PEIST, Ralf (Ellerkirchstr. 31, Düsseldorf, 40229, DE)
SCHLUMPBERGER, Martin (Neu-Löhdorf 24, Solingen, 42699, DE)
PEIST, Ralf (Ellerkirchstr. 31, Düsseldorf, 40229, DE)
| QIAGEN GmbH PA180-PCT
PATENTANSPRüCHE
1. Ein Verfahren zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, umfas- send die Verfahrensschritte:
i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer wässri- gen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biologischen Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die fixierte biologische Probe eine mit Formaldehyd fixierte biologische Probe ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mit Formaldehyd fixierte biologische Probe eine mit Formaldehyd fixierte und in Paraffin eingebettete biologische Probe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Paraffin vor dem in Kontakt bringen mit der wässrigen Lösung zumindest teilweise entfernt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz eine Verbindung ist, welche mindestens eine funktionelle Gruppe aufweist, die eine negative Ladung trägt, die negativ polarisiert ist oder die mindestens ein freies Elektronenpaar aufweist. QIAGEN GmbH PA180-PCT
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz eine Verbindung ist, die mindestes eine primäre, sekundäre oder tertiäre Amino-Gruppe der Struktur I
2
R-N o S R 3 I aufweist, in der
R 1 eine Ci- bis C 2 o-Kohlenwasserstoff-Gruppe, eine mindestens ein Hete- roatom aufweisende Ci- bis C 2 o-Kohlenwasserstoff-Gruppe oder ein gegebenenfalls Heteroatom substituiertes aromatisches Ringsystem ist, R 2 eine Ci- bis C 2 o-Alkylgruppe, eine Ci- bis C 2 o-Hydroxyalkylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist, und
R 3 eine Ci- bis C 2 o-Alkylgruppe, eine Ci- bis C 2 o-Hydroxyalkylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei mindestens einer der Reste R 2 und R 3 ein Wasserstoffatom ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei sowohl R 2 als auch R 3 ein Wasserstoffatom ist.
9. Verfahren nach Anspruch einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das nukle- ophile Reagenz ein Ci- bis Cό-Alkylamin oder ein Ci- bis C 15 Aminoalko- hol, Aminodiol oder eine Aminocarbonsäure ist. QIAGEN GmbH PA180-PCT
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz eine heterozyklische, ein Stickstoffatom beinhaltende Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Pyrrol, Pyridin, Piperidin, Chinolin, Indol, Aza-Cyclopentan, Aza-Cyclohexan, Morpholin oder einem Derivat dieser Verbindungen.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Amino-l,3-propandiol, Aminoguanidin und Tri(hydroxymethyl)-amino methan.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz bei einer Temperatur von 25°C und bei einem pH- Wert von 7 eine Löslichkeit in Wasser von mindestens 1 g/L aufweist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz in einer Konzentration in einem Bereich von 0,1 bis 10.000 mMo 1/1 in der im Verfahrensschritt ii) eingesetzten wässrigen Lösung enthalten ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Verfahrensschritt iii) auf eine Temperatur in einem Bereich von 50 bis 100 0 C erhitzt wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Verfahrensschritt iii) für eine Dauer in einem Bereich von 60 Sekunden bis 10 Stunden erhitzt wird. QIAGEN GmbH PA180-PCT
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren neben den Verfahrensschritten i) bis iii) den Verfahrensschritt
iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls
umfasst.
17. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Biomolekül RNA, DNA oder ein Protein ist.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei während des Erhitzens im Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt ii) oder aber nach dem Verfah- rensschritt iii) die biologische Probe mit mindestens einem Enzym in Kontakt gebracht wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei wenn das Biomolekül DNA und/oder RNA ist, das Enzym eine Protease ist.
20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei wenn das Biomolekül ein Protein ist, das Enzym eine Nuklease ist.
21. Eine biologische Probe, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20.
22. Die Verwendung eines nukleophilen Reagenzes, wie in einem der Ansprüche 5 bis 12 definiert, zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe.
23. Ein Kit zur Isolierung eines Biomoleküls aus einer fixierten biologischen Probe, umfassend QIAGEN GmbH PA180-PCT
(αl) einen Puffer beinhaltend ein nukleophiles Reagenz,
(α2) eine Matrix zur Adsorption eines Biomoleküls,
(α3) gegebenenfalls einen Elutionspuffer,
(α4) gegebenenfalls ein Enzym, sowie
(α5) gegebenenfalls eine chaotrope Substanz.
24. Kit nach Anspruch 23, wobei der Kit neben den Bestandteilen (αl) bis (α2) und gegebenenfalls (α3) bis (α5) einen Waschpuffer (α6) umfasst.
25. Die Verwendung des Kits nach Anspruch 23 oder 24 in einem Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen aus einer fixierten biologischen Probe.
26. Ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, umfassend die Verfahrensschritte: (ßl) Entnahme einer biologischen Probe aus einem Organismus,
(ß2) Fixierung der biologischen Probe mit Formaldehyd, (ß3) Analyse eines Biomoleküls aus der mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe durch das Verfahren nach Anspruch 19,
(ß4) Diagnose einer Krankheit auf der Grundlage der Ergebnisse der Ana- lyse, sowie
(ß5) therapeutische Behandlung der diagnostizierten Krankheit. QIAGEN GmbH PA180-PCT
27. Ein Verfahren zur Behandlung einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe für eine spätere Analyse der in der Probe enthaltenden Proteine, umfassend die Verfahrensschritte:
i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer wäss- rigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biolo- gischen Probe auf eine Temperatur in einem Bereich von 65 bis
85°C, iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die wässrigen Lösung im Verfahrensschritt ii) ein Detergenz enthält.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die biologische Probe in der- wässrigen Lösung vor Schritt iii) 5 bis 40 min gekocht wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei die biologische Probe für eine Dauer von 20 min bis 16 h inkubiert wird |
VERFAHREN ZUR EXTRAKTION VON BIOMOLEKüLEN AUS FIXIERTEN GEWEBEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, die durch dieses Verfahren erhältliche biologische Probe, die Verwendung eines nukleophilen Reagenzes zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, einen Kit zur Isolierung eines Biomoleküls aus einer fixierten biologischen Probe, die Verwendung dieses Kits sowie ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit.
Wird einem lebenden Organismus biologisches Material wie etwa ein Gewebefragment oder isolierte Zellen entnommen, so sterben diese, sofern keine Geeigneten Maßnahmen wie etwa die Inkubation in Nährmedien erfolgt, nach kurzer Zeit ab. Die abgestorbenen Zellen werden dabei sehr schnell zunächst autolytisch- fermentativ und danach bakteriell zersetzt, so dass die ursprünglichen Zell- und Gewebestrukturen zerstört werden. Sollen daher Zellen oder Gewebefragmente für eine histologische Untersuchung aus einem Organismus entnommen werden, so ist es erforderlich, die entnommene biologische Probe zu Fixieren, um eine Zersetzung derselben zu unterbinden. Diese Fixierung soll lebende Strukturen weitgehend lebensähnlich erhalten, damit sie real beurteilt werden können. Je nach Untersuchungsziel muss das am besten geeignete Fixativ gefunden werden. Die Fixierung bietet aber auch den Vorteil, Präparate als Dokumente aufbewahren zu können. Deshalb sind viele morphologische Untersuchungen nur auf der Basis von fixiertem Material möglich.
üblicherweise wird die Fixierung durch Eiweiß -fällende oder Eiweiß-vernetzende Verbindungen wie Säuren, Alkohole, Ketone oder andere organische Substanzen wie Glutaraldehyd oder Formaldehyd erzielt, wobei die Fixierung mit Formaldehyd (eingesetzt in Form einer als „Formalin" bezeichneten 35 gew.-%igen wässri-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
gen Lösung) gefolgt von einer Einbettung des fixierten Materials in Paraffin (sogenanntes „formalin-fixiertes, Paraffin-eingebettetes" (FFPE) Material) vor allem in der Pathologie die größte Bedeutung hat. Der Vorteil der Formalin-Fixierung gegenüber anderen Fixativen, wie etwa 96%igem vergälltem Alkohol, liegt insbe- sondere darin, dass die Zell- und Gewebestrukturen bei der Fixierung vergleichsweise gut erhalten bleiben.
Der Nachteil der Fixierung mit Formaldehyd besteht jedoch insbesondere darin, dass durch den hohen Grad der Vernetzung der Biomoleküle durch das vernetzend wirkende Formaldehyd eine Isolierung von Biomolekülen, wie etwa DNA, RNA oder Proteinen, aus einem FFPE-Material sehr schwierig, eine solche Isolierung dieser Biomoleküle jedoch für zahlreiche Untersuchungen von großer Bedeutung ist. So kann beispielsweise über die Bestimmung der Expression des Enzyms Thymidylat-Synthase in einem Tumorgewebe eine Aussage darüber getroffen werden, ob der Tumor mit bestimmten cyto toxischen Substanzen erfolgreich behandelt werden kann oder ob der Tumor möglicherweise bereits Resistenzen gegen bestimmte Zytostatika entwickelt hat. Kann zum Beispiel die mRNA, welche für die Thymidylat-Synthase kodiert, aus einem FFPE-Tumorgewebe isoliert werden, wie dies in der WO-A-01/46402 beschrieben ist, so kann über die Menge an mRNA im Gewebe ein Rückschluss auf die Enzymexpression und somit das Verhalten des Tumors gegenüber bestimmten Zytostatika gezogen werden. Da jedoch die Biomoleküle in den FFPE-Materialen vernetzt vorliegen und vernetzte RNA in biochemischen Assays, insbesondere bei der reversen Transkription oder der Polymerasekettenreaktion (PCR) kein geeignetes Substrat ist und vernetzte Prote- ine oftmals sehr schlechte Antigene für immunologische Nachweise darstellen, ist es erforderlich, das FFPE-Material vor der Analyse der Biomoleküle entsprechend aufzubereiten.
QIAGEN GmbH PA180-PCT
So schlägt WO-A-01/46402 vor, das FFPE-Material mit einer chaotropen Lösung beinhaltend eine effektive Menge einer Guanidinium- Verbindung für 5 bis 120 Minuten auf eine Temperatur von 75 bis 100 0 C zu erhitzen. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch darin, dass die Bedingungen, unter denen das Material erhitzt wird, oftmals zu einer zumindest teilweisen Zerstörung der Biomoleküle, insbesondere sensitiver Biomoleküle wie etwa RNA führt. Auch sind die für eine ausreichende Lösung der Formaldehyd- Vernetzung erforderlichen Behandlungszeiten oft sehr lang.
US-A-2005/0014203 schlägt vor, eine fixierte biologische Probe zunächst zu Erhitzen, um die Vernetzung der Biomoleküle zumindest teilweise zu lösen, und anschließend die so behandelte Probe mit einem proteolytischen Enzym, beispielsweise mit Proteinase K, zu inkubieren, um das Gewebe und die zellulären Strukturen des Gewebes zu zersetzen. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht e- benfalls darin, dass insbesondere bei kurzen Inkubationszeiten sehr hohe Temperaturen für das Lösen der Vernetzung erforderlich sind und dass bei gemäßigten Temperaturen dieser Vorgang nur sehr langsam erfolgt.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.
Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem eine fixierte biologische Probe, vorzugsweise eine mit Formaldehyd fixierte biologische Probe unter möglichst schonenden Bedingungen derart behandelt werden kann, dass die Biomoleküle in einfacher Weise aus der biologischen Probe isoliert oder in der biologische Probe nachgewiesen werden können.
QIAGEN GmbH PA180-PCT
Der vorliegenden Erfindung lag auch die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Behandlung einer vorzugsweise mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe anzugeben, mit dem im Vergleich zu den aus den Stand der Technik bekannten Verfahren bei einer Behandlungstemperatur von vorzugsweise weniger als 95°C die durch das Fixieren entstandenen Vernetzungen in der biologischen Probe schneller gelöst werden können.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, umfassend die Verfahrens- schritte:
i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer vorzugsweise wässrigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biologischen
Probe.
überraschend wurde festgestellt, dass sich die durch die Fixierung biologischer Proben, insbesondere durch die Formaldehyd-Fixierung entstandenen Vernetzun- gen innerhalb der biologischen Proben in Gegenwart eines nukleophilen Reagenzes deutlich schneller lösen lassen.
Ferner konnte überraschenderweise auch festgestellt werden, dass in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens eine quantitative A- nalyse von Proteinen aus Formalin fixierten Geweben möglich ist. Im Unterschied zum bekannten Stand der Technik wird bei der Behandlung die fixierte Probe bei einer Temperatur zwischen 70 und 90 0 C unter Anwesenheit eines nukleophilen Reagenz inkubiert. Dies führt zu einer Freisetzung einer ausreichenden Menge an intakten Proteinen, die anschließend genau quantifiziert werden
QIAGEN GmbH PA180-PCT
können. Vorzugsweise enthält die wässrige Lösung mit der die fixierte biologische Probe in Kontakt gebracht bei der Extraktion von Proteinen keine proteolytisch wirksame Verbindung wie beispielsweise eine Protease.
Die im Verfahrensschritt i) bereitgestellte fixierte biologische Probe kann ein vollständiger Organismus, ein Teil eines Organismus, insbesondere ein Gewebefragment oder ein Gewebeschnitt, eine Körperflüssigkeit, eine Zelle oder ein Virus sein, wobei Zellen, Gewebefragmente und insbesondere Gewebeschnitte besonders bevorzugte biologische Proben sind. Als Organismus kommen wiederum Tiere, Pflanzen oder Mikroorgansimen wie Bakterien, Hefen oder Pilze in Betracht, wobei eine menschliche biologische Probe ein besonders bevorzugtes Ausgangsmaterial und ein menschlicher Gewebeschnitt, eine aus dem Menschen isolierte Zelle oder eine kultivierte menschliche Zelle am meisten bevorzugte biologische Proben sind.
Die Fixierung der biologischen Probe kann mit allen den Fachmann bekannten Fixativen erfolgen, insbesondere mit Säuren, Alkoholen, Ketonen oder anderen organischen Substanzen, wie etwa Glutaraldehyd oder Formaldehyd, wobei mit Formaldehyd fixierte biologische Proben besonders bevorzugt und mit einer wäss- rigen Formaldehyd-Löung, beinhaltend 1 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 10 Gew.-% Formaldehyd fixierte biologische Proben am meisten bevorzugt sind.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als biologische Probe im Verfahrensschritt i) eine mit Formalde- hyd fixierte, biologische Probe eingesetzt, die in Paraffin eingebettet ist. Solche Proben werden üblicherweise als FFPE-Proben bezeichnet. Hergestellt wird eine solche FFPE-Probe vorzugsweise dadurch, dass eine mit Formalin fixierte biologische Probe zunächst entwässert wird, vorzugsweise mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe (also einer Reihe von Wasser/ Alkohol-Mischungen mit zunehmen-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
der Alkohol- Konzentration, wobei letztlich reiner Alkohol zugesetzt wird). Als Alkohole sind dabei Ci- bis Cs-Alkohole besonders bevorzugt, Ethanol, Methanol und Isopropanol darüber hinaus bevorzugt und Ethanol am meisten bevorzugt. Anschließend wird die entwässerte Probe in flüssiges Paraffin getaucht, welches, nachdem die Probe ausreichend vom Paraffin durchdrungen ist, ausgehärtet wird. Mittels geeigneter Schneidevorrichtungen, beispielsweise mittels eines Mikrotoms, können dann Gewebeschnitte aus dem Paraffinblock hergestellt werden, wobei die Dicke dieser Schnitte für lichtmikroskopische Untersuchung üblicherweise bei etwa 5 bis 20 μm liegt. Des Weiteren kann die paraffinierte Probe auch mittels anderer Verfahren, etwa durch Stanzen mit einer Hohlnadel oder durch das sogenannte ,J ^ aser Capture"- Verfahren in kleinere Probenfragmente zerkleinert werden.
Im Verfahrensschritt ii) wird die im Verfahrensschritt i) bereitgestellte fixierte biologische Probe dann mit einer vorzugsweise wässrigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz in Kontakt gebracht. Sofern es sich bei der biologischen Probe um eine in Paraffin eingebettete biologische Probe handelt, ist es bevorzugt, vor dem in Kontakt bringen der Probe mit der vorzugsweise wässrigen Lösung das Paraffin zunächst aus der biologischen Probe zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig zu entfernen. Das Entfernen des Paraffins aus der biologischen Probe kann grundsätzlich durch alle dem Fachmann bekannten Verfahren der Deparaffinierung von biologischen Proben erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Deparaffinierung dadurch, dass die Probe zunächst mit einem hydrophoben organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, insbesondere mit einem aromati- sehen Kohlenwasserstoff, am meisten bevorzugt mit Xylol, um das Paraffin herauszulösen. Dabei kann es auch vorteilhaft sein, die Mischung aus der biologischen Probe und dem organischen Lösungsmittel zu bewegen, beispielsweise auf einem Laborschüttler zu schütteln, um ein möglichst effektives Herauslösen des Paraffins sicherzustellen. Vorteilhafterweise wird die Mischung dann zentrifugiert
QIAGEN GmbH PA180-PCT
und das organische Lösung vom Pellet ( = biologische Probe) abgetrennt. Gegebenenfalls kann dieser Schritt des Herauslösens des Paraffins aus der biologischen Probe ein-, zwei- drei- oder auch bis zu zehnmal wiederholt werden. Neben dem Herauslösen des Paraffins mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels kommen als Verfahren zur Deparaffinierung auch andere Verfahren, wie beispielsweise das Schmelzen des Paraffins in Betracht, wie von Banerjee et al, Bio- techniques, 18 (1995), Seiten 768-773 beschrieben.
Nach dem Entfernen des Paraffins kann es bevorzugt sein, die biologische Probe wieder zu rehydrieren, wobei dieses Rehydrieren vorzugsweise durch das schrittweise Waschen mit wässrigen Alkohol-Lösungen mit fallender Alkoholkonzentration erfolgt ( = absteigende Alkoholreihe), wobei wiederum Ci- bis Cs-Alkohole besonders bevorzugt, Ethanol, Methanol und Isopropanol darüber hinaus bevorzugt und Ethanol am meisten bevorzugt ist. Gemäß einer bevorzugten Ausfüh- rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Alkoholreihe mit einem Konzentrationsbereich von 100 VoI- % bis 70 VoI- % eingesetzt, wobei der Konzentrationsunterschied zwischen zwei in ihrer Konzentration aufeinanderfolgenden wässrigen Alkohol-Lösungen vorzugsweise weniger als 10 Vol-%, besonders bevorzugt höchstens 5 Vo 1-% beträgt. Eine erfindungsgemäß geeignete absteigen- de Alkoholreihe umfasst beispielsweise die Konzentrationen 100 Vol-%, 95 VoI- %, 90 Vol-%, 80 Vol-% und 70 Vol-%.
Denkbar ist grundsätzlich auch, das Deparaffinieren und das Rehydrieren mit einem einzigen Reagenz, beispielsweise mit dem kommerziell erhältlichen Produkt EZ-DEWAX® der Firma BioGenex, Kalifornien, USA, durchzuführen.
Bevor nun die gegebenenfalls deparaffinierte und rehydrierte biologische Probe im Verfahrensschritt ii) mit der vorzugsweise wässrigen Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz in Kontakt gebracht wird, kann es weiterhin vorteilhaft sein,
QIAGEN GmbH PA180-PCT
die Probe zuvor noch zu trocknen, beispielsweise durch das Stehenlassen an der Luft oder das Inkubieren in einem Trockenschrank.
Weiterhin kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, die gegebenenfalls deparaffi- nierte und rehydrierte biologische Probe vor dem in Kontakt bringen mit der vorzugsweise wässrigen Lösung im Verfahrensschritt ii) noch zu homogenisieren, was insbesondere bei größeren Gewebefragmenten von Vorteil sein kann. Diese Homogenisierung kann durch jede dem Fachmann bekannte Vorrichtung zur Zerkleinerung einer biologischen Probe erfolgen, insbesondere mittels Hochdruck- zellaufschluss, mittels einer mechanischen Zerkleinerungsvorrichtung, beispielsweise einer Mühle, einem Rotor-Stator-Homogenisator, einem Ultra- Turrax- Homogenisator oder einer feinen Kanüle, oder durch Ultraschall- Homogenisatoren.
Im Verfahrensschritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun die fixierte biologische Probe mit einer vorzugsweise wässrigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz in Kontakt gebracht.
Als nukleophiles Reagenz sind dabei alle Lewis-Basen geeignet, die in der Lage sind, Elektronen in ein Leeres Orbital bzw. in Leere Orbitale einer Lewis-Säure zu transferrieren. Unter diesen Lewis-Basen besonders bevorzugt sind Reagenzien, welche mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, die eine negative Ladung trägt, die negativ polarisiert ist oder die mindestens ein freies Elektronenpaar aufweist.
Verbindung umfassend eine funktionelle Gruppe mit einer negativen Ladung sind beispielsweise Alkali- oder Erdalkalialkoxide, Alkali- oder Erdalkalihydroxide, Alkali- oder Erdalkalihalogenide, Alkali- oder Erdalkalicyanide und dergleichen.
QIAGEN GmbH PA180-PCT
Reagenzien, welche mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, die negativ polarisiert ist, sind insbesondere solche Reagenzien, die mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, in der zwei kovalent miteinander verbundene Atome vorliegen, die sich in ihrer Elektronegativität nach Alfred und Rochow um mindes- tens 0,25, besonders bevorzugt um mindestens 0,5 und darüber hinaus bevorzugt um mindestens 1 ,0 unterscheiden.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte nukleophile Reagenzien sind jedoch solche, die mindestens eine funktionelle Gruppe mit einem oder zwei, besonders be- vorzugt mit einem freien Elektronenpaar aufweisen, wobei unter diesen Verbindungen wiederum solche am meisten bevorzugt sind, die mindestes eine primäre, sekundäre oder tertiäre Amino-Gruppe der Struktur I
2
R-N o S R 3 I aufweisen, in der
R 1 eine Ci- bis C 2 o-Kohlenwasserstoff-Gruppe, besonders bevorzugt eine C 2 - bis Ci5-Kohlenwasserstoff-Gruppe und darüber hinaus bevorzugt eine C 2 bis Cio-Kohlenwasserstoffgruppe, eine mindestens ein Heteroatom aufweisende
Ci- bis C 2 o-Kohlenwasserstoff-Gruppe, eine mindestens ein Heteroatom aufweisende C 2 - bis Cis-Kohlenwasserstoff-Gruppe und darüber hinaus bevorzugt eine mindestens ein Heteroatom aufweisende C 2 - bis C 10 - Kohlenwasserstoff-Gruppe oder ein gegebenenfalls Heteroatom substituier- tes aromatisches Ringsystem ist,
QIAGEN GmbH PA180-PCT
R 2 eine Ci- bis C2o-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine Ci- bis C 10 - Alkylgruppe und darüber hinaus bevorzugt eine Ci- bis C2-Alkylgruppe, insbesondere eine Methyl-Gruppe oder eine Ethyl-Gruppe, eine Ci- bis C20- Hydroxyalkylgruppe, besonders bevorzugt eine Ci- bis C 10 - Hydroxyalkylgruppe und darüber hinaus bevorzugt eine Ci- bis C 2 -
Hydroxyalkyl-Gruppe oder ein Wasserstoffatom ist, wobei ein Wasserstoffatom am meisten bevorzugt ist, und
R 3 eine Ci- bis C2o-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine Ci- bis C 10 - Alkylgruppe und darüber hinaus bevorzugt eine Ci- bis C2-Alkylgruppe, insbesondere eine Methyl-Gruppe oder eine Ethyl-Gruppe, eine Ci- bis C20-
Hydroxyalkylgruppe, besonders bevorzugt eine Ci- bis C 10 -
Hydroxyalkylgruppe und darüber hinaus bevorzugt eine Ci- bis C 2 -
Hydroxyalkyl-Gruppe oder ein Wasserstoffatom ist, wobei ein Wasserstoff- atom am meisten bevorzugt ist.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte nukleophile Reagenzien mit einer funktionellen Gruppe der vorstehend dargestellten Struktur I sind insbesondere diejenigen, welche mindestens eine funktionelle Gruppe der Struktur I aufweisen, in der mindestens einer der Reste R 2 und R 3 , am meisten bevorzugt beide Reste R 2 und R 3 ein Wasserstoffatom ist bzw. sind. Darüber hinaus sind insbesondere solche nukleophilen Reagenzien bevorzugt, die mindestens eine funktionelle Gruppe der Struktur I aufweisen, in der das Stickstoffatom nur mit solchen Atomen in den Resten R 1 , R 2 und R 3 kovalent verknüpft ist, die sp 3 -Hybridisiert sind. Insbeson- dere sollten keiner der Reste R 1 , R 2 oder R 3 in der Lage sein, das freie Elektronenpaar am Stickstoffatom über die Reste R 1 , R 2 bzw. R 3 hinweg zu delokalisieren. Somit ist es insbesondere bevorzugt, dass keiner der Reste R 1 , R 2 und R 3 beispielsweise die Struktur II
QIAGEN GmbH PA180-PCT
H
IN H
— C-N
H
II
aufweist.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte nukleophile Reagenzien mit mindestens einer funktionellen Gruppe der Struktur I sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylamin, Ethylamin, Ethanolamin, n-Propylamin, n-Butylamin, iso- Butylamin, tert-Butylamin, Dimethylamin, Diethylamin, Diethanolamin, di-n- Propylamin, di-iso-Propylamin, Dibutylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Triethanolamin, Hexamethylenetetramin, 2-Ethylhexylamin, 2-Amino-l,3- propandiol, Hexylamin, Cyclo hexylamin, 1 ,2-di-Methoxypropanamin, 1- Aminopentan, 2-Methyloxypropylamin, Tri(hydroxymethyl)-aminomethan, Ami- nocarbonsäuren, insbesondere Glycin oder Histidin, oder Aminoguanidin, wobei unter diesen Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Amino-1,3- propandiol, Aminoguanidin und Tri(hydroxymethyl)aminomethan am meisten bevorzugt sind. Weiterhin sind als nukleophile Reagenzien mit mindestens einer funktionellen Gruppe der Struktur I aromatische Amine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anilin, Toluidin, Naphthylamin, Benzylamin, Xyliden, Xyloldi- aminen, Naphthalendiaminen, Toluoldiaminen, 3,3'-dimethyl-4,4'- diphenyldiamin, Phenylendiaminen, 2,4'-Methylendianilin, 4,4'-Methylendianilin, Sulfonyldianilin, und Dimethylbenzylamin bevorzugt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem das nukleophile Reagenz mindestens eine primäre Aminogruppe der
Struktur I aufweist, handelt es sich bei dem nukleophilen Reagenz um ein Ci- bis
C ό -Alkylamin, um ein Ci- bis Co-Alkyldiamin, um ein Ci- bis C ό -Alkyltriamin,
QIAGEN GmbH PA180-PCT
um einen Ci- bis C 15 Aminoalkohol um einen Ci- bis C 15 Aminodiol, oder um eine Ci- bis C 15 Aminocarbonsäure.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform des erfϊndungsgemäßen Ver- fahrens ist das nukleophile Reagenz eine heterozyklische, ein Stickstoffatom beinhaltende Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Pyrrol, Pyridin, Chinolin, Indol, Aza-Cyclopentan, Aza-Cyclohexan, Morpholin, Piperidin, Imida- zol oder einem Derivat dieser Verbindungen, wobei unter einem Derivat dieser Verbindungen vorzugsweise ein Derivat verstanden ist, bei dem an ein oder mehr Kohlenstoffatomen oder an dem Stickstoffatomen in den vorstehend genannten Verbindungen eine Ci- bis Cß-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine Methyl- Gruppe oder Ethyl-Gruppe anstelle eines Wasserstoffatoms gebunden ist.
Unter den vorstehend genannten nukleophilen Reagenzien sind insbesondere die- jenigen besonders bevorzugt, die wasserlöslich sind, insbesondere diejenigen, die in Wasser bei einer Temperatur von 25°C und bei einem pH- Wert von 7eine Lös- lichkeit von mindestens 1 g/L, besonders bevorzugt mindestens 10 g/L und darüber hinaus bevorzugt mindestens 100 g/L aufweisen.
Die vorzugsweise wässrige Lösung beinhaltend das vorstehend beschriebene nukleophile Reagenz kann auf reinem, vorzugsweise entionisiertem Wasser basieren oder aber auch auf anderen, wässrigen Systemen, insbesondere auf Mischungen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, insbesondere Mischungen aus Wasser und Ethanol oder Methanol, wobei die Menge an Wasser vorzugsweise mindestens 50 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 75 Gew.- % und am meisten bevorzugt mindestens 90 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht aus Wasser und organischem Lösungsmittel, beträgt, physiologischen Kochsalzlösungen, auf Puffern, insbesondere Puffer beinhaltend dem Fachmann bekannt Pufferkomponenten wie beispielsweise TRIS, HEPES, PIPES,
QIAGEN GmbH PA180-PCT
CAPS, CHES, AMP, AMPD oder MOPS in einer Menge in einem Bereich von 0,1 bis 1.000 mMol/1, besonders bevorzugt 1 bis 500 mMol/1 und am meisten bevorzugt 10 bis 200 mMol/1, wobei gegebenenfalls eine solche Pufferkomponente, je nach deren Struktur, zugleich auch als nukleophiles Reagenz dienen kann. Wei- terhin können auch Nährmedien, wie etwa MEM-Medium und DMEM-Medium als wässriges System eingesetzt werden. Die Herstellung der wässrigen Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz erfolgt vorzugsweise durch einfaches Vermischen von Wasser oder einem entsprechenden wässrigen System mit dem nukleophilen Reagenz.
Die Konzentration des nukleophilen Reagenzes in der wässrigen Lösung liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 10.000 mMol/1, darüber hinaus bevorzugt von 1 bis 5.000 mMol/1, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von 5 bis 2.500 mMol/1 und am meisten bevorzugt von 20 bis 1.000 mMol/1. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die Konzentration des nukleophilen Reagenzes in der wässrigen Lösung bei mehr als 20 mMol/1, besonders bevorzugt bei mehr als 50 mMol/1 und am meisten bevorzugt bei mehr als 100 mMol/1.
Der pH- Wert der wässrigen Lösung liegt vorzugsweise in einem Bereich von 2 bis 12, besonders bevorzugt von 4 bis 9 und am meisten bevorzugt von 5 bis 8, jeweils gemessen bei Raumtemperatur.
Das in Kontakt bringen der wässrigen Lösung mit der biologischen Probe erfolgt vorzugsweise dadurch, dass die biologische Probe in einfacher Weise in eine ausreichende Menge der wässrigen Lösung eingetaucht wird. Befindet sich die biologische Probe beispielsweise in Form eines Gewebeschnittes und in Form einer adhärenten Zelle auf einem Substrat, so erfolgt das in Kontakt bringen der biolo-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
gischen Probe mit der wässrigen Lösung vorzugsweise durch das einfache Beschichten des Substrates mit der wässrigen Lösung.
Im Verfahrensschritt iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun die mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachte biologische Probe erhitzt, wobei vorzugsweise auf eine Temperatur in einem Bereich von 50 bis 100 0 C, besonders bevorzugt von 55 bis 95°C, darüber hinaus bevorzugt von 60 bis 90 0 C und am meisten bevorzugt 65 bis 85°C erhitzt wird. Insbesondere kann es erfmdungsge- mäß vorteilhaft sein, die mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachte biologi- sehe Probe auf eine Temperatur von weniger als 95°C, besonders bevorzugt weniger als 90 0 C und am meisten bevorzugt weniger als 80 0 C zu erhitzen.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann, wird im Verfahrensschritt iii) die mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachte biologische Probe auf eine Temperatur in einem Bereich von 65 bis 85°C, besonders bevorzugt von 75 bis 85 0 C erhitzt.
Vorzugsweise wird die biologische Probe in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann, 5 bis 40 min vor Verfahrensschritt iii) gekocht, d.h. auf etwa 100 0 C erhitzt.
Die Dauer des Erhitzens in Verfahrensschritt iii) hängt im wesentlichen von der Temperatur und der Reaktivität des nukleophilen Reagenzes ab und der Fachmann wird durch einfache Routineversuche feststellen können, wann unter den gegebenen Behandlungsbedingungen eine ausreichende Zerstörung der Vernetzung der biologischen Probe eingetreten ist. üblicherweise liegt die Dauer des Erhitzens
QIAGEN GmbH PA180-PCT
jedoch in einem Bereich von 60 Sekunden bis 10 Stunden, besonders bevorzugt von 2 Minuten bis 5 Stunden und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 Minuten bis 2 Stunden.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann, kann die Dauer des Erhitzens bis zu 16 Stunden betragen.
Je nach Art und Zusammensetzung der im Verfahrensschritt i) eingesetzten biolo- gischen Probe kann es nach dem Erhitzen im Verfahrensschritt iii) auch vorteilhaft sein, die biologische Probe zu zerkleinern (insbesondere dann, wenn die Probe vor der Behandlung mit dem nukleophilen Reagenz noch nicht zerkleinert worden ist), wobei zum Zerkleinern wiederum jede dem Fachmann zur Zerkleinerung biologischer Proben bekannte Vorrichtung eingesetzt werden kann. Insbe- sondere kann die Zerkleinerung mittels Hochdruckzellaufschluss, mittels einer mechanischen Zerkleinerungsvorrichtung, beispielsweise Rotor-Stator- Homogenisator, einer Mühle, einem Ultra- Turrax-Homogenisator oder einer feinen Kanüle, oder durch Ultraschall-Homogenisatoren erfolgen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die biologische Probe während des Erhitzens im Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt ii) oder aber nach dem Verfahrensschritt iii) mit Verbindungen in Kontakt gebracht, vorzugsweise inkubiert, welche die Zerstörung eines biologischen Gewebes und/oder die Lyse von Zellen fördert, wobei es sich bei dieser Verbindung vorzugsweise um ein Enzym, ein Detergenz, eine chaotrope Substanz oder eine Mischung aus mindestens zwei dieser Komponenten handelt.
In diesem Zusammenhang bevorzugte Enzyme sind insbesondere Proteasen, wobei unter diesen Trypsin, Proteinase K, Chymotrypsin, Papain, Pepsin, Pronase
QIAGEN GmbH PA180-PCT
und Endoproteinase Lys-C. besonders bevorzugt und Proteinase K am meisten bevorzugt ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedoch als Enzym auch eine hitzestabile Protease eingesetzt werden, wie sie etwa in der WO-A-91/19792 (isoliert aus Thermococcus celer, Ther- mococcus sp.ANl, Thermococcus stetteri oder Thermococcus litoralis) oder in der WO-A-91/19792 (isoliert aus Staphylothermus marinus) beschrieben ist. Der Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften hinsichtlich hitzestabiler Proteasen wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann, wird keine proteolytisch wirksame Verbindung wie eine Protease eingesetzt. In einer speziellen Ausführungsform kann jedoch hier eine Nuklease wie eine DNase und/oder RNase, vorzugsweise eine hitzstabile Nuklease verwendet werden.
Die Konzentration des Enzyms in der wässrigen Lösung liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,001 bis 5 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,01 bis 2,5 Gew.-% und am meisten bevorzugt 0,05 bis 0,2 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamt- gewicht der wässrigen Lösung.
Als Detergenzien werden bevorzugt Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Natriumdodecylsulfat (SDS), Polyethylenglykol-pheno lether wie beispielsweise Triton-X-100, Tween, NP-40 oder Mischungen hieraus eingesetzt, wobei SDS und Triton-X-100 als Detergenzien besonders bevorzugt sind. Die Menge an Detergenz, welche zur Lyse der in der biologischen Probe enthaltenen Zellen eingesetzt wird, ist von der Art und der Menge der biologischen Probe abhängig und kann vom Fachmann durch einfache Routineversuche ermittelt werden.
QIAGEN GmbH PA180-PCT
Ganz besonders bevorzugt wird in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann als Detergenz SDS, Natrium-Deoxycholat, CHAPS, Tri- ton XlOO, Nonidet P40 oder Tween 20 verwendet. Die Konzentration an Detergenz liegt hier vorzugsweise in einem Bereich zwischen etwa 0.1-10% , besonders bevorzugt zwischen 1-5%.
Als chaotrope Substanzen sind insbesondere Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidinium-Hydrochlorid bevorzugt, wobei Guanidiniumisothiocyanat besonders bevorzugt ist. Chaotrope Substanzen werden insbesondere dann eingesetzt, wenn aus der biologischen Probe nach der erfindungsgemäßen Behandlung Nukleinsäuren isoliert werden sollen. In diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass neben der chaotropen Verbindung auch reduzierende Verbindungen, insbesondere Dithiothretil (DTT) oder ß-Mercaptoethanol, eingesetzt werden. Die Konzentration an chaotroper Verbindung bei der Behandlung der biologischen Probe liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 50 Mol/l, besonders bevorzugt 0,5 bis 20 Mol/l und am meisten bevorzugt 1 bis 10 Mol/l.
Das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz oder der chaotropen Verbindung, kann, wie vorstehend dargelegt, vor, während des Erhitzens im Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt ii) oder aber nach dem Verfahrensschritt iii) erfolgen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz und/oder der chaotropen Verbindung vor dem Verfahrensschrittes ii). Dazu wird beispielsweise vor dem Verfahrensschritt ii) die biologische Probe mit einer wäss- rigen Lösung beinhaltend das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung
QIAGEN GmbH PA180-PCT
oder mindestens zwei davon, gegebenenfalls zusammen mit einer reduzierenden Verbindung wie ß-Mercaptoethanol, in Form eines Lysepuffers in Kontakt gebracht, auf eine für eine ausreichende Enzymaktivität erforderliche Temperatur erwärmt und anschließend dieser Lysepuffer durch die wässrige Lösung beinhal- tend das nukleophile Reagenz ersetzt oder aber diesem Lysepuffer eine entsprechende Menge an nukleophilem Reagenz zugesetzt.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz oder der chaotropen Verbindung nach dem Verfahrensschritt iii). Dazu kann entweder nach dem Erhitzen im Verfahrensschritt iii) die wässrige Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz von der biologischen Probe entfernt und diese biologische Probe dann mit dem Lysepuffer in Kontakt gebracht werden, oder aber es wird der wässrigen Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon, gegebenenfalls in Form einer konzentrierten Lösung, zugesetzt. Anschließend erfolgt ein Erhitzen auf eine für eine ausreichende Lyse erforderliche Temperatur. Insbesondere bei der Verwendung chaotroper Substanzen ist es bevorzugt, wenn diese erst nach dem Verfahrensschritt iii) zugesetzt werden.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz oder der chaotropen Verbindung während des Verfahrensschrittes iii). Dazu wird als wässrige Lösung im Verfahrensschritt ii) eine wässrige Lösung eingesetzt, welche neben dem nukleophilen Reagenz das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon beinhaltet, oder aber es wird der wässrigen Lösung vor dem Erhitzen im Verfahrensschritt iii) das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon, gegebenenfalls in Form einer konzentrierten wässrigen Lösung, zugesetzt wird. In die-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
sem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, als Enzym eine der vorstehend genannten hitzestabilen Proteasen oder Nukleasen ein zusetzen, da auf diese Weise die für eine zufrieden stellende Lösung der Vernetzungen Temperatur von vorzugsweise 50 bis 100 0 C, besonders bevorzugt von 55 bis 95°C, darüber hinaus bevorzugt von 60 bis 90 0 C und am meisten bevorzugt 65 bis 85°C ohne Beeinträchtigung der Enzymaktivität beibehalten werden kann.
Unabhängig von der Art und Weise der Behandlung des Gewebes in den Verfahrensschritten i) bis iii) liegt jedoch im Anschluss an das Erhitzen der biologischen Probe in der Regel eine wässrige Lösung vor, in der zumindest ein Teil der durch die erfindungsgemäße Behandlung aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküle gelöst ist. Diese wässrige Lösung kann neben den herausgelösten Biomolekülen auch weitere Komponenten umfassen, wie etwa das nukleophile Reagenz, Enzyme, Detergenzien, chaotrope Verbindungen und dergleichen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dieses neben den Verfahrensschritten i) bis iii) auch den Verfahrensschritt
iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls,
wobei es sich bei dem Biomoleküls vorzugsweise um ein Protein, ein Glykopro- tein, ein Lipid, ein Glykolipid, eine RNA oder eine DNA, am meisten bevorzugt jedoch um RNA handelt.
Dabei kann als Ausgangszusammensetzung für die Analyse des aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls
QIAGEN GmbH PA180-PCT
Al) die wässrige Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz, welche im Verfahrensschritt ii) eingesetzt wurde und in der sich nach dem Verfahrensschritt iii) ein Teil der Biomoleküle befindet,
A2) die wässrige Lösung beinhaltend ein Enzym, ein Detergenz und/oder eine chaotrope Verbindung, sofern die wässrige Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz nach dem Verfahrensschritt iii) durch einen entsprechenden Lysepuffer ersetzt oder der wässrigen Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz vor oder nach dem Verfahrensschritt iii) entsprechende Lyse- Komponenten zugesetzt worden sind,
A3) eine wässrige Lösung, welche nach der Aufreinigung eines Biomoleküls in einer der beiden vorstehend genannten Zusammensetzungen Al) oder A2), beispielsweise mittels Filtration, Dialyse, Extraktion, Fällung, Chroma- tographie oder einer Kombination dieser Aufreinigungsverfahren, vorzugsweise jedoch mittels Adsorptionschromatographie, erhalten wurde, wobei insbesondere eine Aufreinigung durch Trennung der wässrigen Lösung Al) oder A2) in eine Protein-Fraktion, eine RNA-Fraktion und eine DNA- Fraktion, beispielsweise durch selektive Fällung, Extraktion oder Adsorpti- on besonders bevorzugt und eine Trennung durch Adsorption am meisten bevorzugt ist, oder
A4) eine wässrige Lösung, welche durch Extraktion des im Anschluss an den Verfahrensschritt iii) erhaltenen Gewebes mit einer entsprechenden wässri- gen Phase erhalten wurde, dienen.
Die Analyse des Biomoleküls in den jeweiligen Zusammensetzungen Al) bis A4) erfolgt vorzugsweise durch die dem Fachmann bekannten Analysemethoden. So kommen als Analyseverfahren insbesondere immunologische Methoden wie Wes-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
tern-Blotting, Enzyme-linked Immonosorbent-Assays (ELISAs), die Immunpräzi- pitation oder die Affinitätschromatographie, Mutationsanalysen, Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE), insbesondere zweidimensionale Polyacrylamid- Gelelektrophorese (2D-P AGE), High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Polymerase-Kettenreaktion (PCR), RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism-Analyse), Southern-Blotting, serielle Analyse der Genexpression (SAGE), Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC), MALDI- TOFF-Massenspektrometrie, SELDI-Massenspektrometrie, Mikroarray- Analyse und dergleichen in Betracht.
Abhängig vom zu Analysierenden Biomolekül kann während des Erhitzens im- Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt ii) oder aber nach dem Verfahrensschritt iii) die biologische Probe mit mindestens einem Enzym in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise kann vor dem Verfahrensschritt ii) die biologi- sehe Probe mit mindestens einem Enzym in Kontakt gebracht werden.
Wenn das zu analysierende Biomolekül DNA und/oder RNA ist, kann das Enzym eine Protease, wie oben offenbart, sein. Wenn das zu analysierende Biomolekül ein Protein ist, kann das Enzym eine Nuklease, wie oben offenbart, sein.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen umfasst ein Verfahren zur Behandlung einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe für eine spätere Analyse der in der Probe enthaltenden Proteine, umfassend die Verfahrensschritte:
i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer wäss- rigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie
QIAGEN GmbH PA180-PCT
iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biologischen Probe auf eine Temperatur in einem Bereich von 65 bis 85°C, iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomole- küls.
Besonders bevorzugt wird im Verfahrensschritt ii) ein Detergenz wie SDS zugegeben und/oder das Detergenz ist bereits in der wässrigen Lösung enthalten. Die biologische Probe wird vorzugsweise in der wässrigen Lösung vor Schritt iii) 5 bis 40 min gekocht und danach vorzugsweise in Schritt iii) für eine Dauer von 20 min bis 16 h inkubiert.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche biologische Probe.
Auch die Verwendung eines nukleophilen Reagenzes, wie vorstehend beschrieben, insbesondere eines nukleophilen Reagenzes, welches mindestens eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe der Struktur I aufweist, zu Behandlung einer fixierten biologischen Probe, insbesondere zur Behandlung einer mit For- maldehyd fixierten biologischen Probe, leistet einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Kit zur Isolierung eines Biomoleküls aus einer fixierten, vorzugsweise aus einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe, umfassend
(αl) einen Puffer beinhaltend ein nukleophiles Reagenz,
(α2) eine Matrix zur Adsorption eines Biomoleküls, sowie
QIAGEN GmbH PA180-PCT
(α3) gegebenenfalls einen Elutionspuffer,
(α4) gegebenenfalls ein Enzym, sowie
(α5) gegebenenfalls eine chaotrope Substanz.
Als nukleophiles Reagenz sind insbesondere diejenigen Reagenzien bevorzugt, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als bevorzugte Reagenzien genannt wurden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits beinhaltet dieser auch noch Komponenten zur Lyse einer Zelle, insbesondere Enzyme (α4), vorzugsweise eines der proteolytischen Enzyme, die vorstehend im Zusam- menhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt wurden, Detergentien oder chaotrope Substanzen (α5), vorzugsweise einer der chaotropen Substanzen, die vorstehend im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt wurden. Insbesondere das Enzym und die chaotrope Substanz können, einzeln oder in Kombination, bereits in dem Puffer (αl) beinhaltend das nukleophile Reagenz enthalten sein. Es ist jedoch auch möglich, dass der Kit einen entsprechenden Lysepuffer (αl ') umfasst, in dem diese Verbindungen enthalten sind und der zum Aufschluss einer biologischen Probe eingesetzt werden kann. Auch kann der erfindungsgemäße Kit ein Lysekonzentrat (αl ") umfassen, das ein Enzym, ein Detergenz oder eine chaotrope Verbindung in konzentrierter Form enthält und der bei der Anwendung des Kits dem Puffer (αl) zu einem geeigneten Zeitpunkt zugesetzt werden kann.
Als Matrix (α2) zur Adsorption eines Biomoleküls können alle dem Fachmann bekannten Materialien zur Adsorption eines Biomoleküls, insbesondere eines Pro-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
teins, einer DNA oder einer RNA, verwendet werden, wobei auf Cellulose basierende Materialien, insbesondere carboxyfunktionelle Cellulosematerialien oder Diethylaminoethyl-Cellulose, Agarose, oder mineralische Träger wie Silika, Glas, Quarz, Zeolithe, oder Metalloxide, oder mit Ionenaustauscher-Materialien be- schichtete Träger, besonders bevorzugt sind. Die genannten Materialien können beispielsweise in Form von Membranen bzw. magnetischen oder nichtmagnetischen Partikeln vorliegen. Vorzugsweise ist diese Matrix als Säulenmaterial in bereits vorgefertigten Säulen oder auch als Suspension in dem Kit enthalten. Die Art der Matrix hängt entscheidend von der chemischen Struktur der zu analysie- renden Biomoleküle ab, wobei dem Fachmann für den jeweiligen Anwendungszweck, z. B. Analyse von Proteinen, RNA oder DNA, geeignete Adsorptionsmaterialien bekannt sind.
Als Elutionspuffer können ebenfalls alle dem Fachmann bekannten Puffer in dem erfindungsgemäßen Kit enthalten sein, die üblicherweise zur Elution in der Säulenchromatographie eingesetzt werden. Bei dem Elutionspuffer handelt es sich vorzugsweise um eine wässrige Salzlösung, insbesondere um wässrige Lösungen beinhaltend Alkalihalogenide, wie etwa NaCl, KCl oder LiCl, Erdalkalihalogeni- de, wie etwa CaCl 2 oder MgCl 2 , Ammoniumsalze wie etwa Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat oder Mischungen aus mindestens zwei dieser Salze, wobei der Elutionspuffer gegebenenfalls auch Puffersysteme wie etwa Alkaliace- tat/Essigsäure oder auf Tris(hydroxymethyl)aminomethan basierende Puffersysteme beinhalten kann. Sofern der Kit zur Isolierung von RNA aus einem fixierten Gewebe eingesetzt wird und als Matrix eine Silika-Membran eingesetzt wird, ist es besonders bevorzugt, als Elutionspuffer Wasser, insbesondere RNase-freies Wasser einzusetzen.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits kann dieser auch noch einen Waschpuffer beinhalten, mit dem die Matrix, nach-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
dem diese das zu analysierende Biomolekül gebunden hat, vor der Elution mit dem Elutionspuffer gewaschen wird.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe leistet weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Kits in einem Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen aus einer fixierten, vorzugsweise einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet schließlich auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, umfassend die Verfahrensschritte:
(ßl) Entnahme einer biologischen Probe aus einem Organismus, vorzugsweise aus einem Säugetier, besonders bevorzugt aus einem Menschen oder aus ei- nem Tier,
(ß2) Fixierung der biologischen Probe, vorzugsweise mit Formaldehyd,
(ß3) Analyse eines Biomoleküls aus der fixierten biologischen Probe durch das erfindungsgemäße Verfahren umfassend den Verfahrensschritt iv),
(ß4) Diagnose einer Krankheit auf der Grundlage der Ergebnisse der Analyse, sowie
(ß5) therapeutische Behandlung der diagnostizierten Krankheit.
Als biologische Probe und als Biomolekül sind wiederum diejenigen biologischen Proben und Biomoleküle bevorzugt, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben wurden.
QIAGEN GmbH PA180-PCT
Die Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Figuren und Beispiele näher erläutert.
Es zeigt die Figur 1 die Ausbeute an RNA (in ng) aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus der Lunge einer Ratte nach der erfindungsgemäßen Behandlung.
Es zeigt die Figur 2 das Verhalten der RNA (in Anzahl der zum Erreichen einer bestimmten DNA-Menge erforderlichen PCR- Zyklen in einer real-time RT-PCR- Analyse), welche durch das erfindungsgemäße Verfahren aus einem Formalin- fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus der Leber einer Ratte isoliert wurde, in einer PCR- Analyse.
Es zeigt die Figur 3 die Ausbeute an RNA (in ng) aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus der Leber einer Ratte nach der erfindungsgemäßen Behandlung.
Figur 4 zeigt die Ausbeute an intaktem Protein aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus dem Darm und der Lunge einer Ratte nach der erfindungsgemäßen Behandlung.
Figur 5 zeigt die Ausbeute an intakten Proteinen aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus dem Herz einer Ratte nach der erfindungsge- mäßen Behandlung in Abhängigkeit zur Temperatur im Inkubationsschritt.
BEISPIELE
QIAGEN GmbH PA180-PCT
Beispiel 1
Mit Formalin fixierte und deparaffinierte Gewebeschnitte (10 μm) aus der Lunge einer Ratte wurden mit jeweils 250 μl einer wässrigen Lösung beinhaltend 5 Mol/l Guanidin-Hydrochlorid und jeweils unterschiedliche nukleophile Reagenzien (13 mM TRIS, 350 mM TRIS, 5 Gew.-% Trimethylamin, 10 mg/ml Aminoguani- din oder 50 mg/ml Aminoguanidin) in Kontakt gebracht, wobei der pH- Wert der wässrigen Lösungen jeweils 7,5 betrug. Die Schnitte wurden für 60 Minuten bei 70 0 C mit den entsprechenden Lösungen inkubiert.
Aus dem erhaltenen Zelllysat wurde die RNA isoliert. Dazu wurde zunächst genomische DNA mittels der gDNA-Eliminator Mini Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) entfernt, der Durchfluss gesammelt, mit 400 μl Ethanol versetzt und die so erhaltene Zusammensetzung auf eine RNeasy ® MinElute Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgetragen. Nach zweimaligem Waschen mittels des im RNeasy ® -Kit enthaltenen RPE-Puffers wurde die Membran getrocknet und die RNA mittels 30 μl RNase-freiem Wasser eluiert. Die Menge an RNA im Eluat wurde mittels OD-Messung bei 260 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Figur 1 dargestellt.
Beispiel 2
Mit Formalin fixierte und deparaffinierte Gewebeschnitte (10 μm) aus der Leber einer Ratte wurden mit jeweils 250 μl einer wässrigen Lösung beinhaltend unter- schiedliche nukleophile Reagenzien (10 mM TRIS, 10 mM TRIS und 1 % Etha- nolamin, 10 mM TRIS und 0,1 % Ethanolamin sowie 10 mM TRIS und 0,01 % Ethanolamin) in Kontakt gebracht, wobei der pH- Wert der wässrigen Lösungen jeweils 7,5 betrug. Die Zellen wurden für 60 Minuten bei 70 0 C mit den entsprechenden Lösungen inkubiert. Anschließend wurde Guanidin-Hydrochlorid in ei-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
ner finalen Konzentration von 5 Mol/l zugesetzt.
Aus dem erhaltenen Zelllysat wurde die RNA isoliert und das Verhalten der RNA in der PCR mittels einer TaqMan- Analyse bestimmt, wobei der QuantiTect Probe RT-PCR Kit der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland, und ein entsprechendes Primer/Probe Set eingesetzt wurden. Dazu wurde zunächst genomische DNA mittels der gDNA-Eliminator Mini Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) entfernt, der Durchfluss gesammelt, mit 400 μl Ethanol versetzt und die so erhaltene Zusammensetzung auf eine RNeasy ® MinElute Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgetragen. Nach zweimaligen Waschen mittels des im RNeasy ® - Kit enthaltenen RPE-Puffers wurde die Membran getrocknet und die RNA mittels 30 μl RNase-freiem Wasser eluiert. Die Ergebnisse der PCR sind in der Figur 2 dargestellt. Neben der Analyse des Verhaltens der RNA in der PCR wurde im Beispiel 2 auch die Menge an isolierter RNA mittels OD-Messung bei 260 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Figur 3 dargestellt.
Den Figuren 2 und 3 ist zu entnehmen, dass durch die erfindungsgemäße Behandlung der Proben hohe Mengen an RNA isoliert werden können und die isolierte RNA zudem ein gutes Verhalten in der PCR- Analyse zeigt.
Beispiel 3
Verifizierung des Temperaturbereichs für die quantitative Extraktion von intakten, volle Länge Proteine aus Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebe
Mit Formalin fixierte und deparaffinierte Gewebeschnitte (10 μm) aus Darm und Hirn einer Ratte wurden mit jeweils 250 μl einer wässrigen Lösung beinhaltend nukleophile Reagenzien 1.25 M Tris/HCl (pH 6.8) und 4 % SDS in Kontakt ge-
QIAGEN GmbH PA180-PCT
bracht. Die Schnitte wurden für 20 min bei 100 0 C gekocht und dann 2 Stunden bei 80 0 C inkubiert.
Der Inkubationsschritt wurde am Beispiel von zwei verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt. Von den erhaltenen Lysaten wurden anschließend gleiche Volumina im Western-Blot analysiert. Das Signal für Actin wurde densitometrisch mittels Easy win ermittelt und verglichen. Das Signal der 80 0 C Proben wurden hierbei immer = 100% gesetzt.
Die Proben, die bei 80 0 C extrahiert wurden zeigten bei den unterschiedlichen Geweben sowohl für Actin als auch für Tubulin die stärksten Signale.
Beispiel 4:
Die Temperaturunterschiede des zweiten Inkubationsschrittes wurden bei diesem Beispiel (Hirn, Ratte) kleiner gewählt. Die Experimente wurden analog dem in Beispiel 3 beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Es ist deutlich zu erkennen, dass die stärksten Signale in den Proben zu detektie- ren sind, die in einem Bereich von 70 bis 85 0 C, insbesondere bei 80° bzw. 85°C inkubiert wurden.
Next Patent: INDUCTIVE POSITION SENSOR