SUBSTÂNCIAS ATIVAS E SEU USO

Campo da invenção :

[001] A presente invenção se refere ao processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu ( Spondias tuberosa Arr. Camara) . O extrato diclorometano fracionado e as substâncias ativas apresentam potente atividade quimiopreventiva .

[002] Em vista das suas características, o extrato e as substâncias ativas obtidos pelo processo ora proposto podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais com potente atividade de quimioprevenção .

Fundamentos da invenção:

[003] A biodiversidade brasileira é fonte de uma grande variedade de frutos comestíveis, sendo o nosso país um dos três maiores produtores mundiais de frutas.

[004] As frutas tropicais representam uma fonte original e valiosa de compostos bioativos e seu consumo vem aumentando nos mercados nacional e internacional, devido ao crescente reconhecimento de seu valor nutritivo e terapêutico .

[005] No entanto, na maioria dos casos, o potencial destes frutos permanece desconhecido ou pouco estudado quanto aos seus constituintes químicos e suas atividades biológicas, como é o caso do fruto exótico da espécie Spondias tuberosa Arr. Camara, conhecido popularmente no Brasil como "umbu".

[006] O umbuzeiro é uma planta tropical nativa do nordeste brasileiro e desempenha um papel importante na Caatinga, uma vez que floresce e dá frutos durante a estação de seca, fazendo desta planta uma valiosa fonte de renda para a população local.

[007] O umbu é muito apreciado nas regiões norte e nordeste do Brasil, principalmente devido ao seu sabor refrescante e ácido. O fruto pode ser consumido fresco ou na forma de suco, sorvete, doce e geleia, bem como na forma da "umbuzada", doce tradicionalmente nordestino em que a polpa é cozida com leite e açúcar.

[008] Estudos anteriores mostraram que substâncias presentes em frutos brasileiros, como o umbu, apresentavam propriedades antioxidantes. Embora as vitaminas, minerais e compostos voláteis presentes na polpa de umbu já tenham sido identificados, nenhum estudo fitoquimico de isolamento dos metabólitos secundários não voláteis e sua bioatividade voltada para quimioprevenção foi realizado.

[009] O câncer trata-se de um processo crónico, no qual células anormais apresentam um crescimento desordenado e descontrolado, invadindo tecidos e órgãos.

[010] Nas últimas décadas, ocorreu em todo o mundo um expressivo aumento nos casos de câncer, decorrente da interação de fatores externos (como estilo de vida moderno, hábitos, costumes e meio ambiente) e fatores internos, como pré-disposição genética.

[011] A carcinogênese é um processo dividido em 3 etapas, sendo elas: a iniciação (quando células "normais" são expostas a um agente carcinogênico ) , a promoção (quando as células anormais persistem e iniciam uma etapa pré- neoplásica) e a progressão (fase em que as células estão em crescimento celular descontrolado) .

[012] Ensaios clínicos e pré-clínicos mostraram que os processos envolvidos na carcinogênese devem ser combatidos sob várias frentes. Sendo assim, inúmeras estratégias são conhecidas para evitar a exposição celular a agentes desencadeadores da carcinogênese, dentre elas modificação no estilo de vida e a quimioprevenção .

[013] A quimioprevenção do câncer é feita pela prevenção, atraso ou reversão do processo de carcinogênese, por meio da ingestão de compostos na dieta ou fármacos. A quimioprevenção intervém em todas as fases do processo da carcinogênese, através da eliminação das células pré- malignas e proteção das células normais de uma possível carcinogênese .

[014] Neste contexto, produtos naturais provenientes de espécies de plantas são conhecidos como desmutagênicos e podem reduzir danos ao DNA através da detoxificação dos mutágenos pela indução de enzimas detoxificadoras (enzimas de fase II), como é o caso da enzima quinona redutase (QR) .

[015] A redução de quinonas eletrofíliças pela QR é uma via de detoxificação importante, que converte quinonas a hidroquinonas e reduz a formação de agentes oxidativos. Como enzimas de fase I podem ativar procarcinógenos , é desejável que produtos naturais que tenham atividade quimiopreventiva apresentem caráter monofuncional , ou seja, induzam apenas enzimas de fase II.

[016] Assim, o estudo de produtos naturais com o ensaio da QR é importante para o descobrimento e desenvolvimento de novas substâncias capazes de prevenir o câncer.

[017] Estudos descritos na literatura científica mostram atividades distintas dos extratos de plantas brasileiras sobre a pele, tais como ação hidratante, de proteção solar, despigmentação e ação antioxidante.

[018] Dentre os frutos já estudados e utilizados na indústria de cosméticos, tem-se a acerola, rica em vitamina C e que apresenta efeito antienvelhecimento, e a romã, que apresenta eficácia como agente fotoquimiopreventivo, uma vez que seus constituintes químicos atuam na modulação dos danos oxidativos causados na pele pela radiação ultravioleta UVA e UVB .

[019] Esses exemplos mostram que vários fitonutrientes ricos em constituintes antioxidantes podem ser bastante eficazes, evitando o dano oxidativo celular.

[020] Nesse sentido, a presente invenção provê um processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes no extrato diclorometano da polpa do umbu ( Spondias tuberosa Arr. Camara) . O extrato foi avaliado frente à indução da enzima quinona redutase, para verificar sua atividade quimiopreventiva .

[021] A partir do extrato, são isoladas e identificadas substâncias que apresentam alta atividade quimiopreventiva, conforme se verifica nos testes biológicos realizados.

[022] Os ativos obtidos de acordo com o processo podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais, em vista da sua potente indução da quinona redutase e consequente atividade quimiopreventiva.

Breve descrição da invenção:

[023] A presente invenção se refere ao processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu {Spondias tuberosa Arr. Camara), que conferem alta atividade quimiopreventiva ao extrato diclorometano, avaliada pelo teste de indução da enzima quinona redutase.

[024] Os ativos obtidos de acordo com o processo podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais.

Breve descrição das figuras:

[025] As Figuras 1A-1D representam estruturalmente o ácido anarcádico e os cardanóis obtidos de acordo com o processo da presente invenção.

[026] As Figuras 2A e 2B representam graficamente a análise do extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa por HPLC/UV (fase reversa) e HPLC/UV/ELSD (fase normal), respectivamente.

[027] As Figuras 3A-3E representam graficamente a análise do extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa por HPLC/UV (fase reversa) após fracionamento por SPE em concentrações de metanol a 20, 40, 60, 80 e 100%.

[028] A Figura 4 é um cromatograma do extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa obtido por HPLC/UV/ELSD.

Descrição detalhada da Invenção:

[029] A presente tecnologia descreve o processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu {Spondias tuberosa Arr. Camara), o qual consiste nas etapas de:

a) obtenção do extrato diclorometano;

b) análise do extrato diclorometano obtido;

c) fracionamento do extrato diclorometano obtido; e d) isolamento das substâncias ativas.

[030] A seguir, as etapas do processo são mais bem detalhadas .

a) Obtenção do extrato diclorometano :

[031] Para a obtenção do extrato diclorometano da polpa, os frutos de Spondias tuberosa Arr. Camara foram coletados no verão (mais especificamente, em fevereiro) , época do ano que favorece a colheita de frutos com a concentração de ativos desejada.

[032] A polpa dos frutos de umbu foi separada das sementes e homogeneizada com o auxilio de um misturador. Após este passo, a polpa foi congelada e liofilizada.

[033] A polpa pulverizada foi exaustivamente extraída por maceração com hexano, seguido por diclorometano e metanol. Todos os solventes estavam puros.

[034] Os extratos secos foram obtidos após a remoção do solvente por evaporação sob pressão reduzida, em uma faixa que varia de 500 a 400 mBar, em uma temperatura que varia de 40 a 42 °C, utilizando rotaevaporador.

b) Análise do extrato diclorometano obtido:

[035] As análises dos extratos diclorometano foram realizadas por um sistema HPLC-UV-PDA com detector de arranjo de díodos, HPLC-UV-ELSD (fase normal) e por LC-PDA- MS .

[036] No HPLC-UV-PDA, a separação foi realizada utilizando octadecilsilano (C18) como fase estacionária, precedida por uma pré-coluna (contendo mesma fase) . O sistema de solvente utilizado como fase móvel foi uma mistura de água (A) e metanol (B) , ambos com 0,01 a 0,5% de ácido fórmico, no modo gradiente de 5 a 100% de B em 60 minutos, com gradiente linear.

[037] As amostras foram injetadas automaticamente, com vazão de 1,0 mL.mirT .

[038] O crornatograma foi registrado e os espectros de UV dos picos individuais foram monitorados na faixa de comprimento de onda de 200 a 400 nm.

[039] As análises por HPLC-ELSD-UV foram realizadas em um sistema de cromatografia liquida Spot Prep II, com coluna preenchida com sílica (fase normal) .

[040] O sistema de solvente utilizado foi uma mistura de acetato de etila (A) e hexano (B) , com modo gradiente de 5 a 100% de B em 60 min, com gradiente linear. A vazão foi de 5,0 mL min ^-1 e o volume de injeção foi de 1 mL .

[041] Dados LC-PDA-MS foram obtidos por meio de um sistema consistindo de um amostrador automático, bomba de mistura de alta pressão e um detector PAD ligado a um espectrômetro de massa tipo quadrupolo, equipado com uma interface de electrospray .

[042] A coluna e as condições cromatográficas foram as mesmas que as utilizadas para as análises por HPLC-UV-PDA. O volume de injeção foi de 20 i e a vazão foi de 0,2 mL min ^-1 .

[043] Para o espectrômetro de massa, a tensão capilar foi de 30 a 50 V, a temperatura capilar foi de 150 a 250°C, a fonte de tensão foi de 4,5 a 5,0 kV e a fonte de corrente foi de 60 a 90 mA. As análises foram realizadas nos modos íons positivos e negativos.

c) Fracionamento do extraio diclorometano obtido:

[044] O fracionamento bioguiado do extrato diclorometano da polpa de umbu foi realizado por um sistema de cromatografia por SPE, com cartucho empacotado com a fase estacionária C18, a fim de localizar a região ativa no ensaio de indução de quinona redutase.

[045] O sistema de solvente utilizado foi uma mistura de água (A) e metanol (B) , nas seguintes proporções: 20:80, 40:60, 60:40, 80:20, 100:0.

[046] A vazão foi de 1,0 mL min ^-1 e o volume de injeção foi de 5 mL .

[047] A separação resultou em 5 frações, as quais foram analisadas por HPLC-UV-PDA sob as mesmas condições utilizadas para a análise do extrato dos frutos e também foram submetidas ao ensaio de indução de quinona redutase.

d) Isolamento das substâncias ativas:

[048] O isolamento das substâncias ativas presentes no extrato diclorometano da polpa dos frutos de S. tuberosa foi realizado com um sistema semipreparativo HPLC/UV/ELSD, o qual forneceu 40 frações.

[049] A coluna foi preenchida com sílica como fase estacionária e, para fase móvel, foi utilizado acetato de etila (A) e hexano (B) , com gradiente de eluição otimizado, sendo ele:

- 0 a 10 min: 2-5% de B em A,

- 10 a 25 min: 5-10% de B em A

- 25 a 30 min: 10% de B em A

- 30 a 40 min: 10-15% de B em A

- 40 a 70 min: 15-60% de B em A.

[050] A vazão utilizada foi de 5,0 mL min ^-1 e o volume de injeção foi de 2 mL, com absorbância no UV detectada a 254 nm. As frações foram coletadas a cada 10,0 mL . Após esta etapa, cada fração foi concentrada em rotaevaporador e depois foram secas usando N2.

[051] Todas as 40 frações obtidas foram monitoradas por HPLC/UV. A fração 5 forneceu uma mistura de ácidos graxos; a fração 11 forneceu um ácido anacárdico com R sendo um pentadecil (Figura IA) e a fração 13 forneceu uma mistura de três cardanóis com Rs sendo 20, 22 e 24 carbonos, respectivamente mostrados nas Figuras 1B, 1C e 1D.

[052] A identificação estrutural das substâncias foi realizada por RMN e HRMS .

Teste realizado :

[053] Para avaliação da atividade quimiopreventiva do extrato diclorometano e das substâncias ativas obtidas, foi realizado o seguinte teste:

- Ensaio de indução da quinona redutase :

[054] A avaliação da atividade quimiopreventiva do extrato e das substâncias ativas foi realizada por meio da indução da enzima quinona redutase. O ensaio foi efetuado segundo método conhecido do estado da técnica.

[055] Para a avaliação de amostras como indutores da enzima quinona redutase, empregou-se uma cultura de células hepáticas, Hepalclc7.

[056] O método proporciona resultados quantitativos e reprodutíveis para detectar compostos puros e extratos de plantas promissores.

[057] A atividade específica da QR é determinada pela medição do NADPH mediada pela redução através do uso de MTT. Ações sobre a proteína são determinadas pela coloração violeta. A atividade da indução de QR será expressa como a concentração necessária para dobrar a atividade específica da enzima.

[058] Resumidamente, a atividade da quinona redutase foi determinada após dois dias de incubação das células com as amostras. As células foram, então, Usadas e a redução do MTT foi medida em um espectrofotômetro de microplacas em λ= 595 nm .

[059] Em paralelo, a quantidade de células viáveis foi determinada por quantificação da proteína usando coloração de cristal de violeta e medida a absorção a 595 nm no mesmo espectrofotômetro . A 4 ' -bromoflavona foi utilizada como controle positivo.

.Resultados obtidos:

[060] Foram analisadas as três partes dos frutos de

Spondias tuberosa separadamente : cascas, polpa e sementes.

Em cada parte do fruto foi realizada a extração por maceração à exaustão (por 48 h) com polaridade crescente de solvente : hexano, diclorometano e metanol.

[061] Bioensaios de atividade quimiopreventiva foram realizados em todos os extratos.

[062] O extrato diclorometano da polpa apresentou uma potente atividade de quimioprevenção, avaliada por meio da indução da enzima quinona redutase em células Hepalclc7 - hepatocarcinoma murino selvagem.

[063] Os resultados demonstraram que o extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa é capaz de promover uma significativa indução da enzima quinona com a razão de indução de 2,8 a 20 \ig mLT ¹ em células Hepalclc7. Adicionalmente, a viabilidade destas células foi de 78,6%, na mesma concentração, o que comprova que o extrato não apresentou citotoxicidade .

[064] O extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa foi analisado por HPLC/UV (fase reversa) e HPLC/UV/ELSD (fase normal), como é possível observar nas Figuras 2A e 2B.

[065] Ainda, foi realizado um fracionamento bioguiado por SPE com o extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa, ativo no ensaio de quimioprevenção, a fim de identificar a região ativa na indução da quinona redutase. Todas as frações obtidas foram analisadas por HPLC/UV e os respectivos cromatogramas estão mostrados nas Figuras 3A a 3E .

[066] Os testes de indução da quinona redutase e de viabilidade foram realizados para todas as frações obtidas por SPE e os resultados estão descritos na Tabela 1 abaixo.

[067] A quinona redutase é um tipo de flavoproteina que catalisa a redução de dois elétrons, favorecendo, assim, a desintoxicação de quinonas e seus derivados e levando à proteção das células contra processos redox, estresse oxidativo e neoplasias.

[068] Vários indutores de QR podem servir como protetores contra o estresse oxidativo e eletrofilico .

Tabela 1 - Teste de indução da quinona redutase e % de viabilidade para as frações obtidas por SPE.

[069] Assim, para realizar o isolamento das substâncias ativas presentes no extrato diclorometano da polpa dos frutos de Spondias tuberosa, foi feito o microfracionamento a fim de identificar rapidamente as substâncias ativas. Obteve-se cerca de 40 frações (vide Figura 4) .

[070] As frações foram analisadas por LC/MS e RMN, sendo identificados ácidos graxos, ácido anacárdico e cardanóis .

[071] A fração 5 forneceu uma mistura de ácidos graxos. A fração 11 forneceu um ácido anacárdico com R sendo um pentadecil (Figura IA) . O espectro de MS-ESI mostrou o ion molecular a m/z 347.14 [M-H] ^~ , que está em concordância com a fórmula molecular C ₂₂ H ₃₆ O ₃ (o cálculo para C ₂₂ H ₃₆ O ₃ fornece 348.27) . A fração 13 forneceu uma mistura de três cardanóis com Rs sendo 20, 22 e 24 carbonos, respectivamente mostrados nas Figuras 1B, 1C e 1D. Os espectros de MS-ESI mostraram os ions moleculares a m/z 373.28, 401.32, 429.35 [M-H] ^~ , que estão em concordância com as fórmulas moleculares C ₂₆ H ₄₆ O, C ₂₈ H ₅₀ O e C ₃₀ H ₅₄ O, respectivamente.

[072] A significativa atividade quimioprotetora indica a possível utilização do extrato do umbu como alimento funcional/nutracêutico .

[073] Embora a versão preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, deve ser compreendido que a invenção não é limitada. Diversas modificações, mudanças, variações, substituições e equivalentes poderão ocorrer, sem desviar do escopo da presente invenção.