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Title:
METHOD FOR EXTRACTING AND ISOLATING ACTIVE SUBSTANCES FROM UMBU PULP, NUTRACEUTICAL AND/OR FUNCTIONAL FOODS AND COSMETICS COMPRISING SAID ACTIVE SUBSTANCES AND USES THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/058071
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to the method for extracting and isolating active substances from umbu pulp (Spondias tuberosa Arr. Camara). Besides high acetylcholinesterase inhibitory activity, the active substances also exhibit powerful antioxidant activity. In view of their properties, the fractionated extract and the active principles obtained by the claimed method can be used in nutraceutical and/or functional foods or in cosmetics. In the form of foods, the active principles are used for the treatment of neurodegenerative diseases. In the form of cosmetics, the active principles are used against ageing.

Inventors:
ZERAIK, Maria Luiza (Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, -900 Araraquara, 14800-900, BR)
FERREIRA QUEIROZ, Emerson (24 Rue Général Dufour, Genève 4, 1211 Genebra, CH-1211, CH)
CASTRO-GAMBOA, Ian (Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, -900 Araraquara, 14800-900, BR)
SIQUEIRA SILVA, Dulce Helena (Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, -900 Araraquara, 14800-900, BR)
CUENDET, Muriel (Quai Ansermet 30, Genève 4, 1211 Genebra, CH-1211, CH)
DA SILVA BOLZANI, Vanderlan (Rua Francisco Degni, 55 Quitandinha, -900 Araraquara, 14800-900, BR)
WOLFENDER, Jean-luc (Quai Ansermet 30, Genève 4, 1211 Genebra, CH-1211, CH)
Application Number:
BR2015/050173
Publication Date:
April 21, 2016
Filing Date:
October 07, 2015
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" (Rua Quirino de Andrade, 215 Centro, -010 São Paulo, 01049-010, BR)
UNIVERSITÉ DE GENÈVE (24 Rue Général Dufour, Genève 4, 1211 Genebra, CH-1211, CH)
International Classes:
C07C39/10; A61K8/34; A61K8/60; A61K36/22; A61P25/28; C07H15/20
Other References:
DING, Y. ET AL.: "Chemical Constituents from Acer mandshuricum and their effects on the function of Osteoblastic MC 3T3-E1 Cells;", BULL. KOREAN CHEM. SOC.;, vol. 31, no. 4, 2010, pages 929 - 933, XP055223392, DOI: doi:10.5012/bkcs.2010.31.04.929
GOMES, E. B. ET AL.: "A Rapid Method for Determination of Some Phenolic Acids in Brazilian tropical fruits of Mangaba (Hancornia speciosa Gomes) and Umbu (Spondias tuberosa Arruda Camara) by UPLC;", JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCES METHODS AND INSTRUMENTATION;, vol. 3, 2013, pages 1 - 10
SILVA, G. A. ET AL.: "Gênero Spondias: Aspectos Botânicos, composição quimica e Potencial Farmacológico;", BIOFAR-REVISTA DE BIOLOGIA E FARMÁCIA, vol. 10, no. 1
CHO, Y-S. ET AL., INHIBITION OF ACETYLCHOLINESTERASE BY GALLIC ACID- GRAFTED-CARBOHYDRATE POLYMERS, vol. 84, 2011, pages 690 - 69
LIU, Y. ET AL.: "Callic acid is the major component of grape seed extract that inhibits amyloid fibril formation;", BIOORGANIC AND MEDICINAL CHEMISTRYL LETTERS, vol. 23, 2013, pages 6336 - 6340, XP028760135, DOI: doi:10.1016/j.bmcl.2013.09.071
MUKHERJEE, P. K. ET AL.: "Bioactive compounds from natural resources against skin aging;", PHYTOMEDICINE, vol. 19, 2011, pages 64 - 73, XP028335548, DOI: doi:10.1016/j.phymed.2011.10.003
OMENA, C. M. B. ET AL.: "Antioxidant, anti-acetylcholinesterase and cytotoxic activities of ethanol extracts of peel, pulp and seeds of exotic Brazilian fruits. Antioxidant, anti-acetylcholinesterase and cytotoxic activites in fruits;", FOOD RESEARCH INTERNATIONAL;, vol. 49, 2012, pages 334 - 344, XP028951927, DOI: doi:10.1016/j.foodres.2012.07.010
RUFINO, M. S. M. ET AL.: "Free radical-scavenging behaviour of some north-east Brazilian fruits in a DPPH. System;", FOOD CHEMISTRY;, vol. 114, 2009, pages 693 - 695, XP025924760, DOI: doi:10.1016/j.foodchem.2008.09.098
MELO, E. A. ET AL.: "Compostos Bioativos e Potencial Antioxidante de Frutos do Umbuzeiro", ALIM. NUTRI., vol. 21, no. 3, 2010, pages 453 - 457
ALMEIDA, M. M. B. ET AL.: "Bioactive compounds and antioxidant activity of fresh exotic fruits from northeastern Brazil", FOOD RESEARCH INTERNATIONAL, vol. 44, 2011, pages 2155 - 2159, XP028098976, DOI: doi:10.1016/j.foodres.2011.03.051
RUFINO, M. S. M. ET AL.: "Bioactive compound and antioxidant capacities of 18 non-traditional tropical fruits from Brazil ;", FOOD CHEMISTRY;, vol. 121, 2010, pages 996 - 1002, XP026971971
GONÇALVES, A.E.S. S. ET AL.: "Chemical Composition and Antioxidant/Antidiabetic Potential of Brazilian Native fruits and Commercial Frozen Pulps;", J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 58, 2010, pages 4666 - 46 74
Attorney, Agent or Firm:
DE MORAES SPIANDORELLO, Fabíola et al. (Rua Bento Teobaldo Ferraz, 271Bloco I, Barra Funda -070 São Paulo, 01140-070, BR)
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Claims:
REIVINDICAÇÕES

1. Processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu caracterizado por compreender as etapas de:

a) obtenção do extrato metanólico;

b) análise do extrato metanólico obtido;

c) fracionamento do extrato metanólico obtido;

d) isolamento das substâncias ativas;

e) hidrólise enzimática das substâncias isoladas; e f) quantificação das substâncias bioativas.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "a", a polpa dos frutos de Spondias tuberosa Arr. Camara coletados no verão é separada das sementes, homogeneizada com o auxilio de um misturador, congelada e liofilizada.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a polpa liofilizada é exaustivamente extraída por maceração com hexano, seguido por diclorometano e metanol.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os solventes são puros.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que os extratos secos são obtidos após a remoção do solvente por evaporação sob pressão reduzida, em uma faixa que varia de 80 a 60 mBar, em uma temperatura que varia de 43 a 45 °C.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "b", o extrato metanólico é analisado por um sistema HPLC-UV-PDA com detector de arranjo de díodos e por LC-PDA-MS.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "c", o fracionamento do extrato metanólico da polpa de umbu é realizado com um sistema de cromatografia liquida Spot Prep II, com coluna empacotada com C18 e sistema de solvente com uma mistura de água (A) e metanol (B) , ambos com 0, 01 a 0,5% de ácido fórmico, e gradiente linear de 5 a 100% de B em 60 minutos.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "d", o extrato metanólico é fracionado usando um sistema MPLC-UV, com coluna preenchida com C18 irregular e fase móvel de metanol (B) e água (A), contendo 0,01 a 0,5% de ácido fórmico, com gradiente de eluição otimizado para detecção em 254 nm.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o gradiente de eluição otimizado é:

- 0 a 8,5 h: 5-30% de B em A,

- 8,5 a 20,4 h: 30% de B em A e

- 20,4 a 63,8 h: 30-80% de B em A.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "e", a hidrólise é realizada com a adição de β-glicosidase de amêndoas ou β- galactosidase de Escherichia coli nas amostras.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as amostras são dissolvidas em tampão acetato e incubadas sob agitação a 35 a 40 °C durante 36 a 48 h.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa "f", as amostras são filtradas em filtro 5 μπι e a substância ativa majoritária da polpa de umbu é quantificada por meio do método do padrão externo por HPLC-UV/PDA.

13. Substâncias ativas, obtidas conforme o processo descrito nas reivindicações 1 a 12, caracterizados pelo fato de apresentarem as estrutura

e apresentarem propriedades antioxidantes e inibidoras da acetilcolinesterase (AChE) .

14. Alimentos nutracêuticos e/ou funcionais caracterizados por compreenderem as substâncias ativas da polpa do umbu obtidas conforme o processo definido nas reivindicações 1 a 12.

15. Uso das substâncias ativas da polpa do umbu caracterizado por ser no preparo de alimentos nutracêuticos e/ou funcionais para tratar doenças neurodegenerativas.

16. Cosméticos caracterizados por compreenderem as substâncias ativas da polpa do umbu obtidas conforme o processo definido nas reivindicações 1 a 12.

17. Uso das substâncias ativas da polpa do umbu caracterizado por ser no preparo de cosméticos para tratar envelhecimento .

Description:
PROCESSO DE EXTRAÇAO E ISOLAMENTO DE SUBSTANCIAS ATIVAS PRESENTES NA POLPA DO UMBU, ALIMENTOS NUTRACEUTICOS E/OU FUNCIONAIS E COSMÉTICOS COMPREENDENDO AS REFERIDAS

SUBSTÂNCIAS ATIVAS E SEUS USOS

Campo da invenção :

[001] A presente invenção se refere ao processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu ( Spondias tuberosa Arr. Camara) . Além da alta inibição da enzima acetilcolinesterase, o extrato fracionado e as substâncias ativas ainda apresentam potente atividade antioxidante.

[002] Em vista das suas características, o extrato e os ativos obtidos pelo processo ora proposto podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais ou, ainda, em cosméticos.

[003] Como alimentos, os ativos são usados no tratamento de doenças neurodegenerativas . Como cosméticos, os ativos são usados contra envelhecimento.

Fundamentos da invenção:

[004] A biodiversidade brasileira é fonte de uma grande variedade de frutos comestíveis, sendo o nosso país um dos três maiores produtores mundiais de frutas.

[005] As frutas tropicais representam uma fonte original e valiosa de compostos bioativos e seu consumo vem aumentando nos mercados nacional e internacional, devido ao crescente reconhecimento de seu valor nutritivo e terapêutico .

[006] No entanto, na maioria dos casos, o potencial destes frutos permanece desconhecido ou pouco estudado quanto aos seus constituintes químicos e suas atividades biológicas, como é o caso do fruto exótico da espécie Spondias tuberosa Arr. Camara, conhecido popularmente no Brasil como "umbu".

[007] O umbuzeiro é uma planta tropical nativa do nordeste brasileiro e desempenha um papel importante na Caatinga, uma vez que floresce e dá frutos durante a estação de seca, fazendo desta planta uma valiosa fonte de renda para a população local.

[008] O umbu é muito apreciado nas regiões norte e nordeste do Brasil, principalmente devido ao seu sabor refrescante e ácido. O fruto pode ser consumido fresco ou na forma de suco, sorvete, doce e geleia, bem como na forma da "umbuzada", doce tradicionalmente nordestino em que a polpa é cozida com leite e açúcar.

[009] Embora as vitaminas, minerais e compostos voláteis presentes na polpa de umbu já tenham sido identificados, nenhum estudo fitoquimico de isolamento dos metabólitos secundários não voláteis e suas bioatividades foi realizado.

[010] Estudos recentes demonstraram o potencial do umbu como agente antioxidante, atividade esta atribuída à presença de compostos fenólicos nas polpas. A ação antioxidante dos extratos de frutas pode estimular a síntese do colágeno e o combate aos radicais livres, sendo útil no combate dos efeitos do envelhecimento ou na melhora da cicatrização da pele.

[011] O envelhecimento da pele é um processo em curso cronológico associado a mudanças clinicamente progressivas, que se manifestam na forma de rugas, tecido prolapso e irregularidades de pigmentação. [012] Além da programação genética, o envelhecimento também é afetado por agentes cumulativos ambientais e químicos (como a exposição ao sol e poluentes) . Os vícios, hábitos e estilo de vida (como o tabagismo, índice de massa corpórea e menopausa) também podem induzir ao envelhecimento precoce da pele.

[013] Específicos antioxidantes reduzem a taxa de formação de danos ultravioleta secundários na pele, particularmente aqueles induzidos por oxigénio singlete, espécie reativa de oxigénio.

[014] A presença de radicais livres no espaço extracelular é controlada por moléculas antioxidantes naturais, impedindo que estas substâncias reativas causem danos aos tecidos. Moléculas antioxidantes podem reduzir ou sequestrar as espécies radicalares ou inibir enzimas responsáveis pela produção destas.

[015] O stress oxidativo ocorre quando há um excesso na produção de radicais livres e as células não são capazes de neutralizá-los por seus próprios mecanismos antioxidantes. Este excesso de radicais atacam macromoléculas celulares, levando ao comprometimento da função celular, dano ou morte .

[016] Diante dos problemas causados pela produção e pela liberação excessiva de moléculas citotóxicas, substâncias antioxidantes têm sido amplamente utilizadas em produtos para oferecer proteção complementar.

[017] Dentre os antioxidantes dietéticos mais usuais, estão substâncias como as vitaminas A, C e E (encontrados nas frutas, em geral); as catequinas (presentes no chá- verde e em frutas como uva e morango) ; ácidos fenólicos (presente no brócoli, na cenoura e nos grãos integrais), mais especificamente a quercetina (encontrada nas cascas e polpas de diversos frutos); antocianinas (presentes em frutas vermelhas) e resveratrol (presente nas uvas) .

[018] Carotenoides presentes na pele tem um papel importante na fotoproteção contra a radiação UV. 0 β- caroteno, uma provitamina A, acumula-se na pele proporcionando uma cor amarelo-ouro . Luteina e zeaxantina, por sua vez, são carotenoides que se acumulam na mácula lútea, onde protegem a retina contra os danos oxidativos da luz UV.

[019] Estudos descritos na literatura cientifica mostraram atividades distintas dos extratos de plantas brasileiras sobre a pele, tais como ação hidratante, de proteção solar e despigmentação e ação antioxidante.

[020] Dentre os frutos estudados e utilizados na indústria de cosméticos, tem-se a acerola, que contém abundante quantidade de vitamina C. Extratos dos frutos de acerola possuem efeito antienvelhecimento, tais como a prevenção de danos causados pela radiação UV, a inibição da glicação e o aumento da síntese do colágeno tipo IV e tipo I, em cultura de fibroblastos humanos.

[021] Os óleos oriundos das polpas ou sementes de frutos do Brasil também são muito utilizados na fabricação de cosméticos, como é o caso do buriti (extraído da polpa do fruto) e do maracujá (extraído da semente), que contém alta porcentagem de ácidos graxos poliinsaturados , além de grande quantidade de tocoferol.

[022] Nos últimos anos, houve um aumento nas pesquisas sobre a aplicação de sequestradores de radicais, principalmente flavonoides, em produtos cosméticos, a fim de promoverem o antienvelhecimento e a fotoproteção . Outra tendência é a adição da vitamina C em doses mais concentradas ou, ainda, combinadas a outros ativos, como o colágeno .

[023] Todos esses exemplos mostram que vários fitonutrientes ricos em constituintes antioxidantes e com ação anti-inflamatória podem ser bastante eficazes, evitando o dano oxidativo da pele e do cabelo, sendo, portanto, matéria-prima valiosa para produtos cosméticos.

[024] Além disso, as substâncias antioxidantes também atuam no organismo humano prevenindo e retardando várias doenças, como a doença de Alzheimer.

[025] A doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de declínio cognitivo em adultos, sobretudo idosos, representando mais da metade dos casos de demência. A idade é o principal fator de risco: sua prevalência passa de 0,7% aos 60 anos de idade para cerca de 40% no grupo etário de 90 anos. Isso revela a magnitude do problema no Brasil, onde já vivem cerca de 15 milhões de indivíduos com mais de 60 anos. Os inibidores das colinesterases (I-ChE) são as principais drogas hoje licenciadas para o tratamento específico da DA. A tacrina (utilizada neste estudo como padrão) é um inibidor reversíveis da acetilcolinesterase, porém provoca muitos efeitos colaterais no organismo.

[026] Em vista do acima exposto, a presente invenção provê um processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes no extrato metanólico da polpa do umbu ( Spondias tuberosa Arr. Camara) .

[027] A partir do extrato, são isoladas e identificadas 7 substâncias em uma única etapa, as quais conferem alta inibição da enzima acetilcolinesterase, além de potente atividade antioxidante, conforme pode-se verificar nos testes biológicos de atividade antioxidante e inibidora de acetilcolinesterase.

[028] Os ativos obtidos de acordo com o processo podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais, que além de fornecer energia e nutrientes essenciais para a sobrevivência, fornecem constituintes não-nutrientes que exercem efeitos fisiológicos benéficos e podem atuar prevenindo ou retardando doenças neurodegenerativas . Ainda, o extrato também apresenta potente atividade antioxidante, o que evidencia seu potencial cosmético.

Breve descrição da invenção:

[029] A presente invenção se refere ao processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu (Spondias tuberosa Arr. Camara), as quais conferem alta inibição da enzima acetilcolinesterase, além de potente atividade antioxidante ao extrato.

[030] Os ativos com caráter multifuncional, obtidos de acordo com o processo, podem ser aplicados em alimentos nutracêuticos e/ou funcionais, utilizados para tratar doenças neurodegenerativas, ou ainda, em cosméticos, em vista da apresenta potente atividade antioxidante.

Breve descrição das figuras:

[031] As Figuras IA, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F e 1G e 2 representam graficamente a análise por HPLC/PDA/ESI/MS das frações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 do extrato metanolico da polpa dos frutos de Spondias tuberosa.

[032] A Figura 3 representa graficamente a análise por meio das técnicas UHPLC/TOF/MS versus MPLC/UV e a identificação de substâncias em 2D do extrato metanolico da polpa dos frutos de Spondias tuberosa .

[033] As Figuras 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F e 4G representam estruturalmente os compostos 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, isolados a partir de polpa dos frutos de Spondias tuberosa (Anacardiaceae ) .

Descrição detalhada da invenção:

[034] A presente tecnologia descreve o processo de extração e isolamento de substâncias ativas presentes na polpa do umbu {Spondias tuberosa Arr. Camara), o qual consiste nas etapas de:

a) obtenção do extrato metanolico;

b) análise do extrato metanolico obtido;

c) fracionamento do extrato metanolico obtido;

d) isolamento das substâncias ativas;

e) hidrólise enzimática das substâncias isoladas; e f) quantificação das substâncias bioativas.

[035] A seguir, as etapas do processo são mais bem detalhadas .

a) Obtenção do extrato metanolico :

[036] Para a obtenção do extrato metanolico da polpa, os frutos de Spondias tuberosa Arr. Camara foram coletados no verão (mais especificamente, em fevereiro) , época do ano que favorece a colheita de frutos com a concentração de ativos desejada.

[037] A polpa dos frutos de umbu foi separada das sementes e homogeneizada com o auxilio de um misturador. Após este passo, a polpa foi congelada e liofilizada.

[038] A polpa pulverizada foi exaustivamente extraída por maceração com hexano, seguido por diclorometano e metanol. Todos os solventes estavam puros.

[039] Os extratos secos foram obtidos após a remoção do solvente por evaporação sob pressão reduzida, em uma faixa que varia de 80 a 60 mBar, em uma temperatura que varia de 43 a 45 °C, utilizando rotaevaporador.

b) Análise do extraio metanólico obtido:

[040] As análises do extrato metanólico foram realizadas por um sistema HPLC-UV-PDA com detector de arranjo de díodos e por LC-PDA-MS.

[041] No HPLC-UV-PDA, a separação foi realizada utilizando octadecilsilano (C18) como fase estacionária, precedida por uma pré-coluna (contendo mesma fase) . O sistema de solvente utilizado como fase móvel foi uma mistura de água (A) e metanol (B) , ambos com 0,01 a 0,5% de ácido fórmico, no modo gradiente de 5 a 100% de B em 60 minutos, com gradiente linear.

[042] As amostras foram injetadas automaticamente, com vazão de 1,0 mL.min -1 .

[043] O cromatograma foi registrado e os espectros de UV dos picos individuais foram monitorados na faixa de comprimento de onda de 200 a 400 nm.

[044] Dados LC-PDA-MS foram obtidos por meio de um sistema consistindo de um amostrador automático, bomba de mistura de alta pressão e um detector PAD ligado a um espectrômetro de massa tipo quadrupolo, equipado com uma interface de electrospray.

[045] A coluna e as condições cromatográficas foram as mesmas que as utilizadas para as análises por HPLC-UV-PDA. O volume de injeção foi de 20 μL e a vazão foi de 0,2 mL mirT .

[046] Para o espectrômetro de massa, a tensão capilar foi de 30 a 50 V, a temperatura capilar foi de 150 a 250°C, a fonte de tensão foi de 4,5 a 5,0 kV e a fonte de corrente foi de 60 a 90 mA. As análises foram realizadas nos modos ions positivos e negativos.

c) Fracionamento do extrato metanolico obtido:

[047] O fracionamento do extrato metanolico da polpa de umbu foi realizado com um sistema de cromatografia liquida Spot Prep II , com coluna empacotada com C18.

[048] O sistema de solvente utilizado foi uma mistura de água (A) e metanol (B) , ambos com 0,01 a 0,5% de ácido fórmico. O modo de gradiente era de 5 a 100% de B em 60 minutos, com gradiente linear.

[049] A vazão foi de 2,0 mL min -1 e o volume de injeção foi de 200 mL, sendo as frações foram coletadas a cada 10,0 mL . Cada fração foi concentrada utilizando um rotaevaporador e seca usando nitrogénio.

[050] A separação resultou em 10 frações, as quais foram analisadas por HPLC-PDA sob as mesmas condições utilizadas para a análise do extrato dos frutos.

d) Isolamento das substâncias ativas:

[051] O extrato metanolico foi fracionado usando um sistema MPLC-UV, ou seja, cromatografia liquida de média pressão acoplada com detector UV-Vis, o qual forneceu 250 frações .

[052] A coluna foi preenchida com C18 irregular como fase estacionária. A fase móvel utilizada foi de metanol (B) e água (A), contendo 0,01 a 0,5% de ácido fórmico, com gradiente de eluição otimizado, sendo ele: - 0 a 8,5 h: 5-30% de B em A,

- 8,5 a 20,4 h: 30% de B em A e

- 20,4 a 63,8 h: 30-80% de B em A.

[053] A vazão utilizada foi de 4,0 mL mirf 1 e a absorbância no UV foi detectada a 254 nm.

[054] Todas as 250 frações obtidas foram monitoradas por UHPLC/TOF/MS . A fração 23 forneceu a substância 1; a fração 26, as substâncias 2 e 3; a fração 30, a substância 4; a fração 46, a substância 5; a fração 73, a substância 6 e a fração 180 forneceu a substância 7. A identificação estrutural das substâncias foi realizada por RMN e HRMS .

e) Hidrólise enzimática das substâncias isoladas :

[055] A hidrólise foi realizada nas frações 1 e 4, a fim de determinar a natureza de suas hexoses.

[056] A reação foi realizada com a adição de β- glicosidase de amêndoas ou β-galactosidase de Escherichia coli nas substâncias das referidas frações.

[057] As amostras são dissolvidas em tampão acetato (pH = 5) e incubadas sob agitação a 35 a 40°C durante 36 a 48 h. Os produtos de hidrólise foram, então, comparados em uma placa de CCD com os compostos originais (1 e 4 não hidrolisados), usando a mistura CHCl 3 -MeOH-H 2 0 (na proporção 65:35:5) como fase móvel e luz ultravioleta (A = 254 nm) para detecção.

f) Quantificação das substâncias bioativas:

[058] A quantificação do composto bioativo majoritário da polpa de umbu foi realizada por HPLC-UV/PDA, usando o método do padrão externo.

[059] As curvas analíticas foram construídas com seis pontos, na faixa de 1,25 a 40,0 mg mLT 1 em metanol. [060] Os cromatogramas foram analisados em triplicata para cada concentração, obtidos em Á = 254 nm.

[061] As amostras foram filtradas através de um filtro 5 μπι antes da injeção para o sistema HPLC-UV/PDA. O processo de quantificação foi realizado em triplicata.

Testes realizados:

[062] Para avaliação da atividade antioxidante, foram realizados os seguintes testes:

- Ensaio da capacidade redutora do radical DPPH:

[063] A capacidade antioxidante dos compostos isolados e do padrão (quercetina) foi avaliada em termos da redução do radical 2 , 2-difenil-l-picrilhidrazil (DPPH) .

[064] O ensaio do DPPH foi realizado conforme procedimento já conhecido do estado da técnica.

[065] Uma aliquota de solução etanólica de DPPH (1,0 10 ~4 mol LT 1 ) é adicionada aos compostos 1 a 7 em diferentes concentrações (72,00 a 1,12 mg.mLT 1 , em etanol) .

[066] O mesmo procedimento é realizado com soluções etanólicas de quercetina. A diminuição na absorbância da solução resultante a 515 nm é monitorada a intervalos de 1 min, durante 90 minutos, utilizando um espectrofotômetro de microplacas .

[067] A microplaca é automaticamente agitada antes de cada leitura. A solução etanólica de DPPH é utilizada como controle .

[068] A porcentagem de DPPH reduzido é calculada utilizando o valor da absorbância após 90 minutos, utilizando a seguinte equação:

% DPPH reduzido = [Abssi5 nm (controle) - Abs5i5 nm (amostra) /Abs5i5 nm (controle) ] 100 [069] A capacidade de redução do DPPH pelo padrão e pelos compostos 1 a 7 é expressa em termos de EC 50 (quantidade de antioxidante necessária para diminuir a concentração inicial de DPPH em 50%) .

[070] O EC50 foi calculado graficamente usando a curva analítica na faixa linear, plotando os compostos isolados versus a porcentagem de DPPH reduzido.

[071] Todos os testes foram realizados em triplicata. - Ensaio da capacidade de sequestro do cátion radical

ABTS:

[072] O ensaio do ABTS ( 2 , 2 ' -azino-bis ( 3- etilbenzotiazolin-6-sulfônico) foi baseado em um método já conhecido. O ABTS foi dissolvido em água e o ABTS cátion radical (ABTS + ) foi produzido por reação da solução com persulfato de potássio.

[073] A mistura foi agitada e mantida no escuro à temperatura ambiente durante 14 a 18 h. A solução foi diluída 60 vezes com água para o ensaio. Em seguida, nas placas de 96 poços, 250 i da solução de ABTS + foi adicionada a 35 i do composto padrão (quercetina) ou aos compostos 1 a 7, em diferentes concentrações.

[074] A absorbância a 755 nm foi registada em intervalos de 1 minuto durante 90 minutos, utilizando espectrofotômetro de microplacas. A microplaca foi automaticamente agitada antes de cada leitura. A solução de ABTS + sem os compostos testados foi usada como controle e a percentagem de ABTS sequestrado foi calculada como se segue :

% ABTS + sequestrado = [ ' AbS 7 55nm (COlltrol θ) ~

Abs755 nm (amostra) /Abs755 nm (controle) ] χ ΙΟΟ [075] A capacidade de sequestro do cátion radical ABTS pelo padrão e pelos compostos 1 a 7 foi expressa em termos de EC 50 .

[076] Todas as determinações foram realizadas em triplicata .

- Ensaio da capacidade de absorção do radical oxigénio (ORAC) :

[077] Foi utilizado o método ORAC para avaliar a capacidade antioxidante de dos compostos 1 a 7. Para isto, a solução do reagente AAPH ( azobis-amidinopropano ) foi preparada em tampão glicina (pH 8,3) .

[078] A solução de fluoresceina foi preparada também em tampão de glicina (pH 8,3) e mantida a 4°C, no escuro.

[079] A solução de trabalho de fluoresceina foi preparada diariamente, diluindo a solução estoque em tampão glicina. Nas placas de 96 poços de paredes pretas, 186 i de solução de fluoresceina foi adicionada a 4,0 i de padrão (quercetina) ou aos compostos de 1 a 7, em diferentes concentrações.

[080] A placa foi coberta com uma tampa e incubada sob agitação durante 10 a 15 min a 38 a 42 °C. Após este passo, a reação foi iniciada com solução de AAPH. Após esta etapa, a reação foi novamente incubada sob agitação durante 90 a 95 min a 38 a 42 °C.

[081] Após a incubação, a placa foi mantida à temperatura ambiente durante 3 a 5 min para esfriar e a fluorescência foi medida num leitor de microplacas.

[082] Filtros de excitação em 485 nm e filtros de emissão em 528 nm foram utilizados.

[083] As medições finais de fluorescência foram expressas relativas ao controle de leitura. Para os ensaios de controle, os compostos testados foram substituídos pelo volume correspondente de tampão glicina sob condições idênticas .

[084] A capacidade de absorção do radical oxigénio por 1 a 7 foi expressa em termos de EC 50 . Todas as determinações foram realizadas em triplicata.

- Ensaio da atividade da enzima acetilcolinesterase :

[085] A atividade inibidora da acetilcolinesterase dos compostos 1 a 7 foi avaliada utilizando o método de Ellman. Este método baseia-se na quantidade de tiocolina liberada quando a enzima acetilcolinesterase hidrolisa o substrato de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) .

[086] O produto tiocolina reage com o reagente de Ellman (ácido 5, 5-bisditionitrobenzoico-DTNB) para produzir um composto amarelo ( 5-tio-2-nitrobenzoato ) , o qual pode ser detectado a 412 nm.

[087] Nas placas de 96 poços, 14,0 i dos compostos 1 a 7 ou os dos padrões tacrina e galantamina foram adicionados a 10,0 μΐ de substrato acetiltiocolina em água e 106,0 i de reagente de Ellman.

[088] A reação enzimática foi iniciada pela adição de solução de AChE proveniente de Electrophorus electricus em tampão fosfato contendo albumina sérica humana.

[089] A absorbância do produto foi medida a 412 nm depois de 5 a 6 min, utilizando um leitor de microplacas. As soluções estoques dos compostos testados e os compostos de referência padrão (tacrina e galantamina) foram preparadas em DMSO e diluídas em tampão fosfato, resultando na concentração final de 1,0% de DMSO em cada poço. [090] Cada concentração foi realizada em triplicata. Para os ensaios do controle (branco) , os compostos testados foram substituídos pelo correspondente volume de DMSO, sob condições idênticas.

[091] A porcentagem de inibição foi calculada utilizando a fórmula:

[Absorbância do controle - absorbância da amostra] / absorbância do controle x 100.

[092] A concentração inibitória 50% (IC 50 ) foi calculada graficamente a partir de curvas de dose-resposta obtidas plotando a porcentagem de inibição versus concentração utilizando software apropriado.

[093] Os valores de IC 50 foram avaliados ao menos em seis concentrações diferentes.

-Resultados obtidos:

[094] Foram analisadas as três partes dos frutos de Spondias tuberosa separadamente: cascas, polpa e sementes. Em cada parte do fruto foi realizada a extração por maceração à exaustão (por 48 h) com polaridade crescente de solvente: hexano, diclorometano e metanol.

[095] Foram realizados os bioensaios de inibição da enzima acetilcolinestersase, de atividade antioxidante em todos os extratos.

[096] O extrato metanólico da polpa do umbu apresentou uma potente inibição da enzima acetilcolinesterase (61%), além de alta atividade antioxidante nos ensaios de DPPH (89%), ABTS (97%) e ORAC (64%) .

[097] O extrato da polpa apresentou alta concentração de compostos fenólicos e alta capacidade antioxidante, podendo ser muito eficaz contra o dano oxidativo da pele e do cabelo, sendo, portanto matéria-prima valiosa para produtos cosméticos.

[098] As significativas atividades inibidoras da enzima acetilcolinesterase (relacionada a doença de Alzheimer) , indicam a possível utilização do extrato do umbu como alimento funcional/nutracêutico .

[099] As frações dos extratos da polpa dos frutos de Spondias tuberosa, bem como o extrato metanólico da polpa em si, foram analisados por HPLC/UV/ELSD e HPLC/PDA/ESI/MS, conforme mostrado nas Figuras IA, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G e 2.

[100] A fim de realizar o isolamento dos compostos ativos presentes na polpa de umbu por meio da técnica MPLC/UV, foi realizada a otimização do gradiente de eluição por HPLC/PAD utilizando uma coluna com C18 como fase estacionária .

[101] As condições analíticas encontradas por HPLC/UV foram geometricamente transferidas para MPLC-UV por meio de cálculos cromatográficos , para o isolamento dos compostos ativos presentes em 1,8 g de extrato de umbu. Por meio da técnica MPLC-UV foram obtidas cerca de 250 frações que foram monitoradas por UHPLC/TOF/MS (como mostra a Figura 3) .

[102] Sete substâncias foram isoladas das frações metanólicas da polpa de Spondias tuberosa e suas estruturas foram elucidadas com base nas análises de RMN e HRMS .

[103] As substâncias foram identificadas como:

- 3, 4-dihidroxifeniletanol-5-?-D-glucose,

- ácido gálico,

- 2 , 4 , 6-trimetoxifenol 1-O-beta-D- glucopiranosídeo (ou isotachioside ) ,

- 5-hidroxi-4-metoxi benzoico-3-0-3-D-glucopiranosideo,

4-metoxil-5-hidroximetil benzóico 0-/3-D- glucopiranosideo,

- 3 , 5-di-hidroxi-4-metoxi-ester metil benzóico; e

- eriodictiol 7-O-metileter 3'-0-β-Ό- glucopiranosideo, respectivamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7.

[104] Entre os compostos isolados, a separação por MPLC forneceu dois novos produtos: 1 e 4.

[105] O composto 1 foi isolado como um sólido amorfo marrom. O espectro de MS-ESI mostrou o ion molecular a m/z 331, 0973 [M-H] ~ , que está em concordância com a fórmula molecular C14H1 9 O 9 (o cálculo para C14H2 0 O 9 fornece 332, 1107) .

[106] O espectro de RMN 1 H apresentou dois sinais em <¾ 6.33 e 6.45, correspondendo a dois prótons aromáticos em posição meta. Estes dois sinais se correlacionam no experimento de HMBC com um sinal em â c 38.8, sugerido a presença do grupo CH 2 ligado ao anel aromático.

[107] Por outro lado, a análise do espectro de RMN 2D revela que este grupo CH 2 é ligado a outro grupo CH 2 (<¾ 3.51/<¾ 62.4), substituído por um grupo hidroxila.

[108] O espectro de HMBC também apresenta correlação dos prótons aromáticos em <¾ 6.33 e 6.45 com três carbonos aromáticos oxigenados em â c 133.2, 145.4 e 145.9. A presença de um açúcar, foi confirmada após análise do espectro de MS/MS que forneceu o ion fragmento a m/z 169.03 [M-162] + , sugerindo a perda de uma hexose.

[109] Esta hipótese também foi confirmada por meio do espectro de RMN que forneceu três sinais em δ 4.57 (IH, d, J=6.5 Hz), correspondendo a um próton anomérico. Este açúcar foi identificado como uma β-hexose baseado na constante de acoplamento.

[110] A fim de identificar a unidade de hexose, duas hidrólises enzimáticas diferentes foram realizadas usando β-D-glicosidase e β-D-galactosidase, e os produtos foram analisados por CCD. A hidrólise enzimática somente ocorreu com a /3-D-glucosidase e confirmou a presença de /3-D-glucose no composto 1.

[111] A ligação da unidade de açúcar no carbono C-3 foi alcançada com base na correlação HMBC entre os prótons anoméricos em <¾ 4.87 e o sinal de carbono em â c 150.3. Baseado nestes resultados, 1 foi identificado como 3,4- dihidroxifeniletanol-5^-D-glucose, um novo derivado de feniletanol .

[112] O composto 4 foi isolado como um sólido amorfo marrom. O espectro de MS-ESI mostrou um ion molecular a m/z 345.0997 [M-H] ~ , que está em concordância com a fórmula molecular C14H18O10 (cale. for C14H19O10, 346.0900) . O espectro de RMN 1 H apresentou dois sinais singletos largos aromáticos em <¾ 7.12 e 7.15, atribuídos a dois prótons aromáticos em posição meta.

[113] Estes dois sinais se correlacionam no experimento de HMBC com um sinal em â c 168.5, sugerindo a presença do grupo carbonil ligado ao anel aromático. O espectro de HMBC também apresenta as correlações destes dois prótons aromáticos com três carbonos aromáticos oxigenados em â 139.6, 149.9 e 150.4. Como para o composto 1, a presença de um açúcar foi confirmada pelos sinais em <¾ 4.87 (IH, d, J=l .3 Hz, correspondente a um próton anomérico do espectro RMN 1 H. Este açúcar foi identificado como um β-hexose com base na constante de acoplamento. Como para 1, o composto 4 foi submetido a uma hidrólise enzimática utilizando β-D- glicosidase e β-D-galactosidase, de modo a determinar a unidade de açúcar. Como para 1, a hidrólise enzimática ocorreu apenas com o β-D-glicosidase e confirmou a presença de um β-D-glicose, no composto 4. Finalmente, a ligação da unidade do açúcar no carbono C-3 foi alcançada com base na correlação HMBC entre os prótons anoméricos em Sn 4.87 e o sinal de carbono a S c 150,3. Os espectros de RMN de 1 H e C 13 de 4 apresentam também sinais característicos de um grupo metoxila [<¾ 3.75 and õ c 60.1] . Uma vez que não foi observada correlação no espectro NOESY entre os sinais de metoxila e o próton aromático em H-6, o grupo metoxila foi posicionado na posição C-4. Com base nestes resultados, o composto foi identificado como sendo 5-hydroxyl-4-metoxi benzóico -3-0-3-D-glucose benzóico, que é um novo derivado do ácido benzóico.

[114] O principal composto bioativo (o composto 5) foi quantificado pelo método do padrão externo, utilizando-se HPLC-UV com detecção a Á = 280 nm.

[115] A curva analítica foi obtida para 5 (com y = - 34,09 + 341,4 x ), com boa linearidade (r = 0,9999 e n = 3), dentro do intervalo de 1,25 e 40,0 mg.mL-1, isto é, 12, 5 a 400,0 mg.

[116] O conteúdo do composto 5 no extrato de polpa do umbu foi de 3,88 ± 0,02 mg.mL-1 (média ± desvio padrão, n = 3), isto é, 38,78 ± 0,20 mg, o que representa 775,6 ± 3,80 mg.g-1 de extrato ou 77,6% do composto 5 no extrato.

[117] Em média, a polpa, sementes e cascas constituem 57, 78, 21, 27 e 20, 95% do peso total do fruto do umbu, respectivamente .

[118] O peso do fruto varia de 8 a 23 g, logo, o conteúdo do composto 5 presente na polpa do umbu (a qual consiste, em média, a 9, 00 g) foi de 6, 98 g, valor consideravelmente elevado.

[119] O efeito das substâncias isoladas sobre a atividade da acetilcolinesterase e também a capacidade antioxidante destas substâncias foram analisadas.

[120] Todas as substâncias testadas (compostos 1 a 7) apresentaram elevada capacidade antioxidante, tal como indicado pelos testes de sequestro dos radicais DPPH ' e ABTS + , bem como pelo método ORAC (vide Tabela 1 abaixo) .

Tabela 1. Avaliação da atividade antioxidante e AChE dos compostos isolados da polpa do umbu (exceto o composto 3 r o qual estava em mistura)

Em que: n.t. significa não testado.

[121] Os valores apresentados são as médias ± desvios- padrão obtidos a partir de três experimentos independentes.

[122] Os compostos isolados a partir da polpa do umbu ainda foram testados no ensaio de acetilcolinesterase (também mostrado na Tabela 1) .

[123] As substâncias 2 (ácido gálico) e 5 ( 4-metoxil-5- hidroximetil benzóico Ο-β-glucopiranosideo) apresentaram alta inibição da AChE, com valores de IC 50 inferiores a 13,0 μπιοΐ . LT 1 .

[124] Por outro lado, os compostos 1, 4, 6 e 7, não tiveram efeito inibidor significativo no ensaio, quando comparados aos padrões tacrina e galantamina.

[125] Estudos anteriores mostraram o ácido gálico (composto identificado na polpa do umbu) como potente inibidor da acetilcolinesterase e inibidores desta enzima são, ainda, a melhor farmacoterapia disponível para pacientes com Alzheimer.

[126] No entanto, os inibidores da acetilcolinesterase usados atualmente, como a tacrina, produzem efeitos colaterais, como a hepatotoxicidade . Logo, a utilização de compostos naturais bioativos, tais como os antioxidantes, pode ser a eventual aplicação na prevenção e tratamento da doença de Alzheimer.

[127] Os inibidores enzimáticos que apresentam propriedades antioxidantes são promissores no caso das doenças neurodegenerativas , devido ao seu papel protetor contra espécies radicalares.

[128] Os estudos suportam a hipótese de que a atividade radicalar excessiva ocorre na doença de Alzheimer, a qual pode ser manifestada como uma redução de antioxidantes no plasma, especialmente as vitaminas A, C e E.

[129] Estes radicais podem ser produzidos não apenas sob condições patológicas, mas também a partir do metabolismo de certos compostos que podem levar a riscos toxicológicos severos. Assim, uma abordagem de descoberta de drogas com múltiplos alvos é promissor.

[130] A polpa dos frutos de umbu pode ser considerado uma importante fonte dos compostos bioativos 2 e 5, compostos que apresentam propriedades antioxidantes e inibidoras da acetilcolinesterase (AChE) , podendo levar ao desenvolvimento de alimentos funcionais com benefícios para a saúde e/ou pode proporcionar novos produtos naturais com interessantes potenciais atividades contra doenças neurodegenerativas .

[131] Embora a versão preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, deve ser compreendido que a invenção não é limitada. Diversas modificações, mudanças, variações, substituições e equivalentes poderão ocorrer, sem desviar do escopo da presente invenção.