Beschreibung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Mykotoxinen aus Getreiden und anderen Lebensmitteln oder aus Futtermitteln und deren anschließende Quantifizierung. Anwendungsgebiete sind die Lebensmittelindustrie, die Futtermittelindustrie oder die Biotechnologie.

Hintergrund der Erfindung

Mykotoxine sind von Schimmelpilzen gebildete sekundäre Stoffwechselprodukte, die bei Wirbeltieren bereits in kleinsten Mengen giftig wirken. Derzeit sind etwa 200 verschiedene Mykotoxine bekannt, die von über 300 Pilzarten gebildet werden. Der Begriff Mykotoxine umfasst eine Reihe chemischer Verbindungen mit unterschiedlicher Struktur und Wirkung, die sich zu folgenden Stoffgruppen zusammenfassen lassen: Aflatoxine, Ochratoxine, Trichothecene wie beispielsweise Deoxynivalenol, Fumonisine, Alternaria-Toxine, Fusarium-Toxine, Mutterkorn- alkaloide.

Von besonderer Bedeutung in der Lebens- und Futtermittelindustrie sind Myktoxine der Aflatoxin-Gruppe, der Fumonisin-Gruppe, Ochratoxin A, Deoxynivalenol (DON), HT-2-Toxin (kurz HT2), T-2-Toxin (kurz T2) und Zearalenon. Aufgrund deren ausgesprochen hohen Gefährdungspotentials und der weiten Verbreitung können bereits kleinste Mengen in Lebens- und Futtermittel die Gesundheit von Mensch und Tier akut oder chronisch beeinträchtigen. Daher haben Gesetzgeber weltweit national gültige Grenzwerte für die verschiedenen Mykotoxine in unterschiedlichen Matrices erlassen. Als Beispiel sei an dieser Stelle die EU-Richtlinie 1881 aus dem Jahr 2006 genannt. Ferner wurden in diesem Zusammenhang Minimalanforderungen an Testsysteme (z.B. ELISA) in der EU durch die Richtlinie 519 aus dem Jahr 2014 festgelegt. Es besteht deshalb ein außerordentliches Interesse, Lebens- oder Futtermittel auf eine eventuelle Mykotoxinbelastung zu untersuchen. Als problematisch hat sich dabei in der Vergangenheit der Umstand erwiesen, dass die oben erwähnten Mykotoxine äußerst heterogen in ihrer Molekülstruktur sind und damit unterschiedlichste Eigenschaften wie z.B. unterschiedliche Lösungseigenschaften besitzen. So sind die hydrophoben Aflatoxine unlöslich in Wasser, während im Gegensatz dazu die Fumonisine und Deoxynivalenol in Wasser löslich sind (Fig. 1). Aflatoxine müssen daher unter Einsatz von Wasser-Methanol oder Wasser-Ethanol-Gemischen aus einer Probe extrahiert werden. Die anderen Mykotoxine wie z.B. T2 und HT2 (Fig. 1) nehmen hinsichtlich ihrer Polarität und Extrahierbarkeit eine Mittelstellung ein, benötigen aber auch Lösungsmittel wie Methanol zur Extraktion.

Stand der Technik

Bisher erfolgte die Extraktion von Mykotoxinen unter Einsatz organischer Lösungsmittel wie Ethanol, Acetonitril oder Methanol. Allerdings fallen dabei große Mengen an organischen Lösungsmitteln an, die anschließend entsorgt werden müssen. Als Alternative dazu wurden Methoden entwickelt, bei denen durch Zusatz spezifischer Substanzen wie Cyclodextrine, proteinhaltige Komponenten (z.B. Rinderserumalbumin) bzw. Lösungsvermittler (z.B. nicht-ionische Tenside wie Triton oder Brij) bestimmte Mykotoxine extrahiert werden können. Solche Verfahren ohne organische Lösungsmittel sind häufig in den letzten Jahren patentiert worden (US 2014/0356978; WO 2015/188205; WO 2016/057044). Allerdings wird bei den Extraktionen ohne organische Lösungsmittel die Extraktion von Ochratoxin entweder nicht beschrieben oder erfordert wegen der im Molekül enthaltenen Carboxylfunktion den Einsatz eines speziellen Puffers (Mishra et al., 2016, Food Add.Contam. 33: 500-508). Eine Extraktionsmethode für alle relevanten Mykotoxine wurde noch nicht beschrieben. Aufgrund der genannten Nachteile sind diese Methoden nicht Mittel der Wahl, um Lebensmittel wie beispielsweise Getreideproben schnell, einfach, umweltschonend und kostengünstig auf die Anwesenheit von verschiedensten Mykotoxinen zu analysieren.

Ziel und Aufgabe der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, verschiedenste Mykotoxine (Abb. 1) möglichst einheitlich mit einem einzigen Extraktionsmittel aus Lebensmitteln und Futtermitteln zu extrahieren.

Daraus leitet sich die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ab, ein Extraktionsverfahren zu entwickeln, mit dem es möglich ist Mykotoxine mit unterschiedlichen Lösungseigenschaften einheitlich zu extrahieren Insbesondere leitet sich daraus die Aufgabe ab, die Mykotoxine Aflatoxin, Deoxynivalenol, Ochratoxin A, Zearalenon, Fumonisin und T2/HT2 aus Getreide (Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Gerste und deren Verwandte aus dem Tribus Triticeae), Futtermittel, Nüssen, Soja, Maisgluten, und Reis aber auch Feigen, Datteln, Rosinen und Pistazien zu extrahieren und anschließend zu quantifizieren. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere mögliche Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen, der Beschreibung und den Beispielen.

Wesen der Erfindung Überraschend wurde gefunden, dass mit Hilfe von wässrigen, gepufferten Naphthyl- und/oder Phenylverbindungen bzw. deren heterozyklische Analoga sowohl hydrophobe als auch hydrophile Mykotoxine extrahiert werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass gepufferte Lösungen von Naphthyl- und/oder Phenylverbindungen und/oder deren heterozyklische Analoga, die wenigstens eine Sulfonsäure- bzw. wenigstens eine Carbonsäuregruppe tragen, mit den Getreiden oder anderen Lebensmitteln oder Futtermitteln in Kontakt gebracht werden, die wässrige Lösung anschließend abgetrennt und der Gehalt der extrahierten Mykotoxine in der wässrigen Lösung bestimmt wird. Erfindungsgemäß werden Naphthyl- oder Phenylverbindungen oder deren heterozyklische Analoga der allgemeinen Formel I einzeln oder als Gemisch eingesetzt, um Mykotoxine verschiedenster Gruppen besonders effektiv zu extrahieren.

Formel I: X

in der X, R1 und R2 folgende Bedeutung haben:

X = Naphthyl- oder Phenylrest oder deren heterozyklische Analoga R1 = wenigstens eine Sulfonsäuregruppe oder wenigstens eine

Carbonsäuregruppe

R2 = unsubstituiert oder eine funktionelle Gruppe ausgewählt aus

Hydroxy-, Alkyl-, Alkoxy-, Amino-, Sulhydryl-, Halogen- und

Thioether, die in o-, m- oder p-Stellung zur Säuregruppe im

Molekül angeordnet sind, wobei α-Aminosäuren ausgeschlossen sind.

Nachfolgend sind Beispiele aufgelistet, die in der Lage sind Mykotoxine

verschiedenster Gruppen zu extrahieren:

1.5- Naphthyldisulfonsäure

2.6- Naphthyldisulfonsäure

4-Hydroxyphenylsulfonsäure

Benzolsulfonsäure,

4-Methylbenzolsulfonsäure,

Benzol-1 ,3-disulfonsäure,

1- Naphthol-3,6-disulfonsäure,

3- Sulfobenzoesäure,

4- Sulfobenzoesäure,

2- Hyd roxy benzoesä u re ,

2,6-Dihydroxybenzoesäure,

2,5-Dihydroxybenzoesäure,

2,4-Dihydroxybenzoesäure,

3,4-Dihydroxybenzoesäure, 3 , 5-D i hyd roxybenzoesäu re .

2-Hydroxy-5-sulfobenzoesäure

Als besonders vorteilhaft stellte sich der alleinige aber auch kombinierte Einsatz von 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure, 2,6-Naphtyldisulfonsäure und/oder p- Hydroxyphenylsulfonsäure heraus.

Der resultierende wässrige Überstand, der die extrahierten Mykotoxine enthält, wird anschließend abgetrennt und für die Analytik eingesetzt. So kann die Bestimmung oder die weitere Reinigung der Mykotoxine beispielsweise mit Hilfe von enzymatischen, enzymimmunologischen, chromatographisch-gestützten und/oder immunoaffinitätschromatographischen Verfahren erfolgen.

Für alle nachfolgend beschriebene Versuche kommen zertifizierte Referenzmaterialien zum Einsatz (Tabelle 1). Für jedes Mykotoxin werden eine Blankprobe und eine kontaminierte Referenzprobe vermessen.

Tabelle 1. Zertifizierte Mykotoxin-Referenzmaterialien zur Überprüfung des Extraktionseffizienz der beanspruchten Verfahren

*nicht detektiert mittels HPLC; siehe Zertifikate der Firma Trilogy für nähere

Erläuterungen wie z.B. Nachweisgrenze der verwendeten Methode

**zum Einsatz kamen Materialien der Firma Trilogy (Washington, MO, USA)

Die Erfindung wird nachfolgend an der Bestimmung von Aflatoxin in Mais näher erläutert. Die Referenz-Extraktionsmethode sieht eine Probeneinwaage von 1 g vor, welche mit 5 ml_ 70% Methanol in Wasser 10 min unter Schütteln extrahiert wird (Tabelle 2). Nach Zentrifugation oder Filtration wird der Überstand 1 :7 mit destilliertem Wasser verdünnt (z.B. 100 μΙ_ Extrakt + 600 μί. Wasser) und in einem handelsüblichen kommerziellen ELISA der Aflatoxingehalt quantifiziert. Zum Einsatz kommt der RIDASCREEN ^® Aflatoxin Total (Art. Nr. 4701 , R-Biopharm AG, Darmstadt, siehe auch Tabelle 2). Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten sind mit Fänger-Antikörpern gegen anti-Aflatoxin- Antikörper beschichtet. Zugegeben werden Kaiibratoren bzw. extrahierte Probenlösung, enzymmarkiertes Aflatoxin (Enzymkonjugat) und anti-Aflatoxin- Antikörper. Freies und enzymmarkiertes Aflatoxin konkurrieren um die Aflatoxin- Antikörperbindungsstellen. Gleichzeitig werden auch die anti-Aflatoxin-Antikörper von den immobilisierten Fänger-Antikörpern gebunden. Nicht gebundenes enzym markiertes Aflatoxin wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe von Substrat-/Chromogenlösung. Gebundenes Enzymkonjugat wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm; die gemessene optische Dichte (OD)der Lösung ist umgekehrt proportional zur Aflatoxin-Konzentration in der Probe.

Tabelle 2. Angewandte Referenzextraktion und eingesetztes ELISA-System zum Vergleich der Extraktionseffizienz der beanspruchten Verfahren

Nachfolgend ist als Beispiel ein bevorzugtes Verfahren für die Extraktion von Aflatoxin aus Mais dargestellt. Dazu wird 1 g homogenisierte Maisprobe mit 5 mL einer Lösung bestehend aus 250 mM 1 ,5-Naphthyldisulfonsäure gepuffert auf pH 8 mit 100 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) versetzt, 10 min geschüttelt und zentrifugiert bzw. filtriert. Der klare Überstand wird 1 :7 mit destilliertem Wasser verdünnt und wie oben bereits beschrieben im ELISA vermessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Dabei ist zu beachten, dass aus Vergleichsbarkeitsgründen die Ergebnisse als „Signalreduktion in %" angegeben werden. Die Signalreduktion ergibt sich aus dem kompetitiven Format des ELISAS als Testsystems. Bewertet werden soll die Extraktionsausbeute im Vergleich zwischen dem neuen, beanspruchten Verfahren und der etablierten Referenzextraktion. Eine hohe Analytkonzentration im Extrakt (bedingt durch eine hohe Extraktionsausbeute) führt zu einer Reduktion des Messsignals (OD _{450 n} m) Die Signalreduktion in [%] berechnet sich wie folgt: Signalreduktion [%] = 100 - (OD _p0 sitive Probe/OD _ne gative Probe 100)

Tabelle 3: Extraktionsausbeute von Aflatoxin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanz 1 ,5-Naphthyldisulfonsäure (in Tris-Puffer pH 8.0) im Vergleich zur Referenzextraktion. Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Aflatoxin Total ermittelt.

Vergleicht man die Werte der Referenzextraktion mit denen der beanspruchten Extraktion, so wird deutlich, dass diese sehr ähnlich sind. Aflatoxin wurde somit erfolgreich aus der Matrix Mais durch das beanspruchte Verfahren quantitativ extrahiert. Geringe Unterschiede in den OD-Werten vor allem der Blankproben können durch Sekundäreffekte der beanspruchten Substanzen im Messsystem ELISA erklärt werden. Durch Wechselwirkungen wird die Kompetition zwischen Aflatoxin aus dem Extrakt (Probe) und Aflatoxin-Enzym-Konjugat um Antikörperbindungsstellen leicht gestört. Dieses ist auch der Grund, warum keine Konzentrationswerte ermittelt worden sind, sondern die Ergebnisse als „Signalreduktion [%]" angegeben werden. Diese würden ein falsches Bild entstehen lassen, weil die Beeinflussung des ELISAS nicht Teil der beanspruchten Extraktion ist. Die ELISA Systeme können entsprechend auf solche Substanzen eingestellt werden, so dass die Richtigkeit des Messsystems gegeben ist.

Unabhängig von dem oben aufgeführten Beispiel ist es aber auch möglich, andere Proben aus dem Lebensmittel- bzw. Futtermittelbereich zu untersuchen wie beispielsweise Weizen, Roggen, Hafer, Gerste und deren Verwandte aus dem Tribus Triticeae, Futtermittel, Nüssen, Soja, Maisgluten und Reis. Ferner sind Feigen, Datteln, Rosinen und Pistazien von Interesse.

Ebenso ist die Extraktion nicht auf die oben genannten Aflatoxine limitiert. So ist es auch möglich, dass Deoxynivalenol, Ochratoxin A, Zearalenon, Fumonisin und T2/HT2 mit dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert werden. Ebenso können andere Toxine wie Ergotalkaloide, Citrinin, und Sterigmatocystin mit dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert werden.

Untersuchungen haben gezeigt, dass die Effektivität des Verfahrens durch ein geeignetes Puffersystem positiv beeinflusst wird. So sollte die wässrige Lösung der Naphthyl- oder Phenylverbindungen oder deren heterozyklische Analoga im Bereich von pH 5 - 10 gepuffert vorliegen. Dabei sind Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)- und „lmidazol"-haltige Puffer im Bereich von pH 7.5 - 8.5 als bevorzugt anzusehen (siehe Beispiel in Tablle 3). Der„lmidazol"-Puffer wurde durch Mischung von Isopropylimidazol und Imidazolhydrochlorid in den entsprechenden Anteilen angesetzt. Andere Puffersysteme wie Phosphat und EPPS (N-(2-Hydroxyethyl)- piperazin-N'-(3-propansulfonsäure) sind ebenfalls möglich, können aber in Abhängigkeit von Konzentration und Mykotoxin abweichende Extraktionsergebnisse aufweisen.

Möglich ist auch ein Extraktionsverfahren, bei dem aromatische Phenyl- oder Naphthylverbindungen verwendet werden, mit wenigstens einer mit Stickstoff substituierten Position.

Das Verfahren weist gegenüber den bisher bekannten Extraktionsverfahren den Vorteil auf, dass alle wichtigen Mykotoxine mit einem umweltschonenden, wässrigen Extraktionsmittel effizient und möglichst vollständig aus relevanten Lebensmittelmatrices extrahiert werden können. Die Analyse mehrerer unterschiedlicher Mykotoxine erfordert nicht mehr, wie in den herkömmlichen Verfahren, separate Probeneinwaagen und individuelle Extraktionsmittel, sondern lediglich eine einmalige Probeneinwaage und eine universelle Extraktion mit dem beanspruchten Verfahren. Dadurch ergeben sich für den Anwender dieses neuen Verfahrens eine signifikante Zeit- und Materialersparnis, die zu einer Kostenreduktion führt sowie die Vermeidung einer Exposition mit gesundheitsgefährdenden Lösungsmitteln aus den Extraktionsmitteln herkömmlicher Verfahren. Die Erfindung wird nachfolgend mit Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1 Tabelle 4: Extraktionsausbeute von Aflatoxin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 250 mM) unter Einsatz verschiedener Puffer (100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Aflatoxin Total ermittelt.

Beispiel 2

Tabelle 5: Extraktionsausbeute von Aflatoxin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 2,6-Naphtyldisulfonsäure (2,6-NDS, 125 mM) unter Einsatz verschiedener Puffer (100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Aflatoxin Total ermittelt.

Beispiel 3

Tabelle 6: Extraktionsausbeute von DON aus Weizen unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 250 mM) unter Einsatz verschiedener Puffer (100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® DON ermittelt.

Beispiel 4

Tabelle 7: Extraktionsausbeute von DON aus Weizen unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 2,6-Naphtyldisulfonsäure (2,6-NDS, 125 mM) unter Einsatz verschiedener Puffer (100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® DON ermittelt.

Beispiel 5 Tabelle 8: Extraktionsausbeute von Ochratoxin A aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 250 mM) unter Einsatz verschiedener Puffer (100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Ochratoxin A 30/15 ermittelt.

Beispiel 6

Tabelle 9: Extraktionsausbeute von Ochratoxin A aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 2,6-Naphtyldisulfonsäure (2,6-NDS, 125 mM) unter Einsatz verschiedener Puffer (100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Ochratoxin A 30/15 ermittelt.

Beispiel 7 Tabelle 10: Extraktionsausbeute von Zearalenon aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 250 mM) oder 2,6- Naphthyldisulfonsäure unter Einsatz verschiedener Puffer (2,6-NDS, 100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD- Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Zearalenon ermittelt.

Beispiel 8

Tabelle 11 : Extraktionsausbeute von Fumonisin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 50 mM) oder 2,6- Naphthyldisulfonsäure unter Einsatz verschiedener Puffer (2,6-NDS, 100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD- Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Fumonisin ermittelt.

Beispiel 9 Tabelle 12: Extraktionsausbeute von T2 und HT2 aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 250 mM) oder 2,6- Naphthyldisulfonsäure unter Einsatz verschiedener Puffer (2,6-NDS, 100 mM) und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD- Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® T2/HT2 ermittelt.

Beispiel 10

Tabelle 13: Extraktionsausbeute von Aflatoxin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 250 mM) oder 2,6- Naphthyldisulfonsäure (2,6-NDS, 100 mM) unter Einsatz verschiedener Pufferstärken und pH-Werte im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Aflatoxin Total ermittelt.

^* (N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-(3-propansulfonsäure )

Beispiel 11

Tabelle 14: Extraktionsausbeute von Aflatoxin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanz 1 ,5-Naphtyldisulfonsäure in verschiedenen Konzentrationen bei pH 8.0 (5 mM Phosphat) im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Aflatoxin Total ermittelt.

Beispiel 12

Tabelle 15: Extraktionsausbeute von Aflatoxin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanz 2,6-Naphtyldisulfonsäure in verschiedenen Konzentrationen bei pH 8.0 (5 mM Phosphat) im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Aflatoxin Total ermittelt.

Beispiel 13

Tabelle 16: Extraktionsausbeute von Deoxynivalenol, Fumonisin und Zearalenon (Matrices siehe Tabelle 1) unter Einsatz der beanspruchten Substanz 4- Hydroxyphenylsulfonsäure (375 mM; 4-OH-PSN) unter Zusatz von 50 mM Phosphat (pH 8.0) im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD- Werte wurde in kommerziell erhältlichen ELISA der RIDASCREEN® Serie ermittelt (siehe Tabelle 2).

*DON, Deoxynivalenol; Fumo, Fumonisin; Zea, Zearalenon Beispiel 14 Tabelle 17: Extraktionsausbeute von Aflatoxin, Ochratoxin und T2/HT2 (Matrices siehe Tabelle 1) unter Einsatz der beanspruchten Substanz 4- Hydroxyphenylsulfonsäure (375 mM; 4-OH-PSN) unter Zusatz von 50 mM Phosphat (pH 8.0) im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD- Werte wurde in kommerziell erhältlichen ELISA der RIDASCREEN® Serie ermittelt (siehe Tabelle 2).

*Afla, Aflatoxin; OTA, Ochratoxin

Beispiel 15 Tabelle 18: Extraktionsausbeute von Aflatoxin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanz 4-Hydroxyphenylsulfonsäure in verschiedenen Konzentrationen bei pH 8.0 (5 mM Phosphat) im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Aflatoxin Total ermittelt.

Beispiel 16

Tabelle 19: Extraktionsausbeute von Ochratoxin aus Mais unter Einsatz der beanspruchten Substanz 4-Hydroxyphenylsulfonsäure in verschiedenen Konzentrationen bei pH 8.0 (5 mM Phosphat) im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Ochratoxin A 30/15 ermittelt.

Beispiel 17

Tabelle 20: Extraktionsausbeute von Ochratoxin aus Mais unter kombiniertem Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphthyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 250 mM) und 4-Hydroxyphenylsulfonsäure (verschiedene Konzentrationen von 10 mM bis 150 mM) bei pH 8.0 (5 mM Phosphat) im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Ochratoxin A 30/15 ermittelt.

250 mM 1,5-NDS

Ref. 150 mM 100 mM 75 mM 50 mM 20 mM 10 mM

ODßlank 1 ,551 1 ,120 1 ,231 1 ,360 1 ,352 1,494 1 ,495

ODpositiv 0,305 0,330 0,375 0,321 0,355 0,422 0,485

Signal80 71 70 76 74 72 68 reduktion [%] Beispiel 18

Tabelle 21 : Extraktionsausbeute von Ochratoxin aus Mais unter kombiniertem Einsatz der beanspruchten Substanzen 1 ,5-Naphthyldisulfonsäure (1 ,5-NDS, 250 mM) und 4-Hydroxyphenylsulfonsäure (4-OH-PSN, 50 mM und 75 mM) bei verschiedenen pH-Werten von 7.5 bis 9.0 im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Ochratoxin A 30/15 ermittelt.

Beispiel 19 Tabelle 22: Extraktionsausbeute von Ochratoxin aus Mais unter kombiniertem Einsatz der beanspruchten Substanzen 2,6-Naphthyldisulfonsäure (125 mM) und 4- Hydroxyphenylsulfonsäure (verschiedene Konzentrationen von 20 mM bis 150 mM) bei pH 8.0 (5 mM Phosphat) im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Ochratoxin A 30/15 ermittelt.

Beispiel 20

Tabelle 23: Extraktionsausbeute von Ochratoxin aus Mais unter kombiniertem Einsatz der beanspruchten Substanzen 2,6-Naphthyldisulfonsäure (2,6-NDS, 125 mM) und 4-Hydroxyphenylsulfonsäure (4-OH-PSN, 50 mM und 75 mM) bei verschiedenen pH-Werten von 7.5 bis 9.0 im Vergleich zur Referenzextraktion (Ref., siehe auch Tabelle 2). Die OD-Werte wurde im kommerziell erhältlichen ELISA RIDASCREEN® Ochratoxin A 30/15 ermittelt.

Legende zu den Figuren

Figur 1 : Liste von in der Lebens- und Futtermittelindustrie relevanten

Mykotoxinen. Neben der Auflistung sind auch deren chemische Strukturformeln und ihre Lösungseigenschaften in wässriger Umgebung dargestellt