Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von 2,3- 5 Butandiol aus einer wässrigen Mischung mittels Methylacetat

(Essigsäuremethylester, Methyle hanoat , CAS 79-20-9) als Extraktionsmittel .

Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstelle) lungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.

15 Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2- Baustein) , Glycerin, 1, 3-Propandiol, 1 , 2 -Propandiol , Milchsäure (C3 -Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Sutanol, 2-Butanol, 1,4- Butandiol oder auch 2, 3-Butandiol {C -Bausteine) . Diese chemi-

20 sehen Bausteine sind die biogenen Ausgangs erbindungen, aus denen auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fer- mentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen.

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Kostenfaktoren bei der Produktion chemischer Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese

30 Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Daneben ist die Isolierung der fermentativ erzeugten Synthesebausteine aus den Fermentationsansätzen ein entscheidender Kostenfaktor. Da die biogen erzeugten Synthesebausteine oft eine gute Löslichkeit im wässrigen Fermentermedium haben,

35 ist ihre Isolierung meistens mit einem hohen apparativen, energetischen und chemischen Aufwand verbunden, was sich ungünstig auf die Wirtschaftlichkeit auswirkt. Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4-Bauste

Butandiol. Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3- Butandiol Herstellung ist zusaramengefasst in Celinska und

Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725}.

Der Stand der Technik zur Aufarbeitung von 2 , 3 -Butandiol ist zusammengefasst in Xiu und Heng (Appl. Microbiol. Biotechnol (2008) 78: 917-926) sowie auch in Syu (Appl. Microbiol. Biotechnol (2001) 55: 10-18). 2 , 3 -Butandiol ist charakterisiert durch einen hohen Siedepunkt von 180 °C {bei Normdruck) und eine praktisch unbegrenzte Mischbarkeit mit Wasser. Daher sind z.B. einfache destillative und extraktive Methoden zur 2 , 3 -Butandiol Isolierung mit einem hohen chemischen und energetischen Aufwand verbunden. Entsprechend kommen Xiu und Zeng {Appl. Microbiol. Biotechnol (2008) 78: 917-926) zur Schlussfolgerung, dass die Isolierung von 2 , 3 -Butandiol aus wässrigen Mischungen wie z.B. aus Fermentationsansätzen eine technologische Herausforderung und wirtschaftliche Hürde darstellt auf dem Weg zur industriellen biotechnologischen Produktion von 2 , 3 -Butandiol .

Verschiedene Verfahren zur Anreicherung von 2 , 3 -Butandiol wurden beschrieben, darunter die apparativ aufwändigen Methoden der reversen Osmose und Pervaporation. Dabei wird Wasser aus den Ansätzen entfernt und eine Anreicherung des 2 , 3 -Butandiols im Fermentationsansatz erreicht. Mit dem 2 , 3 -Butandiol werden jedoch auch andere Bestandteile eines Fermentationsansatzes aufkonzentriert , was zusätzliche Verfahrensschritte zur Produktisolierung erfordert. Ein energetisch sehr aufwändiges Verfahren zur 2 , 3 -Butandiol Isolierung stellt das sog. Dampf -Stripping dar (Blom et al . , Industrial and Engineering Chemistry (1945) 37; 865-870), das sich im technischen Maßstab nicht durchsetzen konnte. Verschiedene Verfahren zur flüssig- flüssig Extraktion sind bekannt. Ghosh and Swaminathan (Chem. Biochem. Eng. Q. (2003) 17: 319-325} beschreiben ein extraktives Fermentationsverfahren in einem wässrigen PEG (Polyethylenglykol) /Dextran 2 -Phasensystem. Sun et al . (Biotechnol . Lett. (2009) 31: 371-376) beschreiben ein Extraktionsverfahren unter Verwendung von Ammoniumsulfat und Isopropanol. Li et al . (Process Biochemistry (2010) 45:

731-737) beschreiben ein ähnliches Verfahren unter Verwendung von Ammoniumsulfat und Ethanol. Beide Verfahren setzen große Mengen an Ammoniumsulfat zu, was zu einer hohen Salzfracht sowohl im Extrakt als auch im Extraktionsrückstand führt, die in einem technischen Verfahren aufwändig zurückgewonnen werden muss. Ein in situ Extraktionsverfahren unter Verwendung von Oleylalkohol wird von Anvari und Khayati (J. Ind. Microbiol . Biotechnol. (2009) 36: 313-317) beschrieben, wobei der fermen- tative Butandioltiter mit 23 g/1 sehr niedrig war und nur 68 % des Produkts extrahiert wurden. Darüber hinaus stellt sich, in einem technischen Verfahren, die Wiedergewinnung des Extrakti- onsmittels aufgrund des hohen Siedepunkts von 330-360°C als energetisch sehr aufwändig dar.

Die in der Literatur zur Extraktion von 2 , 3 -Butandiol eingesetzten nicht-wassermischbaren Lösemittel, z.B. aus der Klasse der Alkohole und Ester, bedingen wegen der ungünstigen Lage des Verteilungsgleichgewichts einen hohen apparativen Aufwand und den Einsatz großer Mengen Lösemittel. Xiu und Zeng (Appl.

Microbiol. Biotechnol (2008} 78: 917-926) fassen den dazu verfügbaren Stand der Technik zusammen.

Die Bewertung des Standes der Technik in Xiu und Zeng (Appl . Microbiol. Biotechnol. (2008) 78: 917-926} sowie auch in Syu (Appl. Microbiol. Biotechnol (2001) 55: 10-18} ergab, dass die verfügbaren Methoden zum einen eine technische Herausforderung darstellen und andererseits aus wirtschaftlicher Sicht zu kos- tenaufwändig sind. Ein Problem bei der Isolierung von 2,3- Butandiol aus wässrigen Mischungen, speziell Fermenterbrühen, ist dessen hoher Siedepunkt von 180°C. Wegen des hohen Energieaufwandes zur Abtrennung des Wassers verbietet sich eine direk- te Destillation. Die aus wirtschaftlicher Sicht an sich bevorzugte flüssig- flüssig Extraktion bietet keine tragbare Lösung, da die Extraktion mit bekannten Lösemitteln wie Alkoholen oder Estern zu ineffizient erfolgt. Aufgabe der Erfindung war es ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es erlaubt 2, 3-Butandiol kostengünstig und effizient aus einer 2 , 3 -Butandiol -haltigen wässrigen Mischung zu extrahieren, um dessen nachfolgende Aufarbeitung mittels an sich bekannter Verfahren zu verbessern.

Gelöst wurde die Aufgabe durch ein Verfahren, bei dem eine 2,3- Butandiol -haltige wässrige Mischung mit einem organischen Ex- traktionsmittel gemischt wird, wobei 2 , 3 -Butandiol der wässrigen Mischung entzogen und in das organische Extraktionsmittel überführt wird, diese Mischung dann in eine wässrige und eine organische Phase getrennt und das 2 , 3 -Butandiol aus der organischen Phase abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das organischen Extraktionsmittel Methylacetat ist.

Bei der 2 , 3 -Butandiol-haltigen wässrigen Mischung handelt es sich vorzugsweise um eine Mischung, mit einem 2 , 3 -Butandiol - gehalt (definiert als g 2 , 3 -Butandiol je 1 wässrige Phase) grö- ßer als 10 g/1, bevorzugt größer 50 g/1, besonders bevorzugt größer 100 g/1 und insbesondere bevorzugt größer 150 g/1.

Die 2 , 3 -Butandiol -haltige wässrige Mischung enthält die isomeren Formen des 2 , 3 -Butandiols {Meso-2 , 3 -Butandiol, R,R-2,3- Butandiol und S, 3-2, 3-Butandiol) entweder einzeln oder als Gemisch in beliebigen Verhältnissen. Sie kann bei Raumtemperatur (23°C) aus einer Phase bestehen, kann aber auch aus mehreren Phasen, darunter flüssigen, festen und auch gasförmigen Phasen bestehen. Vorzugsweise handelt es sich bei der 2 , 3 -Butandiol - haltigen wässrigen Mischung um eine Fermenterbrühe .

Eine 2, 3 -Butandiol-haltige Fermenterbrühe wird durch Kultivierung, z.B. durch Fermentation, eines 2 , 3 -Butandiol Produktions - Stammes hergestellt. Ein 2 , 3-Butandiol Produktionsstamm ist de- finiert als ein Mikroorganismus, der aus einer beliebigen C- Quelle 2 , 3-Butandiol herstellen kann. Bei dem Mikroorganismus kann es sich um einen nicht optimierten Wildtyp Stamm handeln oder aber um einen optimierten Stamm, dessen Fähigkeit zur 2,3- Butandiolproduktion entweder durch gentechnische Optimierung oder durch Mutagenese und Selektion oder aber auch durch eine Kombination der beiden Methoden erreicht bzw. verbessert wurde. Vorzugsweise handelt es sich um einen Mikroorganismenstamm aus- gewählt aus 2 , 3 -Butandiol produzierenden Bakterien, besonders bevorzugt handelt es sich um einen Mikroorganismenstamm der Gattungen Klebsiella, Raoultella oder Bacillus und insbesondere bevorzugt um einen Stamm der Art Klebsiella (Raoultella) terri- gena und Klebsiella planticola.

Eine 2 , 3 -Butandiol-haltige Fermenterbrühe enthält als feste Phase in der Regel die gebildete Biomasse. Die Biomasse ist vorzugsweise definiert als der Rückstand eines Fermentationsansatzes, der nach dessen vollständiger Trocknung, z.B. bei er- höhter Temperatur von 80°C verbleibt {Biotrockenmasse} . Der Biotrockenmasseanteil der Fermenterbrühe beträgt bevorzugt mehr als 10 g/1, bevorzugt mehr als 25 g/1, besonders bevorzugt mehr als 50 g/1 und insbesondere bevorzugt mehr als 100 g/1. Die Fermenterbrühe kann noch alle Bestandteile, die zur fermen- tativen Herstellung von 2 , 3 -Butandiol erforderlich sind, enthalten. Dazu gehören z.B. alle Salze eines Fermentationsmediums, darunter Kationen wie Na, K, NH ₄ ⁺ , Mg, Ca, Fe, Co, Mn, Zn, Mo, bzw. Anionen wie Phosphat, Sulfat, Chlorid, Nitrat, Carbo- nat . Des weiteren können auch komplexe Bestandteile des Fermentationsmediums wie z.B. Hefeextrakt, Malzextrakt, CSD {Corn Steep Liquor, in fester oder flüssiger Form) , Sojaextrakt, C~ Quellen der Fermentation wie z.B. Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse, Xylose, Mannose, Hydrolysate komplexer, hochmole- kularer C-Quellen wie z.B. Stärke, Lignozellulose oder Bagasse oder alternative C-Quellen wie Glycerin, CO oder C0 ₂ vorhanden sein.

Ferner kann die Fermenterbrühe Bestandteile, die im Verlauf der Fermentation entstehen und die in ihrem Gehalt und ihrer Zusammensetzung abhängig vom jeweiligen Produktionsstamm und vom Fermentations erfahren sind, enthalten. Dazu gehören beispielsweise Nebenprodukte des Stoffwechsels wie Acetat, Ethanol, Lactat (Milchsäure), Acetoin, Succinat (Bernsteinsäure) , 1,2- Propandiol, aber auch Aminosäuren und Produkte des Sekundärstoffwechsels wie z.B. extrazelluläre Makromoleküle wie Polysaccharide, Proteine oder auch Lipide und Fettsäuren.

Neben der für eine Fermentation typischen, durch die Biomasse gebildeten zweiten festen Phase ist es möglich, dass die 2,3- Butandiol-haltige wässrige Mischung noch weitere Phasen enthält, z.B. eine von Methylacetat verschiedene, mit Wasser nicht mischbare flüssige Phase zur z.B. in situ Extraktion von Fermentationsprodukten oder eine von der Biomasse verschiedene feste Phase bestehend z.B. aus organischen oder aber auch anorganischen Adsorbentien. Diese Adsorbentien dienen als Fällungs- mittel zur einfacheren Entfernung von z.B. der Biomasse oder zur Entfernung störender Verunreinigungen. Dazu gehören z.B. makromolekulare Polysaccharide, Polymere auf Polyacrylamidbasis (z.B. unter den Markennamen Prästol^ oder Zetag ^® erhältliche Flockungsmittel) Celite*, Bentonite, Kaolin, oder aber auch Aktivkohle .

Besonders bevorzugt handelt es sich bei der 2 , 3 -Butandiol- haltigen wässrigen Mischung um eine einphasige Mischung, d.h. eine wässrige Lösung bestehend vorzugsweise aus einer Fermenterbrühe enthaltend 2 , 3 -Butandiol , aus der alle festen Bestand- teile entfernt wurden.

Vorzugsweise werden die 2 , 3~Butandiol-haltige wässrige Mischung und Methylacetat in einem Gewichtsverhältnis von 1:0,1 bis 1:5 zusammengegeben, besonders bevorzugt von 1:0,8 bis 1:3, insbe- sondere bevorzugt von 1:1 bis 1:2.

Die Methylacetat-Extraktion kann kontinuierlich oder absatzweise (Batch-Verfahren) erfolgen. In der einfachsten Form erfolgt die Extraktion, indem die wässrige Phase und Methylacetat in einen Scheidetrichter gegeben, durch schütteln durchmischt und nach erfolgter Phasentrennung (Entmischung der beiden Phasen aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte) die das extrahierte 2 , 3 -Butandiol enthaltende Methylacetatphase isoliert wird. Die- ser Extraktionsvorgang kann beliebig, bevorzugt in 10 Extraktionen, besonders bevorzugt 5 Extraktionen, insbesondere bevorzugt 3 Extraktionen, wiederholt werden, bis das 2 , 3-Butandiol quantitativ (bis zu 99 % des in der wässrigen Phase enthaltenen 2 , 3 -Butandiols) aus der wässrigen Phase extrahiert ist.

Eine bekannte auch im technischen Maßstab einsetzbare Methode der Extraktion erfolgt in an sich bekannter Form in Rührkesseln, wobei gegenüber dem Scheidetrichter als Änderung neben dem größeren Maßstab die Durchmischung nicht mehr durch schütteln, sondern durch ein Rührwerk erfolgt. Das Volumen des Rührkessels ist abhängig vom Produktionsmaßstab und kann beliebig groß sein, bevorzugt > 1 1, besonders bevorzugt > 100 1, besonders bevorzugt > 1.000 1 und insbesondere bevorzugt > 10.000 1.

Die Vermischung erfolgt jeweils vorzugsweise über eine Zeitraum von mindestens 1 Minute bis 10 h, besonders bevorzugt von 5 Minuten bis 5 h, insbesondere bevorzugt von 15 Minuten bis 1 h. Das Vermischen erfolgt vorzugsweise bei einem pH der wässrigen Phase von 1 bis 14, bevorzugt von 2 bis 10, besonders bevorzugt von 3 bis 9, insbesondere bevorzugt von 4 bis 8 und bei einer Temperatur, welche das Verteilungsgleichgewicht zu Gunsten der organischen Methylacetatphase und zu Ungunsten der wässrigen Phase optimiert, bevorzugt von -15°C bis 50 °C, besonders bevorzugt von 0°C bis 45°C, insbesondere bevorzugt von 20°C bis 40°C.

Als für den technischen Einsatz bekannte Apparate für die Ex~ traktion kommen darüberhinaus Mischer-Abscheider-Batterien (Mi- xer-Settler-Batterien) oder Extraktionskolonnen in Frage. Geeignete Bauformen sind dem Fachmann bekannt, ohne die Ansprüche einzuschränken sind z.B. geeignete Au führungsformen Siebbodenkolonnen, Füllkörperkolonnen mit reglosen Füllkörperschüttun- gen, Kolonnen mit regelmäßigen, statischen Mischer-Einbauten (Extraktionspackungen) , Kolonnen mit speziell geformten Böden wie z.B. Ventilböden oder Kaskadenböden. Alle Kolonnen können gepulst oder ungepulst betrieben werden und andere Formen des Energieeintrages wie z.B. durch Rührwerke sind ebenfalls erfin- dungsgemäß .

Die Trennung von organischer und wässriger Phase wird erreicht durch dem Fachmann allgemein bekannte Phasentrennapparate der Extraktionsverfahrenstechnik wobei statische Absetzbehälter (mit oder ohne Packung) oder die Extraktion unter Zuhilfenahme von Zentrifugalkräften (Zentrifugalextraktion mit Trennung der unterschiedlich dichten Phasen im Beschleunigungsfeld} unter anderem geeignet sind.

Wie im Rahmen der Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten, überraschend gefunden wurde und wie exemplarisch in den Beispielen gezeigt, kann 2, 3-Butandiol aus wassrigen Mi- schungen mittels Methylacetat im Vergleich zu anderen nicht wassermischbaren Lösemitteln aus den Klassen der Alkohole, Ester und Ether mit deutlich erhöhter Effizienz extrahiert werden. Unter den Carbonsäureestern ist nur Methylacetat nicht {bzw. nur in geringem Umfang) in Wasser löslich und zugleich ein gutes Lösemittel für 2 , 3 -Butandiol . Die weniger polaren Vertreter der niederen Carbonsäureester, Ethylacetat, Methyl- propionat und Methylbutyrat sind nicht, bzw, nur in begrenztem Umfang zur Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus wassrigen Lösungen geeignet. Das war nach dem Stand der Technik nicht zu erwarten. So wurden unter den Bedingungen des im 2. Beispiel beschriebenen Verfahrens zum Vergleich der Extraktionseffizienz verschiedener Lösemittel mit Methylacetat ca. 42 % des in der wässrigen Phase enthaltenen 2 , 3 -Butandiols extrahiert, dagegen mit Ethylacetat nur ca. 20 , mit MTBE ca. 5 %, mit 1-Pentanol ca. 25 %, mit Methylpropionat ca. 7 % und mit Oleylalkohol ca. 10 %. 1- Butanol war mit der Fermenterbrühe mischbar und es konnte keine Phasentrennung erzielt werden. Mit einem weiteren Methylester, Methylbutyrat, war die Extraktion von 2 , 3 -Butandiol kaum nachweisbar. Überraschend wurde gefunden, dass mit Oleylalkohol nur ca. 10 % des 2 , 3 -Butandiols extrahiert werden konnten. Unter den speziellen von Anvari und Khayati (J. Ind. Microbiol. Bio- technol. (2009) 36: 313-317) beschriebenen Bedingungen einer in situ Extraktion während der Fermentation war bei vergleichswei- se sehr niedrigen Produktionsraten von 2 , 3-Butandiol (23 g/1) eine Gesamtausbeute der Extraktion von 68 % berichtet worden. Unter den Bedingungen der vorliegenden Erfindung, bei der die Effi ienz von Lösemitteln bei der Extraktion von Fermentations- mischungen mit einem 2 , 3-Butandiol Gehalt deutlich über 100 g/1 verglichen wurden, ist Oleylalko ol dem Methylacetat als Lösemittel deutlich unterlegen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Methylacetat zur Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus wässrigen Mischungen, vorzugsweise wässrigen Lösungen.

Unter den Bedingungen des im 2. Beispiel beschriebenen Verfahrens zur Ermittlung der Extraktionseffizienz eines gegebenen Lösemittels werden in einem einmal durchgeführten Extraktions- schritt mehr als 30 %, bevorzugt mehr als 40 %, besonders bevorzugt mehr als 50 % und insbesondere bevorzugt mehr als 60 % des 2 , 3-Butandiol aus der wässrigen Phase in die Methylacetat Phase extrahiert. Dies stellt eine signifikante Verbesserung der Extraktion von 2 , 3 -Butandiol mit nicht-wassermischbaren Lösemitteln gegenüber dem Stand der Technik dar.

Die Ausbeute des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich dadurch erhöhen, dass die Extraktion mit Methylacetat mehrfach, vorzugsweise 1 bis 10-fach, besonders bevorzugt 1 bis 6-fach und insbesondere bevorzugt 1 bis 3 -fach wiederholt wird, oder dass in einer an sich bekannten kontinuierlichen Extraktion z.B. nach dem Gegenstromprinzip einer 2 , 3 -Butandiol-haltigen wässrigen Mischung Methylacetat als Extraktionsmittel einge- setzt wird.

Somit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine Ausbeu- temaximierung mittels mehrfacher oder kontinuierlicher Extraktion der 2 , 3 -Butandiol-haltigen wässrigen Lösung mittels Me- thylacetat als Extraktionsmittel, wobei die 2,3-

Butandiolausbeute im Extrakt >70 %, bevorzugt >80 %, besonders bevorzugt >90 % und insbesondere bevorzugt 100 % der zur Ex- JO traktion eingesetzten 2 , 3 -Butandiolmenge (ausgedrückt in g 2,3- Butandiol) beträgt.

Es ist ferner möglich, in jedem Extraktionsschritt das Volumen des Lösemittels im Vergleich zum Volumen der zu extrahierenden wässrigen 2 , 3 -Butandiollösung zu erhöhen und auf diese Weise die Zahl der nötigen Extraktionsschritte zu reduzieren, wobei die Erhöhung des Lösemittelvolumens im Vergleich zum Volumen der wässrigen 2 , 3 -Butandiollösung um den Faktor 5 bevorzugt, um den Faktor 3 besonders bevorzugt und um den Faktor 2 insbesondere bevorzugt ist.

Zur Erhöhung der Extraktionseffizienz können der wässrigen 2,3- Butandiol-Lösung auch Zusätze zugefügt werden. Dabei handelt es sich z. B. um Salze mit einem sog. Aussalzeffekt wie z.B. Sulfatsalze, Phosphatsalze, Carbonatsalze, Nitratsalze oder Chloridsalze.

Diese Zusätze werden vorzugsweise zugefügt in Mengen von 1 % bis 100 %, besonders bevorzugt 1 % bis 70 % und insbesondere bevorzugt 1 % bis 40 % bezogen auf ihre maximale Löslichkeit in Wasser .

Bei den Zusätzen kann es sich aber auch um unpolare organische Lösemittel handeln, die mit Methylacetat mischbar, mit der wässrigen Phase aber nicht mischbar sind. Beispiele dafür, aber nicht darauf beschränkt, sind organische Lösemittel wie n- Pentan, n-Hexan, n-Heptan, Cyclopentan, Cyclohexan, sowie alle Isomere des Pentans, Hexans oder Heptans .

Diese Zusätze werden zugefügt in Mengen von 0,1 % bis 30 %, bevorzugt 0,5 % bis 20 %, besonders bevorzugt 1 % bis 10 % und insbesondere bevorzugt 1,5 % bis 5 % bezogen auf das eingesetzte Volumen Methylacetat.

Wenn es sich bei der 2 , 3 -Butandiol -haltigen wässrigen Mischung um eine durch Fermentation eines 2, 3 -Butandiol produzierenden Stammes erhaltenen Fermenterbrühe handelt, so kann die Extrak- Π tion von 2 , 3-Butandiol durch Methylacetat ohne vorgeschaltete Verfahrensschritte direkt aus der Fermentertarühe erfolgen oder bereits in situ während der Fermentation erfolgen. Vor der Extraktion aus der Fermenterbrühe ist es jedoch auch möglich, die Mikroorganismen zu inaktivieren. Die Inaktivierung der Mikroorganismen kann in an sich bekannter Weise chemisch erfolgen (z.B. durch Behandlung der Fermenterbrühe mit Peroxiden, Wasserstoffperoxid oder mit Bleichlauge, Lösungen der hy- pochlorigen Säure oder ihrer Salze} oder aber auch thermisch durch Behandlung der Fermenterbrühe mit Wasserdampf, wie z.B. autoklavieren bei 121°C.

Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die Extraktion aus der Fermenterbrühe ohne weitere Vorbehandlung oder nach thermischer Inaktivierung erfolgt.

Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die Extraktion aus der Fermenterbrühe ohne weitere Vorbehandlung erfolgt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Fermenterzellen vor der Extraktion aus der Fermenterbrühe abgetrennt. Die Abtrennung der Fermenterzellen erfolgt dabei in an sich bekannter Weise durch z.B. Sedimentation, Zentrifugati- on, Filtration, Fällung, Flockung oder aber auch durch eine Vorextraktion in einem Zweiphasengemisch (wie z.B. nach dem Stand der Technik mit Ammoniumsulfat und Isopropanol, bzw.

Ethanol) . Besonders bevorzugt ist die Abtrennung der Fermenterzellen durch Zentrifugation, Filtration oder Flockung, insbesondere bevorzugt ist die Abtrennung der Fermenterzellen durch Zentrifugation oder Filtration. Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Batchve fahren oder im kontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden. Die Extraktion im Batchve fahren kann dabei beliebig oft wiederholt werden, bis das 2 , 3-Butandiol vollständig aus der wässrigen Phase extrahiert ist. Bevorzugt sind ein bis sechs Extraktionen im Batchverfahren, besonders bevorzugt eine bis drei Extraktionen und insbesondere bevorzugt eine Extraktion.

Die Extraktion von 2 , 3-Butandiol mit Methylacetat aus einer wässrigen Lösung im kontinuierlichen Verfahren wird in an sich bekannter Weise vorzugsweise mit einer Extraktionskolonne im Gegenstrom durchgeführt wobei sowohl eine Siebbodenkolonne wie auch eine Füllkörperkolonne zur Anwendung kommen können.

Je nach gewünschtem Reinheitsgrad des 2 , 3 -Butandiolprodukts kann das erfindungsgemäße Verfahren durch zusätzliche Verfah- rensschritte, die entweder vor oder nach der Extraktion mit Methylacetat durchgeführt werden, ergänzt werden.

Bei diesen Verfahrensschritten handelt es sich um an sich bekannte Methoden wie Zentrifugation, Sedimentation, Sedimentati- on unter Einsatz von Flockungsmitteln, Filtration, Destillation, Dünnschichtverdampfen, Extraktion mit einem von Methylacetat verschiedenen Lösemittel, Kristallisation, Chromatographie, Pervaporation, Reverse Osmose, Dampf -Strippen. Bevorzugt handelt es sich um Zentrifugation, Filtration und Destillation,

Durch Kombination verschiedener Aufarbeitungsschritte und unter Einbeziehung der Extraktion von 2 , 3-Butandiol aus einer wässrigen Lösung mit Methylacetat kann 2 , 3 -Butandiol in einer Ausbeute (definiert als die Menge 2 , 3 -Butandiol in Prozent bezogen auf die in der wässrigen Lösung enthaltene Menge 2 , 3 -Butandiol) >60 %, bevorzugt >70 %, besonders bevorzugt >80% und insbesondere bevorzugt >90 % isoliert werden, wobei die chemischen Reinheit des 2,3-BDL Produktes durch die weitere Verwendung bestimmt ist und bis >99 % betragen kann. Eine mögliche Abfolge von Aufarbeitungsschritten unter Einbeziehung der erfindungsgemäßen Extraktion mit Methylacetat zur Gewinnung von 2,3- Butandiol aus Fermentationsansätzen ist exemplarisch im 5. , 6. und 7 . Beispiel beschrieben. Dabei ist dem Fachmann bekannt, dass Zahl, Abfolge und Art der Aufarbeitungsschritte beliebig kombiniert werden können, aber immer zum Ziel haben, 2,3- Butandiol zu den geringst möglichen Kosten aus einer Fermenterbrühe zu isolieren.

Die in den Beispielen beschriebene Abfolge möglicher Aufarbeitungsschritte umfasst die erfindungsgemäße Extraktion einer 2, 3 -Butandiol enthaltenden Fermenterbrühe mit Methylacetat , wobei die Fermenterbrühe entweder direkt eingesetzt werden kann oder aber nach vorheriger Abtrennung der Biomasse, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration, bzw. eine Kombination aus beiden, und das 2 , 3 -Butandiol anschließend mit Methylacetat extrahiert wird. Der resultierende Methylacetat Extrakt wird anschließend vorzugsweise durch eine zweistufige Destillation aufgearbeitet, wobei vorzugsweise in einem ersten Schritt das niedrig siedende Methylacetat (5. und 7. Beispiel) abgetrennt wird (dieses wird bevorzugt zur Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus einer Fermenterbrühe wiederverwendet) , vorzugsweise gefolgt von einer zweiten Destillation {Feindestillation, 6. Beispiel), bei der zuerst eine Fraktion mit mittlerem Siedepunkt (Acetoin, Ethanol, Wasser, Essigsäure} und schließlich die höher siedende Hauptfraktion des 2, -Butandiol gewonnen wird.

Zur Quantifizierung, bzw. Bestimmung der Reinheit des isolier- ten 2,3-BDL Produkts stehen verschiedene analytische Methoden zur Verfügung, darunter GC, HPLC, NMR, Bestimmung des Siedepunktes, Elementaranalyse oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden . Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung :

Beispiel 1:

2,3-BDL Produktion mittels eines K. terrigena Stammes durch Fed-Batch Fermentation

Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulu von Klebsiella terrigena-pALSbl-tet (offenbart in DE 102011003394) in LBtet Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl, 15 g/ml Tetracyclin) wurde hergestellt, indem 2 x 100 ml LBtet Medium, jeweils in einem 1 1 Erlenmeyer- kolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LBtet Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei -20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OD ₆₀ o/ml von 0,5 - 2,5) . 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 1 Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 1 Fermentermedium.

Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat ^® C-DCü 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt, Fermentationsmedium war FM2tet. Die Fermentation erfolgte im Baten Modus .

FM2tet Medium enthielt Glucose 60 g/1; 10 g/1; Hefeextrakt (Oxoid) 2,5 g/1; Ammoniumsulf t 5 g/1; NaCl 0,5 g/1; FeS0 ₄ x 7 H ₂ 0 75 mg/1; Na ₃ Citrat x 2 H ₂ 0 1 g/1; CaCl ₂ x 2 H ₂ 0 14,7 mg/1;

MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0 0,3 g/1; H ₂ P0 ₄ 1,5 g/1; Spurenelementemix 10 ml/1 und Tetracyclin 15 mg/1. Der pH des FM2tet Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt. Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H ₃ B0 ₃ 2,5 g/1; CoCl ₂ x 6 H ₂ 0 0,7 g/1; CuS0 ₄ x 5 H ₂ 0 0,25 g/1; MnCl ₂ x 4 H ₂ 0 1,6 g/1; ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0 0,3 g/1 und Ma ₂ Mo0 ₄ x 2 H ₂ 0 0,15 g/1.

2 x 8 1 FM2tet wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermenta- tionstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH ₄ OH, bzw. 6 N H ₃ P0 ₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm (vvm: Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute) . Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450 - 1.000 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (Schill & Seilacher, 20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Wach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD^o/rol von 30 - 40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet. Hauptfermenter : Die Fermentation wurde in einem Biostat ^® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 1, Kesselvolumen 500 1} der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2tet. Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus. 180 1 FM2tet wurden mit 16 1 Inokulum beimpft. Fermentations- temperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,0 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH ₄ OH, bzw. 6 N H ₃ P0 ₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem, bezogen auf das Anfangsvolumen konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200 - 500 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser} verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Glu- coseverbrauch durch off-line Glucose-Messung mit einem Glucose- Analysator der Fa. YSI bestimmt. Sobald die Glukosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/1 betrug (8 - 10 h nach Inokulation) , wurde die Zudosierung einer 60% w/w Glucose Feed- lösung gestartet. Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Glukosekonzentration von 10 - 20 g/1 eingehalten werden konnte.

In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:

Die Zelldichte OD600 als Maß der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt {BioRad Photometer SmartSpec™ 3000) . Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert , das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Gehaltsanalyse für 2 , 3 -Butandiol und andere Fermentations- produkte in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch ¹ H-NMR. Dazu wurde aus der Fermentation ein Aliquot des Fermentationsansatzes entnommen und zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) , um einen Kulturüberstand zu gewinnen. 0,1 ml des Kulturüberstandes wurden mit 0,6 ml TSP (3- Trimethylsilyl) Propionsäure-2 , 2 , 3 , 3-d ₄ Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/1) in D ₂ 0 gemischt. Die ¹ H~NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analysen in folgenden Bereichen integriert:

TSP: 0,140 - - 0,145 ppm (9H)

2 , 3 -Butandiol : 1,155 - - 1,110 ppm (6H)

Ethanol : 1,205 - - 1,157 ppm (3H)

Essigsäure : 2, 000 - - 1,965 ppm (3H)

Acetoin: 2,238 - - 2,200 ppm (3H)

Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 330 1. Der Fermentationsansatz wurde aus dem Fermenter abgelassen und in Aliquots bei -20°C aufbewahrt. Die Gehaltsbestimmung der Fermenterbrühe ergab folgendes Ergebnis:

2 , 3 -Butandiol : 122,3 g/1

Ethanol : 6,7 g/1

Essigsäure : 9,0 g/1

Acetoin: 8,2 g/1

Beispiel 2

Vergleichende Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus Fermenterbrühen mit Methylacetat , Ethylacetat, MTBE, 1-Pentanol, Methylpropio™ nat und Oleylalkohol

Eine 2 , 3 -Butandiol-haltige Fermenterbrühe wurde hergestellt und der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol wurde bestimmt wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol betrug 122,3 g/1. 20 ml der Fermenterbrühe wurden einmal mit je 20 ml Methylacetat, Ethylacetat, MTBE, 1-Pentanol, Methylpropionat und Oleylalkohol bei 22°C extrahiert, indem die Ansätze 15 min bei 400 rpm auf einem Orbitalschüttler (Schüttler KL- 2 der Fa. Bühler) gemischt wurden. Die Ansätze wurden anschließend zur Phasentrennung jeweils zentrifugiert (Eppendorf Megafuge, 5 min 3.000 rpm). Die obere, organische Phase wurde jeweils abpipettiert, in einen 250 ml Glasrundkolben überführt, das Lösemittel durch Destillation an einem Rotationsverdampfer abgezogen und der Gehalt an 2, 3-Butandiol durch NMR bestimmt (siehe 1. Beispiel) . Vom Ansatz mit Oleylalkohol wurde wegen des hohen Siedepunkts von 330-360°C das 2 , 3 -Butandiol {Siedepunkt 180°C) im Rotationsverdampfer abdestilliert und der Gehalt im Destillat bestimmt. Von der unteren, wassrigen Phase wurde der Gehalt an 2 , 3-Butandiol direkt durch NMR bestimmt. Die 2 , 3-Butandiol Ausbeuten sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1:

Extraktionseffizienz verschiedener Lösemittel bei der Extrakti- on von 2 , 3 -Butandiol aus Fermenterbrühen

(E) erfindungsgemäßes Verfahren; (V) Vergleichsverfahren Beispiel 3 :

Extraktion von 2 , 3 -Butandiol aus einer Fermenterbrühe durch Mehrfachextraktion mit Methylacetat, Ethylacetat, MTBE und 1- Pentanol Eine 2 , 3-Butandiol-haltige Permenterbrühe wurde hergestellt und der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol wurde bestimmt wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol betrug 122,3 g/1. Die Fermenterbrühe wurde mit Methylacetat , Ethylacetat, MTBE oder 1-Pentanol extrahiert. Dazu wurden 25 ml der Fermenterbrühe dreimal mit je 25 ml des betreffenden Lösemittels bei 22°C extrahiert, indem die Ansätze 15 min bei 400 rpm auf einem Orbitalschüttler (Schüttler KL-2 der Fa. Bühler) gemischt wurden. Die Ansätze wurden anschließend zur Phasentrennung jeweils zentrif giert (Eppendorf Megafuge, 5 min 3.000 rpm) . Die oberen, organischen Phasen der drei Extraktionsschritte wurden jeweils abpipettiert und in einen 250 ml Glasrundkolben vereinigt. Anschließend wurde das Lösemittel durch Destillation an einem Rotationsverdampfer abgezogen. Vom Destillationsrückstand wurde das Volumen und der Gehalt an 2 , 3 -Butandiol bestimmt

(siehe 1. Beispiel) . Die 2 , 3 -Butandiolausbeuten sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2:

2 , 3 -Butandiol Ausbeute nach Extraktion von Fermenterbrühe mit verschiedenen Lösemitteln

2 , 3 -Butandiol (g) Ausbeute (%)

Fermenterbrühe 3 , 06 100

ethylacetatextrakt 1 ₁ SX 59,3

Ethylacetatextrakt 0, 75 24 , 5

ΜΤΒΞ- Extrakt 0, 13 4,2

1 - Pentanolextrakt 1,30 42,5

Mit 1-Pentanol konnten 42,5 % 2 , 3 -Butandiol extrahiert werden, wobei aufgrund des hohen Siedepunkts von 1-Pentanol von 138°C (zum Vergleich: Siedepunkt von 2 , 3-Butandiol 180°C) ca. 40 % des extrahierten 2 , 3 -Butandiols in der abdestillierten Lösemittelfraktion wiedergefunden wurden. Dies bedeutet bei der Verwendung von l-Pentanol als Lösemittel zur Extraktion, dass ein größerer Aufwand zur destillativen Gewinnung des extrahierten 2 , 3 -Butandiols betrieben werden muss, Beispiel 4

Extraktion von 2,3-BDL mit Methylacetat, Methylpropionat und Methylbutyrat 0,1 1 des im 1. Beispiel hergestellten Fermentationsansatzes wurde 15 min bei 15.000 rpm zentrifugiert (Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem SS34 Rotor) . Drei Aliquots von je 20 ml des Zentrifugationsüberstandes (2 , 3 -Butandiol Einsatzmenge 2,4 g} wurden in 50 ml Falconröhrchen überführt und mit je- weils 20 ml Methylacetat, Methylpropionat und Methylbutyrat extrahiert. Dazu wurden die verschlossenen Falcon Reaktionsgefäs~ se 20 min bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend zur Phasentrennung zentrifugiert (5 min 3.000 rpm, Eppendorf Me™ gafuge) . Von der unteren, wässrigen Phase wurde jeweils ein Aliquot zur Bestimmung des 2 , 3 -Butandiol Gehalts verwendet.

Nach Extraktion mit Methylacetat wurden 1,4 g 2 , 3 -Butandiol in der wässrigen Phase wiedergefunden, entsprechend 60 % der eingesetzten 2 , 3 -Butandiolmenge von 2,4 g. 40 % der eingesetzten 2 , 3 -Butandiolmenge wurden somit unter den gewählten Bedingungen der einfachen Extraktion durch Methylacetat extrahiert. Mit Methylpropionat konnten 5 %, mit Methylbutyrat hingegen kein 2,3- Butandiol extrahiert werden.

Beispiel 5

Präparative Extraktion von 2,3-BDL aus zellfreien Fermentationsüberständen mit Methylacetat

1 1 des im 1. Beispiel hergestellten Fermentationsansatzes wurde 30 min bei 8.000 rpm zentrifugiert (Sorvall Zentrifuge RC5C, ausgestattet mit einem GS- 3 Rotor) . 800 ml des Zentrif gationsüberstandes (2 , 3 -Butandiol Einsatzmenge 97,8 g) wurden dreimal mit je 1,6 1 Methylacetat extrahiert, indem der Extraktionsansatz jeweils 30 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die organische Phase wurde jeweils über einen Scheidetrichter von der wässrigen Phase abgetrennt. Die organischen Phasen wurden vereinigt und das Methylacetat destillativ in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Dadurch wurden 250 ml einer 2 , 3-Butandiol Rohfraktion gewonnen. Die 2 , 3-Butandiolkonzentration der Roh- fraktion betrug 323,3 g/1. Die 2 , 3 -Butandiolausbeute betrug 80,8. g, bzw. 82,7 % {bezogen auf die Einsatzmenge von 97,8 g) .

Beispiel 6

Destillative Aufarbeitung von 2,3-BDL Extrakten

Die im 6. Beispiel durch Extraktion mit Methylacetat gewonnene Rohfraktion (250 ml, 80,8 g 2 , 3-Butandiol) wurde durch Destillation fraktioniert. Die Rohfraktion wurde in einen 0,5 1 Glas- rundkolben überführt und über einen 30 cm Rückflusskühler fraktioniert destilliert. Dabei wurde ohne Vakuum destilliert

(Heiztemperatur 118 °C) , um niedriger siedende Fraktionen abzutrennen (Dauer ca. 30 min) , Anschließend wurde ein Vakuum von 100 mbar angelegt und die Heiztemperatur bis auf 192 °C erhöht (Dauer ca. 60 min). Die 2 , 3 -Butandiol Fraktion wurde bei einer Kopftemperatur von 120 °C aufgefangen und ausgewogen. Die Aus- waage der Fraktion betrug 75 g. Die Fraktion wurde durch NMR analysiert (siehe 1. Beispiel). Der Anteil an Verunreinigungen war < 1 %. Bezogen auf die eingesetzte Menge 2, 3-Butandiol in der Rohfraktion von 80,8 g betrug die Ausbeute 92,8 %.

Beispiel 7

Praparative Extraktion von 2,3-BDL aus zellfreien Fermentationsüberständen mit Methylacetat im Pilot-Maßstab

60 1 des im 1. Beispiel fermentativ hergestellten Fermentationsansatzes wurden sukzessive in je 6 1 Aliquots 30 min bei 5.000 rpm zentrifugiert (Sorvall Zentrifuge Evolution RC der Fa. Thermo Scientific, ausgestattet mit einem Rotor F8S

SxlOOOy) . Vom gesammelten Zentrifugationsüberstand wurde anschließend in 17 Chargen zu je 3 1 durch Querstromfiltration ein zellfreies Filtrat hergestellt.

Zur Filtration wurde eine kommerziell erhältliche Querstrom Filtrationseinheit der Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH (Sar- tocon ^® Slice, ausgestattet mit drei 0,2 m Hydrosart Microfil- termembranmodulen von je 0,1 m ² Filtrationsfläche und betrieben mit einer Sartojet Membranpumpe des gleichen Herstellers) ein- gesetzt und entsprechend den Empfehlungen des Herstellers betrieben. Die Pumpgeschwindigkeit betrug dabei 38 1/h, die

Druckbegrenzung war auf einen Maximaldruck von 3 bar eingestellt. Die Filtrationsrate betrug durchschnittlich 0,4 1/h. 40 1 Filtrat wurden gewonnen entsprechend einer 2 , 3-Butandiolmenge von 4,9 kg.

Zur Extraktion des 2 , 3 -Butandiols wurden die 40 1 Filtrat in einem 200 1 Reaktionskessel dreimal mit je 80 1 Methylacetat extrahiert. Dazu wurde der Extraktionsansatz jeweils 1 h bei

Raumtemperatur gerührt und die Methylacetatphasen nach der Phasentrennung in einem 500 1 Reaktionskessel vereinigt. Das Lösemittel wurde anschließend abdestilliert {bei 50 °C und einem Vakuum von 100 rnbar) und ein Rohextrakt erhalten. Das Volumen des Rohextraktes betrug 13,1 1. Die Ausbeute an 2 , 3 -Butandiol betrug 4 kg (82 % Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Menge 2,3- Butandiol von 4,9 kg) . Die analytisch bestimmte Zusammensetzung des Rohextraktes war: 2 , 3-Butandiol 305,9 g/1, H20 656,9 g/1, Acetoin 38,3 g/1, Ethanol 5,7 g/1, Essigsäure 1,1 g/1.