CAMPO TÉCNICO

La presente invención incluye métodos óptimos de extracción de flavonoles, a partir de residuos (cáscara, pepas y bagazo) de frutas tropicales preferentemente mango y/o palta, y su posterior transformación en una tecnología de preservación de alimentos frescos y alimentos cortados listos para comer (ready to eat, RTE). Esto, con la finalidad de generar un efecto natural y fung ¡estático que aporte propiedades funcionales contra el deterioro de los alimentos protegiendo su frescura y extendiendo su vida útil.

Esta invención está comprendida dentro del campo técnico de las industrias alimentarias, bioindustha, biotecnología, bioingeniería y derivados agroindusthales.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los productos hortofrutícolas frescos o cortados son productos altamente perecederos debido a su intensa actividad metabólica, por lo que su calidad es altamente vulnerable a diversos factores abióticos y bióticos. Por estos motivos, se demanda un adecuado manejo post-cosecha que garantice su preservación para asegurar la exportación y distribución evitando pérdidas, desperdicios y deterioro en el tiempo. Hoy en día existe un gran interés por desarrollar biotecnologías ecológicas, innovadoras y rentables que ayuden a preservar la vida en anaquel de frutos con vida útil limitada, o de alimentos procesados de cuarta gama como son los alimentos cortados ready to eat (RTE), siendo una alternativa factible el uso de recubrimientos biodegradables, y su enriquecimiento con extractos de naturaleza ecológica. En ese sentido, los flavonoides, pigmentos naturales presentes en diversos vegetales presentan una gran actividad antioxidante generando propiedades quelantes y secuestradoras de radicales libres, así como de la inhibición de oxidasas que al ser aplicada a diversos frutos generan un efecto físico - químico que reduce la oxidación y mejora la conservación de los alimentos de forma poco esperada. Existen diversos compuestos flavonoides en los residuos de frutas tropicales como el mango como las flavonas, flavonoles y moléculas afines. No existen investigaciones que relacionen la aplicación de flavonoides, específicamente flavonoles de residuos de frutas tropicales como el mango o la palta para su inclusión en preparaciones con efecto mejorado en productos agrícolas en aras de potenciar su valor agroindustrial; sin embargo, se han reportado en diferentes industrias como la farmacéutica y medicina el uso de flavonoles con funciones benéficas para el ser humano; en consecuencia los principales flavonoles reportados son : la quercetina y el kaempferol.

La quercetina, como flavonoide - flavonol, tiene propiedades antioxidantes y anticancerígenas, así como efectos sobre la regulación de la expresión genética. La patente ES2464192A1 contempla extractos fenólicos ricos en mangiferina y quercetina en un porcentaje de 1 ,93% y 0.83% respectivamente, obtenidos por solventes verdes a alta presión para uso cosmético y/o alimentario. Ésta patente contempla 4 etapas a) una etapa de preparación de la materia prima, b) extracción a altas presiones con solventes verdes como dióxido de carbono supercrítico y mezclas de agua / alcohol, c) una etapa de concentración supercrítica en columna y d) una evaporación del disolvente al vacío o con nitrógeno. La patente KR101300667B1 refiere un método para separar quercetina de una cebolla que comprende una etapa de mezcla en lisado alcohólico para la preparación de tabletas de quercetina.

Asimismo, existe el antecedente CN107349240A, en el cual se describe un método para extraer quercetina y otros polifenoles de cáscara de mango, realizando un primer proceso de limpieza y secado en homo a 55-65° C durante 10-12 h, luego realiza una extracción enzimática asistida por ultrasonidos, entre 42-54 °C por 3-5h, añade 2-5% en peso del hidrolizado de cloruro de aluminio, realiza una ultrafiltración del extracto y concentración a vacío no mayor a 75°C. Sin embargo, este antecedente carece de una extracción por soxhlet en gradiente de polaridad con Isopropanol, éter de petróleo, etanol, y/o lactosuero, además no realiza una reducción de olores con carbón activado.

Por otra parte, se han reportado investigaciones brindándole capacidad antimicrobiana a la quercetina. Los estudios han demostrado que la quercetina no solo tiene un buen efecto inhibidor sobre las bacterias, sino que también tiene una importante actividad inhibidora sobre los hongos. Varios experimentos han encontrado que la quercetina tiene un buen efecto inhibidor sobre el crecimiento de bacterias patógenas como Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis , Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Proteus y Aspergillus flavus (Yang et al ,2020) Por su parte Hossion y col.(2011 ) descubrieron que los nuevos acil glucósidos de quercetina, diseñados y sintetizados artificialmente, inhibían eficazmente el crecimiento de E. coli, S. aureus y P. aeruginosa. Además, el extracto de bayberry tiene actividades antibacterianas significativas contra Salmonella, Listeria y Shigella con valores de concentración mínima inhibitoria (MIC) que oscilan entre 2,07 y 8,28 mg / mi.

En este sentido, la extracción de este flavonol es de gran importancia debido a sus propiedades químicas y biológicas.

El kaempferol, antioxidante flavonol que se encuentra en frutas y verduras, con efectos dietéticos que reducen el riesgo de enfermedades crónicas, especialmente cáncer. Por ello, la patente CN105924419A brinda un método para extraer kaempferol de hojas de camellia oleífera siguiendo pasos de: lixiviación, separación de resina de adsorción macroporosa D101 , separación por cromatografía en gel de sílice y separación cromatográfica DAC que se combinan con análisis cromatográfico. En cuanto a la patente CN104557833A, la invención describe un método para extraer kaempferol utilizando flores de durazno. El método comprende los pasos de: realizar operaciones de pretratamiento, desengrasado, extracción, concentración, hidrólisis y purificación de las flores de durazno a tratar para obtener un producto de kaempferol.

Por otro lado, en cuanto a estudios sobre antioxidantes incluidos en recubrimientos comestibles o tecnologías aplicadas en la agroindustria, Pedro (2019) reporta un estudio en base a un recubrimiento de almidón de mango con aditivos fenólicos extraídos por el método de Soxhlet que impartieron a las películas, propiedades activas (antioxidantes y absorbentes de rayos UV), aunque también disminuyeron la transparencia a la luz visible de las películas. Otro estudio realizado por León (2018) reporta una investigación sobre la generación de películas comestibles formuladas con cáscara de mango el cual mostró buenas propiedades de barrera, con una permeabilidad al vapor de agua. Sin embargo, la adición de extracto antioxidante en base a polifenoles no muestra un efecto significativo (p> 0.05) sobre las propiedades ópticas, ni realiza un estudio exhaustivo sobre la vida útil otorgada.

Por su parte, se han reportado algunos estudios en cuanto al uso de residuos y extractos de paltas para formular recubrimientos comestibles, por ejemplo; Ramesh et al (2021 ) investigaron la preparación de películas comestibles utilizando almidón de semilla de paltas, donde realizaron el análisis y modelado de la superficie de respuesta para la permeabilidad al vapor de agua, los resultados mostraron que el sorbitol y el Tween-20 utilizado, afectan significativamente la propiedad del vapor de la película comestible basada en almidón de semilla de palta, por ello se recomienda el uso individual del recubrimiento para potenciar su efectividad.

Por lo expuesto, no se han encontrado referencias que relacionen el empleo de flavonoles de residuos de frutas tropicales, como el mango y/o la palta para enriquecer recubrimientos o películas para la preservación de productos agrícolas frescos o alimentos cortados RTE, por lo cual es necesario contar con un proceso para la eficiente extracción de flavonoles con alto poder antioxidante y quelante proveniente de residuos de residuos de frutas tropicales, y de fácil proceso sin aditivos químicos orgánicos en el producto final, que contribuyan a conservar y/o mejorar las características nuthcionales y organolépticas en alimentos frescos y alimentos cortados RTE, dirigidos a humanos y animales, con grado alimenticio.

Además, la valorización de residuos de la agroindustria nos ayudará a mermar el impacto ambiental y aprovechar ciertas moléculas como flavonoles para usarlos en la elaboración de recubrimientos con poder bioactivo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Como solución al problema técnico antes mencionado se desarrolló el presente invento que propone un novedoso método para la extracción de una composición de flavonoles, el método para la preparación de su dispersión coloidal y a los productos obtenidos en dichos métodos, a partir de residuos de frutas tropicales, preferentemente frutas como el mango y la palta, y residuos como cáscaras, pepas y bagazo de los frutos, donde el compuesto comprende al menos 75% los compuestos quercetina y kaempferol concentrados en la composición.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para la preparación de una solución y/o recubrimiento con efecto protector para los productos hortofrutícolas frescos y cortados, tales como frutas, hortalizas, tubérculos y raíces, y su posterior extensión de vida útil.

Esta invención contiene flavonoles que tienen estructura de fenil-benzo-y-pirona (o fenil-y-cromona), productos del metabolismo secundario de los residuos de frutas tropicales que utilizamos como materia prima. Los cuales se encuentran en forma de heterósidos. Estos heterósidos son solubles en solvente acuoso, mientras que sus geninas o agliconas, parte no azucarada del heterósido, lo son en menor medida. Los flavonoles de esta invención están constituidos por una estructura de 3 anillos con un esqueleto de difenil propano fórmula I.

Este único anillo se sintetiza por la condensación de 3 moles de malonil- coenzima A proveniente del metabolismo de la glucosa y genera una chalcona sintasa formula II.

Como estructura básica, los flavonoides presentan un esqueleto carbonado C6- C3-C6 - fórmula III, donde los componentes C6 son anillos aromáticos unidos por tres átomos de carbono que pueden formar o no un tercer anillo pirano o pirona (anillos A-C). Las distintas clases de flavonoides tienen diferentes concentraciones de saturación y en los sustituyeles del anillo C, mientras que los compuestos individuales, dentro de cada uno de estos grupos, se distinguen por la diferente sustitución de los anillos A y B. De esta forma, hemos identificado 2 flavonoles y un flavonoide en nuestra patente.

A partir de esta distribución, nuestra invención aisló quercetina presente como (2- (3,4-dihidroxifenil) -3,5,7 thhidroxi-4 H -cromen-4-ona) fórmula IV.

La biosíntesis de quercetina, inicialmente pasó a través de la ruta fenilpropanoide, donde la fenilalanina se convirtió en 4-cumaril-CoA por la acción catalítica de la fenilalanina amoniaco liasa, cinamato-4-hidroxilasa y 4-cumahl CoA ligasa. Luego, la chalcona sintasa catalizó la combinación de 4-cumaroil- CoA con tres moléculas de malonil-CoA (3), lo que produjo la formación de tetrahidroxi chalcona. La tetrahidroxi chalcona se convirtió en naringenina usando la chalcona isomerasa y la naringenina se convirtió en eriodictiol por la acción de la enzima flavanona-3[3-h¡drox¡lasa. El eriodictiol formado se convirtió en dihidroquercetina por la acción de la flavanona-3[3-h¡drox¡lasa, que finalmente se convirtió en quercetina, fórmula IV por el flavonol sintasa.

Por su parte, la producción de kaempferol, inicia cuando la fenilalanina pasa a ser p -cumaril-CoA mediante fenilalanina amoniaco liasa (PAL), ácido cinámico 4-hidroxilasa (C4H) y ácido 4-cumárico ligasa (4CL). Luego, la naringenina se genera por reacción de condensación entre una p -cumaril-CoA molecular y tres moléculas de malonil-CoA por síntesis de chalcona (CHS) y calcona isomerasa (CHI). Finalmente, la naringenina se convierte en kaempferol a través de dihidrokaempferol por la flavanona 3[3-hidroxilasa (F3H) y el flavonol sintasa (FLS).

Finalmente, con la presente invención, a partir de los subproductos, se extrajo en combinación un compuesto activo líquido, fórmula (V), alto en quercetina y kaempferol.

El objeto de la invención es el método para la extracción de una composición de flavonoles concentrada y la preparación de su dispersión coloidal, a partir de frutas tropicales preferentemente mango y palta, y residuos como cáscaras, pepas y bagazo, que comprende las siguientes etapas a) eliminación de macro- contaminantes de los residuos de frutas tropicales b) extracción y recuperación eficiente de sustancias bioactivas con tratamientos ecológicos, c) purificación con tecnología de membranas y carbón activado ecológico, d) Síntesis orgánica y concentración de la composición de flavonoles.

La eliminación de macro-contaminantes de los residuos de frutas tropicales como las cáscaras, pepas y bagazo, comprende los siguientes subprocesos en detalle:

- Selección, lavado y desinfectado de los residuos de frutas tropicales como las cáscaras, pepas y bagazo seleccionados.

- Deshidratación parcial de la materia prima con asistencia de calor, preferentemente a realizarse en un homo convencional a 40-60°C por alrededor de 3-6 horas con aire caliente en reflujo.

- Extracción continua usando un equipo soxhlet a 80°C por 3-6 ciclos, usando soluciones de solventes orgánicos con agua en relación escalonada de 1 : 1 a 1 :30, con Isopropanol, éter de petróleo, etanol, o lactosuero como medio para eliminar las macromoléculas en una proporción entre 40%-60%. La extracción y recuperación eficiente de sustancias bioactivas con tratamientos ecológicos se realiza mediante un pre-tratamiento con ultrasonido con una potencia de vibración entre 50 - 80 kHz, por 30 - 60 minutos a una temperatura entre 40 - 60°C, seguida por una extracción asistida con calor de convección a 40-60°C por un ratio de 2-6 horas, usando soluciones en proporción entre 20- 70% etanol en relación solvente materia prima entre 1 :10 - 1 :30, en base a la naturaleza y estado de maduración de la materia prima.

La purificación con tecnología de membranas y carbón activado ecológico del extracto de residuos de frutas tropicales comprende el uso de un bombeo tangencial a una batería de filtros secuenciales de tamaño de partícula 10 - 200 nm y una columna de carbón activado para retener olores típicos, en una presión de bombeo a 0.5-1 bar. Previamente, el carbón activado ecológico se obtiene a partir del acondicionamiento de los residuos sólidos filtrados de frutas tropicales, preferiblemente mango, con una solución de ácido fosfórico 25-30% carbonizado a 700-800 K por un tiempo de 2-4 horas.

La síntesis orgánica y concentración de la composición de flavonoles se realiza mediante una mezcla preliminar del extracto de residuos de frutas tropicales y una reacción con un medio ácido como el Buffer fosfato (45 nM), luego se procede a realizar una destilación al vacío en un evaporador giratorio sometido a vacío entre 0,5 - 15 inHg a 40-65°C por 30 - 90 minutos hasta lograr una concentración entre 20-40%.

La composición de flavonoles de residuos de frutas tropicales puede aplicarse directamente sobre productos hortofrutícolas, a través de una solución con agua purificada en relación 1 : 10 - 1 :30, en base a la naturaleza del producto.

El objeto de la invención también comprende la preparación de una dispersión coloidal y /o recubrimiento con función de barrera orgánica para los productos hortofrutícolas frescos y cortados, tales como frutas, hortalizas, tubérculos y raíces, y su posterior extensión de vida útil, gracias al efecto quelante y antioxidante de los flavonoles eficientemente sintetizados y concentrados, que comprende los siguientes postulados:

- Suspender y/o disolver entre 5-20% de la composición de flavonoles de residuos de frutas tropicales en un medio coloidal como el alginato de sodio, goma xanthan, goma arábiga, goma guar, goma de zapote y/o cualquier goma afín en una proporción entre 3 - 6%, junto con aditivos que complementan su efecto de barrera como plastificantes grado alimentario entre 3-6%, ácido graso saturado o ceras de origen natural como la cera de carnauba, cera de abeja o la cera de candelilla en una proporción entre 5-10%.

- Formación de microemulsiones del postulado b, a partir de altas revoluciones por encima de 10 500 RPM para una eficiente aplicación sobre la superficie de las frutas.

- Deshidratación y/o pulverización de la suspensión coloidal del postulado c para su manipulación en forma sólida.

Una ventaja de la presente invención es que la obtención de la composición de flavonoles supone una alternativa con una eficiencia por encima del 75% de los compuestos flavonoles quercetina y kaempferol.

Otra ventaja de la invención es que supone alternativas para usar los flavonoles como tecnologías pertinentes para mantener la calidad de productos hortofrutícolas frescos y cortados diversos en el tiempo, no descritas en el estado del arte, y su enriquecimiento con agentes activos de los residuos de frutas tropicales como el mango y palta, para su uso integral en el proceso productivo de frescos y procesados.

Un objetivo de la invención es obtener antioxidantes flavonoles de alta concentración fenólica, a partir de residuos de frutas tropicales, de preferencia el mango y la palta, con efecto quelante directamente vinculada con su efecto sobre la vida útil de los productos frescos y alimentos cortados perecibles. La invención supone una mejora en el estado del arte, ya que, no se ha reportado un uso de flavonoles como compuestos bioactivos para la conservación de alimentos, menos aún extraído de residuos agroindusthales, lo cual supone una contribución al problema de pérdidas y desperdicios de alimentos a nivel global, y al uso de soluciones ecológicas, circulares y sostenibles que tanto hacen falta en el mundo para luchar contra el calentamiento global.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de la invención en el que se detallan sus cuatro etapas principales.

Figura 2. índice de pudhción (%) en mandarinas a los 49 días de almacenamiento.

Figura 3. Dinámica de Solidos solubles (°Bhx) en kaki a los 21 días de almacenamiento.

Figura 4. Concentración Mínima Inhibitoria de la invención formulada.

EJEMPLOS PREFERIDOS (O REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA

Procedimiento para la extracción de un compuesto que comprende flavonoles derivados de residuos de frutas tropicales para la preservación de alimentos frescos y cortados, y su aplicación.

Una preparación de la extracción del compuesto que comprende flavonoles derivados de residuos de frutas tropicales, para la preservación de alimentos frescos de la invención, a manera de ejemplo, supone la selección, lavado y desinfectado de las cáscaras, pepas y bagazo del fruto de mango Mangifera indica L con 100 ppm de hipoclorito de sodio diluido en agua filtrada; luego se procede a deshidratar con un deshidratador de bandejas a una temperatura aproximada de 40°C durante 6 horas. Una vez culminada la deshidratación, se procede a medir el grado de humedad de la materia prima y se purifica con solventes orgánicos como isopropanol al 40% en una relación 1 :20 mediante extracción asistida y continua con soxhlet (aparato para extraer sustancias de baja solubilidad en el disolvente de extracción, emplea una técnica de separación sólido-líquido) hasta por 5 ciclos; después las materias primas siguen un pretratamiento con ultrasonido con una potencia de vibración entre 80 kHz, por 40 minutos a una temperatura entre 50°C por 1 hora para extraer los compuestos bioactivos, purificándolos a través de dos filtros secuenciales con nanoporos de 10 nm y superficie mínima de 0,01 m2, a la misma temperatura del proceso anterior, por donde pasa la solución bombeada a presiones entre 0,5 bar, y una columna de carbón activado ecológica elaborada a partir del bagazo de los sólidos filtrados anteriores carbonizados y acondicionados con 25% de ácido fosfórico, que le confiere una adsorción de los olores y un proceso circular del uso integral de los residuos. La solución se mezcla con una solución Buffer Fosfato 45 nM hasta pH <3.5 por 1 hora y se concentra con el método de destilación al vacío en un evaporador sometido a una presión entre 0,5 - 15 inHg a 65°C por 60 minutos hasta lograr una concentración de al menos 20%.

En un proceso aparte, se suspende 10% de la composición que comprende flavonoles derivados de residuos del mango en una solución de alginato de sodio al 5% glicerol USP (2%), ácido graso saturado (5%), y agua destilada con movimiento constante a 500 RPM durante 1 hora y se homogeniza a 12000 RPM formando una microemulsión que forma parte del ejemplo preferente que se aplica sobre productos agrícolas postcosecha frescos como la mandarina y el kaki, a partir del método de aspersión aplicando 1 litro de producto por tonelada de producto agrícola, siendo no excluyentes. Se presentaron los resultados a 49 días en condiciones de almacenamiento ideal para la mandarina fresca y 21 días para el kaki fresco, y piña cortada, así como el poder antioxidante y fungiestático de la composición de flavonoles, a continuación:

Evaluación de la invención en la vida poscosecha de productos hortícolas cortados (RTE)

Se realizaron experimentos para evaluar el efecto de la invención en la vida útil de alimentos cortados, como las piñas ready to eat, pelados y troceados previamente en comparación con un control sin tratamiento. Posteriormente se almacenaron los experimentos en refrigeración (Tabla 1 y 2).

Evaluación de la invención en la vida poscosecha de productos hortícolas frescos

Se realizaron experimentos para evaluar el efecto de la invención en la vida poscosecha de mandarinas (Citrus reticulata) y kaki (Diospyrus kaki) en comparación a un control con cera polietilénica en el caso de mandarinas, y sin cobertura como control negativo en el caso de kakis (Tabla 2). El tratamiento de cobertura concerniente a la invención fue aplicado mediante aspersión sobre la superficie de las frutas y dejada a secar a temperatura ambiente. Posteriormente, se almacenó las unidades experimentales en condiciones específicas para simular condiciones de exportación (Tabla 1 ).

Tabla 1. Condiciones de almacenamiento de frutas Tabla 2. Resumen de resultados

La aplicación de la cobertura referente a la invención genera, estadísticamente, una menor pérdida de peso en mandarinas almacenadas en frío. Coberturas bioactivas de otras naturalezas químicas poseen el mismo o menor rendimiento en este parámetro en comparación con otras ceras polietilénicas (Arnon et al., 2014). El control de la pudrición es eficaz en comparación a coberturas polietilénicas (Ver Figura 2).

La aplicación de la cobertura referente a la invención genera, estadísticamente, una menor pérdida de peso en kakis almacenados en frío. La utilización de coberturas comestibles, como el reportado por Saleem et al. (2020), retrasa la pérdida de peso en frutos de kaki. Los resultados de este experimento muestran una menor pérdida de peso con la cobertura referente a la invención en comparación a la cobertura reportada por los autores anteriormente mencionados. Por otro lado, existe la misma tendencia en la reducción del aumento de solidos solubles, con cifras similares en ambos estudios (Ver Figura 3).

Por otro lado, Azarakhsh (2014) reportó una pérdida de peso de más del 14% en piñas sin tratamiento y mayor del 9% para piñas cortadas aplicadas con un recubrimiento en base a alginato, lo cual resulta mayor a lo reportado por la invención a los 8 días de evaluación.

Poder antioxidante de la Invención

Los métodos de cuantificación de compuestos bioactivos fueron realizados mediante técnicas espectrofotométhcas, entre ellas, el método de cuantificación de flavonoides totales (CFT), y de compuestos fenólicos totales (CPT).

La presente invención desarrolla métodos eficientes de extracción de bioactivos, que resulta en un índice de 780.75 ± 1.3 hasta 1126.22 ± 1.9 mg GAE /g* para CPT y 815.94±0.46 hasta 1429.21 ±0.78 mg QE/g** de flavonoides. Los valores mínimos y máximos están en función de los parámetros de extracción utilizados para la recuperación de los compuestos bioactivos, mencionados anteriormente.

Investigaciones recientes en cáscara de palta y/o mango, demuestran que las tecnologías tradicionales de extracción recuperan compuestos fenólicos hasta en un 10%. Kemadjou et al., (2021 ), evaluaron el extracto etanolico de 12 variedades de cáscara de palta y reportaron valores desde 733 hasta 1037 mg GAE/g (CPT); 311 a 724 mq QE/g para flavonoides totales. Asimismo, Aminah et al., (2016), reportaron índices de 4.012 mgQE/g en extractos etanolicos; Trujillo-Mayo et al. (2018), 257.2+- 7.515 mg GAE/g y 57.1 +- 0.9 mq QE/g en extractos macerados por 12 horas. Por otro lado, tecnologías emergentes basadas en la extracción por microondas (MAE), ultrasonido (U) y la mezcla de ambos, han logrado recuperar en mayor cantidad los compuestos fenólicos, como referencia de ello, Mañane et al., (2018), alcanzaron valores de 1360.34 +- 188.65 mg QE/g en extractos acuosos; Trujillo-Mayo et al. (2018), 281 .4 +- 0.2 mg GAE/g y 62 +- 0.4 mq QE/g en extractos U-MAE; Tremocoldi et al., (2017), 120.3 - 7.8 mg GAE/g en extractos U con tratamiento de liofilizado de la muestra.

^miligramos de ácido gálico por gramo de muestra seca

**miligramos de quercetina estándar por gramo de muestra seca Poder fungiestático

Para evaluar el poder fungistático de la presente invención se realizaron pruebas in vitro en hongos fitopatógeno de Cladosporium herbarum y Aspergillus niger.

Pruebas in vitro

En placas Petri con Agar Sabouraud se sembraron las cepas de C. herbarum y A. niger, se procedió a colocar 60 uL de la invención formulada (mezcla de flavonoides, como control positivo Belomil y agua destilada, como control negativo).

Los ensayos se realizan por triplicado al menos dos veces, obteniéndose de esta manera 3 tratamientos y 18 placas en total para cada uno de los hongos.

Finalmente, se incubaron las placas a 25°C por siete días, tomando como resultado positivo la aparición de un halo de inhibición alrededor de los pocilios. Se observaron las zonas claras de inhibición del crecimiento (halos) y se midieron los diámetros en mm con el calibre Vernier, se registraron y se consideraron como un indicativo de actividad antifúngica.

Los resultados fueron reportados en las tablas 3 y 4:

Tabla 3. Análisis estadístico de la media de los halos de inhibición de A. niger. Inv. Invención de la formulación; C+. Belomil; C-. agua; N. número de repeticiones; DS. Desviación estándar.

*Tukey; letras diferentes en las columnas representan diferencias significativas en un 5% de error.

Tabla 4. Análisis estadístico de la media de los halos de inhibición de C. herbarum.

Inv. Invención de la formulación; C+. Belomil; C-. agua; N. número de repeticiones; DS. Desviación estándar.

*Tukey; letras diferentes en las columnas representan diferencias significativas en un 5% de error.

Con estos resultados, la formulación de la invención fue sometida a la prueba de micro dilución en placa para determinar su Concentración Mínima Inhibitoria (CMI).

La Figura 4 muestra los resultados de la CMI de la invención formulada frente a los fitopatógenos de Aspergillus niger y Cladosporium herbarum. Las concentraciones de la invención vaharon entre 10mg/ml y 0.02 mg/ml. Finalmente, la CMI para A. niger fue de 0.36mg/ml y 0.24 mg/ml para C. herbarum.

La invención formulada mostró efectiva actividad antifúngica con una CMI de 0.24 mg/ml para Cladosporium herbarum, resultado que presentó ventajas altamente significativas frente a diversos estudios que enfrentaron extractos a la cepa mencionada; por ejemplo, Gonzales et. al (2016) evaluaron tres concentraciones del extracto vegetal (25, 50 y 75 %) de las especies Moringa oleífera Lam. (Moringa), Morinda citri folia L (noni), Azaridachta indica A. Juss (nim), Melia azedarach L (paraíso), donde solo el extracto de paraíso mostró un resultado efectivo para inhibir Cladosporium spp a la concentración de 25 %. En cuanto a Aspergillus niger, en el presente estudio se reportó una CMI de 0.36 mg/ml resultado que difiere ventajosamente con diversos estudios, como el de Díaz et al (2019) quienes reportaron una CMI de 3.12 mg/ml para el extracto crudo de ajo.