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Title:
METHOD FOR EXTRACTING AND ISOLATING ACTIVE SUBSTANCES FROM UMBU PULP, ACTIVE SUBSTANCES, NUTRACEUTICAL AND/OR FUNCTIONAL FOODS COMPRISING SAID ACTIVE SUBSTANCES AND USES THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/058070
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to the method for extracting and isolating active substances from the pulp of the umbu plant (Spondias tuberosa Arr. Camara). Said active substances exhibit powerful chemopreventive activity, and in view of these characteristics, the fractionated dichloromethane extract and the active principles obtained by the present method can be used in nutraceutical and/or functional foods.

Inventors:
ZERAIK, Maria Luiza (Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, -900 Araraquara, 14800-900, BR)
FERREIRA QUEIROZ, Emerson (24 Rue Général Dufour, 1211 Genève 4, CH-1211, CH)
CASTRO-GAMBOA, Ian (Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, -900 Araraquara, 14800-900, BR)
SIQUEIRA SILVA, Dulce Helena (Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, -900 Araraquara, 14800-900, BR)
CUENDET, Muriel (Quai Ansermet 30, 1211 Genève 4, CH-1211, CH)
MARCOURT, Laurence (Quai Ansermet 30, 1211 Genève 4, CH-1211, CH)
CICLET, Olivier (Quai Ansermet 30, 1211 Genève 4, CH-1211, CH)
DA SILVA BOLZANI, Vanderlan (Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, -900 Araraquara, 14800-900, BR)
WOLFENDER, Jean-luc (Quai Ansermet 30, 1211 Genève 4, CH-1211, CH)
Application Number:
BR2015/050172
Publication Date:
April 21, 2016
Filing Date:
October 07, 2015
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" (Rua Quirino de Andrade, 215 Centro, -010 São Paulo, 01049-010, BR)
UNIVERSITÉ DE GENÈVE (24 Rue Général Dufour, 1211 Genève 4, CH-1211, CH)
International Classes:
C07C37/68; A61K36/22; A61P35/00; C07C39/04; C07C51/42; C07C63/64
Other References:
M.L. ZERAIK ET AL.: "Chemical Composition, canceer chemopreventive and acetylcholinesterase activities of Spondias tuberosa", PLANTA MED., 2013, pages 79 - PI33
M.L. ZERAIK ET AL.: "Phytochemical Analysis of an Exotic Brasilian Fruit, Spondias tuberosa, using 2D MPLC x UHPLC/TOF/MS Monitoring", PLANTA MED., July 2013 (2013-07-01), pages 79 - PN74
M. L. ZERAIK ET AL.: "Bioactive compounds from the Spondias tuberosa fruits", MEDICINAL CHEMISTRY CHEMICAL BIOLOGY - CHIMIA 2013, vol. 67, no. 7/ 8, August 2013 (2013-08-01)
M. DE SOUSA GALVÃO ET AL.: "Volatile compounds in umbu (spondias tuberosa arruda câmara) fruits during maturation", ISHS ACTA HORTICULTURAE 864: III INTERNACIONAL SYMPOSIUM ON TROPICAL AND SUBTROPICAL FRUITS, June 2010 (2010-06-01)
Attorney, Agent or Firm:
DE MORAES SPIANDORELLO, Fabíola et al. (Rua Bento Teobaldo Ferraz, 271Bloco I, Barra Funda -070 Sao Paulo, 01140-070, BR)
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Claims:
REIVINDICAÇÕES

1. Processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu caracterizado por compreender as etapas de:

a) obtenção do extrato diclorometano;

b) análise do extrato diclorometano obtido;

c) fracionamento do extrato diclorometano obtido; e d) isolamento das substâncias ativas.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "a", a polpa dos frutos de Spondias tuberosa Arr. Camara coletados no verão é separada das sementes, homogeneizada com o auxilio de um misturador, congelada e liofilizada.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a polpa liofilizada é exaustivamente extraída por maceração com hexano, seguido por diclorometano e metanol.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os solventes são puros.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que os extratos secos são obtidos após a remoção do solvente por evaporação sob pressão reduzida, em uma faixa que varia de 500 a 400 mBar, em uma temperatura que varia de 40 a 42 °C.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "b", o extrato metanólico é analisado por um sistema HPLC-UV-PDA com detector de arranjo de díodos, HPLC-UV-ELSD (fase normal) e por LC-PDA-MS.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "c", o fracionamento bioguiado do extrato diclorometano da polpa de umbu é realizado por um sistema de cromatografia por SPE, com cartucho empacotado com a fase estacionária C18 e sistema de solvente com mistura de água (A) e metanol (B) , nas proporções de 20:80, 40:60, 60:40, 80:20, 100:0.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "d", o isolamento das substâncias ativas presentes no extrato diclorometano é realizado com um sistema semipreparativo HPLC/UV/ELSD, com coluna preenchida com sílica e fase móvel de acetato de etila (A) e hexano (B) , com gradiente de eluição otimizado.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o gradiente de eluição otimizado é:

- 0 a 10 min: 2-5% de B em A,

- 10 a 25 min: 5-10% de B em A

- 25 a 30 min: 10% de B em A

- 30 a 40 min: 10-15% de B em A

- 40 a 70 min: 15-60% de B em A.

10. Substâncias ativas, obtidas conforme o processo descrito nas reivindicações 1 a 9, caracterizados pelo fato de serem um mistura de ácidos graxos, ácido anacárdico com R sendo um pentadecil e uma mistura de três cardanóis com estrutura

em que os Rs são 20, 22 e 24 carbonos.

11. Alimentos nutracêuticos e/ou funcionais caracterizados por compreenderem as substâncias ativas da polpa do umbu obtidas conforme o processo definido nas reivindicações 1 a 9.

12. Uso das substâncias ativas da polpa do umbu caracterizado por ser no preparo de alimentos nutracêuticos e/ou funcionais para quimioprevenção .

Description:
PROCESSO DE EXTRAÇAO E ISOLAMENTO DE SUBSTANCIAS ATIVAS PRESENTES NA POLPA DO UMBU, SUBSTÂNCIAS ATIVAS, ALIMENTOS NUTRACÊUTICOS E/OU FUNCIONAIS COMPREENDENDO AS REFERIDAS

SUBSTÂNCIAS ATIVAS E SEU USO

Campo da invenção :

[001] A presente invenção se refere ao processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu ( Spondias tuberosa Arr. Camara) . O extrato diclorometano fracionado e as substâncias ativas apresentam potente atividade quimiopreventiva .

[002] Em vista das suas características, o extrato e as substâncias ativas obtidos pelo processo ora proposto podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais com potente atividade de quimioprevenção .

Fundamentos da invenção:

[003] A biodiversidade brasileira é fonte de uma grande variedade de frutos comestíveis, sendo o nosso país um dos três maiores produtores mundiais de frutas.

[004] As frutas tropicais representam uma fonte original e valiosa de compostos bioativos e seu consumo vem aumentando nos mercados nacional e internacional, devido ao crescente reconhecimento de seu valor nutritivo e terapêutico .

[005] No entanto, na maioria dos casos, o potencial destes frutos permanece desconhecido ou pouco estudado quanto aos seus constituintes químicos e suas atividades biológicas, como é o caso do fruto exótico da espécie Spondias tuberosa Arr. Camara, conhecido popularmente no Brasil como "umbu".

[006] O umbuzeiro é uma planta tropical nativa do nordeste brasileiro e desempenha um papel importante na Caatinga, uma vez que floresce e dá frutos durante a estação de seca, fazendo desta planta uma valiosa fonte de renda para a população local.

[007] O umbu é muito apreciado nas regiões norte e nordeste do Brasil, principalmente devido ao seu sabor refrescante e ácido. O fruto pode ser consumido fresco ou na forma de suco, sorvete, doce e geleia, bem como na forma da "umbuzada", doce tradicionalmente nordestino em que a polpa é cozida com leite e açúcar.

[008] Estudos anteriores mostraram que substâncias presentes em frutos brasileiros, como o umbu, apresentavam propriedades antioxidantes. Embora as vitaminas, minerais e compostos voláteis presentes na polpa de umbu já tenham sido identificados, nenhum estudo fitoquimico de isolamento dos metabólitos secundários não voláteis e sua bioatividade voltada para quimioprevenção foi realizado.

[009] O câncer trata-se de um processo crónico, no qual células anormais apresentam um crescimento desordenado e descontrolado, invadindo tecidos e órgãos.

[010] Nas últimas décadas, ocorreu em todo o mundo um expressivo aumento nos casos de câncer, decorrente da interação de fatores externos (como estilo de vida moderno, hábitos, costumes e meio ambiente) e fatores internos, como pré-disposição genética.

[011] A carcinogênese é um processo dividido em 3 etapas, sendo elas: a iniciação (quando células "normais" são expostas a um agente carcinogênico ) , a promoção (quando as células anormais persistem e iniciam uma etapa pré- neoplásica) e a progressão (fase em que as células estão em crescimento celular descontrolado) .

[012] Ensaios clínicos e pré-clínicos mostraram que os processos envolvidos na carcinogênese devem ser combatidos sob várias frentes. Sendo assim, inúmeras estratégias são conhecidas para evitar a exposição celular a agentes desencadeadores da carcinogênese, dentre elas modificação no estilo de vida e a quimioprevenção .

[013] A quimioprevenção do câncer é feita pela prevenção, atraso ou reversão do processo de carcinogênese, por meio da ingestão de compostos na dieta ou fármacos. A quimioprevenção intervém em todas as fases do processo da carcinogênese, através da eliminação das células pré- malignas e proteção das células normais de uma possível carcinogênese .

[014] Neste contexto, produtos naturais provenientes de espécies de plantas são conhecidos como desmutagênicos e podem reduzir danos ao DNA através da detoxificação dos mutágenos pela indução de enzimas detoxificadoras (enzimas de fase II), como é o caso da enzima quinona redutase (QR) .

[015] A redução de quinonas eletrofíliças pela QR é uma via de detoxificação importante, que converte quinonas a hidroquinonas e reduz a formação de agentes oxidativos. Como enzimas de fase I podem ativar procarcinógenos , é desejável que produtos naturais que tenham atividade quimiopreventiva apresentem caráter monofuncional , ou seja, induzam apenas enzimas de fase II.

[016] Assim, o estudo de produtos naturais com o ensaio da QR é importante para o descobrimento e desenvolvimento de novas substâncias capazes de prevenir o câncer.

[017] Estudos descritos na literatura científica mostram atividades distintas dos extratos de plantas brasileiras sobre a pele, tais como ação hidratante, de proteção solar, despigmentação e ação antioxidante.

[018] Dentre os frutos já estudados e utilizados na indústria de cosméticos, tem-se a acerola, rica em vitamina C e que apresenta efeito antienvelhecimento, e a romã, que apresenta eficácia como agente fotoquimiopreventivo, uma vez que seus constituintes químicos atuam na modulação dos danos oxidativos causados na pele pela radiação ultravioleta UVA e UVB .

[019] Esses exemplos mostram que vários fitonutrientes ricos em constituintes antioxidantes podem ser bastante eficazes, evitando o dano oxidativo celular.

[020] Nesse sentido, a presente invenção provê um processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes no extrato diclorometano da polpa do umbu ( Spondias tuberosa Arr. Camara) . O extrato foi avaliado frente à indução da enzima quinona redutase, para verificar sua atividade quimiopreventiva .

[021] A partir do extrato, são isoladas e identificadas substâncias que apresentam alta atividade quimiopreventiva, conforme se verifica nos testes biológicos realizados.

[022] Os ativos obtidos de acordo com o processo podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais, em vista da sua potente indução da quinona redutase e consequente atividade quimiopreventiva.

Breve descrição da invenção:

[023] A presente invenção se refere ao processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu {Spondias tuberosa Arr. Camara), que conferem alta atividade quimiopreventiva ao extrato diclorometano, avaliada pelo teste de indução da enzima quinona redutase.

[024] Os ativos obtidos de acordo com o processo podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais.

Breve descrição das figuras:

[025] As Figuras 1A-1D representam estruturalmente o ácido anarcádico e os cardanóis obtidos de acordo com o processo da presente invenção.

[026] As Figuras 2A e 2B representam graficamente a análise do extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa por HPLC/UV (fase reversa) e HPLC/UV/ELSD (fase normal), respectivamente.

[027] As Figuras 3A-3E representam graficamente a análise do extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa por HPLC/UV (fase reversa) após fracionamento por SPE em concentrações de metanol a 20, 40, 60, 80 e 100%.

[028] A Figura 4 é um cromatograma do extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa obtido por HPLC/UV/ELSD.

Descrição detalhada da Invenção:

[029] A presente tecnologia descreve o processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu {Spondias tuberosa Arr. Camara), o qual consiste nas etapas de:

a) obtenção do extrato diclorometano;

b) análise do extrato diclorometano obtido;

c) fracionamento do extrato diclorometano obtido; e d) isolamento das substâncias ativas.

[030] A seguir, as etapas do processo são mais bem detalhadas .

a) Obtenção do extrato diclorometano :

[031] Para a obtenção do extrato diclorometano da polpa, os frutos de Spondias tuberosa Arr. Camara foram coletados no verão (mais especificamente, em fevereiro) , época do ano que favorece a colheita de frutos com a concentração de ativos desejada.

[032] A polpa dos frutos de umbu foi separada das sementes e homogeneizada com o auxilio de um misturador. Após este passo, a polpa foi congelada e liofilizada.

[033] A polpa pulverizada foi exaustivamente extraída por maceração com hexano, seguido por diclorometano e metanol. Todos os solventes estavam puros.

[034] Os extratos secos foram obtidos após a remoção do solvente por evaporação sob pressão reduzida, em uma faixa que varia de 500 a 400 mBar, em uma temperatura que varia de 40 a 42 °C, utilizando rotaevaporador.

b) Análise do extrato diclorometano obtido:

[035] As análises dos extratos diclorometano foram realizadas por um sistema HPLC-UV-PDA com detector de arranjo de díodos, HPLC-UV-ELSD (fase normal) e por LC-PDA- MS .

[036] No HPLC-UV-PDA, a separação foi realizada utilizando octadecilsilano (C18) como fase estacionária, precedida por uma pré-coluna (contendo mesma fase) . O sistema de solvente utilizado como fase móvel foi uma mistura de água (A) e metanol (B) , ambos com 0,01 a 0,5% de ácido fórmico, no modo gradiente de 5 a 100% de B em 60 minutos, com gradiente linear.

[037] As amostras foram injetadas automaticamente, com vazão de 1,0 mL.mirT .

[038] O crornatograma foi registrado e os espectros de UV dos picos individuais foram monitorados na faixa de comprimento de onda de 200 a 400 nm.

[039] As análises por HPLC-ELSD-UV foram realizadas em um sistema de cromatografia liquida Spot Prep II, com coluna preenchida com sílica (fase normal) .

[040] O sistema de solvente utilizado foi uma mistura de acetato de etila (A) e hexano (B) , com modo gradiente de 5 a 100% de B em 60 min, com gradiente linear. A vazão foi de 5,0 mL min -1 e o volume de injeção foi de 1 mL .

[041] Dados LC-PDA-MS foram obtidos por meio de um sistema consistindo de um amostrador automático, bomba de mistura de alta pressão e um detector PAD ligado a um espectrômetro de massa tipo quadrupolo, equipado com uma interface de electrospray .

[042] A coluna e as condições cromatográficas foram as mesmas que as utilizadas para as análises por HPLC-UV-PDA. O volume de injeção foi de 20 i e a vazão foi de 0,2 mL min -1 .

[043] Para o espectrômetro de massa, a tensão capilar foi de 30 a 50 V, a temperatura capilar foi de 150 a 250°C, a fonte de tensão foi de 4,5 a 5,0 kV e a fonte de corrente foi de 60 a 90 mA. As análises foram realizadas nos modos íons positivos e negativos.

c) Fracionamento do extraio diclorometano obtido:

[044] O fracionamento bioguiado do extrato diclorometano da polpa de umbu foi realizado por um sistema de cromatografia por SPE, com cartucho empacotado com a fase estacionária C18, a fim de localizar a região ativa no ensaio de indução de quinona redutase.

[045] O sistema de solvente utilizado foi uma mistura de água (A) e metanol (B) , nas seguintes proporções: 20:80, 40:60, 60:40, 80:20, 100:0.

[046] A vazão foi de 1,0 mL min -1 e o volume de injeção foi de 5 mL .

[047] A separação resultou em 5 frações, as quais foram analisadas por HPLC-UV-PDA sob as mesmas condições utilizadas para a análise do extrato dos frutos e também foram submetidas ao ensaio de indução de quinona redutase.

d) Isolamento das substâncias ativas:

[048] O isolamento das substâncias ativas presentes no extrato diclorometano da polpa dos frutos de S. tuberosa foi realizado com um sistema semipreparativo HPLC/UV/ELSD, o qual forneceu 40 frações.

[049] A coluna foi preenchida com sílica como fase estacionária e, para fase móvel, foi utilizado acetato de etila (A) e hexano (B) , com gradiente de eluição otimizado, sendo ele:

- 0 a 10 min: 2-5% de B em A,

- 10 a 25 min: 5-10% de B em A

- 25 a 30 min: 10% de B em A

- 30 a 40 min: 10-15% de B em A

- 40 a 70 min: 15-60% de B em A.

[050] A vazão utilizada foi de 5,0 mL min -1 e o volume de injeção foi de 2 mL, com absorbância no UV detectada a 254 nm. As frações foram coletadas a cada 10,0 mL . Após esta etapa, cada fração foi concentrada em rotaevaporador e depois foram secas usando N2.

[051] Todas as 40 frações obtidas foram monitoradas por HPLC/UV. A fração 5 forneceu uma mistura de ácidos graxos; a fração 11 forneceu um ácido anacárdico com R sendo um pentadecil (Figura IA) e a fração 13 forneceu uma mistura de três cardanóis com Rs sendo 20, 22 e 24 carbonos, respectivamente mostrados nas Figuras 1B, 1C e 1D.

[052] A identificação estrutural das substâncias foi realizada por RMN e HRMS .

Teste realizado :

[053] Para avaliação da atividade quimiopreventiva do extrato diclorometano e das substâncias ativas obtidas, foi realizado o seguinte teste:

- Ensaio de indução da quinona redutase :

[054] A avaliação da atividade quimiopreventiva do extrato e das substâncias ativas foi realizada por meio da indução da enzima quinona redutase. O ensaio foi efetuado segundo método conhecido do estado da técnica.

[055] Para a avaliação de amostras como indutores da enzima quinona redutase, empregou-se uma cultura de células hepáticas, Hepalclc7.

[056] O método proporciona resultados quantitativos e reprodutíveis para detectar compostos puros e extratos de plantas promissores.

[057] A atividade específica da QR é determinada pela medição do NADPH mediada pela redução através do uso de MTT. Ações sobre a proteína são determinadas pela coloração violeta. A atividade da indução de QR será expressa como a concentração necessária para dobrar a atividade específica da enzima.

[058] Resumidamente, a atividade da quinona redutase foi determinada após dois dias de incubação das células com as amostras. As células foram, então, Usadas e a redução do MTT foi medida em um espectrofotômetro de microplacas em λ= 595 nm .

[059] Em paralelo, a quantidade de células viáveis foi determinada por quantificação da proteína usando coloração de cristal de violeta e medida a absorção a 595 nm no mesmo espectrofotômetro . A 4 ' -bromoflavona foi utilizada como controle positivo.

.Resultados obtidos:

[060] Foram analisadas as três partes dos frutos de

Spondias tuberosa separadamente : cascas, polpa e sementes.

Em cada parte do fruto foi realizada a extração por maceração à exaustão (por 48 h) com polaridade crescente de solvente : hexano, diclorometano e metanol.

[061] Bioensaios de atividade quimiopreventiva foram realizados em todos os extratos.

[062] O extrato diclorometano da polpa apresentou uma potente atividade de quimioprevenção, avaliada por meio da indução da enzima quinona redutase em células Hepalclc7 - hepatocarcinoma murino selvagem.

[063] Os resultados demonstraram que o extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa é capaz de promover uma significativa indução da enzima quinona com a razão de indução de 2,8 a 20 \ig mLT 1 em células Hepalclc7. Adicionalmente, a viabilidade destas células foi de 78,6%, na mesma concentração, o que comprova que o extrato não apresentou citotoxicidade .

[064] O extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa foi analisado por HPLC/UV (fase reversa) e HPLC/UV/ELSD (fase normal), como é possível observar nas Figuras 2A e 2B.

[065] Ainda, foi realizado um fracionamento bioguiado por SPE com o extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa, ativo no ensaio de quimioprevenção, a fim de identificar a região ativa na indução da quinona redutase. Todas as frações obtidas foram analisadas por HPLC/UV e os respectivos cromatogramas estão mostrados nas Figuras 3A a 3E .

[066] Os testes de indução da quinona redutase e de viabilidade foram realizados para todas as frações obtidas por SPE e os resultados estão descritos na Tabela 1 abaixo.

[067] A quinona redutase é um tipo de flavoproteina que catalisa a redução de dois elétrons, favorecendo, assim, a desintoxicação de quinonas e seus derivados e levando à proteção das células contra processos redox, estresse oxidativo e neoplasias.

[068] Vários indutores de QR podem servir como protetores contra o estresse oxidativo e eletrofilico .

Tabela 1 - Teste de indução da quinona redutase e % de viabilidade para as frações obtidas por SPE.

[069] Assim, para realizar o isolamento das substâncias ativas presentes no extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa, foi feito o microfracionamento a fim de identificar rapidamente as substâncias ativas. Obteve-se cerca de 40 frações (vide Figura 4) .

[070] As frações foram analisadas por LC/MS e RMN, sendo identificados ácidos graxos, ácido anacárdico e cardanóis .

[071] A fração 5 forneceu uma mistura de ácidos graxos. A fração 11 forneceu um ácido anacárdico com R sendo um pentadecil (Figura IA) . O espectro de MS-ESI mostrou o ion molecular a m/z 347.14 [M-H] ~ , que está em concordância com a fórmula molecular C 22 H 36 O 3 (o cálculo para C 22 H 36 O 3 fornece 348.27) . A fração 13 forneceu uma mistura de três cardanóis com Rs sendo 20, 22 e 24 carbonos, respectivamente mostrados nas Figuras 1B, 1C e 1D. Os espectros de MS-ESI mostraram os ions moleculares a m/z 373.28, 401.32, 429.35 [M-H] ~ , que estão em concordância com as fórmulas moleculares C 26 H 46 O, C 28 H 50 O e C 30 H 54 O, respectivamente.

[072] A significativa atividade quimioprotetora indica a possível utilização do extrato do umbu como alimento funcional/nutracêutico .

[073] Embora a versão preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, deve ser compreendido que a invenção não é limitada. Diversas modificações, mudanças, variações, substituições e equivalentes poderão ocorrer, sem desviar do escopo da presente invenção.