ET TAMPONS MIS EN ŒUVRE

DESCRIPTION

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention appartient au domaine de la biologie et, plus particulièrement, au domaine de la biologie moléculaire.

Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé permettant d'extraire et de purifier des acides nucléiques et ce, en vue d'une (ou plusieurs) analyse(s) ultérieure(s) du type amplification ou séquençage. Le procédé selon l'invention réalisé à partir d'un échantillon contenant des acides nucléiques utilise des tampons contenant du glycérol et des particules ou billes, magnétiques ou magnétisables.

La présente invention concerne également les tampons mis en œuvre durant ce procédé et notamment les tampons de lavage et éventuellement de lyse.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE En biologie moléculaire, de nombreux travaux et études sont réalisés sur les acides nucléiques et ce, dans des domaines englobant notamment la recherche académique ; la recherche et les analyses, cliniques et diagnostiques, avec des essais réalisés sur des prélèvements de sang ou des biopsies cellulaires ou tissulaires ; la surveillance environnementale ; la surveillance civile ; la sécurité alimentaire et notamment le contrôle qualité ; les analyses criminelles sur traces... Ces travaux et études nécessitent tous l'extraction et la purification préalables de ces acides nucléiques.

Différents procédés sont connus à l'heure actuelle pour réaliser de telles extraction et purification. La diversité dans ces procédés est la conséquence des différents critères et paramètres dont il faut tenir compte tels que, par exemple, l'acide nucléique cible, le matériel le contenant, l'organisme source de ce matériel et l'utilisation ultérieure de cet acide nucléique cible. Toutefois, la plupart des procédés présentent une séquence d'étapes consistant à (i) lyser le matériel contenant le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s), (ii) éliminer les composés contaminants notamment du type protéique, présents dans l'extrait obtenu suite à l'étape (i) et (iii) récupérer le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s).

L'étape de lyse des procédés de l'art antérieur doit permettre d'extraire les acides nucléiques du matériel les contenant tout en préservant leur intégrité. En d'autres termes, l'étape de lyse doit être suffisamment douce pour préserver les acides nucléiques tout en inhibant ou désactivant les enzymes qui détruisent ces acides nucléiques i.e. les nucléases. Lors de cette étape, la lyse peut être mécanique, chimique et/ou enzymatique.

Les étapes (ii) et (iii) correspondent, à proprement parler, à la purification des acides nucléiques. Ces étapes peuvent mettre en œuvre une ou plusieurs techniques choisies parmi

- une extraction par solvants telle qu'une extraction par phénol- chloroforme ;

- une précipitation telle qu'une précipitation alcoolique ou une précipitation avec de fortes concentrations salines ;

- une technique chromatographique telle qu'une filtration sur gel, une chromatographie par échange d'ions, une chromatographie par adsorption ou une chromatographie par affinité et

- une centrifugation ou une ultracentrifugation telle qu'une centrifugation sur chlorure de césium.

Certaines des techniques présentées ci-dessus mettent en œuvre des réactifs dont la manipulation nécessite des précautions comme le phénol. Elles peuvent avoir recours à un appareillage lourd tel qu'une ultracentrifugeuse ou à de nombreuses étapes rendant le processus d'extraction et de purification long. Ces différents inconvénients rendent difficile une automatisation des procédés d'extraction et de purification utilisant de telles techniques.

Dans les techniques développées sur la base de la chromatographie d'adsorption ou d'affinité, certaines mettent en œuvre des billes magnétiques ou paramagnétiques qui présentent la capacité d'adsorber spécifiquement des acides nucléiques. Cette adsorption spécifique est liée à la charge des billes telles que des billes chargées positivement ou négativement ou à la présence, au niveau de la surface des billes, de groupements auxquels se lient les acides nucléiques tels que des anticorps anti- ADN ou des oligonucléotides tels que des oligonucléotides poly(Thymine) (ou oligo(dT)).

Ainsi, le brevet US 6 855 499 au nom de Cortex Biochem Inc. vise à fournir un procédé simple pour isoler et purifier les acides nucléiques tels que ADN (pour « Acide DésoxyriboNucléique »), ARN (pour « Acide RiboNucléique »)ou ANP (pour « Acide Nucléique Peptidique ») à partir d'échantillons divers comme du sang, du lait, du fluide séminal, un tissu ou des lysats cellulaires bactériens et ce, sans centrifugation, sans alcool et sans préparation préliminaire des tampons. La solution technique proposée dans ce brevet consiste à utiliser des particules de cellulose qui se présentent sous forme de particules magnétiques ou paramagnétiques, enrobées par de la cellulose ou un de ses dérivés. En ajustant la concentration en sels et en polyalkylène glycol dans une solution contenant des acides nucléiques et les particules de cellulose, il est possible d'obtenir la fixation des acides nucléiques sur ces particules. Plus particulièrement, le tampon de liaison décrit est constitué de polyéthylène glycol de masse molaire 8000 g/mol (ou PEG 8000) à 10% et 1,25 M de NaCI. De même, le tampon de lavage mis en œuvre est également constitué de PEG 8000 à 10% et de NaCI mais à 2,5 M. Le kit PROMEGA MagaZorb DNA mini prep est basé sur le protocole décrit dans le brevet US 6 855 499.

L'état de la technique connaît d'autres kits commerciaux utilisant des billes magnétiques dans des protocoles d'extraction et de purification des acides nucléiques. Par exemple, le Kit Silane Genomic DNA de Life Technologies (Ref 370-12D) est proposé pour la préparation d'acides nucléiques à partir d'échantillons sanguins. Dans ce kit, de l'alcool du type éthanol ou isopropanol est utilisé, ce qui nécessite de préparer les tampons de capture et de de lavages en y ajoutant un alcool avant de commencer l'extraction. En plus de l'utilisation d'éthanol, ce protocole présente d'autres inconvénients que sont des temps d'incubation supérieurs à 3 min et 4 étapes de lavages du culot ADN-billes magnétiques. Les inventeurs se sont rendu compte que les kits commerciaux présentent des rendements d'extraction et de purification bien moins bons lorsqu'ils sont mis en œuvre avec d'autres billes magnétiques que celles du kit (voir, à cet effet, l'exemple 5 de la partie expérimentale ci-après). Aussi, les inventeurs se sont fixé pour but de proposer un procédé simple en termes d'étapes, de protocoles préparatoires et de réactifs, pour extraire et purifier des acides nucléiques, ledit procédé impliquant une étape de chromatographie d'adsorption ou d'affinité pouvant utiliser n'importe quelles billes ou particules, magnétiques ou paramagnétiques.

EXPOSÉ DE L'INVENTION

Les inventeurs ont résolu ce problème technique et trouvé une solution aux inconvénients des procédés de l'art antérieur en proposant un procédé complet permettant d'extraire et de purifier des acides nucléiques à partir de divers échantillons en mettant en œuvre des tampons de lyse et de lavage contenant du glycérol et ce, en utilisant des particules magnétisables de différentes origines.

Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé pour extraire et purifier au moins un acide nucléique cible contenu dans un échantillon, comprenant les étapes successives consistant à :

a) mettre en contact l'échantillon avec un tampon de lyse moyennant quoi un lysat cellulaire est obtenu ;

b) mettre en contact le lysat cellulaire obtenu après l'étape (a) avec des particules magnétisables, dans des conditions permettant la capture dudit au moins un acide nucléique cible par lesdites particules ;

c) laver lesdites particules magnétisables obtenues suite à l'étape (b) avec un tampon de lavage contenant, de préférence, du glycérol ; et

d) mettre en contact lesdites particules lavées obtenues après l'étape (c) avec un tampon d'élution, dans des conditions permettant la libération dudit acide nucléique cible dans le tampon d'élution. Par « acide nucléique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal ; un ARN de transfert ; un ANP ; une portion ou un fragment de ceux-ci. L'expression « acide nucléique » utilisée dans la présente invention est équivalente aux termes et expressions suivants : « molécule nucléotidique », « polynucléotide », « séquence nucléotidique » et « séquence polynucléotidique ». De plus, dans la présente invention, l'expression « acide(s) nucléique(s) cible(s) » désigne le (ou les) acide(s) nucléique(s) que l'on souhaite extraire et purifier par mise en œuvre du procédé revendiqué.

Il est évident que l'échantillon mis en œuvre dans le cadre du procédé selon la présente invention peut être de nature et de source très variées. De façon générale, il s'agit de tout échantillon pour lequel on souhaite extraire et purifier les ou des acides nucléiques qu'il contient ou par lequel il est contaminé.

Avantageusement, cet échantillon peut être un fluide biologique ; un fluide végétal tel que sève, nectar et exsudât racinaire ; un prélèvement dans un milieu de culture ou dans un réacteur de culture biologique comme une culture cellulaire d'eucaryotes supérieurs, de levures, de champignons, de bactéries, de virus ou d'algues ; un liquide obtenu à partir d'un tissu animal ou végétal ; un tissu animal ou végétal ; une ou plusieurs cellules ; un culot cellulaire ; un prélèvement dans une matrice alimentaire, de préférence dilué dans un tampon ; un prélèvement dans un réacteur chimique ; un prélèvement dans une station d'épuration ; un prélèvement dans une station de compostage ; de l'eau de ville, de rivière, d'étang, de lac, de mer, de piscines, de tours aéro-réfrigérées ou d'origine souterraine; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide ; de l'eau usée provenant notamment d'élevages intensifs ou d'industries du domaine chimique, pharmaceutique ou cosmétique ; un prélèvement provenant d'une filtration d'air ou d'un revêtement ; un prélèvement sur un objet tel qu'un fragment de tissu, un habit, une semelle, une chaussure, un outil, une arme, etc. ; un produit pharmaceutique ; un produit cosmétique ; un parfum ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par « prélèvement » tout type de collecte d'échantillons, par exemple, par contact, raclage, forage, découpage, poinçonnage, broyage, lavage, rinçage, aspiration, pompage, etc ...

Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, la salive, le crachat, les larmes, la sueur, le sperme, l'urine, les selles, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito- urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal, par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, un prélèvement ou un lavage. Les étapes de récupération et d'isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention.

L'échantillon mis en œuvre dans le cadre de la présente invention peut contenir, de par sa nature ou éventuellement suite à une contamination, une (ou plusieurs) cellule(s) (identiques ou différentes). Par « cellule », on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien une cellule de type procaryote que de type eucaryote. Parmi les cellules eucaryotes, la cellule peut être une levure telle qu'une levure du genre Saccharomyces ou Candida, une cellule végétale ou une cellule animale telle qu'une cellule de mammifères ou d'insectes. Les cellules de type procaryote sont des bactéries qui peuvent être de type gram positif ou des Gram -. Parmi ces bactéries, on peut citer, à titre d'exemples et de façon non-exhaustive, les bactéries appartenant aux embranchements des spirochètes et des chlamydiae, les bactéries appartenant aux familles des entérobactéries (telles que Escherichia coli), des streptococcacées (telles que Streptococcus et, en particulier, Streptococcus pneumoniae), des microccacées (telles que Staphylococcus), des légionelles, des mycobactéries, des bacillacées et autres. De même, si un des prélèvements envisagés ne permet pas de le soumettre à un procédé selon la présente invention, par exemple du fait de sa nature notamment solide, de sa concentration ou des éléments qu'il contient tels que résidus solides, déchets, suspension ou molécules interfé rentes, cette mise en œuvre et notamment le procédé d'extraction et de purification tel que défini ci-après comprend en outre une étape préalable de préparation de l'échantillon avec éventuellement une mise en solution du prélèvement par les techniques connues de l'homme du métier telles que filtration, précipitation, dilution, distillation, mélange, concentration, etc. L'étape (a) du procédé selon la présente invention consiste, comme dans les procédés connus d'extraction et de purification d'acides nucléiques, à extraire les acides nucléiques de l'échantillon les contenant tout en préservant leur intégrité et ce, notamment en inhibant ou désactivant les enzymes lysant les acides nucléiques cibles.

Dans le cadre de la présente invention, la lyse lors de l'étape (a) est une étape de lyse chimique et enzymatique. Tout tampon de lyse pour une lyse chimique et enzymatique connu de l'homme du métier est utilisable dans le cadre de la présente invention. Avantageusement, le tampon de lyse mis en œuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention contient du glycérol.

Plus particulièrement, le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est un tampon contenant du glycérol, au moins un tensioactif et au moins un agent chaotropique.

Le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contient avantageusement du glycérol en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 20%, en particulier entre 7 et 15% et, plus particulièrement, de l'ordre de 10% (i.e. 10% ± 2%) en masse par rapport à la masse totale du tampon de lyse (i.e. pourcentage massique). On estime que la présence de glycérol dans le tampon de lyse n'est pas nécessaire, mais avantageuse, car cela augmente le rendement total du protocole.

Le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contient au moins un tensioactif, ce dernier participant à la lyse chimique. Par « tensioactif », on entend une molécule comportant une partie lipophile (apolaire) et une partie hydrophile (polaire). Tout tensioactif apte à solubiliser les membranes cellulaires et les lipides membranaires est utilisable dans le cadre de la présente invention.

Avantageusement, ce tensioactif est choisi parmi les tensioactifs anioniques, les tensioactifs cationiques, les tensioactifs zwittérioniques, les tensioactifs amphotères et les tensioactifs non-ioniques. Le tampon de lyse selon l'invention peut comprendre plusieurs tensioactifs appartenant à une même famille de tensioactifs précédemment listée (i.e. anionique, cationique, zwittérionique, amphotère ou non ionique) ou plusieurs tensioactifs appartenant à au moins deux familles distinctes de tensioactifs.

Pour rappel, les tensioactifs anioniques sont des tensioactifs dont la partie hydrophile est chargée négativement tels que les alkyle ou aryle sulfonates, sulfates, phosphates, sulfosuccinates ou sarcosinates associés à un contre ion comme un ion ammonium (NH ₄ ⁺ ), un ammonium quaternaire tel que tétrabutylammonium, et les cations alcalins tels que Na ⁺ , Li ⁺ et K ⁺ . A titre de tensioactifs anioniques, il est, par exemple, possible d'utiliser le paratoluènesulfonate de tetraéthylammonium, le dodécylsulfate de sodium (ou SDS), le laurylsarcosinate de sodium (ou sarcosyl), le palmitate de sodium, le stéarate de sodium, le myristate de sodium, le di(2-éthylhexyl) sulfosuccinate de sodium, le méthylbenzène sulfonate et l'éthylbenzène sulfonate.

Les tensioactifs cationiques sont des tensioactifs dont la partie hydrophile est chargée positivement, notamment choisis parmi les ammoniums quaternaires comportant au moins une chaîne aliphatique en C ₄ -C ₂₂ associés à un contre ion anionique choisi notamment parmi les dérivés du bore tels que le tétrafluoroborate ou les ions halogénures tels que F ^" , Br ^" , Γ ou Cl ^" . A titre de tensioactifs cationiques, il est, par exemple, possible d'employer le chlorure tétrabutyl-ammonium, le chlorure tetradécyl-ammonium, le bromure de tetradécyl-triméthyl-ammonium (TTAB), le bromure de cétyl-triméthyl-ammonium (CTAB), le bromure d'octadecyl-triméthyl- ammonium, le bromure de hexadecyl-triméthyl-ammonium, les halogénures d'alkylpyridinium portant une chaîne aliphatique et les halogénures d'alkylammonium. Les tensioactifs zwittérioniques sont des composés neutres possédant des charges électriques formelles d'une unité et de signe opposés, notamment choisis parmi les composés présentant une chaîne alkyle en C ₅ -C ₂₀ substituée généralement par une fonction chargée négativement comme un sulfate ou un carboxylate et une fonction chargée positivement comme un ammonium. A titre de tensioactifs zwittérioniques, on peut citer le N,N diméthyl-dodécyl-ammoniumbutanate de sodium, le diméthyl-dodécyl- ammonium propanate de sodium et les acides aminés.

Les tensioactifs amphotères sont des composés se comportant à la fois comme un acide ou comme une base selon le milieu dans lequel ils sont placés. A titre de tensioactifs amphotères, il est possible d'utiliser le lauroamphodiacétate de disodium et les bétaïnes comme l'alkylamidopropylbétaïne ou la laurylhydroxysulfobétaïne.

Les tensioactifs non ioniques, également connus sous le nom de tensioactifs neutres, sont des tensioactifs qui ne présentent aucun groupe apte à être ionisé dans l'eau à un pH neutre ou proche de la neutralité. De tels tensioactifs sont cependant amphipathiques puisque contenant des entités lipophiles et des entités hydrophiles. Les propriétés tensioactives des tensioactifs non ioniques, notamment l'hydrophilie, sont apportées par des groupements fonctionnels non chargés tels qu'un alcool, un éther, un ester ou encore un amide, contenant des hétéroatomes tels qu'un atome d'azote ou un atome d'oxygène. En raison de la faible contribution hydrophile de ces fonctions, les composés tensioactifs non ioniques sont le plus souvent polyfonctionnels. Tout tensioactif non ionique connu de l'homme du métier est utilisable dans le cadre de la présente invention. A titre de tensioactifs non ioniques, il est possible d'utiliser dans le cadre de la présente invention les alcoxylates d'alkyles, d'alcools gras, d'amines grasses, d'acides gras, d'oxoalcools ou d'alkylphénols ; les éthoxylates d'alkyles, d'alcools gras, d'amines grasses, d'acides gras, d'oxoalcools ou d'alkylphénols ; les monoesters (monolaurate, monomyristate, monostéarate, monopalmitate, monooléate, etc), phospholipides et polyesters d'acides gras et du glycérol ; les amides gras polyglycérolés comportant en moyenne de 1 à 5 ; les esters d'acide gras du sorbitan oxyéthylénés comportant de 2 à 30 moles d'oxyde d'éthylène ; les monoesters (monolaurate, monomyristate, monostéarate, monopalmitate, monooléate, etc) et polyesters d'acides gras et du sorbitane, les monoesters de polyoxyéthylène sorbitane ; les polyols (tensioactifs dérivés de sucres) en particulier les alkylates de glucose ; les tensioactifs dérivant de glucoside (laurate de sorbitol) ou de polyols ; les alcanolamides et leurs mélanges.

Dans le cadre de la présente invention, le (ou les) tensioactif(s) mis en œuvre lors de l'étape (a) sont avantageusement choisi(s) parmi les tensioactifs non ioniques et les tensioactifs anioniques et leurs mélanges. Parmi les tensioactifs non ioniques mis en œuvre lors de l'étape (a), ces derniers sont avantageusement choisi(s) parmi les éthers polyéthoxylés, les monoesters de polyoxyéthylène sorbitane et leurs mélanges.

Plus particulièrement, le (ou les) tensioactif(s) mis en œuvre lors de l'étape (a) sont choisis dans le groupe constitué par le polyéthylène glycol tert- octylphényl éther (ou Triton X-100 ^® ), le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane 20 (ou Tween 20 ^® ), le dodécylsulfate de sodium (ou SDS), le laurylsarcosinate de sodium (ou sarcosyl) et leurs mélanges. Dans une forme de mise en œuvre toute particulière, le tampon de lyse mis en œuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention comprend un mélange de SDS et de Tween 20 ^® et avantageusement un mélange de SDS à 1% massique et Tween 20 ^® à 20% massique par rapport à la masse totale du tampon de lyse.

Le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contient au moins un agent chaotropique, ce dernier participant également à la lyse chimique. Par « agent chaotropique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un sel qui modifie la solubilité des protéines et peut provoquer leur précipitation. Certains des agents chaotropiques utilisables dans le tampon de lyse de l'invention peuvent, de plus, affecter la structure tridimensionnelle des protéines et les dénaturer. Tout agent chaotropique connu de l'homme du métier est utilisable dans le cadre de la présente invention.

Avantageusement, l'agent chaotropique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de sodium (NaCI), le sulfate d'ammonium ((NH ₄ ) ₂ S0 ₄ ), le perchlorate de sodium (NaCI0 ₄ ), l'iodure de sodium (Nal), le chlorure de lithium (LiCI), le perchlorate de lithium (LiCI0 ₄ ), le chlorure de baryum (BaCI ₂ ), le chlorure de césium (CsCI ₂ ), le chlorure de potassium (KCI), l'iodure de potassium (Kl), de l'urée (CO(NH ₂ ) ₂ ), un sel de guanidine tel que le thiocyanate de guanidine (GuSCN) et leurs mélanges.

Plus particulièrement, l'agent chaotropique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est un mélange de chlorure de sodium et de thiocyanate de guanidine. Typiquement, dans le tampon de lyse selon l'invention, le chlorure de sodium est à une concentration supérieure ou égale à 0,5 M et notamment de l'ordre de 1 M (i.e. 1 M ± 0,2 M) et le thiocyanate de guanidine est à une concentration comprise entre 0,5 et 1 M et notamment de l'ordre de 0,85 M (i.e. 0,85 M ± 0,1 M).

Le tampon de lyse mis en œuvre dans le cadre de l'étape (a) du procédé selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un élément apte à inhiber les DNAses et RNAses et/ou au moins un élément apte à détruire les ponts disulfure dans les protéines ou à empêcher leur reformation. A cet effet, ledit tampon de lyse peut en outre comprendre au moins un élément choisi parmi un thiol ; un agent réducteur tel que du β-mercapto-éthanol ou du dithiothreitol (DTT) ; de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) et un citrate. De même, si certains des acides nucléiques contenus dans l'échantillon ne sont pas des acides nucléiques cibles et, de fait, doivent être éliminés comme, par exemple, l'ADN ou l'ARN, il est possible d'ajouter, au tampon de lyse, des composés permettant la lyse, chimique ou enzymatique, de l'ADN ou de l'ARN. Parmi ces composés, on peut citer l'hydroxyde de sodium (NaOH), une RNAse et une DNAse.

Lors de l'étape (a) du procédé selon la présente invention, la quantité de tampon de lyse utilisé est telle que le rapport (v/v) échantillon/tampon de lyse est compris entre 1/3 et 3, notamment entre 1/2 et 2 et, en particulier, ce rapport est égal à 1.

Comme l'étape (a) du procédé selon la présente invention est une lyse non seulement chimique mais aussi enzymatique, il est nécessaire d'ajouter au mélange constitué par l'échantillon et le tampon de lyse, une protéase et avantageusement au moins une endoprotéase et ce, pour réaliser la digestion enzymatique (ou protéolyse enzymatique) des protéines de l'échantillon et conduire à la formation de fragments peptidiques plus ou moins courts à partir des protéines contenues dans l'échantillon. L'homme du métier connaît différentes protéases, spécifiques ou non, et notamment différentes endoprotéases, spécifiques ou non, utilisables lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention.

Avantageusement, la (ou les) protéase(s) mise(s) en œuvre lors de l'étape (a) du procédé est(sont) choisie(s) dans le groupe constitué par la protéinase K, la subtilisine, la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, la thrombine, la thermolysine, la protéase du VIH, l'élastase, le facteur Xa, une endopeptidase à thiol telle que la capaïne ou une caspase, une endopeptidase spécifique de la lysine (endoLysN), une endopeptidase spécifique de l'arginine (endoArgC) et une endopeptidase spécifique de l'acide glutamique (endoGluC). La protéase plus particulièrement mise en œuvre lors de l'étape (a) du procédé est une endoprotéase non spécifique et avantageusement la protéinase K. Plus particulièrement encore, cette protéinase K est utilisée à une concentration comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, notamment entre 0,4 et 2 mg/ml et en particulier entre 0,7 et 1,5 mg/ml de solution mise en œuvre lors de l'étape (a). Par « solution mise en œuvre lors de l'étape (a) », on entend la solution formée à partir de l'échantillon, du tampon de lyse et de la protéinase K.

La solution mise en œuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention est homogénéisée manuellement ou par vortex et maintenue à une température comprise entre 40 et 65°C, notamment entre 50 et 60°C et, en particulier, de l'ordre de 56°C (i.e. 56°C ± 3°C) pendant une durée comprise entre 2 et 30 min, notamment entre 5 et 20 min et, en particulier, de l'ordre de 10 min (i.e. 10 min ± 3 min). De cette façon et par action des différents éléments ajoutés à l'échantillon, un lysat cellulaire contenant le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) est obtenu suite à l'étape (a) du procédé selon la présente invention.

L'étape (b) consiste à mettre en contact le lysat cellulaire obtenu lors de l'étape (a) avec des particules magnétisables aptes à capturer, de façon réversible, par adsorption ou via des interactions spécifiques, des acides nucléiques. Par « particules magnétisables », on entend des particules ne présentant des propriétés magnétiques que lorsqu'elles sont soumises à un champ magnétique. Toutes particules magnétisables connues de l'homme du métier sont utilisables dans le cadre de la présente invention.

Les particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont sensiblement sphériques et leur diamètre moyen est avantageusement compris entre 0,5 et 100 μιη et notamment entre 1 et 50 μιη. A noter que, dans le cadre de la présente invention, les expressions « particule magnétisable », « particule (para)magnétique », « bille magnétisable » et « bille (para)magnétique » sont équivalentes et utilisables de manière interchangeables.

Les particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention comprennent des grains (ou nanoparticules) magnétiques et une matrice organique ou minérale. En fonction du procédé utilisé pour préparer ces nanoparticules magnétisables, il est possible d'obtenir différentes structures telles que (i') des nanoparticules de type cœur/coquille avec le cœur comprenant les grains magnétiques et la coquille formée par la matrice organique ou minérale ou (ϋ') des nanoparticules dans lesquelles les grains magnétiques sont uniformément répartis dans la matrice organique ou minérale.

Avantageusement, les grains (ou nanoparticules) magnétiques sont en au moins un matériau choisi dans le groupe constitué par les oxydes métallique de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse ou de nickel ; la magnétite ; la maghémite ; l'hématite ; les ferrites de manganèse, de nickel ou de manganèse-zinc et les alliages de cobalt-nickel.

La matrice organique des particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention est en un polymère organique naturel ou synthétique et, à titre d'exemple, choisi dans le groupe constitué par l'albumine ; la cellulose et ses dérivés notamment tels que définis dans le brevet US 6 855 499 ; les polyacrylates tels que le poly(acide acrylique) et le poly(méthacrylate d'hydroxyéthyle) ; l'alcool polyvinylique et le polystyrène. En variante, lorsque les particules magnétisables mises en œuvre dans l'invention présentent une matrice minérale, cette dernière se présente avantageusement sous forme de gel de silice.

Dans une l ^ere forme de mise en œuvre, les particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention peuvent capturer les acides nucléiques au niveau de leur surface par adsorption. Dans ce cas, cette capture fait intervenir des interactions de Van der Waals, des interactions électrostatiques, des liaisons hydrogène ou des interactions hydrophobes. Avantageusement, l'adsorption des acides nucléiques sur les particules magnétisables se fait au moyen d'interactions électrostatiques et de liaisons hydrogène. A cet effet, les particules magnétisables présentent, au niveau de leur surface, des groupements participant à de telles interactions ou liaisons, tels que des groupements cationiques ou anioniques. Ces groupements sont portés, de façon intrinsèque ou par fonctionnalisation, par la matrice des particules.

Dans une 2 ^nde forme de mise en œuvre, les particules magnétisables mises en œuvre dans le cadre de la présente invention peuvent capturer les acides nucléiques à leur surface par des interactions spécifiques. Cette forme de mise en œuvre nécessite la fonctionnalisation, covalente ou non, de la surface des particules par un élément apte à capturer les acides nucléiques cibles comme, par exemple, par hybridation. Un tel élément est avantageusement choisi dans le groupe constitué par un oligonucléotide complémentaire d'une séquence spécifique présente dans les acides nucléiques cibles, un oligonucléotide poly(thymine), de la streptavidine, de la biotine ou un anticorps anti-ADN.

L'homme du métier connaît différents procédés pour préparer des particules magnétisables éventuellement fonctionnalisées telles que précédemment définies. En variante, lors de l'étape (b) du procédé selon l'invention, des particules magnétisables commerciales peuvent être utilisées. A titre d'exemples illustratifs et non- limitatifs de telles particules, on peut citer les billes Silanol (CHEMICELL), les billes MagPrep ^® HS (Merck SAS Estapor), les billes Dynabeads ^® MyOne™ (Life Technologies), les billes Dynabeads ^® Streptavidine (Life Technologies) et les billes MagaZorb ^® (PROMEGA). Le rapport entre le volume d'échantillon lors de l'étape (a) et le volume de particules magnétisables mises en œuvre lors de l'étape (b) est compris entre 1 et 50, notamment entre 5 et 25 et, en particulier, de l'ordre de 10 (i.e. 10 ± 2).

La mise en contact lors de ladite étape (b) se fait en présence d'un tampon de capture et ce, pour favoriser la liaison réversible entre les acides nucléiques cibles contenus dans le lysat cellulaire et les particules magnétisables. Avantageusement, un tel tampon de capture comprend au moins un solvant choisi dans le groupe constitué par le 1,2-butanediol ; le 1,2-propanediol ; le 1,3-butanediol ; l'acétate de l-méthoxy-2- propanol ; le 3-méthyl-l,3,5-pentanetriol ; un ester dibasique tel que du DBE-2, du DBE-3, du DBE-4, du DBE-5 ou du DBE-6 ; l'éther monoéthylique du diéthylène glycol (DGME) ; l'acétate d'éther monoéthylique du diéthylène glycol (DGMEA) ; le lactate d'éthyle ; l'éthylène glycol ; le poly(2-éthyl-2-oxazoline) ; un sel de sodium d'un copolymère d'acide 4-styrène sulfonique et d'acide maléique ; le tetraéthylène glycol (TEG) ; le tetraglycol ; le tetrahydrofurfuryl polyéthylène glycol 200 ; l'éther divinylique de triéthylène glycol ; le triéthylène glycol anhydre et l'éther monoéthylique du triéthylène glycol.

Avantageusement, le tampon de capture mis en œuvre lors de ladite étape (b) du procédé selon l'invention comprend au moins deux solvants tels que précédemment définis. En particulier, le tampon de capture mis en œuvre lors de ladite étape (b) du procédé selon l'invention est un mélange de deux solvants tels que précédemment définis. Plus particulièrement, le tampon de capture mis en œuvre lors de ladite étape (b) du procédé selon l'invention est un mélange de TEG et de 1,2-butanediol et, typiquement, un mélange à 60% (v/v) de TEG et à 40% (v/v) de 1,2-butanediol.

Le mélange mis en œuvre lors de l'étape (b) du procédé selon l'invention contenant le lysat cellulaire, les particules magnétisables et le tampon de capture tels que précédemment définis est homogénéisé manuellement ou par vortex et maintenu à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) et ce, pendant une durée comprise entre 2 et 30°min, notamment entre 5 et 20 min et, en particulier, de l'ordre de 10 min (i.e. 10 min ± 3 min). Suite à l'étape (b) du procédé selon l'invention, les particules magnétisables ont capturé le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s). L'étape (c) du procédé selon la présente invention consiste à séparer les particules magnétisables qui ont capturé les acides nucléiques cibles du milieu contenant lesdites particules en fin d'étape (b) et, en particulier, des autres éléments non capturés par les particules magnétisables (i.e. non liés à ces dernières) présents dans ce milieu. Ce dernier est formé à partir de l'échantillon, du tampon de lyse, de la protéinase K et du tampon de capture.

Avantageusement, l'étape (c) du procédé selon la présente invention consiste à (ci) soumettre les particules magnétisables ayant capturé le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) à un champ magnétique, (c ₂ ) éliminer la phase liquide i.e. le milieu entourant lesdites particules magnétisables, (c ₃ ) ajouter un tampon de lavage et (c ₄ ) remettre en suspension lesdites particules magnétisables dans ledit tampon de lavage en supprimant le champ magnétique, lesdites étapes (c ₃ ) et (c ₄ ) pouvant être réalisées l'une après l'autre ou simultanément.

Les étapes (ci) à (c ₄ ) sont des étapes classiques dans les différents domaines utilisant des particules magnétisables. Le champ magnétique (ou force magnétique) peut être appliqué(e), lors de l'étape (ci), au moyen d'un aimant ou d'un banc magnétique. Toute technique visant à éliminer un liquide est utilisable dans le cadre de l'étape (c ₂ ). A titre d'exemples, cette élimination peut être réalisée par renversement, par tapotement, par absorption ou par aspiration.

L'étape (c) du procédé selon la présente invention et les étapes (ci) à (c ₄ ) peuvent être répétées au moins une fois. Lors de ces répétitions, le tampon de lavage mis en œuvre lors de l'étape (c) ou (c ₃ ) peut être identique ou différent au tampon de lavage mis en œuvre lors de l'étape (c) ou (c ₃ ) précédente.

Cependant, tout tampon de lavage mis en œuvre à l'une quelconque des étapes (c) ou (c ₃ ) contient du glycérol, un tensioactif et éventuellement un agent chaotropique tel que précédemment défini.

Le (ou les) tampon(s) de lavage mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contien(nen)t du glycérol en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 30% et, en particulier, entre 7 et 25% en masse par rapport à la masse totale du tampon de lavage.

Le (ou les) tampon(s) de lavage mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contien(nen)t un tensioactif, en particulier un tensioactif de la famille des éthylènes glycols, par exemple un tétraéthylène glycol (TEG) ou un polyalkylène glycol. Tout polyalkylène glycol est utilisable dans le cadre de la présente invention. Toutefois, un tel polyalkylène glycol est notamment du polyéthylène glycol ou du polypropylène glycol et, en particulier, du polyéthylène glycol (PEG). Le polyéthylène glycol dans le (ou les) tampon(s) de lavage présente une masse molaire supérieure à 1000 g/mol, notamment supérieure à 2000 g/mol, en particulier, comprise entre 4000 et 10000 g/mol et, plus particulièrement, comprise entre 6000 et 8000 g/mol. Le (ou les) tampon(s) de lavage mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contien(nen)t un tensioactif de la famille des éthylènes glycols et notamment du tétraéthylène glycol ou du polyéthylène glycol en une quantité comprise entre 1 et 40%, notamment entre 5 et 30% et, en particulier, entre 7 et 25% en masse par rapport à la masse totale du tampon de lavage.

Le solvant du (ou des) tampon(s) de lavage est typiquement choisi parmi du Tris à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris base à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris/HCI à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, de la triéthanolamine à une concentration comprise entre 5 et 50 mM ou un de leurs mélanges. Le pH du tampon de lavage est avantageusement de l'ordre de 8 (i.e. 8 ± 0,5).

Le rapport entre le volume de tampon de lavage mis en œuvre lors de chaque étape (c) et le volume de particules magnétisables mises en œuvre lors de l'étape (b) est compris entre 10 et 200, notamment entre 25 et 100 et, en particulier, de l'ordre de 50 (i.e. 50 ± 5).

L'étape (c) du procédé selon la présente invention et notamment les étapes (ci) et (c ₄ ) sont réalisées à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C). Dans une forme de mise en œuvre particulière, l'étape de lavage est répétée deux fois. Le tampon de lavage utilisé lors de la l ^ere étape de lavage comprend du glycérol, un tensioactif comme un tensioactif de la famille des éthylènes glycols et un agent chaotropique tels que précédemment définis et notamment du glycérol, du PEG et un agent chaotropique ou du glycérol, du TEG et un agent chaotropique tels que précédemment définis, alors que le tampon de lavage utilisé lors de la 2 ^nde étape de lavage comprend du glycérol et un tensioactif comme un tensioactif de la famille des éthylènes glycols tels que précédemment définis et notamment du glycérol et du PEG ou du glycérol et du TEG tels que précédemment définis. Dans la partie expérimentale ci- après, des exemples particuliers de tels tampons de lavage sont donnés.

L'étape (d) du procédé selon la présente invention consiste à remettre en solution le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) en décrochant, au moyen d'un tampon d'élution, le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) des particules magnétisables. Lors de ce décrochage, les liaisons non covalentes et de faible stabilité entre le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) et les particules magnétisables sont rompues par l'action du tampon d'élution, éventuellement combinée aux conditions opératoires de l'étape (d) telles qu'un chauffage.

Avantageusement, l'étape (d) du procédé selon la présente invention consiste à (di) soumettre les particules magnétisables à un champ magnétique, (d ₂ ) éliminer le tampon de lavage, (d ₃ ) ajouter un tampon d'élution et (d ₄ ) remettre en suspension lesdites particules magnétisables dans ledit tampon d'élution en supprimant le champ magnétique, lesdites étapes (d ₃ ) et (d ₄ ) pouvant être réalisées l'une après l'autre ou simultanément.

Les étapes (di) à (d ₄ ) sont également des étapes classiques dans les différents domaines utilisant des particules magnétisables. Le champ magnétique (ou force magnétique) peut être appliqué(e), lors de l'étape (di), au moyen d'un aimant ou d'un banc magnétique. Toute technique visant à éliminer un liquide est utilisable dans le cadre de l'étape (d ₂ ). A titre d'exemples, cette élimination peut être réalisée par renversement, par tapotement, par absorption ou par aspiration. Le tampon d'élution mis en œuvre lors de l'étape (d) ou (d ₃ ) peut être tout tampon d'élution connu de l'homme du métier et adapté au type de capture mis en œuvre lors de l'étape (b) préalable i.e. adsorption ou interactions spécifiques. A titre d'exemple d'un tel tampon d'élution, on peut citer un tampon choisi parmi du Tris à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris base à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, du Tris/HCI à une concentration comprise entre 5 et 50 mM, de la triéthanolamine à une concentration comprise entre 5 et 50 mM ou un de leurs mélanges. Le pH du tampon d'élution est avantageusement de l'ordre de 9 (i.e. 9 ± 0,5).

Le rapport entre le volume de tampon d'élution mis en œuvre lors de chaque étape (d) et le volume de particules magnétisables mises en œuvre lors de l'étape (b) est compris entre 1 et 20, notamment entre 2 et 10 et, en particulier, de l'ordre de 5 (i.e. 5 ± 1).

L'étape (d) du procédé selon la présente invention et notamment l'étape (d ₄ ) peuvent être réalisées à une température comprise entre 40 et 80°C, notamment entre 50 et 70°C et, en particulier, de l'ordre de 60°C (i.e. 60°C ± 5°C), les étapes (di) à (d ₃ ) pouvant, quant à elles, être réalisées à une température comprise entre 10 et 40°C, avantageusement entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C).

De plus, l'étape (d) du procédé selon la présente invention et notamment l'étape (d ₄ ) peuvent être réalisées sous agitation et ce, pendant une durée comprise entre 1 et 15 min, notamment entre 2 et 7 min et, en particulier, de l'ordre de 3 min (i.e. 3 min ± 1 min). Cette agitation est réalisée au moyen d'un agitateur magnétique et à une vitesse supérieure ou égale à 100 rpm, notamment supérieure ou égale à 500 rpm et, en particulier, comprise entre 1000 et 1500 rpm.

Une fois l'étape (d) du procédé selon l'invention effectuée, il est facile de récupérer le tampon d'élution contenant le (ou les) acide(s) nucléique(s) cible(s) en éliminant les particules magnétisables et ce, en appliquant un champ magnétique.

La présente invention concerne également les tampons de lyse et de lavage susceptibles d'être mis en œuvre dans un procédé tel que précédemment défini. Ainsi, la présente invention concerne un tampon de lyse susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé tel que précédemment défini, contenant au moins un tensioactif, au moins un agent chaotropique et du glycérol tels que précédemment définis. Un exemple particulier d'un tel tampon de lyse est donné dans la partie expérimentale ci-après.

De plus, la présente invention concerne un tampon de lavage susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé tel que précédemment défini, contenant du glycérol, un tensioactif, notamment un tensioactif de la famille des éthylènes glycols comme un TEG ou un polyalkylène glycol et éventuellement un agent chaotropique tels que précédemment définis et notamment contenant du glycérol, du TEG ou du PEG et éventuellement un agent chaotropique tels que précédemment définis. Deux exemples particuliers d'un tel tampon de lavage sont donnés dans la partie expérimentale ci-après.

La présente invention concerne également un kit comprenant au moins un tampon de lyse tel que précédemment défini et au moins un tampon de lavage tel que précédemment défini. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le kit selon l'invention comprend un tampon de lyse et deux tampons de lavage tels que donnés dans la partie expérimentale ci-après ou un tampon de lyse et le tampon de lavage n°2 tels que donnés dans la partie expérimentale ci-après. Le kit selon la présente invention peut en outre contenir au moins un élément choisi dans le groupe constitué par (i") une protéase, notamment une endoprotéase et, en particulier, de la protéinase K ; (ii") un tampon de capture tel que précédemment défini ; (iii") un tampon d'élution tel que précédemment défini et (iv") des particules magnétisables telles que précédemment définies.

La présente invention concerne en outre l'utilisation d'un tampon de lyse, d'un tampon de lavage et d'un kit tels que précédemment définis pour extraire et purifier des acides nucléiques cibles dans un échantillon, ladite extraction et purification utilisant des particules magnétisables.

En d'autres termes, la présente invention concerne, d'une part, un procédé pour lyser un échantillon consistant à mettre en contact ledit échantillon avec un tampon de lyse selon l'invention et, d'autre part, un procédé pour laver des particules magnétisables ayant capturé au moins un acide nucléique cible consistant à mettre en contact lesdites particules avec un tampon de lavage selon l'invention.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

La Figure 1 est une représentation schématisée du procédé selon la présente invention.

La Figure 2 présente le pourcentage de purification de l'ADN en fonction de la quantité de glycérol contenue dans le tampon de lyse et les tampons de lavage.

La Figure 3 présente le pourcentage de purification de l'ADN en fonction de la quantité de glycérol contenue dans le tampon de lyse.

La Figure 4 présente le pourcentage de purification de l'ADN en fonction de la quantité de glycérol contenue dans le tampon de lavage No. 1.

La Figure 5 présente le pourcentage de purification de l'ADN en fonction de la quantité de glycérol contenue dans le tampon de lavage No. 2.

La Figure 6 présente la valeur de cycle seuil ou Ct pour un surnageant obtenu avec le procédé commercial PROMEGA en utilisant les billes magnétiques référencées que sont les billes MagaZorb ou d'autres billes commerciales non référencées que sont les billes Dynabeads MyOne.

La Figure 7 présente la valeur de cycle seuil ou Ct pour un surnageant obtenu avec le procédé selon la présente invention en utilisant différentes billes magnétiques. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS

Exemple 1 : Variation de la concentration de Glycérol présent dans les tampons de lavages et de lyse.

Le protocole ci-après et schématisé à la Figure 1 a été mis en œuvre pour étudier l'effet de la concentration de glycérol dans les tampons de lavage et de lyse. Pour cela, pour chaque essai indépendant, une même concentration notée « A% » correspondant à la masse de glycérol par rapport à la masse totale de solution a été utilisée dans les tampons de lyse et de lavage, avec A représentant 0, 1, 10 ou 20.

1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA, ajouter

200 μί de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol A%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris-HCI à pH 8) ;

2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;

3. Ajouter 250 μί de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μί de billes MagPrep HS (Merck SAS Estapor - Cat No. Magprep HS 101899) ;

4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;

5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol A%) ;

7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage

(10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol A%) ;

9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ; 10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ;

11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.

Dans le surnageant récupéré, l'ADN est analysé par qPCR en utilisant des amorces spécifiques des pathogènes visés. On obtient ainsi la quantité d'ADN présente dans le tube en fin de procédé et cette dernière est comparée à la quantité totale d'ADN de l'échantillon initial avec, pour la quantité d'ADN théorique, le calcul suivant : 1 bactérie=l copie ADN. Les résultats sont présentés à la Figure 2.

En absence de glycérol, aucun ADN n'est extrait. Une extraction d'ADN est obtenue dès un ajout de 1% de glycérol et ce, pour certains échantillons de bactéries. Il en est de même pour le protocole utilisant 20% de glycérol dans les tampons de lyse et de lavage. Les meilleurs résultats quant à l'extraction pour tous les échantillons sont obtenus lorsque le tampon de lyse et les tampons de lavage contiennent 10% de glycérol.

Exemple 2 : Variation de la concentration en glycérol présent dans le tampon de lyse.

Le protocole ci-après a été mis en œuvre pour étudier l'effet de la concentration de glycérol dans le tampon de lyse. Pour cette étude, la concentration dans le tampon de lyse, notée « B% » et correspondant à la masse de glycérol par rapport à la masse totale de solution représente 0%, 1%, 10% ou 20%.

1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA, ajouter 200 μί de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol B%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris-HCI à pH 8) ;

2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;

3. Ajouter 250 μί de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μί de billes MagPrep HS (e.g. Merck SAS Estapor - Cat. No. Magprep HS 101899) ; 4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;

5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M

GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol 10%) ;

7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol 20%) ;

9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ;

11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.

Dans le surnageant récupéré, l'ADN est analysé par qPCR en utilisant des amorces spécifiques des pathogènes visés. On obtient ainsi la quantité d'ADN présente dans le tube en fin de procédé et cette dernière est comparée à la quantité totale d'ADN de l'échantillon initial avec, pour la quantité d'ADN théorique, le calcul suivant : 1 bactérie=l copie ADN. Les résultats sont présentés à la Figure 3.

En absence de glycérol dans le tampon de lyse et avec des tampons de lavage contenant du glycérol, de l'ADN peut être extrait. L'ajout de 1% de glycérol dans le tampon de lyse a peu d'effet sur l'extraction. Par contre, les meilleurs résultats quant à l'extraction sont obtenus lorsque le tampon de lyse contient 10% de glycérol et sont conservés, pour certains échantillons, avec 20% de glycérol dans le tampon de lyse. Ainsi, la présence de glycérol dans le tampon de lyse n'est pas nécessaire ; Elle est cependant préférable car elle permet d'augmenter le rendement total du protocole. Exemple 3 : Variation de la concentration de Glycérol présent dans le tampon de lavage n°l.

Le protocole ci-après a été mis en œuvre pour étudier l'effet de la concentration de glycérol dans le tampon de lavage n°l. Pour cette étude, la concentration dans le tampon de lavage n°l, notée « C% » correspondant à la masse de glycérol par rapport à la masse totale de solution représente 0%, 1%, 10% ou 20%.

1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA , ajouter 200 μΙ_ de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol 10%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris- HCI à pH 8) ;

2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;

3. Ajouter 250 μΙ_ de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μΙ_ de billes MagPrep HS (Merck SAS Estapor - Cat. No. Magprep HS 101899) ;

4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;

5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol C%) ;

7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol 20%) ;

9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ; 11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.

Dans le surnageant récupéré, l'ADN est analysé par qPCR en utilisant des amorces spécifiques des pathogènes visés. On obtient ainsi la quantité d'ADN présente dans le tube en fin de procédé et cette dernière est comparée à la quantité totale d'ADN de l'échantillon initial avec, pour la quantité d'ADN théorique, le calcul suivant : 1 bactérie=l copie ADN. Les résultats sont présentés à la Figure 4.

Lorsque comparée à l'extraction d'ADN avec 0% de glycérol dans le tampon de lavage n°l, une augmentation de l'extraction d'ADN peut être observée dès l'ajout de 1% de glycérol dans ce tampon et est maintenue pour certains échantillons jusqu'à une teneur de 40% de glycérol.

Exemple 4 : Variation de la concentration de Glycérol présent dans le tampon de lavage n°2.

Le protocole ci-après a été mis en œuvre pour étudier l'effet de la concentration de glycérol dans le tampon de lavage n°l. Pour cette étude, la concentration dans le tampon de lavage n°2, notée « D% » correspondant à la masse de glycérol par rapport à la masse totale de solution représente 0%, 1%, 10% ou 20%.

1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA, ajouter

200 μΙ_ de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol 10%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris- HCI à pH 8) ;

2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;

3. Ajouter 250 μΙ_ de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μΙ_ de billes MagPrep HS (Merck SAS Estapor - Cat No. Magprep HS 101899) ;

4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;

5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ; 6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol 10%) ;

7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage

(10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol D%) ;

9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ;

11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.

Dans le surnageant récupéré, l'ADN est analysé par qPCR en utilisant des amorces spécifiques des pathogènes visés. On obtient ainsi la quantité d'ADN présente dans le tube en fin de procédé et cette dernière est comparée à la quantité totale d'ADN de l'échantillon initial avec, pour la quantité d'ADN théorique, le calcul suivant : 1 bactérie=l copie ADN. Les résultats sont présentés à la Figure 5.

Lorsque comparée à l'extraction d'ADN avec 0% de glycérol dans le tampon de lavage n°2, une augmentation de l'extraction d'ADN peut être observée dès l'ajout de 1% de glycérol dans ce tampon et est maintenue pour certains échantillons jusqu'à une teneur de 40% de glycérol.

Exemple 5 (comparatif) : Protocole d'extraction commercial PROMEGA mis en œuyre avec différentes billes.

Le protocole commercial PROMEGA ci-dessous a été mis en œuvre avec les billes magnétiques adaptées à ce protocole à savoir les billes MagaZorb (PROMEGA - Cat No. MB1004) mais aussi avec d'autres billes commerciales non référencées à savoir les billes magnétiques Dynabeads MyOne (Life Technologies - Cat No. Dynabeads ^® MyOne™Silane 37002D). 1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate, ajouter 200 μί de tampon de lyse PROMEGA, 20 μΙ protéinase K PROMEGA ;

2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;

3. Ajouter 500 μΙ_ de tampon de capture PROMEGA et 20 μΙ_ de billes magnétiques :

- MagaZorb (PROMEGA - Cat No. MB1004) ;

- Dynabeads MyOne (Life Technologies - Cat No. Dynabeads ^® MyOne™

Silane 37002D) ;

4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;

5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage PROMEGA ;

7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage

PROMEGA ;

9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

10. Eluer les acides nucléiques dans 100 μΙ de tampon d'élution PROMEGA et incuber pendant 10 min à température ambiante ;

11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour une analyse par PCR quantitative.

Pour rappel, dans une PCR quantitative, la quantité d'amplicons produits à chaque cycle est suivie par mesure de la fluorescence. Lorsque cette dernière devient statistiquement et significativement plus élevée que le bruit de fond, le cycle d'amplification correspondant est défini comme le cycle seuil ou Ct (pour « Cycle treshold »). Il existe une relation linéaire entre la quantité de matrices nucléiques dans le surnageant obtenu suite au protocole d'extraction/purification et le Ct obtenu avec ce surnageant. En d'autres termes, plus le Ct est élevé, plus la quantité de matrices dans le surnageant est faible et donc moins le rendement d'extraction/purification est faible. Pour analyser les Ct en PCR, il est important de noter qu'une différence de moins de 1 Ct n'est pas significative.

Les résultats des Ct des surnageants obtenus par le protocole PROM EGA utilisant les billes magnétiques référencées (MagaZorb, PROM EGA) ou des billes commerciales non référencées (Dynabeads MyOne, Life Technologies) sont donnés à la Figure 6. L'éluat obtenu contient l'ADN de trois pathogènes (E. coli, S. epidermidis, S. pneumonaie). La Figure 6 représente les Ct obtenus pour chaque pathogène.

La perte de 3 Ct pour le protocole PROM EGA lorsqu'on utilise des billes non référencées met en évidence que ce protocole est adapté aux billes référencées i.e. les billes MagaZorb. A noter qu'il a été expérimentalement vérifié (analyse RM N) que les tam pons de lyse et de lavage du protocole PROMEGA ne contenaient pas de glycérol.

Exemple 6 : Procédé selon l'invention avec des billes magnétiques de différents fournisseurs.

Dans cet exemple, différentes billes magnétiques com merciales ont été utilisées en suivant le procédé de l'invention décrit ci-après :

1. Dans un tube de 1,5 mL contenant 10000 bactéries E. coli dans un échantillon sanguin de 200 μί, ledit tube contenant du citrate ou de l'EDTA, ajouter 200 μί de tampon de lyse (SDS 1%, Tween20 20%, GuSCN 0,85 M, NaCI 1 M, Glycérol 10%), 28,6 μΙ protéinase K (20 mg/ml, Sigma - Cat No. P2308, dissoute dans 10 mM Tris- HCI à pH 8) ;

2. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à 56°C ;

3. Ajouter 250 μί de tampon de capture (TEG 60%, 1,2-butanediol 40%) et 20 μL de billes magnétiques :

- MagPrep HS (Merck SAS Estapor - Cat No. Magprep HS 101899) ;

- Dynabeads MyOne (Life Technologies - Cat No. Dynabeads ^® MyOne™ Silane 37002D) ; - MagaZorb (PROMEGA - Cat No. MB1004) ;

- Silanol (CHEMICELL - Cat No. SiMAG-Silanol 1101-1) ;

4. Homogénéiser le tube par vortex et incuber 10 min à température ambiante ;

5. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

6. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (2 M GuSCN, 10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 10%, Glycérol 10%) ;

7. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

8. Laver les particules magnétiques avec 1 mL de tampon de lavage (10 mM Tris-HCI à pH 8, PEG8000 20%, Glycérol 20%) ;

9. Placer le tube sur un banc magnétique et laisser sédimenter le culot particules magnétiques-ADN puis enlever le surnageant ;

10. Eluer les acides nucléiques dans 92 μΙ de tampon d'élution (10 mM

Tris-HCI à pH 9) et agiter avec un Eppendorf - Thermomixer compact N° 5350 000.013 pendant 3 min à 1400 rpm à 60°C ;

11. Placer le tube sur un banc magnétique puis récupérer le surnageant pour réaliser différentes analyses.

La Figure 7 présente les Ct obtenus, correspondant à l'ADN extrait d'E.

Coli, par mise en œuvre du procédé selon la présente invention avec des billes magnétiques commerciales de différentes origines. Avec les tampons contenant du glycérol, une meilleure homogénéité dans les Ct est obtenue, montrant que ces tampons sont compatibles avec une plus grande variété de billes. Ainsi, les résultats présentés mettent en évidence la possibilité d'utiliser des billes magnétiques différentes avec le procédé selon la présente invention.