analyse des gènes identifiés est réalisée à un temps donné. Le modèle EPISKIN peut ainsi être le tissu de référence pour évaluer le caractère sensibilisant et/ou irritant d'un composant test. Ainsi, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test, de préférence du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, comprenant les étapes de:

a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique;

b) mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB (membre 9 de la superfamille du TNF), ABCA6 (Cassette de fixation de

ΓΑΤΡ, sous famille A membre 6), Adam 8 (ADAM metallopeptidase domaine 8), ADAM 17 (disintegrine and metallopeptidase domaine 17), APC (adenomateux polypose coli), ATM (gène de l'ataxia telangiectasia), B7DC (PCD 1 ligand 2), BCL3 (Cellules B CLL/lymphome 3), BLC (CXC chimiokine ligand 13), BTK (tyrosine kinase de l'agammaglobulinemie de Burton), CAECAM (Molécule d'adhésion cellulaire ressemblant à l'antigène carcinoembryonnaire 1), CASP1 (interleukine 1-beta convertase), CASP12 (caspase 12), CCR1 (CC chimiokine récepteur 1), CCR5 (CC chimiokine récepteur 5), CCR7 (CC chimiokine récepteur 7), CD 122 (récepteur beta de l'interleukine 2), CD 124 (récepteur de l'interleukine 4), CD 163 (CD 163 molécule), CD209 (CD209 molécule), CD23 (récepteur de faible affinité pour le fragment Fc des IgE 2 (CD23)), CD244 (CD244 molécule), CD24A (CD24 molécule), CD25 (récepteur alpha de l'interleukine 2), CD34 (CD34 molécule), CD44 (CD44 molécule), CHEK1 (homologue du checkpoint 1), CLEC4E (lectine de type C domaine famille 4, membre E), CMYB (protéine c-myb), Colla (collagène, type I, alpha 1), Co al (collagène, type III, alpha 1), CTGF (facteur de croissance du tissu connectif), CXCR5 (CXC chimiokine récepteur 5), CYCLINE1 (cycline El), DR5 (Récepteur de mort 5), DR6 (Récepteur de mort 6), ELC (CC chimiokine ligand 1), EMBP (proteoglycane 3), ENG (endogline), EOT (CC chimiokine ligand 11), EOT2 (CC chimiokine ligand 24), FAK (protéine tyrosine kinase 2), FAS (Membre 6 de la superfamille du TNF récepteur), FOSB (FOSb), FYB (Protéine de fixation de FYN), G-CSF R (récepteur du facteur de croissance des colonies 3), GITRL (Membre 18 de la superfamille du TNF), GM-CSF R (sous unité alpha du récepteur du GM-CSF), HSP60 (chaperonine), HSP70 (Protéine de choc thermique à 70kDa), HYALURONIDASE (hyaluronoglucosaminidase 1), 1309 (CC chimiokine ligand Ibis), ICOS (costimulateur inductible des cellules T), ID1 (Inhibiteur de la fixation de 1ADN 1), ID3 (Inhibiteur de la fixation de 1ADN 3), IGSF3 (Membre 3 de la superfamille des immunoglobulines), IL-10RA (récepteur alpha de rinterleukine 10), IL- 1 IRA (récepteur alpha de rinterleukine 11), IL- 16 (interleukine 16), IL-17R (récepteur alpha de rinterleukine 17), ILIRa (récepteur type 1 de rinterleukine 1), IL1RAP (protéine accessoire du récepteur de rinterleukine 1), IL-24 (interleukine 24), IP10 (CxC chimiokine ligand 13), ITAK (CxC chimiokine ligand 11), ITGAM (CDl lb antigène), ITGB6 (integrine, beta 6), JAK 3 (Janus kinase 3), JUNB (jun B proto-oncogene), KC (CxC chimiokine ligand 2), Krtl3 (kératine 13), LAMA1 (laminine, alpha 1), LAMA3A (laminine alpha 3A), LAMC2 (laminine, gamma 2), LARC (CC chimiokine ligand 20), LIX (CxC chimiokine ligand 6), LPTN (C chimiokine ligand 1), LRPl (Protéine apparentée au récepteur des lipoprotéines de faible densité 1), LSST (carbohydrate (N- acetylglucosamine 6-0) sulfotransferase 4 ), LTA (lymphotoxine alpha), LTBR (récepteur de la lymphotoxine B), MARCKS (protéine kinase C riche en alanine myristoylaté), MCP1 (CC chimiokine ligand 13), MCP2 (CC chimiokine ligand 8), MCP3 (CC chimiokine ligand 7), MCP5 (CC chimiokine ligand 2), Mcpt6 (tryptase beta 2), M-CSF (Facteur de stimulation des colonies de macrophage), MIG (CxC chimiokine ligand 9), MIP1G (CC chimiokine ligand 9), MMP2 (metallopeptidase de matrice 2), MMP9 (metallopeptidase de matrice 9), MR1 (récepteur au mannose C type 1), MYD88 (Différenciation myeloide 88), MyhlO (Chaîne lourde de la Myosine 10), NCAM (molécule de l'adhésion cellulaire neurale), NFKB PI 05 (facteur nucléaire des cellules B-l), ONCM (oncostatine M), OSMR (récepteur oncostatine M), Procr (protéine C récepteur), RANTES (CC chimiokine ligand 5), RGS1 (régulateur des G-protéine 1), RGS14 (régulateur des G-protéine 14), RGS16 (régulateur des G-protéine 16), RGS3 (régulateur des G-protéine 3), RIPK1 (récepteur interagissant avec la kinase serine-threonine 1), Sele (selectine E), SELP (selectine P), SLP76 (protéine du cytosol des lymphocytes 2), SMAD6 (MAD homologue 36), SOCS-2 (suppresseur du signaling des cytokines 2), SOCS-3 (suppresseur du signaling des cytokines 3), STAT2 (signal transduceur and activateur de transcription 2), TANK (membre de la famille TRAF associé au NF-KAPPA-B), TARC (CC chimiokine ligand 17), TECK (CC chimiokine ligand 25), Thbd (thrombomoduline), TIRAP (toll-interleukine 1 récepteur), TLR2 (toll-like récepteur 2 ), TNFRP75 (récepteur du TNF p75), TRAF1 (facteur associé au TNF récepteur 1), TRAF3 (facteur associé au TNF récepteur 3), VAVl (oncogène vav 1), VEGFR (FMS-like tyrosine kinase 1), VEGI (membre 15 de la superfamille du TNF), BDEFENSIN (defensine, beta 4), C10 (CC chmiokine ligand 6), CCR2 (CC chimiokine récepteur 2), CD 160 (CD 160 molécule), CD207 (CD207 molécule, langerine), CD83 (CD83 molécule), CJUN (oncogène jun), CLEC4D (lectine de type C domaine famille 4, membre D), CLEC7A (Lectine de type C domaine famille 7, membre A), CMYC (v-myc), COX2 (synthase de prostaglandin-endoperoxide 2), CYCLINA1 (cycline Al), CYCLINE1 (cycline El), CYP2E1 (cytochrome P450, famille 2, sousfamille E, polypeptide 1), CYP7A1 (cytochrome P450, famille 7, sous famille A, polypeptide 1), DAPK2 (kinase associée à la mort 2), EDA2R (récepteur de l'ectodysplasin A2), EGR1 (gène de croissance précoce 1), EGR2 (gène de réponse précoce 2), FCER1 (récepteur de haute affinité pour le fragment Fc des IgE), Fcgrl (antigène CD64), FTH1P (ferritine, polypeptide lourd 1), GATA-2 (Protéine de fixation GATA-2), GATA- 3 (Protéine de fixation GATA-3), HISTR2 (récepteur de Γ histamne 2), ICAM2 (molécule d'adhésion intercellulaire 2), IEX1 (gène de la réponse immédiate 1), IL12rb (récepteur béta 1 de l'interleukine 12), IL-15 (interleukine 15), IL- 19 (interleukine 19), IL-20 (interleukine 20), JUNK1 (protéine kinase activée par les mitogènes 8), JUNK2 (protéine kinase activée par les mitogènes 9), Krtl7 (kératine 17), Krt6 (kératine 6B), LY9 (antigène CD229), LY96 (lymphocyte antigen 96), LYN (v-yes-1), MIP1A (CC chimiokine ligand 3), MKP1 (phosphatase de spécificité duale 1), MKP3 (Protéine kinase activée par les mitogènes 3), MMP12 (metallopeptidase de matrice 12 ( elastase du macrophage )), MYELOPEROXIDASE (MPO), NOTCH3 (Notch homologue 3 (Drosophile)), PPARA (récepteur alpha du peroxisome activé par la prolifération), , St6gall (ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1), TECK (CC chimiokine ligand 25), TLR13 (Récepteur Toll-Like 13), Tpsabl (tryptase alpha/beta 1), VEGF (facteur de croissance endothelium vasculaire A), ZAP70 (protéine kinase associée à la chaîne zeta (TCR) 70kDa), CCL2 (CC chimiokine ligand 2), CCL20 (CC chimiokine ligand 20), CCL22 (CC chimiokine ligand 22), CD207 (langerine), CDH3 (cadherine 3), CDSN (corneodesmosine), FASCIN (fascine), IL2RG (récepteur de l'interleukine 2 chaîne gamma), IL4R (récepteur de l'interleukine 4), KRT17 (Kératine 17), KRT2 (Kératine 2), LCP1 (Protéine du cytosol lymphocytaire 1), MMP9 (metallopeptidase de la matrice 9), NRF2 (Facteur nucléaire issus des erythrocytes 2), PDZK1IP1 (protéine d'interaction PDZK1), S100A4 (Protéine fixant le calcium S 100 A4), S100A7 (Protéine fixant le calcium S 100 A7), S100A9 (Protéine fixant le calcium S 100 A9), STAT1 (signal transduceur et activateur de la transcription 1), TPSAB1 (tryptase alpha/beta 1), TYR (tyrosinase), VIM (Vimentine), CCL27 (CC chimiokine ligand 27), CLEC4A (lectine de type C domaine famille 4, membre A), DSC1 (desmocolline 1), DSG2 (desmogleine 2), EPHX1 (hydrolase epoxide 1), GUSB (glucuronidase, beta), IL10RB (récepteur beta de l'interleukin 10), IL20RA (récepteur alpha de l'interleukin 20), IL22R (récepteur de l'interleukine 22), KEAP1 (Protéine associée ressemblant à kelch 1), KRT10 (Kératine 10), KRT14 (Kératine 14), KRT18 (Kératine 18), LOR (Loricrine), S100A11 (Protéine fixant le calcium S 100 Ai l), SERPINB3 (Serpine B3), STAT3 (signal transduceur et activateur de la transcription 3), TIMP3 (inhibiteur tissulaire de metalloproteinase 3), et VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire), de préférence dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, F AS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL- 1 IRA, IL-16, IL- 17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.

De préférence, la méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une étape c) de détermination du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test, de préférence du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test.

Préférentiellement, ladite étape c) peut consister en une étape de sélection dudit composé comme présentant un potentiel sensibilisant et/ou irritant, de préférence un potentiel sensibilisant et irritant, si le niveau d'expression est supérieur à une valeur seuil.

De préférence, la méthode selon la présente invention est une méthode in vitro.

Tel qu'utilisé ici, le terme « échantillon biologique » se réfère à tout échantillon solide ou liquide issu d'un sujet.

De préférence, ledit échantillon biologique est un échantillon de peau.

Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon de peau est un échantillon de peau reconstruite in vitro, comme le EpiSkin (EPISKIN, Lyon France), EpiDerm™ (MATEK Corporation, Ashland, MA)) ou SkinEthic™ RHE (SKINETHIC, Nice, France).

De manière encore préférée, l'échantillon de peau ne comprend pas l'addition d'autres types cellulaires supplémentaires, et encore préférentiellement pas de cellules de Langerhans supplémentaires. Au sens de la présente invention, la mesure de l'expression dudit au moins un gène de l'étape b) permet de déterminer le niveau d'expression dudit gène.

Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc.

Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée.

De telles compositions peuvent être, par exemple, des échantillons d'un produit cosmétique ou dermatologique.

De préférence, ledit composé test est apte à être utilisé sur la peau et peut être utilisé dans une composition cosmétique ou dermatologique. La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification du potentiel sensibilisant et irritant d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée.

De préférence, dans la méthode selon la présente invention, le niveau d'expression dudit gène est évalué par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau d'expression de l'ARNm dudit gène ou d'un fragment de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, l'expression dudit au moins un gène est effectuée par analyse de l'expression de transcrits d'ARNm ou de précurseurs d'ARNm, tel qu'un ARN natif, dudit gène. Ladite analyse peut être réalisée en préparant l'ARNm/ADNc de cellules d'un échantillon biologique d'un patient, et hybridation de l'ARNm /ADNc avec un polynucléotide de référence. L'ARNm/ADNc préparé peut être utilisé dans une analyse par hybridation ou amplification qui inclut, sans s'y limiter, les analyses Southern et Northen, les analyses par PCR (« polymerase chain reaction »), telle que la PCR quantitative (Taqman) et l'utilisation de sondes (« probes arrays ») telles que les matrices ADN GeneChip® (AFFYMETRIX) .

Avantageusement, l'analyse de l'expression du niveau d'ARNm transcrit dudit au moins un gène implique un procédé d'amplification des acides nucléiques, comme par exemple la RT-PCR (mode de réalisation expérimental décrit dans le Brevet US 4,683,202), la réaction en chaîne par la ligase (BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991), la réplication de séquences auto-entretenue (« self sustained séquence réplication ») (GUATELLI et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990), le système d'amplification transcriptionnelle. (KWOH et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989), la « Q-Beta Replicase » (LIZARDI et al, Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988), la « rolling circle réplication » (U. S. Patent No. 5,854,033) ou toute autre méthode d'amplification d'acides nucléiques, suivie d'une étape de détection des molécules amplifiées par des techniques bien connues de l'homme du métier. Ces modes de détection sont particulièrement utiles pour la détection de molécules d'acides nucléiques en très faibles quantités.

Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la méthode selon la présente invention comprend une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci.

Telles qu'utilisées ici, les amorces d'amplifications sont définies comme étant une paire de molécules d'acides nucléiques qui peuvent s'apparier respectivement aux régions 3' et 5' d'un gène de façon spécifique (brins positif et négatif, ou inversement) et encadrent une courte région dudit gène. De manière générale, les amorces d'amplification ont une longueur de 10 à 30 nucléotides et permettent l'amplification d'une région d'une longueur comprise entre 50 et 200 nucléotides. Avantageusement, les amorces utilisées dans le cadre de la présente invention sont choisies parmi celles listées dans les tableaux 1 à 4.

Dans un autre mode de réalisation préféré, la mesure de l'expression dudit au moins un gène est réalisée par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène. Ladite analyse peut être réalisée en utilisant un anticorps (par exemple, un anticorps radiomarqué, marqué avec un chromophore, un fluorophore, ou une enzyme), un dérivé d'anticorps (par exemple un anticorps conjugué à un substrat ou à une protéine ou un ligand d'une protéine d'un couple ligand/protéine (par exemple biotine-streptavidine)) ou un fragment d'anticorps (par exemple un anticorps à une seule chaîne, un domaine hypervariable d'un anticorps isolé, etc.) qui se lie spécifiquement au polypeptide codé par ledit gène. Lesdites analyses peuvent être réalisées par de nombreuses techniques à la portée de l'homme du métier incluant, sans s'y limiter, les tests immuno logiques basés sur l'utilisation d'activité enzymatique (« enzyme immunoassay » EIA), les tests immuno logiques basés sur l'utilisation d'isotopes radioactifs (RIA), l'analyse par Western blot et les tests ELISA (« enzyme linked immunoabsorbant assay »).

Au sens de la présente invention, on entend par « polypeptide » une séquence comprenant au moins deux acides aminés, et les termes « polypeptide », « peptide » et « protéine » peuvent être indifféremment utilisés. Par « fragment de l'ARNm ou de l'ADNc », on entend une séquence d'au moins 50 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides nucléiques, de préférence d'au moins 200 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides nucléiques, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides nucléiques.

Par « fragment du polypeptide », on entend une séquence d'au moins 50 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides aminés, de préférence d'au moins 200 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides aminés, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides aminés.

Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test, de préférence du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, chez l'homme, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1 , DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3, et VEGF.

Encore préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant d'un composé test chez l'homme, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF. Alternativement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test chez l'homme, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.

Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test, de préférence le potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, chez la souris, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, F AS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL- 17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA- 3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF et ZAP70.

Encore préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant d'un composé test chez la souris, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, DAPK2, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF et ZAP70.

Alternativement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test chez la souris, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASPl, CASPl 2, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, F AS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR et VEGI.

De préférence, l'étape b) de ladite méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant, de préférence du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, comprend la mesure de l'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, et encore préférentiellement d'au moins 18 gènes choisis dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM- CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL- 10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, BDEFENSIN, C10, CCR2, CD 160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF.

Encore préférentiellement, l'étape b) de ladite méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, comprend la mesure de l'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, et encore préférentiellement d'au moins 18 gènes choisis dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL- 17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM. Ainsi, on pourra conclure qu'un composé test présente un potentiel sensibilisant et/ou irritant, de préférence un potentiel sensibilisant et irritant, si une surexpression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17 et encore préférentiellement d'au moins 18 desdits gènes est observée par rapport à leurs niveaux d'expression en l'absence dudit composé test. On entend par « potentiel sensibilisant », le risque pour le composé test de provoquer une réaction immunologique lors de sa mise en contact avec un mammifère, de préférence un humain. Ainsi, le potentiel sensibilisant peut être considéré comme le risque de développer une allergie au contact du composé test. On entend par « potentiel irritant », le risque pour le composé test de provoquer une inflammation réversible des tissus vivants par action chimique au site de contact.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant d'un composé test, comprenant les étapes de:

a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique;

b) mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl , VEGF, ZAP70, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, , KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF. De préférence, l'étape b) de ladite méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant comprend la mesure de l'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, et encore préférentiellement d'au moins 8 gènes choisis dans le groupe constitué par : BDEFENSIN, C10, CCR2, CD 160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA- 3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF.

De préférence, la méthode selon la présente invention permet d'évaluer si le composé test est susceptible de provoquer une allergie de contact ou dermatite atopique.

De préférence, la méthode selon la présente invention comprend en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit gène avec une valeur de référence. Cette valeur de référence peut servir de contrôle positif et/ou négatif. Un contrôle positif peut par exemple être effectué en comparant le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test avec le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé connu comme sensibilisant et/ou irritant. Par exemple, si le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test est supérieur ou égal au niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé connu comme sensibilisant et/ou irritant, on pourra en conclure au potentiel sensibilisant et/ou irritant dudit composé. A titre d'exemple de composé connu comme sensibilisant, on peut citer l'acide 2,4,6- trinitrobenzene sulfonique, la p-phénylenediamine, le dinitrochlorobenzène, le benzaldehyde, le résorcinol, le disulfure de tétraméthyl thiurame, l'oxazolone, le chloroAtranol, le diphenylcyclopropénone le potassium dichromate, l'aldéhyde cinnamique, le 2-Bromo-2-(bromomethyl)glutaronitrile, le glyoxal, la saccharine, le formaldehyde, l'anhydride trimellitique, le méthylchloroisothiazolinone, le benzoate de benzyl, Γ alpha- hexyl cinnamaldehyde, l'eugenol, le 2- mercaptobenzothiazole, l'soeugenol, la diphénylcyclopropénone (DPCP), le lauryl gallate (LG), la 3-3-dimethylaminopropylamine (3-DMAPA), l'aldéhyde cinnamique (CA), le citral (Cal), la 1 ,4-hydroquinone (HQ), le glutaraldéhyde (GA), la 1,2- benzisothiazolin-3-one (Ben), la phénylacetaldéhyde (PA) et le lilial (Li), préferentiellement parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 1,4- hydroquinone et le glutaraldéhyde, et de manière particulièrement préférée la 1 ,4- hydroquinone.

Alternativement, dans le cadre de la présente invention, on peut utiliser une composition sensibilisante, comme le « fragrance mix ».

A titre d'exemple de composé connu comme irritant, on peut citer le LaurylSulfate de Sodium (SLS), l'acide octanoïque, le cholobenzene, l'acide lactique, le bromo- butane, le méthyl salicylate et le butanol. Un contrôle négatif peut être réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un composé connu comme non sensibilisant et non irritant comme par exemple l'huile d'olive, l'huile d'olive ou du glycérol, le cétyl trimethylammonium bromide (CTAB) et le dipropylène glycol. Dans le cadre de la présente invention, on pourra conclure qu'un composé test présente un potentiel sensibilisant et/ou irritant de préférence un potentiel sensibilisant et irritant, si une surexpression dudit gène est observée par rapport à son niveau d'expression en l'absence dudit composé test. On entend par « surexpression », un niveau d'expression signifïcativement plus élevé dudit gène par rapport à son niveau d'expression normal. De préférence, on entend par surexpression un niveau d'expression dans un échantillon biologique qui est supérieur à au moins 20% du niveau normal d'expression dudit gène, de préférence supérieur à au moins 50%> du niveau normal d'expression dudit gène, et de manière particulièrement préférée supérieur à au moins 90% au niveau normal d'expression dudit gène.

Le « niveau d'expression en l'absence dudit composé test » ou « niveau normal » est le niveau d'expression dudit gène dans un échantillon contrôle correspondant potentiellement à l'échantillon biologique d'un patient ne présentant pas de réaction de sensibilisation et/ou d'irritation ou, de préférence, à la moyenne du niveau d'expression dudit gène dans différents échantillons contrôle.

De préférence, l'étape b) est réalisé entre 2 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière préférée entre toute 6 heures après l'étape a).

Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL- 1 IRA, IL- 16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGSl, RGS14, RGSl 6, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, BDEFENSIN, C10, CCR2, CD 160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, DEFB1, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3, et VEGF, pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test.

De préférence, selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL- 1 IRA, IL- 16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGSl, RGS14, RGSl 6, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test.

La présente invention se rapporte également à une trousse pour la mise en œuvre de la méthode selon la présente invention, comprenant des moyens de détection du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT 1 , TPS AB 1 , TYR et VIM.

De préférence, ladite trousse comprendra au moins une paire d'amorces permettant l'amplification d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, FTHIP, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF.

De préférence, ladite trousse comprendra au moins une paire d'amorces permettant l'amplification d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.

Exemples

1) Protocole LLNA

Animaux

Des souris CBA/J provenant des distributeurs européens ont été utilisées. L'âge des animaux était compris entre 7 et 12 semaines. Les animaux ont été maintenus dans des conditions standard et ont eu un accès libre à la nourriture et l'eau. 2 animaux par groupe ont été utilisés.

Traitement

La face dorsale de chaque oreille a été traitée avec 25 μΐ/oreille de la solution test. Le diluant utilisé était l'Acetone/Huile d'olive (50/50 v/v) ou DMF. Les substances testées sont alpha hexyl cinnamaldehyde (HCA) 25%, Isoeugenol, 50%, Lauryl sulfate (SLS) 50%, Hydroxy citronelal (OHC), 50%; PPD 0,1%, acide octanoique 25%. Une biopsie de l'oreille a été récupérée après 6h, 12h ou 24h de traitement avec un punch de 8mm et le feuillet externe a été retiré avec des pinces et immédiatement congelé dans l'azote liquide.

Résultats

Les résultats des tableaux 1 et 2 sont exprimés en taux d'augmentation par rapport au témoin négatif. La moyenne des taux d'expression au 3 temps de la cinétique (3h, 6h et 24h après application de la substance) a été calculée. Le tableau 1 présente la liste des gènes qui sont induits à la fois par les substances sensibilisantes et irritantes et le tableau 2 celui des gènes spécifiquement induits par les substances sensibilisantes. L'expression de ces gènes n'est pas augmentée en réponse au véhicule qui a servi de contrôle.

Tableau 1 : Biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation et de l'irritation dans le modèle LLNA

Tableau 2 : Biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation dans le modèle LLNA

2) Protocole clinique

Une étude mono-centrique avec comparaisons intra-individuelles, a été réalisée en double aveugle, randomisée et contrôlée avec un témoin non traité.

Afin d'éviter le recours à un trop grand nombre de patients, il apparaissait inutile d'introduire des groupes excipients ou patch seul puisque l'objectif de l'étude est la comparaison entre les types de réactions inflammatoires, irritation versus sensibilisation, et n'est pas une étude d'activité d'un produit par rapport à un autre.

Produits inducteurs

Suite à la directive 2003/15/CE, depuis le 11 mars 2005, 26 substances, ayant entre autres des propriétés parfumantes ou aromatiques, ont été identifiées comme étant potentiellement sensibilisantes et doivent figurer en clair dans la liste des ingrédients, quelle que soit leur fonction, dès que leur concentration dépasse 0,001% dans les produits non rincés (crèmes, etc..) et 0,01% dans les produits rincés (shampooings, etc.).

Parmi ces 26 substances figurent les 8 qui font partie de «Fragrance Mix », le produit que les médecins utilisent sous forme de patch pour savoir si un sujet est allergique au "parfum" de manière générale. Entre 1 et 2% de la population générale serait allergique à ce mélange.

La composition exacte du Fragrance Mix standard (8%) est la suivante:

* 1% Amyl Cinnamal (Aldéhyde Alpha Amyl Cinnamylique)

* 1% Cinnamyl Alcohol (Alcool Cinnamylique)

* 1% Cinnamal (Aldéhyde Cinnamique)

* 1% Eugénol

* 1% Geraniol

* 1% Hydroxycitronellal

* P/o Isoeugénol

* 1% Mousse de Chêne (Evernia Prunastri en INCI, Oak Moss en anglais) * 5% Sorbitan Sesquioleate (émulsifïant)

Les produits inducteurs qui ont été utilisés dans cette étude clinique sont donc le fragrance mix (8%), le Nickel sous forme sulfate et le Lauryl Sulfate de Sodium (LSS).

Choix des temps de cinétique

Dans cette étude, les étapes ciblées des réactions cutanées étudiées sont celles qui se déroulent dans la peau, plus particulièrement dans l'épidémie, au cours des premières phases du processus. Supposées moins complexe que les étapes tardives impliquant un plus grand nombre de types cellulaires, elles devraient permettre une meilleure discrimination entre les différents types de réponses. L'analyse portera donc en premier lieu sur les premières 12 h suivant l'application du produit et sur les phénomènes se déroulant dans la peau et plus particulièrement dans l'épiderme.

Mode de traitement

Les sujets inclus appartenaient à deux groupes : allergiques au nickel et allergiques au fragrance mix.

Les deux groupes d'application sont les suivants :

- Groupe 1 : 12 sujets avec 3 double patchs au nickel sur un avant-bras et 2 double patchs avec l'irritant et une zone non traitée sur l'autre avant-bras (Allergiques au nickel).

- Groupe 2 : 12 sujets avec 3 double patchs au fragrance mix sur un avant- bras et 2 double patchs avec l'irritant et une zone non traitée sur l'autre avant-bras

(Allergiques au fragrance mix).

La zone non traitée a remplacé un temps d'application de l'irritant, ce qui a été inclus dans le schéma de randomisation attribué à chaque sujet. La zone non traitée a été randomisée avec les temps d'application de l'irritant sur l'avant-bras correspondant à l'irritant.

Chaque avant-bras est divisé en trois zones qui correspondent aux différents temps d'application pour un produit inducteur. Deux prélèvements ont été réalisés par zone.

Technique de prélèvement

Dans cette étude, la méthode de prélèvement par bulle de succion (Kiistala, 1968) a été utilisée pour obtenir des prélèvements épidermiques aussi purs que possible. La mise à disposition de prélèvements épidermiques non contaminés par des éléments dermiques est indispensable pour permettre une interprétation pertinente des résultats des analyses génomiques.

Analyse des biomarqueurs chez l'homme.

Le but de l'étude était d'une part de mettre en évidence des biomarqueurs permettant de distinguer les substances sensibilisantes et/ou irritantes mais aussi de définir le « tissu minimal » pouvant être utilisé en culture in vitro capable d'exprimer suffisamment des gènes sélectionnés pour permettre l'analyse et la classification de ces substances dans un modèle in vitro.

Pour analyser la composition du « tissu minimal », une analyse du transcriptome après application de substances irritantes et/ou sensibilisantes non pas sur des biopsies totales de peau mais sur des biopsies bulles de succion qui ne comprennent que l'épidémie a été réalisée chez l'homme.

Pour cette étude, le test a été réalisé sur des patients sensibilisés soit au Nickel soit au « fragrance mix », un mélange d'ingrédients de parfum utilisé pour analyser une sensibilisation.

Le tableau 3 montre l'ensemble des gènes surexprimés à la fois par les sensibilisants Nickel et « Fragrance Mix » et l'irritant SLS chez l'homme.

Tableau 3 : Biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation et de l'irritation chez l'homme

Table 4 : gènes spécifiquement induit par les sensibilisants chez l'homme

On note qu'il est là aussi possible de définir des gènes spécifiquement exprimés par les molécules irritantes et sensibilisantes. La plupart de ces gènes sont communs avec ceux trouvés chez la souris comme C2TA, CCL2, CCL20, CCL22, CD14, CD83, FASCIN, IL10RA, IL2RG, IL4R, KRT17, MMP9, S100A8, STAT1. Les autres gènes trouvés n'avaient pas été testés, ou n'ont pas d'équivalent (comme IL-8) chez la souris.