L'invention a pour objet un procédé d'extraction et de stabilisation de phycocyanine et ses applications notamment en diagnostic et dans le domaine médical, alimentaire, ou cosmétique, ou comme compléments alimentaires.

La phycocyanine est une protéine hydrosoluble qui constitue l'un des principaux pigments de cyanobactéries comme par exemple îa spiruline {Arthrospira platensis ou Spirulina maxima) ou l'AFA (Aphanizomenon Fios-Aquae). Au repos, la phycocyanine a une couleur bleue et elle est pourvue d'une fluorescence rouge. Elle présente une absorption maximum à 620 nm et une radiation d'émission à 635 nm. Cette qualité en fait un produit fluorescent naturel qui est un marqueur de choix dans les diagnostics biomédicaux.

' Au niveau physiologique, la phycocyanine est aussi un antioxydant important notamment pour protéger les protéines plasmatiques contre les modifications oxydatives. La structure chimique de !a phycocyanine présente une ressemblance structurale très proche avec la bilirubine (qui est un produit de la dégradation de l'hémoglobine) et des propriétés assez voisines.

La phycocyanine est une molécule de grand intérêt notamment en raison de ses propriétés bénéfiques pour la santé humaine et animale. La phycocyanine est consommée notamment pour ses propriétés antioxydantes et aussi pour sa capacité à favoriser la production de cellules souches.

Il s'agit cependant d'une molécule coûteuse et compliquée à extraire. C'est de plus une molécule qui se dégrade très rapidement, après extraction, en cas de contamination bactérienne, ce qui surenchérit les coûts car sous forme liquide, dans l'eau, cette molécule doit être extraite dans des conditions stériles et conditionnée en mono doses.

Différentes méthodes d' extraction ont été proposées, parmi lesquelles la filtration tangentielle, l'extraction accélérée par solvant, la iyse cellulaire et l'extraction aqueuse en deux phases. Le brevet F 2 789 399 décrit un procédé de filtration tangentielle à 0,2 micromètres qui permet d'extraire en milieux aqueux à froid et de façon stérile la phycocyanine. Cependant, ce procédé demande des investissements importants, car les matériels de filtration tangentielle sont très onéreux, et il implique le conditionnement en mono doses, par exemple des ampoules en verre, car après ouverture le milieu n'est plus stérile et la phycocyanine ne se conserve pas dans l'eau dans ces conditions.

Ce process est très compliqué à réaliser avec du glycérol comme solvant en remplacement de l'eau, le glycérol présentant une viscosité trop importante pour permettre de réaliser une filtration tangentielle dans de bonnes conditions.

Le procédé d'extraction accélérée par solvant qui dure moins de trente minutes est caractérisé par une température et une pression élevées qui maintiennent le solvant en dessous de son point d'ébullition. Dans cette méthode, différents solvants ont été testés : hexane, éther de pétrole, éthanol et eau, à des températures de 60, 115 et 170 °C et des temps d'extraction différents de 3, 9 et 15 min. Tous ces solvants posent des problèmes : l'hexane et l'éther de pétrole sont toxiques. L'éthano! permet l'extraction la plus efficace, mais pose de nombreux problèmes ; toxicité, interdiction dans certaines religions et perte de l'activité antioxydante beaucoup plus importante qu'avec l'hexane ou l'éther de pétrole qui ont des rendements d'extraction très faibles de seulement 4,30% pour l'hexane et 3,60% pour l'éther de pétrole. L'eau quant à elle pose des problèmes de conservation car en cas de contamination bactérienne la phycocyanine se dégrade en quelques jours. , La technique de lyse cellulaire la plus couramment employée consiste en l'alternance de phases de congélation-décongélation suivies :

• soit d'un traitement par ultrasons qui rompt les membranes cellulaires et ainsi facilite l'accès aux molécules présentes dans le cytoplasme et les organites intracellulaires.

• soit de l'ajout d'une solution de tampon phosphate pH 6,8 durant l'étape de congélation-décongélation puis passage au mixer, suivi d'une étape d'extraction à l'acide chlorhydrique. La séparation et la concentration des différents constituants s'effectuent ensuite par une étape de centrifugation permettant de recueillir le surnageant dans lequel se trouve la phycocyanine. Cette technique présente des inconvénients étant donné que la phycocyanine sous forme aqueuse se dégrade rapidement en cas de contamination bactérienne et doit donc être conservée sous forme stérile ou au froid (congélation), ce qui entraîne des surcoûts importants. L'extraction aqueuse en deux phases implique la séparation des molécules entre deux ou plusieurs phases aqueuses immiscibles. Du polyéthylène glycol (PEG) et du phosphate de potassium sont ajoutés à une quantité donnée d'extrait frais de phycocyanine. Après mélange et décantation, le système se sépare en deux phases. Ces phases sont ensuite analysées par chromatographie d'échange d'ions et spectroscopie UV pour estimer la pureté et la quantité de la phycocyanine et des protéines totales. Le mélange PEG et phosphate de potassium est utilisé pour réaliser un coefficient de partage entre la phycocyanine et les . autres protéines. Ce système est ensuite soumis à l'extraction aqueuse en deux phases. Pour augmenter la pureté, une chromatographie par échange d'ions est effectuée, Si cette méthode d'extraction permet d'obtenir une bonne concentration de phycocyanine, elle présente toutefois l'inconvénient de nécessiter des étapes nombreuses et complexes et l'usage de matériels sophistiqués et coûteux.

Il existe donc un besoin en un procédé d'obtention de phycocyanine aisé à mettre en œuvre et économiquement satisfaisant.

Une exigence supplémentaire porte sur la stabilité de la solution de phycocyanine obtenue. ' Il est en effet connu qu'en milieu aqueux, la stérilisation par la chaleur ou les ultraviolets dégrade la molécule de phycocyanine et perd toute efficacité après ouverture du conditionnement, impliquant un conditionnement mono dose. Les conservateurs chimiques présentent une toxicité qui les rend incompatibles pour un usage alimentaire. Seuls des essais avec des huiles essentielles, ont donné des résultats acceptables. L'huile essentielle de Ravintsara (Cinnomomum Camphora), retarde le développement bactérien tout en restant compatible avec un usage alimentaire, mais ce traitement ne convient que pour une préservation à court terme de la phycocyanine car les développements bactériens sont freinés mais pas annihilés. Il n'est pas possible non plus d'acidifier fortement le milieu pour empêcher le développement de bactéries car la phycocyanine est très sensible au pH et toute variation importante entraîne une précipitation des molécules. La phycocyanine devient instable et précipite en dessous de pH 5 et au-delà de pH 7,5.

La congélation est une solution simple à mettre en œuvre, mais elle rend le transport très compliqué et très coûteux en raison de la nécessité de préserver la chaîne du froid.

L'alcool (éthanol) à forte concentration permet de stabiliser la phycocyanine, mais altère les propriétés de la phycocyanine qui perd une grande partie de ses propriétés antioxydantes. De plus, l'alcool est problématique en raison des multiples interdictions religieuses auquel il est soumis. En outre, son utilisation se heurte à de nombreux problèmes techniques : il s'agit d'un produit très inflammable, de dépendance (toxicité de l'alcool), auquel s'appliquent des contraintes commerciales, les produits alcoolisés étant soumis à de nombreuses taxes et interdictions. les autres solvants ou produits chimiques utilisés lors des procédés d'extraction : hexane, éther de pétrole, solution de tampon phosphate, polyéthylène glycol sont coûteux et présentent des problèmes importants de toxicité alimentaire.

Les solutions trouvées par les industriels pour permettre une conservation à long terme de la phycocyanine à température ambiante sont les suivantes :

· soit, la phycocyanine est, après extraction et concentration, conservée sous forme de poudre sèche déshydratée ce qui diminue considérablement son efficacité car le séchage altère les molécules ainsi que leur structure tridimensionnelle et aboutit à la perte ou à ia diminution des propriétés biologiques et de fluorescence de la molécule ;

· soit, la phycocyanine est conservée sous forme liquide en milieux aqueux, ce qui implique des procédés coûteux et complexes d'extraction, de clarification et de filtration stérile suivis d'un conditionnement en mono doses (par exemple des ampoules en verre}, car après ouverture le milieu se contamine en bactéries et la consommation doit donc être immédiate.

On sait que la forme liquide est à privilégier, la phycocyanine étant sous cette forme beaucoup plus biodisponibie que sous forme sèche car elle reste sous forme native et conserve ses propriétés de fluorescence.

Ces procédés surenchérissent considérablement les prix et rendent la phycocyanine active et hautement purifiée très coûteuse. Son prix peut atteindre 50$ US le milligramme purifié.

La production de phycocyanine à un coût accessible et ceci sans dégradation de ses propriétés reste donc toujours un défi.

Les recherches effectuées par l'inventeur ont montré que ces problèmes pouvaient être surmontés de manière satisfaisante en réalisant l'étape d'extraction avec un nouveau solvant.

L'invention a donc pour but de fournir un nouveau procédé d'extraction et de stabilisation de phycocyanine.

Elle vise également à fournir des solutions ou extraits de phycocyanine avec le cas échéant d'autres nutriments, de grande stabilité, utilisables de manière avantageuse dans des conditionnements multf doses pour des applications en particulier en diagnostic et dans le domaine médical, alimentaire, ou cosmétique, ou comme compléments alimentaires.

Le procédé d'extraction de phycocyanine à partir d'au moins un matériau la renfermant est caractérisé en ce qu'il comprend une étape de macération du ou des matériaux dans du glycérol ou un mélange eau/gfycérol. L'utilisation d'un mélange eau/glycérol présente l'intérêt d'un coût plus faible, d'une filtration plus rapide, le produit étant plus fluide et permet une extraction de meilleure ' efficacité. La teneur en phycocyanine est plus importante dans le filtrat quand on utilise un mélange eau / glycérol au lieu de glycérol pur.

Avantageusement, le rapport eau/glycérol peut aller jusqu'à 60/40.

Le glycérol est une molécule qui présente de nombreux avantages. Le glycérol est un ingrédient alimentaire homologué (E422) qui est reconnu comme très sûr et qui est en conséquence autorisé quantum satis. Le glycérol est halal, Kacher et consommable par les végétariens et les végétaliens. Enfin, le glycérol présente l'avantage d'avoir un goût sucré agréable et d'être peu calorique. De plus, il s'agit d'une molécule qui est naturellement produite par les organismes vivants. Quand le corps utilise les graisses stockées comme source d'énergie, du glycérol et des acides gras sont libérés dans le sang.

En outre, le glycérol est un excellent conservateur naturel car il stabilise les protéines et empêche leur agrégation ainsi que la croissance bactérienne. Le glycérol est également un cryoprotecteur qui empêche la formation de cristaux de glace.

De manière préférée, le ou les matériaux renfermant la phycocyanine utilisé(s) dans le procédé de l'invention se présente(nt) sous forme de poudre sèche ou fraîche.

Lorsque l'extraction est suffisante, par exemple après quinze jours de macération à température ambiante, une étape de filtration est réalisée qui conduit à l'obtention d'un filtrat renfermant la phycocyanine extraite et d'un rétentat.

Le ou lesdits matériaux sont avantageusement choisis parmi la spiruline {Arthrospira platensis, Spirulina maxima) et/ou l'AFA (Aphanizomenon FIos-Aquae).

De manière inattendue, la phycocyanine s'extrait naturellement et se concentre progressivement dans le glycérol au cours du temps.

Avantageusement, le filtrat obtenu contient également des micros nutriments qui sont naturellement extraits du ou des matériaux utilisés. .Selon une disposition supplémentaire de l'invention, le glycérol est chauffé pour augmenter la vitesse d'extraction. Des températures appropriées sont inférieures à 100°C, plus spécialement à 70°C, de préférence à 40°C et sont utilisées plus spécialement sur une courte durée, pour éviter de dégrader la phycocyanine et pour préserver les propriétés de fluorescence. Le glycérol chauffé extrait la phycocyanine beaucoup plus rapidement et la durée de macération peut donc être raccourcie.

Dans un mode préféré de réalisation du procédé de l'invention, la filtration est effectuée de manière frontale, avantageusement sur filtre alimentaire, par exemple en polyamide, notamment en nylon, avec une finesse de 2 à 50 microns, de préférence inférieure à 25 ' microns. Cette disposition permet d'obtenir un filtrat clarifié dans lequel la phycocyanine est active et se conserve=avec toutes ses propriétés biologiques et de fluorescence pendant une durée supérieure à un an. La phycocyanine est protégée des bactéries et de l'oxydation par le glycérol. Jusqu'à 60 % d'eau dans le mélange d'extraction, le risque de contamination bactérienne ou de dégradation de la phycocyanine est très limité et les propriétés biologiques sont conservées sur des durées qui peuvent aller jusqu'à plusieurs années. Il est à noter que la phycocyanine ainsi obtenue conserve ses propriétés de fluorescence, ce qui est une preuve indirecte de la conservation de ses propriétés par la molécule et de sa non- dénaturation,

Dans un autre mode préféré de réalisation du procédé de l'invention tel que défini dans l'une, plusieurs, ou toutes les dispositions ci-dessus, le filtrat obtenu est additionné de C0 ₂ sous pression, ce qui permet une meilleure conservation et confère un goût agréable au produit.

De manière générale, le coût de production de phycocyanine obtenue selon l'invention est nettement plus faible qu'avec les procédés habituels car on travaille à température ambiante avec une technologie simple et bon marché. De plus, il n'est pas nécessaire de travailler en conditions stériles étant donné que le glycérol protège la phycocyanine des contaminations bactériennes. Par conséquent, le produit obtenu est stable dans te temps et il n'est donc pas nécessaire de le conditionner dans des ampoules mono doses. De plus, après ouverture, le flacon ne risque pas de contamination bactérienne, ce qui permet de conditionner dans des conditionnements muiti doses, par exemple en flacons de 500 ml, correspondant à 30 doses journalières pour un être humain. Ces conditionnements sont beaucoup plus économiques qu'un conditionnement en ampoules mono doses.

Il est à noter que les temps de filtration qui sont longs avec une filtration frontale ne constituent pas un problème dès lors que la phycocyanine est protégée des bactéries et de l'oxydation tout au long du process.

Les matériaux utilisés dans l'étape d'extraction comprennent généralement de nombreux nutriments d'intérêt. Ainsi, la spiruline contient, sous une forme parfaitement assimilable, de nombreux micronutriments. Parmi les éléments réputés les plus efficaces, on trouve : Vitamines A, B2, B5, B8, B12, PP, D, Superoxyde dismutase, sélénium, magnésium, zinc.

La plupart des micronutriments des matériaux utilisés sont retrouvés dans l'extrait liquide obtenu selon le procédé de l'invention et bénéficient eux aussi de l'effet protecteur du glycérol. L'invention vise également les filtrats/extraits obtenus. Ces filtrats/extraits comprennent une solution dans le glycérol ou un mélange eau/glycérol de phycocyanine avec un ou plusieurs des nutriments présents dans le ou les matériaux utilisés pour l'extraction.

Dans une variante, les filtrats sont additionnés avec du C0 ₂ sous pression.

Compte tenu des avantages évoqués ci-dessus présentés par ces filtrats/extraits, leurs applications dans le domaine alimentaire, médical ou cosmétique, y compris les dentifrices, ou encore comme compléments alimentaires, s'avèrent particulièrement intéressantes. Les filtrats/extraits de l'invention peuvent être ainsi utilisés, notamment, comme ingrédients dans la fabrication de produits cosmétiques comme des crèmes de beauté avec notamment une action anti rides ou encore dans ia préparation de dentifrices avec un effet bénéfique contre les saignements de gencives. On citera également l'utilisation des filtrats/extraits de l'invention en remplacement du glycérol habituellement utilisé dans les préparations cosmétiques. Selon encore un autre aspect, l'invention vise les conditionnements desdits extraits, en particulier sous forme muiti doses, Ces conditionnements sont particulièrement appropriés pour leurs diverses applications.

L'invention vise également en tant que nouveaux produits les rétentats obtenus à l'issue de l'étape de filtration. Ces rétentats sont également utilisables dans le domaine alimentaire, médical ou cosmétique ou comme compléments alimentaires.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans l'exemple qui suit à titre illustratif.

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Exemple :

On mélange 800 grammes de poudre de spiruline, d'AFA, ou un mélange des deux, dans 10 kg de glycérol. On laisse macérer pendant quinze jours à température ambiante. Une filtration frontale lente est ensuite effectuée, avec un filtre compatible alimentaire (par exemple un filtre en nylon) d'une finesse de 25 microns, sachant que la finesse du filtre doit être comprise entre 2 et 50 microns).

A la fin de la filtration, on obtient environ 7 litres de filtrat et 3 litres de rétentat. ' Le filtrat qui contient la phycocyanine est conditionné en flacons muiti doses, par exemple en flacon de 500 ml qui correspond à une quantité suffisante pour environ 30 jours d'utilisation pour un être humain. Un tel flacon peut être conservé sans problème pendant 3 ans à température ambiante. Des analyses effectuées par spectrophotométrie ont montré que ce procédé permet d'obtenir couramment des concentrations en phycocyanine dépassant les 900 mg par litre de filtrat. De plus, le rétentat est facilement récupérable sur le filtre et peut être valorisé comme aliment compte tenu de sa richesse en protéines. Le rétentat peut être utilisé, par exemple, pour enrichir des rations destinées à l'alimentation d'animaux.