DE BOMBYX MORI ET SUBSTANCE OBTENUE

La présente invention est du domaine des biotechnologies et a pour objet un procédé d'obtention d'un produit biologique à partir de la larve du ver à soie : BOMBYX MORI, le produit obtenu suivant _. le procédé et des applications de ce produit aux domaines de la dermo-cosmétique, pharmacie, diététique.

Actuellement, il existe sur le marché de nombreuses matières premières visant ces do¬ maines, d'origine végétale ou animale en particulier mam¬

10 mifères (organiques, placentaire, embryonnaire, sanguine...), ainsi que des extraits de chrysalides, notam¬ ment de BOMBYX MORI. Par ailleurs, la larve de BOMBYX MORI est connue par ses qualités nutritionnelles en particulier dans les pays tropicaux et équatoriaux où elle permet de limiter les carences multinutritionnelles à ceux qui en consomment. En effet, sur un plan analytique, cet aliment contient des vitamines, des oligo-éléments, des acides aminés essentiels, des acides gras essentiels en proportions tout a fait intéressantes.

De nombreuses publications

20 ont décrit les techniques de traitement des larves d'in¬ sectes et notamment du BOMBYX MORI.

Pour cerner de manière plus précise l'arrière plan de l'invention, se reporter aux deux publications suivantes.

25 En premier lieu, un Brevet FR1503586 (BORDAS) décrit la manière d'obtenir des produits cosmétiques à partir de corps adipeux de lépidoptères, le BOMBYX MORI étant cité ; il y a lieu d'observer toutefois que cette publication préconise le traitement de l' "insecte"

30 dans le cas présent au stage de sa métamorphose Nymphe/ Chrysalide, soit le 6ème âge, car selon l'auteur l'activité est plus importante que celle qui pourrait être observée sur la larve au 5ème âge, c'est-à-dire à son stade chenille ou larve, avant le coconnage. -,- La simple observation des ana-

lyses citées dans les tableaux permet de constater qu'il n'en est rien et c'est pourquoi il est proposé de traiter l'insecte en entier dans sa phase chenille et uniquement dans la période du Sème âge. Le traitement peut se faire 5 sur le ver frais ou congelé ou sur le ver lyophilisé par des extractions de type chimique ou/et mécanique pour ob¬ tenir les meilleures propriétés pharmacodynamiques (tableaux 1, 2 et 3) .

En second lieu, KODONDI, ₀ LECLERCQ, BOURGEAY-CAUSSE et la (1987) ont publié dans la revue "Aliments" sous le titre "Intérêt nutritionnel de chenilles et attacidés du Zaire : composition et valeur nutritionnelle", un article fournissant des analyses de larves et leurs modes opératoires ; cet article ne précise pas toutefois à quel stade de développement doivent être 5 prises ces chenilles qui, au demeurant, ne sont pas de larves de BOMBYX MORI.

La démarche inventive du de¬ mandeur a consisté, dans un premier temps, à mettre en doute le fait que seul le corps adipeux de la chenille o ou de la chrysalide pouvait expliquer les vertus cosmétiques et, dans un deuxième temps, à procéder à de nombreuses analyses précises : il apparaît que, dans le 5ème âge (avant la métamorphose) , la chenille possède une quantité très équilibrée d'éléments protéiques, lipidiques, vitaminiques. 5 Dans un troisième temps, les domaines d'application sont élargis à la dermatologie et à la nutritrion.

L'invention, tant dans les conditions du procédé que dans les résultats quantitatifs obtenus est strictement limitée à la larve de BOMBYX MORI _Q - élevée dans une magnanerie et nourrie avec des feuilles de mûriers.

Le procédé de 1'invention consiste tout d'abord à sélectionner et à récolter les chenilles atteignant le stade dit "de la montée", dans le 5ème âge, c'est à dire à l'âge consécutif à la 5ème

mue, en général, vers le 8ème jour, parfois plus tard.

Suivant une première variante du procédé, ces chenilles sont, de préférence, et dans cet ordre : broyées, de préférence cryobroyéeε, séchéeε, de préférence lyophilisées, et la poudre obtenue tamisée. A l'un quelconque des stades de traitement, le produit peut être congelé, de préférence sous azote liquide en attendant l'étape suivante. On obtient une poudre plus ou moins fine selon le tamis utilisé, plus ou moins homogène selon le broyage, d'odeur végétale, de couleur plus ou moins verte selon la façon dont le produit a été conservé.

Une seconde étape du procédé de l'invention consiste en l'ensemble des étapes consé¬ cutives suivantes : centrifugation, broyage, séchage, ta¬ misage. Une troisième étape consiste en une extraction lipidique par des méthodes chimiques comme la méthode de FOLCHE, ou le C02 super critique plus ou moins associé à une pompe à co-solvant, ou par l'hexane, ou autre solvant organique. Une quatrième étape peut consister à séparer par tamisage la glande séricigène et son contenu broyé du reste de la poudre.

Une cinquième étape consiste à effectuer une extraction aqueuse selon des procédés clas- siques pour obtenir ainsi un résidu délipidé sans soie insoluble dans l'eau. Soumise à hydrolise par des moyens physiques ou chimiques, la substance obtenue représente un hydrolisat d'acides aminés utilisable en cosmétologie et produits d'hygiène corporelle. Une sixième étape consiste à congeler, en notant que la congélation est possible après l'une quelconque des étapes précitées en attendant l'étape suivante.

Une septième étape consiste en l'adjonction d'additifs tels que : antioxydants, conser-

vateurs, antiseptiques, antibiotiques, huiles essentielles, parfums... pourrant être incorporés à un stade quelconque des extractions dans une substance biologique quelconque issue des extractions afin de la stabiliser, de parfumer...

Une huitième étape consiste à stériliser le produit d'extraction par filtration, par rayonnements ionisants, par gaz ou par procédés chimiques ; on notera que ce traitement est applicable à la susbtance issue de l'une quelconque des étapes précitées.

10 A titre de variante de la pre¬ mière étape on peut laisser le ver à soie se vider du contenu de leurs tubes digestifs et recueillir, trier et sécher cette substance excrémentielle qui contient des vitamines en grande quantité et en particulier la vitamine B12 ; la substance obtenue est utilisable en nutrition

15 animale et humaine.

A titre de variante du procédé sus-décrit la deuxième étape peut être précédée d'une cen- trifugation.

A titre de variante on sépare

20 par différence de densité les deux composants de la soie de BOMBYX MORI fibroine et séricine, la soie obtenue pouvant être considérée comme de la soie native possédant un haut pouvoir couvrant quand elle est pulvérulente après tamisage fin, et pouvant être utilisée à ce titre comme poudre de 25 maquillage, ou encore comme charge dans les produits cosmétiques en particulier de maquillage, à titre de fixation de pigment, ou encore être utilisée comme vecteur de principe actif ; un tamisage moins fin, ou plus grossier, permet d'obtenir une poudre légèrement abrasive pouvant , _Q être utilisée comme produit de gommage ou de peeling dans le domaine de la dermocosmétologie.

A titre illustratif d'extraction convenant à la substance de l'invention, le Demandeur préconise le mode opératoire suivant: - - - mise en suspension de la

poudre de ver à soie dans l'eau (soit poudre brute, soit poudre délipidée, soit poudre désoyée, soit poudre délipidée et désoyée) ,

- macération sous agitation mécanique ou magnétique, par exemple à 30°C pendant 1 heure,

- puis filtration sur verre fritte ou sur papier, sous vide ou sous pression atmos¬ phérique,

- la solution obtenue, dont l'extrait sec est fonction des quantités relatives d'eau et de poudre, peut être stabilisée par adjonction de pro- pylèneglycol (ou autre conservateur), la stabilisation pouvant aussi être réalisée par déssication.

La méthode sus-indiquée s'ap¬ plique aussi bien à la poudre qu'au broyât frais du ver.

Dans la substance obtenue suivant la variante de la deuxième étape dans laquelle on a conservé au ver à soie ses glandes séricigènes, le rapport protéines (en grammes) sur lipides (en grammes) est supérieur à 4,5, et la somme des quantités de vitamines B5 et PP est supérieure ou égale à 10 mg.

La substance constituant le reliquat du traitement de la quatrième étape à savoir le ver amputé de sa glande séricigène, traité par dissolution dans l'eau, peut être utilisée en cosmétologie et derma¬ tologie et elle possède un pouvoir oxygraphique important à extrêmement important selon la concentration en principes actifs, elle a un effet cicatrisant et un effet de lissage cutané donc antiride par modification du nombre et de la profondeur de rides.

La substance résultant de l'am¬ putation des glandes séricigènes a un rapport protéines (en grammes) sur lipides (en grammes) supérieur à 3,5.

La substance peut être utilisée en dermatologie et en cosmétologie, diluée dans un corps gras ou pur et incorporé dans un excipient plus ou moins

gras ou dans un gel ; elle a un effet de restructuratior. cutanée après agression par exemple le lauryl sulfate ; en outre elle augmente la résistance de la peau à la dé¬ formation (test de fermométrie) et a un effet hydratant par reconstitution de la barrière cutanée.

Le tableau 1, établi à partir d'analyses du lyophilisât de larves de BOMBYX MORI prélevées après le 8ème jour du 5ème âge, conformément à l'invention, fournit les concentrations d'un certain nombre de composants (quantités relatives).

Le tableau 2 est tiré du brevet cité ci-dessus FR1503586, il représente les quantités re¬ latives de certains composants.

Le tableau 3, qui est une ana¬ lyse comparative des pourcentages de glucides, lipides, protéines, d'une part du produit du brevet cité ci-dessus, d'autre part du produit de l'invention, démontre que ces produits sont totalement différents. En effet, la quantité relative de protéines dans le produit de l'invention est très supérieure, au détriment des lipides. Ces trois tableaux sont pré¬ sentés en ANNEXE de la présente description.

On tirera du TABLEAU 1, à titre de proportions caractéristiques de l'extrait, ou substance, relevant de 1*invention : - la proportion protides/lipides de - 66,1/14,0 = 4,73, toutjours supérieure à 3,52 dans la période pré-pupale,

- un poids cumulé pour 100 g. de matière sèche (MS) des vitamines B5 et PP, de 15 mg pouvant descendre jusqu'au 10 mg.

On comprendra que seuls les moyens modernes d'analyses ont permis d'optimiser le moment du prélèvement et il est permis d'espérer que des moyens encore plus performants permettront d'affiner encore da- vantage une ou plusieurs périodes à l'intérieur de celle

ci-dessus définie, afin de pouvoir même sélectionner le stade optimal de production d'une vitamine ou d'une hormone particulière ; bien évidemment les conditions d'élevage devront, parallèlement permettre une homogénéité concomit- tante de la population des chenilles.

A titre de variantes :

- le broyage peut être suivi d'un pressage et/ou d'une filtration,

- on peut ajouter à ce broyât filtré ou non des additifs : conservateurs, antiseptiques, bactéricides, fongicides, antioxydants, huiles essentielles, parfums, ou autres stabilisants, ^'

- à l'un quelconque de ces stades de traitement, le produit peut être congelé sous azote liquide ou non en attendant l'étape suivante,

- le broyât ou le filtrat peut ne pas être congelé ni séché et alors être utilisé pur ou dilué dans un excipient avec ou sans autre principe actif, dès l'instant où il sera stabilisé,

- le séchage peut être, non seulement effectué par lyophilisation, mais aussi par atomi- sation ou par nébulisation, ou par exemple par séchage sur surface raclée (procédé HATMAKER) ou tout autre moyen au risque de détruire des molécules thermosensibles.

A titre de variante d'extrac- tion, à partir du broyât frais ou du lyophilisât, il est possible d'extraire chimiquement les lipides avec les vi¬ tamines liposolubles d'un côté, et les autres composants de l'autre avec, en particulier, les protéines et les vi¬ tamines hydrosolubles ; il est aussi possible d'effectuer des extractions aqueuses, des extractions alcooliques.

A titre d'autre variante d'ex¬ traction, il est possible d'enlever les glandes séricigènes avant le broyage et on obtiendra, d'une part les glandes séricigènes très riches en acides aminés suivants : ty- rosine, glycine, alanine, serine et que l'on peut broyer

très finement jusqu'à obtenir une poudre pulvérulente et, d'autre part, les chenilles amputées de cet organe, avec une teneur en protéines moindre mais sur laquelle on peut procéder identiquement à des extractions diverse : lipi- diques, aqueuses, alcooliques entre autres ; l'enlèvement de cette glande séricigène peut avantageusement être ré¬ alisée par une centrifugation.

Il est, bien sûr, possible de débactériser la substance obtenue selon le procédé de l'invention, ou ses variantes, de façon plus ou moins pous¬ sée selon les domaines d'application.

Des tests de toxicité ont été effectués avec la poudre lyophilisée sur recommandation de 1*INSTITUT PASTEUR, par le laboratoire HAZLETON, sur un lot de rats, et se sont avérés négatifs. Aucune toxicité par voie orale n'est apparue, même aux doses les plus éle¬ vées.

Des tests d'oxygraphie sont effectués sur l'extrait aqueux : son pouvoir oxygraphique est extrêmement important. Un essai clinique a été réalisé sur une femme d'une cinquantaine d'années, qui présentait sur l'avant bras gauche, face postérieure, une cicatrice de brûlure, 2ème degré profond, ancienne de 8 mois et, à ses dires, douloureuse au frottement des vêtements, rouge-violacée, boursouflée, dyspigmentée. En quelques jours, l'hyperesthésie avait disparue ; au bout de deux mois, il reste une cicatrice étoilée, complètement indolore, dépigmentée, plane, très souple et ne présentant aucun aspect chéloïdique. Cette femme a, de son propre chef, passé sur sa cicatrice de brûlure, le broyât pur de ver à soie, préparé un an auparavant et conservé au réfrigé¬ rateur, sans aucun additif ; -l'utilisatrice a seulement noté l'apparition d'un halo plus foncé à la surface du produit et correspondait probablement à l'oxydation des lipides en contact avec l'air. Aucune mauvaise odeur n'est

apparue et encore moins l'apparition de moisissures.

Le Demandeur propose pour l'ex¬ trait de larves de ver à soie BOMBYX MORI, ci-dessus αecrit - des applications dermo-cosmétiques : par son haut pouvoir oxygraphique et toutes les propriétés qui en découlent, par son effet tenseur immédiat et prolongé, donc son action anti-rides, par son action sur l'amélioration à effacement complet de certaines tâches dyspigmentées (hypo ou hyper pigmentées), ce qui tendrait à dire que ce serait une action de régulation de la pigmentation cutanée, une .amélioration de l'aspect du teint, une action de diminution de la coupe¬ rose, une action au niveau des vergetures, de même qu'au niveau des petites cicatrices, ainsi qu'une action capil- laire certaine de par sa teneur très élevée en acide pan- thothénique en particulier ; par son effet de reconsti¬ tution de la barrière cutanée et donc effet hydratant et amélioration visuelle de la surface cutanée.

- des usages pharmaceutiques : en accélérant les cicatrisations cutanées ou muqueuses, traumatiques ou chirurgicales, récentes ou anciennes, et en améliorant l'élasticité des tissus cicatriciels et leur aspect. On pourrait l'utiliser, en particulier, dans le cas des brûlures profondes ou superficielles (cette in- vention paraît intéressante pour améliorer les cicatrices chéloidiques, les hyperesthésies résiduelles) ; par une action au niveau de certains vitiligos en permettant une repigmentation ; par un usage nutritionnel médical à la vue des analyses biochimiques des constituants, très équi- librée en fonction des besoins de l'homme ou de certaines espèces d'animaux (vitamines, oligo-éléments) dont les analyses ont été effectuées par l' INSTITUT PASTEUR de Lyon ; lipides, acides aminés dont les analyses ont été faites par l'INRA de Theix, et par les résultats très encourageants des tests de nutrition à utiliser comme complément alimen-

taire en particulier dans des situations pathologiques comme les dénutritions post-chirurgicales, ou d'origine cancéreuse, pendant ou après un traitement anti-cancéreux, ou lors de pathologies digestives médicales ou chirurgicales et toutes autres dénutritions relevant de la médecine. A la frontière de la médecine, ce produit pourra être uti¬ lisé au cours de régimes demandant une supplémentation en éléments essentiels, par exemple des régimes amaigris¬ sants.

Des usages diététiques "grand public" lors de toutes occasions demandant une supplémen¬ tation en éléments essentiels, par exemple, lors de la pratique de sports intensifs, pour ceux qui font de la musculation et qui ont besoin d'un apport accru de proté¬ ines ; ou comme aliment de survie par exemple pour les cosmonautes, les spéléologues.

A la limite de la diététique et de la cosmétique, ce produit peut être utilisé comme complément alimentaire de 1'application de produits cos¬ métiques, comme "cosmétique alimentaire".

Il doit être enfin compris que les applications de la substance de l'invention sont données à titre illustratif et non limitatif.

A N N E X E

TABLEAU 1

COMPOSITION DE LA POUDRE DE VER A SOIE

SODIUM 6,2 mg/100 g

POTASSIUM 1615,0 mg/100 g

CALCIUM 286,0 mg/100 g

MAGNESIUM 188,0 mg/100 g

FER 2,2 mg/100 g

MANGANESE 1,1 mg/100 g

CUIVRE 0,5 mg/100 g

ZINC 5,6 mg/100 g

POSPHORE EN P 482,0 mg/100 g

CENDRES 4,37 %

LIPIDES 14.0 g%

PROTIDES 66.1 g%

GLUCIDES 9,8 g%

HUMIDITE 5.5 g%

CENDRES 4.6 g%

TAUX MOYEN

VITAMINE A 23,5 ug/100 g VITAMINE E 4,4 mg/100 g BETA-CAROTENE 550,0 ug/100 g (308 U.I./100 g) VITAMINE Bl 907,0 ug/100 g VITAMINE B2 4,0 mg/100 g VITAMINE B5 7,71 mg/100 g (Ac. panto) VITAMINE B6 550,0 ug/100 g VITAMINE PP 7,75 mg/100 g VITAMINE B8 57,20 ug/100 g ACIDE FOLIQUE 0,29 mg/100 g

TABLEAU 1 (suite)

Ng/16g

8,2 3,25 9,95 8,2 2,6 18,35 14,25 3,8 0,65 1,0 2,4 3,45 6,75 3,3 3,6 1,95 3,55

MSg/lOOg : en g/lOOg de matière sèche mesurée à l'étuve. Ng/16g : en g. pour 16g. d'azote

% DES ACIDES PAR TOTAUX

Acide palmitique 20%

Acide stéarique 5%

Acide oléique 26%

Acide linoléique 10%

Acide linolénique 45%

TABLEAU 2

14. CIDE GLUTAMIQUE 10,0 à 12,0 %

Pour un gramme frais de corps adipeux

1. LIPIDES 30 à 32 %

2. ACIDE OLEIQUE 21 à 23 %

3. ACIDE PANTHOTENIQUE 40 à 41 %

4. ACIDE FOLIQUE 6 à 7 %

5. ACIDE ASCORBIQUE 12 à 14 %

Vitamines (en gramme)

6. RIBOFLAVINE (B2) 11,0 à 13,0 %

7. THIAMINE (Bl ) 10,0 à 11,0 %

8. PYRIDOXINE (B6) 16,0 à 18,0 %

9. VITAMINE A 12,0 %

10. NIACINE (PP) 6,0 à 7,0 %

11. SUCRES 0,3 %

TABLEAU 3

ANALYSE COMPARATIVE DU CORPS ADIPEUX DE L'ART ANTERIEUR ET DU PRODUIT DE L'INVENTION

Corps adipeux Produit de de l'art antérieur l'invention

(par gramme de (par gramme de produit frais) matière sèche)

1. PROTIDES 28,0 à 30,0 % 66,1 %

2. LIPIDES 30,0 à 32,0 % 14,0 %

3. GLUCIDES 0,3 % 9,8 %

4. EAU 6.0 %

5. CENDRES 4.1 %