Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cephalosporin C mit Acremonium chrysogenum

Die Aufarbeitung von Antibiotika enthaltenden Kulturbrühen erfolgt in der Regel nach dem Erreichen des maximalen Gehalts. Meistens erfolgt als erster Schritt eine Abtrennung von Zellen und Feststoffen durch Filtration oder Zentrifugation. Danach kann eine Wertstoffanreicherung durch -Extraktion oder Adsorption erfolgen. Das gereinigte Produkt wird dann in der Regel kristallisiert und kann zu semisynthetischen Antibiotika weiterverarbeitet werden.

Bei dieser Schritt-für-Schritt Methode macht sich die Instabilität vieler Antibiotikamoleküle, wie z.B. Cephalosporin C (CPC) nachteilig bemerkbar. Schon während der Fermentation findet ein Abbau des CPC's statt. Dieser kann sowohl rein chemisch, Angriff von Wasser auf den ß-Lactamring, als auch enzymatisch, z.B. durch Esterasen, stattfinden (Konecny et al., 1973, J. of Antib., 26, 3, 135-141). Ferner treten bei der Fermentation eine Reihe von Nebenprodukten, wie Deacetoxycephalosporin C (DOCPC) und Deacetylcephalosporin C (DCPC) auf, die bei der Reinigung von CPC abgetrennt werden müssen. Damit sind erhebliche Ausbeuteverluste verbunden.

Cross-fiow-Filtrationssysteme mit Polymer- oder Keramikmembranen wurden für die Aufarbeitung von Antibiotikabrühen bereits verwendet (Harris et al., J. Chem. Techn. Biotechnol., 1988, 42, 19-30). Es wurde bisher nicht gezeigt, daß bei diesen Verfahren der Zerfall von Cephalosporin C vermindert werden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zu finden, mit dem der Abbau von Cephalosporin C und die Nebenproduktbildung vermindert, sowie die Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Substratmenge erhöht werden können.

ERSATZB

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß durch Verwendung eines Cross-flow Filtrationsmoduls während der Fermentation von Acremonium chrysogenum die Ausbeute an CPC erhöht, die Bildung von DCPC vermindert und die Produktionszeit verlängert werden konnte. Ferner wird durch die Filtration und die geringe DCPC-Bildung die Aufarbeitung von Cephalosporin C wesentlich vereinfacht.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von CPC, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Fermentationslösung während der Fermentation über ein Cross-flow Filtrationssystem filtriert wird und die abgenommene Filtratmenge im Fermenter ersetzt werden kann.

Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium), sowie Mutanten und Selektanten, solange sie CPC-Derivate herstellen, eignen sich zum Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren.

Die Nährlösung enthält Kohlenstoffquellen wie Saccharose, Maisstärke, Dextrose oder Molasse und Stickstoffquellen wie Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Malzextrakt oder Ammoniumacetat.

Das Nährmedium enthält auch anorganische Salze wie Natriumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Calciumsulfat, Caiciumcarbonat, Magnesiumsulfat oder Kaliumhydrogenphosphat. Ferner kann dem Nährmedium auch Fett wie Ölsäuremethylester oder Sojaöl zugesetzt werden. Daneben werden auch Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Kupfer-, Zink-, Kobalt- oder andere Metallsalze zugegeben.

Die Kultivierung von Acremonium chrysogenum (Chephalosporium acremonium), bevorzugt DSM 6473, erfolgt bei Temperaturen zwischen 20 °C und 30 °C, bevorzugt bei 25 °C und bei pH-Werten zwischen 5 und 8, bevorzugt bei pH 7. Die Kultivierung erfolgt aerob zunächst im Schüttelkolben und danach im Fermenter unter Rühren und Belüftung mit Luft oder reinem Sauerstoff. Die Kultivierung der Mikroorganismen in den Fermentern erfolgt über einen Zeitraum von 120 bis 240 Stunden, bevorzugt zwischen 130 und 170 Stunden.

Als Cross-flow Fitrationssystem können Platten-, Rohr-, Kapillarrohr-, Wickel- oder Hohlfasermembranmodule aus Polymeren, Kohlenstoff oder Keramik mit Trenngrenzen vom Ultrafiltrations- bis zum Sterilfiltrationsbereich eingesetzt werden. Bevorzugt werden Filtrationsmodule mit einer Porengröße von 0,2 //m oder 4 nm eingesetzt. Als Membranmaterialien können Polysulfone, Polyamide, Celluloseacetat, Aluminiumoxid oder Zirkonoxid eingesetzt werden. Die Filtration kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Sie beginnt etwa 2 - 3 Tage nach dem Animpfen des Fermenters und kann bis zum Ende der Fermentation fortgeführt werden. Die Überströmgeschwindigkeit der Fermenterlösung über die Filtrationsfläche beträgt zwischen 0,5 und 20 m/s, bevorzugt 1 bis 10 m/s.

Das Filtrat, das während der Fermentation aus dem Fermenter abgezogen wird, kann durch eine entsprechende Menge an Flüssigkeit ersetzt werden oder nach Abtrennung des Wertproduktes z.B. durch Absorbtion, kann das Filtrat in den Fermenter zurückgeführt werden. Dazu kann Wasser, angereichert mit entsprechenden Salzen oder anderen Nährmediumsbestandteilen, zugepumpt werden.

Das nicht durch die Membran permeierte Fiüssigkeitsvolumen wird wieder in den Fermenter zurückgeführt.

Der Fermenter und das Cross-flow Filtrationssystem werden mit entsprechenden Rohren oder Schläuchen verbunden und vor der Fermentation sterilisiert. Für einen 1001-Fermenter werden etwa 0,2 m ² Filtrationsfläche benötigt. Es können auch größere und kleinere Filtrationsflächen verwendet werden.

ERSATZ

Beispiel 1 :

Fermentation von Acremonium chrysogenum DSM 6473

Die Fermentation erfolgte in folgender Nährlösung:

Vorkulturmedium g/l

Cornsteep 11 ,75

Ammonium acetat 4,5

Saccharose 20,0

CaS0 ₄ -2H ₂ 0 0,5

MgS0 ₄ 7H ₂ 0 0,5 pH 7,0 (eingestellt mit 15 w% NaOH)

Fermentationsmedium g/l

fettfreies Erdnußmehl 100,0

Ammonium Acetat 6,0

Glucose Monohydrat 5,0

Methyloleat 5,0

D,L-Methionin 3,0

CaS0 ₄ 2H ₂ O 5,0

MgS0 ₄ 7H ₂ 0 5,0

CaC0 ₃ 5,0

Antischaummittel 0,5

Fed-batch Lösung:

Glucose Monohydrat 500,0

D,L-Methionin 24,75

Schrägagarkulturen werden zur Beimpfung von 100 ml Vorkulturmedium verwendet (500 ml Schüttelkolben mit 4 Schikanen). Die Kolben werden 48 Stunden mit 150

Umdrehungen pro Minute (Upm) bei 25 bis 28 °C inkubiert. Diese Kulturen werden zum Beimpfen einer weiteren Vorkultur verwendet (1000 ml Medium, 5000 ml Kolben, 25 bis 28 °C, 120 Upm, 58 bis 60 Stunden). Mit der zweiten Vorkultur werden 60 I Fermentationsmedium in einem Rührfermenter beimpft. Die Fermentation erfolgt bei 25 °C. Die Begasung wird so gesteuert, daß der p0 ₂ über 20 % in der Fermentationsnährlösung liegt.

Nach 74 Stunden Fermentation beginnt die Filtration mit einem Cross-flow-Keramikmodul (Fa. Membraflow, σ-AI ₂ 0 ₃ ) mit 0,2 m ² Filterfläche und 0,2 μm Porengröße. Es wurden folgende Prozeßparameter eingehalten: Überströmgeschwindigkeit: 2 m/s

Umpumpgeschwindigkeit: 1500 l/h

Filtrationsleistung: 2 l/h

Fitrationszeit: 68 Std.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Versuchsergebnisse nach 142 Stunden einer Fermentation ohne (A) und mit Cross-flow Filtration (B):

Tabelle 1:

Beispiel 2

Die Fermentation erfolgt wie in Beispiel 1. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse nach 167 Stunden einer Fermentation mit Cross-flow Filtration (B) im Vergleich zu einer Parallel-Fermentation ohne Filtration die nach 142 Stunden abgebrochen wurde:

Tabelle 2: