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Patent Searching and Data


Title:
METHOD FOR THE EXTRACTION AND PURIFICATION OF NATIVE MARINE COLLAGEN FROM SARDINA PILCHARDUS SARDINE SCALES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/209587
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for the low-temperature acid extraction and purification of soluble type I native marine collagen from fresh or frozen sardine scales (sardina pilchardus), characterised in that it comprises the steps of: 1) washing the scales with water, 2) drying the scales, 3) alkaline treatment to eliminate non-collagen proteins, 4) acid treatment to eliminate minerals, 5) cold-extraction at acid pH in order to solubilise the native collagen fibrils, 6) ultra-centrifugation to eliminate large aggregates, 7) precipitation of the collagen by adding a neutral salt, 8) re-suspension of the precipitated collagen, and 9) dialysis using a dialysis pouch. The method can be used to produce collagen having a maximum purity within a reasonable period of time, by removing almost all of the non-collagen impurities and minerals, solubilising all of the collagen and limiting the denaturation thereof. In addition to obtaining a high yield of type I native marine collagen, the method of the invention, optimised by the response surface method (RSM), can be used to reduce the duration of the alkaline and acid treatment and to considerably reduce the duration of the acid extraction. It can also be used to reduce the amount of reagents used, in this case soda, demineralisation acid and extraction acid. The method solves the particular problem of managing chemicals, in a more durable and cost-effective manner. The high-quality native collagen obtained is suitable for food, food-based cosmetics and biomedical uses.

Inventors:
KHAROUBI MARIEM (MA)
BELLALI FATIMA (MA)
TENZALI ZAKARIA (MA)
YOUSSEF RADI (MA)
CHAIRA JAMAL (MA)
HASSAN ALHAYANE (MA)
HANOUN SAID (MA)
AKESBI ABDELLAH (MA)
LAAZUIOUZ ISSAM (MA)
Application Number:
PCT/MA2017/000013
Publication Date:
December 07, 2017
Filing Date:
June 01, 2017
Export Citation:
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Assignee:
INSTITUT NATIONAL DE RECH HALIEUTIQUE (MA)
ASSOCIATION PÔLE DE COMPÉTITIVITE POU LA PÊCHE ET L'INDUSTRIE DE TRANSF DES PRODUITS DE LA MER (MA)
International Classes:
C07K1/14; C07K1/36; C07K14/78
Foreign References:
CN102839207A2012-12-26
CN102586373A2012-07-18
CN102321719A2012-01-18
Other References:
NAGAI TAKESHI ET AL: "Fish scale collagen. Preparation and partial characterization.", INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY, vol. 39, no. 3, March 2004 (2004-03-01), pages 239 - 244, XP002775172, ISSN: 0950-5423
KANOKWAN MATMAROH ET AL: "Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish ()", FOOD CHEMISTRY, ELSEVIER LTD, NL, vol. 129, no. 3, 20 May 2011 (2011-05-20), pages 1179 - 1186, XP028099708, ISSN: 0308-8146, [retrieved on 20110526], DOI: 10.1016/J.FOODCHEM.2011.05.099
NOMURA YOSHIHIRO ET AL: "Preparation and some properties of type I collagen from fish scales", BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, vol. 60, no. 12, 1996, pages 2092 - 2094, XP002775173, ISSN: 0916-8451
F BELLALI ET AL: "RESPONSE SURFACE METHODOLOGY OPTIMIZATION OF DEPROTEINIZATION FROM SARDINE (SARDINA PILCHARDUS) SCALE OF MOROCCAN COAST The International Journal of Biotechnology", THE INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 182 - 192182, XP055419773, Retrieved from the Internet
FATIMA BELLALI ET AL: "E-ISSN: 2320-7078 P-ISSN: 2349-6800 JEZS Response surface methodology optimization of demineralization from sardine (Sardina pilchardus) scale", ~554~ JOURNAL OF ENTOMOLOGY AND ZOOLOGY STUDIES, 1 January 2016 (2016-01-01), XP055419776, Retrieved from the Internet
FATIMA BELLALI ET AL: "Alkali Pre-Treatment Optimization of Sardine Scales", INTERNATIONAL JOURNAL OF INNOVATIVE RESEARCH IN SCIENCE, ENGINEERING AND TECHNOLOGY, vol. 4, no. 10, 15 October 2015 (2015-10-15), pages 9510 - 9515, XP055419778, ISSN: 2347-6710, DOI: 10.15680/IJIRSET.2015.0410002
Attorney, Agent or Firm:
KHAROUBI, Mariem (MA)
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Claims:
REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de collagène à partir des écailles de sardine fraîches ou décongelées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de lavage à l'eau des écailles, de traitement alcalin, de traitement acide d'extraction acide à froid, ultracentrifugation, précipitation et dialyse

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lavage à l'eau est un lavage à l'eau courante 3 fois.

3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les écailles de sardine sont utilisées séchées.

4. Procédé selon les revendications 1, 2 et 3 caractérisés en ce que les écailles séchées sont déprotéinsées par la soude à raison de 0,1 M de NaOH, ratio 1 : 8 pendant 4h.

5. Procédé selon les revendication 1, 2, 3 et 4 , caractérisé en ce que les écailles déprotéinsées sont déminéralisées par un acide diaminotétracarboxylique ou un acide minéral.

6. Procédé selon la revendication 5 , caractérisé en ce que l'acide déminéralisateur est choisi parmi les acides minéraux comme étant l'acide chlorhydrique.

7. Procédé selon la revendication 5 , caractérisé en ce que l'acide déminéralisateur est choisi parmi les acides diaminotétracarboxylique comme étant l'EDTA.

8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le acide chlorhydrique est utilisé de préférence à une concentration de 0,1M pendant 18 h.

9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'EDTA est utilisé de préférence à une concentration de 0,3 M pendant 18 h.

10. Procédé selon la revendication 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 et 9 caractérisé en ce qu'on procédé à un lavage des écailles déprotéinsées et déminéralisées à l'eau jusqu'à neutralisation

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que l'extraction acido-soluble du collagène est effectuée par un acide organique.

12. Procédé selon la revendication 1 1 caractérisé en ce que l'extraction est effectuée à froid, de préférence à une concentration de 0,5 M d'acide acétique pendant 30H 4°C.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre par une étape de précipitation saline avec le chlorure de sodium, après 12 h d'agitation à 4°C.

14. Procédé selon les revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la solution de collagène précipité est ensuite récupérée sous forme de culots par centrifugation.

15. Procédé selon la revendication 14 selon laquelle la centrifugation est effectuée à 20 000g pendant 1 heure à 4°C.

16. Procédé selon la revendication 1 àl5 selon lesquelles les culots récupérés sont resolubilisés dans l'acide acétique.

17. Procédé selon la revendication 1 àl6 selon lesquelles on procédera ensuite à deux dialyses successives effectuées contre de l'acide acétique d'une part et contre l'eau distillée d'autre part avec un sac de dialyse dont le seuil de rupture est 14 KDA.

18. Procédé selon la revendication 1 àl 7 selon lesquelles le collagène purifié est un hetérodimére qui se compose de deux chaînes alpha et une chaîne Béta.

19. Procédé selon la revendication 1 àl8 selon lesquelles le collagène purifié a une température de dénaturation de 27,5°C.

20. Procédé selon la revendication 1 àl9 que le rendement en collagène natif est de 26,7%.

21. Procédé selon la revendication 1 à 20 que les solutions de collagène sont transparentes à une concentration en collagène comprise entre 4 mg/ml et 5,23 mg/ml d'acide acétique.

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que les écailles proviennent de poissons marins ou d'eau douce.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22 caractérisé en ce que le dit poisson est la sardine marocaine sardina pilchardus.

CITATIONS

Citation hors brevet

Fujiokai, K., Maeda, M.W.T., Akami, H. & Sano, A. (1998). Protein release from collagen matrices. Advanced drug delivery reviews, 31: 247-266.

Kieliy, CM, Grant, ME. (2002). The collagen family: structure, assembly, and organization in the extracellular matrix. In : Dir. Royce, PM., Steinmann, B. (2nd Ed)., Connective tissue and its heritable disorders. Moleeular, genetic, and médical aspects. New York : Wiley-Liss. pp.159-221.

Wallace, D.G., & Rosenblatt, J. (2003). Collagen gel Systems for sustained delivery and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews, 55(12):1631.

Citations de brevets

Brevet cité Date de dépôt Date de publication Déposant Titre

NingDE Préparation technology for

CN 104726527(A) 24- 03 - 2015 24- 0 - 2015 Xiyawei food producing collagen through corporation enzymolysis of fish scales

LTD

Wenz Hou METHOD FOR PREFARING

CN102839207 17- 09 - 2012 28- 12 - 2012 University COLLAGEN PEFTIDE FROM

FISH SCALES

METHOD FOR EXTRACTING

CN102586373 16- 01 - 2012 18- 07 - 2012 Yu Xiaob Ing HIGH - QUALITY COLLAGEN AT

LOW TEMPERATURE

PREPARATION METHOD OF

CN102633877 07- 02 - 201 1 15- 08 - 2012 Li Shitai COLLAGEN POWDER BY

USING FISH SKIN AND FISH SCALE

INDUSTRIAL PRODUCTION

CN102321719 07- 02 - 2011 15- 08 - 2012 Li Shitai METHOD FOR PREPARING

COLLAGEN FROM FISH SCALE BY ENZYME METHOD

Description:
Domaine

Le domaine de l'invention est la biotechnologie marine plus particulièrement le domaine technique de l'extraction du collagène pour la production industrielle du collagène marin type I à des fins d'application en agro- alimentaire, en cosmetfood et éventuellement en application médicale.

DESCRPTION DETAILLEE

Contexte

[0001]

Le collagène est une protéine extracellulaire fibreuse très largement répandue chez les animaux et sécrétée principalement par les cellules des tissus conjonctifs, comme la peau et les os.

[0002]

La prépondérance des résidus prolines et hydroxyproline confère à la triple hélice du collagène une rigidité caractéristique. Les groupements hydroxyles des résidus d'hydroxyproline participent à la formation de très nombreuses liaisons hydrogènes qui permettent de stabiliser l'ensemble de la structure (Kielty et Grant, 2002).

[0003]

Le collagène est un biopolymère largement utilisé dans la conception de biomatériaux visant à remplacer ou à traiter les tissus endommagés (Wallace, 2003). Ce collagène natif non dénaturé peut être ainsi utilisé par les industries cosmétique, pharmaceutique et médicale en raison de ses nombreuses autres caractéristiques. Notamment, quatre de ces propriétés sont particulièrement mises à contribution dans les biomatériaux: une forte résistance mécanique, un pouvoir hémostatique, une faible antigénicité et des effets sur la différenciation cellulaire (Fujioka et al, 1998).

[0004]

Actuellement, l'origine industrielle du collagène est bovine, porcine ou aviaire. Les origines porcines et bovines sont en tête de la production de collagène.

[0005]

En ce qui concerne cette production, elle se heurte à des restrictions religieuses dans certains pays musulmans ou juifs et à des restrictions sanitaires notamment celle relative à la crise de l'Encéphalopathie spongioforme et à celle de la grippe aviaire.

[0006]

La recherche d'autres ressources alternatives pour la production du collagène est donc particulièrement importante.

[0007]

Les écailles et les arrêtes du poisson renferment également du collagène qui s'apparente à celui des mammifères. [0008]

Au Maroc, ces écailles ne sont pas actuellement valorisées et sont considérées comme des déchets.

[0008]

Au Maroc, les entreprises en amont notamment les industries de pêche et les industries transformatrices de la sardine génèrent des tonnages considérables d'écaillés que l'on peut envisager de transformer en collagène marin.

Etat de la technique antérieure

Le brevet CN102839207 décrit un procédé de préparation de peptides de collagène à partir des écailles de poisson, caractérisé par les étapes principales suivantes :

- La récupération des écailles de poisson et leur immersion dans l'acide chlor hydrique pour éliminer le calcium; leur lavage pour neutraliser, leur séchage et leur broyage; L'ajout des écailles de poisson déminéralisées, séchées et broyées obtenus dans l'étape 1 dans un réacteur enzymatique avec de l'eau et un mélange de protéase mixte pour extraire le peptide de collagène. Après que l'extraction soit effectuée, la désactivation de l'enzyme et la centrifugation sont mises en œuvre pour obtenir une solution d'enzymolyse, dans laquelle la protéase mixte est un mélange de protéase neutre, de papaïne et de flavourzyme ;

La réalisation de la concentration en film de la solution d'hydrolysat obtenu par l'étape 2, la congélation et le séchage de la solution concentrée pour obtenir la poudre de peptide de collagène.

Selon cette invention, le peptide de collagène des écailles de poisson obtenu par méthode enzymatique en utilisant la protéase neutre, la papaïne et le flavourzyme fait intervenir une seule étape, de telle sorte que non seulement le temps d'hydrolyse enzymatique (9 heures ) est réduit, mais le taux d'extraction du peptide de collagène est également améliorée(72,72%). Par ailleurs, le procédé résout le problème particulier de la saveur du goût amer du peptide de collagène rencontré dans les autres techniques.

Le brevet CN102586373 divulgue un procédé d'extraction de collagène de haute qualité à basse température.

Le procédé comprend les étapes suivantes:

Récupération des écailles de poisson ou des peaux de poisson ;

Traitement par hydrolyse enzymatique à une température de 6 0 C;

Filtration de l'hydrolysat enzymatique pour obtenir une solution de collagène

- Séchage de la solution de collagène pour obtenir une poudre de collagène.

Selon l'invention, le procédé décrit est sûr, pratique et respectueux de l'environnement. En plus, en raison de l'adoption de l'extraction à basse température, l'activité du peptide de collagène est conservée à une étendue maximale. Le brevet CNl 02633877 traite un procédé de préparation industrielle d'une poudre de collagène à partir des peaux de poisson et à partir des écailles de poissons, caractérisé par une extraction à basse température, à quatre reprises.

Le procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:

- la dilution de l'acide et de la base et le déshuilage à basse température,

- l'extraction à basse température, à quatre reprises,

- la désodorisation par du charbon actif et par de la porcelaine,

- la séparation par centrifugation papillon des particules solides, de l' l'huile et de l'eau,

L'adsorption par résine macroporeuse de telle sorte que les métaux lourds sont éliminés, le liquide de collagène est obtenu et le pigment est élué.

- La concentration par ultrafiltration

- Le séchage par pulvérisation, de sorte que le collagène et deux pigments peuvent être obtenus;

La réalisation d'une extraction supercritique au dioxyde de carbone, de sorte que l'huile de poisson comestible peut être obtenu.

Selon le procédé, non seulement la toxicité provoquée par le solvant résiduel est éliminée, mais l'huile de poisson peut également être obtenu. Grâce à la résine macroporeuse, non seulement la couleur et l'odeur de poisson sont complètement enlevées, mai le pigment naturel peut également être obtenu. La méthode présente les effets bénéfiques que l)le collagène est blanc et sans odeur 2) le rendement est considérable 3) le pigment naturel est non-toxique, de couleur vive et stable 4) l'huile de poisson es comestible.

Les quatre produits ainsi obtenus peuvent être utilisés pour des produits de soins et de santé, des aliments et des additifs alimentaires. La poudre de collagène est un matériau médicinal et biochimique.

L'invention CN10 23 21 719 relate la technologie de préparation de production de collagène particulièrement la technologie de préparation de production de collagène par hydrolyse enzymatique des écailles de poisson, appartenant au domaine technique de l'extraction de collagène. La présente technologie passe par les étapes suivantes de 1) lavage. 2) Traitement alcalin 4) Décalcification 5) Cuisson 6) Refroidissement 7) Hydrolyse enzymatique préliminaire 8) Hydrolyse enzymatique secondaire 9) Fermentation par levure de la solution du collagène des écailles de poisson 10) Réaction d'adsorption par le charbon actif 1 1) Filtration 12) Concentration 13) Stérilisation 13) Atomisation .

La méthode fournie par l'invention, en plus de l'effet de l'obtention de peptides de collagène à forte concentration et à faible poids moléculaire à partir des écailles de poisson, elle apporte les effets de l'élimination des pigments qui affectent l'apparence du produit de collagène et réduit Γ odeur de poisson de collagène, ce qui améliore la valeur du produit fini du collagène marin. Description détaillée de Pinvention

Four résoudre le problème

Les extractions acides de collagène marin nécessitent des traitements préliminaires pour éliminer les impuretés minérales et les impuretés sous forme de protéines non collagénique. Ces traitements de déprotéinisation et de déminéralisation consomment des quantités considérables de produits chimiques (bases et acides) et sont de longue durée. La déprotéinisation avec l'hydroxyde de sodium peut durer jusqu'à 24 heures avec des concentrations comprises entre 0,3 M et 2, 5 M selon un ratio compris entre 1 : 10 et 1 : 30. Quant à la déminéralisation, sa durée peut aller jusqu'à 48 h. Similairement, l'extraction acido-soluble nécessite un investissement important en temps qui avoisinent les 48 heures et en quantité d'acide extracteur, ce qui se répercute inéluctablement sur la rentabilité industrielle de tout le procédé.

La présente invention concerne un procédé dont lequel les traitements préliminaires de déprotéinisation et de déminéralisation et l'extraction acido-soluble sont optimisés par la méthode de réponse de surface de telle manière à minimiser la quantité des intrants, la durée du process tout en réussissant des performances maximales de déminéralisation, de déprotéinisation, de récupération de collagène natif avec un haut degré de pureté.

Les moyens de résolution du problème

L'invention concerne un procédé acide de préparation de collagène marin natif type I, de bonne qualité, à partir des écailles de sardine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de lavage à l'eau des écailles, de traitement alcalin, de traitement acide, d'extraction à froid à pH acide , d'ultracentrifugation, de précipitation et de dialyse (figure 1).

La matière première est constituée des écailles fraîches ou décongelées, obtenues en grande quantité, lors de la pêche et lors la transformation industrielle de la sardine.

Dans le procédé de l'invention, les écailles fraîches ou congelées sont lavées suffisamment à l'eau courante 3 fois pour éliminer les composés indésirables, tels que par exemple le sang, les graisses, les lambeaux de chair et les algues.

Les écailles sont ensuite séchées dans séchoir électrique à froid.

Après lavage et séchage, les écailles sont immergées, sous agitation, dans un bain alcalin froid de soude afin d'éliminer les protéines non collagénique et obtenir un collagène avec un haut degré de pureté.

Le bain alcalin est suivi d'un lavage à l'eau pour éliminer l'excès de soude et d'une filtration pour récupérer les résidus déprotéinisés.

Nous avons montré par la méthode de réponse de surface RSM qu'une combinaison judicieuse des paramètres réactionnels tels que la concentration de la soude, le ratio soude écaille et la durée de la déprotéinisation permettaient l'élimination des protéines non collagénique avec un rendement satisfaisant sans altérer l'intégrité du collagène. Les trois facteurs étudiés pour la déprotéinisation sont donc la concentration de NaOH, le temps de traitement et le ratio NaOH /écailles. La teneur en protéines totales et en hydroxyproline en solution ont été analysées respectivement en vue de déterminer la quantité des protéines non collagénique solubilisés et les pertes de collagène durant la déprotéinisation et la déminéralisation.

De ce fait, et selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, nous utiliserons la soude à raison de 0,1M de NaOH avec un ratio uniquement de 1:8 pendant seulement 4h. Après cette déprotéinisation, les écailles sont immergées dans un bain acide froid sous agitation.

D'une manière avantageuse, et comparés aux travaux décrits dans la littérature, nous avons trouvé par la méthode de réponse de surface RSM qu'une combinaison judicieuse des paramètres réactionnels tels que la nature de l'acide, la concentration de l'acide et la durée de la déminéralisation permettaient d'extraire le maximum de minéraux avec un rendement satisfaisant supérieur à 99% en seulement 18 h sans altérer l'intégrité du collagène.

Deux acides peuvent être utilisés pour la déminéralisation, soit l'acide diaminotétracarboxylique l'EDTA ou l'acide minéral : l'acide chlorhydrique.

D'une manière avantageuse, la déminéralisation a été effectuée à une concentration de 0,1M H CL pendant 18h.

D'une manière profitable, la déminéralisation a été effectuée à une concentration de

0, 3 M EDTA pendant 18h.

On comprend ainsi que l'invention permet de résoudre les problèmes techniques de la longueur du traitement acide et alcalin énoncés précédemment avec seulement 4H et un ratio de 1 :8 pour le traitement alcalin et une diminution de 24 H à 18H pour le traitement acide.

Les écailles ainsi déprotéinisées et déminéralisées sont ensuite lavées à l'eau jusqu' à neutralisation.

Les écailles déprotéinisés, déminéralisées et neutralisées sont solubilisées dans un bain acide froid sous agitation.

D'une manière avantageuse, l'extraction acidosoluble a été effectuée à une concentration de 0,5 M d'acide acétique pendant seulement 30 H.

On comprend ainsi que l'invention permet de contourner le problème techniques de la durée d'extraction acide qui se voit baisser de 48 H à 30H avec seulement 0,5 M d'acide acétique.

La solution de collagène ainsi obtenue est ensuite centrifugée à froid à 20 000g à 4°C pendant 1 heure dans le but d'éliminer les gros agrégats non dissous.

Le surnageant récupéré est précipité sélectivement par un sel neutre. De préférence ce sel est le chlorure de sodium

Après 12 h d'agitation à 4°C, un précipité de collagène se forme.

Le collagène précipité est ensuite récupéré sous forme de culots par centrifugation à 20 000g pendant 1 heure à 4°C. Ces culots sont solubilisés dans l'acide acétique.

On procédera ensuite à deux dialyses successives effectuées contre de l'acide acétique d'une part et contre l'eau distillée d'autre part. La dialyse a été réalisée grâce à un sac de dialyse dont le seuil de rupture est de 14 KDA.

Le collagène ainsi purifié est un hétérodimère qui se compose de deux chaînes alpha et une chaîne Béta (Fig.2).

La température de début de dénaturation du collagène purifié à partir des écailles est de 27,5°C. La température de dénaturation des collagènes acido-solubles de mammifères est de l'ordre de 38 ° C tandis que la température de début de dénaturation du collagène à partir des écailles conforme à l'invention est voisine de 27,5 °C. Cette température plus basse constitue une caractéristique avantageuse du collagène de l'invention.

Les solutions de collagène sont transparentes à une concentration en collagène comprise entre 4 mg/ml et 5,23 mg/ml d'acide acétique.

Le rendement d'extraction obtenu par ce procédé est de 26,7%.

Brèves description de figures

La figure 1 décrit le procédé acide de préparation de collagène marin à partir des écailles de sardines en qui comprend : Le lavage, le traitement alcalin, le traitement acide, l'extraction à froid à pH acide, l'ultracentrifugation, la précipitation du collagène, la remise en suspension du collagène et la dialyse.

fig. 1. Procédé acide de préparation de collagène marin natif à partir des écailles de sardine

La figure 2 décrit l'identification moléculaire par électrophorèse du collagène purifié. Comparé avec un marquer moléculaire (à gauche), le collagène purifié est un hetérodimére qui se compose de :

Deux chaînes alpha dont le poids moléculaire est situé entre Π 6 et 97 KDa

Une chaîne Béta d'un poids moléculaire approximatif de 200 KDa

figure 2. Electrophorèse SDS-PAGE en conditions dénaturantes Exemple

L'invention est illustrée de manière non limitative par l'exemple ci-dessous :

Exemple

40 g des écailles de sardine congelées sont mises à décongeler en chambre froide (4°C). Après, on procède à une déprotéinisation par 360 mL de NaOH (0,1M) sous agitation pendant 4H à 4°C. Les écailles déproteinisées ont été filtrées et lavées 3 fois avec 360 ml chaque fois

- Les résidus déproteinisés sont ensuite déminéralisés dans une solution 400 ml HCL 0.1M pendant 18 h à 4°C.

- Les écailles sont ensuite totalement solubilisés dans 400 ml de l'acide acétique ml 0.5M sous agitation pendant 30 h à 4°C .

- La solution de collagène est centrifugée par la suite à 20 000g à 4°C pendant 1 heure. On récupère le surnagent, le culot est resolubilisé dans 320ml d'acide acétique (0,5M).

- Cette opération d'extraction est réalisée deux fois. Le deux surnageant sont réunis et le collagène qu'ils renferment est précipité par addition de 60g de chlorure de sodium (concentration 0,7 M final ).

Le collagène obtenu est récupéré sous forme de culots par centrifugation à 20 000g pendant 1 heure à 4°C. Ces culots sont resolubilisés dans 3 ml d'acide acétique à 0.5M. La solution de collagène est dialysée contre de l'acide acétique à 0,5 M pendant 24h et contre l'eau distillée (24h) (Il faut environ 10 volumes de la solution de l'eau distillé ou a acétique pour un volume de collagène dialysé).

- Le rendement calculé selon la formule suivante ci-dessous est de 26,7%

Rendement^ masse du collagène purifié / masse initiale des écailles x 100

10. 6 g 26, 7%

40 g X 100