Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur dielektrophoretischen Manipulierung von suspendierten Partikeln, insbesondere zur Sortierung von suspendierten Partikeln, wie z. B. biologischen Zellen oder Mikrokompartimenten, in einem fluidischen Mikrosystem. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein fluidisches Mikrosystem, das zur dielektrophoretischen Manipulierung, insbesondere zur Sortierung, von suspendierten Partikeln eingerichtet ist. Anwendungen der Erfindung sind z. B. bei der Prozessierung von Partikeln, insbesondere von biologischen Zellen, Mikrokompartimenten oder anderen Mikroobjekten, in der Chemie, Medizin, Biologie oder Biochemie gegeben.

In der vorliegenden Beschreibung wird auf den folgenden Stand der Technik Bezug genommen, der den technischen Hintergrund der Erfindung darstellt:

[1] M. Boutros et al. (2015): Microscopy-based high-content screening. Cell 163, 1314-1325;

[2] N. Godino et al. (2019): Combining dielectrophoresis and computer vision for precise and fully automated single-cell handling and analysis. Lab Chip 19, 4016-4020;

[3] C. -T. Ho et al. (2005): Micromachined electrochemical T-switches for cell sorting applications. Lab Chip 5, 1248-1258;

[4] M. Kirschbaum et al. (2008): T cell activation on a single-cell level in dielectrophoresisbased microfluidic devices. J Chromatogr A. 1202 (1), 83-89;

[5] B. Landenberger et al. (2012): Microfluidic sorting of arbitrary cells with dynamic optical tweezers. Lab Chip 12, 3177-3183;

[6] M. Li et al. (2018): Cellular dielectrophoresis coupled with single-cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry 410, 2499-2 515;

[7] G. Meineke et al. (2016): A microfluidic opto-caloric switch for sorting of particles by using 3Dhydrodynamrc focusing based on SLE fabricatron capabilities. Lab Chip 16, 820-828;

[8] N. Nitta et al. (2018): Intelligent Image-Activated Cell Sorting. Cell 175(1 ):266-276;

[9] S. Sakuma et al. (2017): On-chip cell sorting by high-speed local-flow control using dual membrane pumps. Lab Chip 17, 2760-2767;

[10] Y. Shen et al. (2019): Recent advances in microfluidic cell sorting systems. Sensors & Actuators: B. Chemical 282, 268-281;

[11] DE 198 15 882 Al; [12] DE 198 60 117 Al; und

[13] DE 19860 118 CI.

In der Biologie und Medizin besteht ein starkes Interesse an der Charakterisierung und Verarbeitung heterogener Partikelproben, wie z. B. heterogener Zellproben. Es ist allgemein bekannt, dass die herkömmliche Durchflusszytometrie eine Charakterisierung großer Zellproben innerhalb kurzer Zeit anhand sehr einfacher Marker ("low-content"-Marker), wie z. B. Größe, Granularität oder integrale Fluoreszenzintensität der biologischen Zellen ermöglicht. Um auch strukturelle Eigenschaften von einzelnen Zellen oder künstlichen Mikrokompartimenten ortsaufgelöst zu erfassen ("high-content"-Marker), werden typischerweise Mikroskopietechniken verwendet. Die "high- content"-Marker sind für die moderne Biomedizin von hoher Relevanz, da z.B. biologische Prozesse oft durch die räumliche Anordnung zellulärer Bestandteile bestimmt werden [1], So äußern sich wichtige zelluläre Eigenschaften, wie z.B. die Antigenspezifizität von Immunzellen, Gerinnungsstörungen der Blutplättchen oder das Metastasierungspotential von Krebsstammzellen, über die Stärke und Art der Interaktion von Zellen untereinander, die örtliche Proteinverteilung innerhalb der Zelle und/oder über die Anzahl und Anordnung zellulärer Bestandteile.

Für funktionelle Analysen ist es wichtig, die Zellen anhand ihres Phänotyps nicht nur identifizieren, sondern auch sortieren zu können, was basierend auf der Durchflusszytometrie mit der Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Technik möglich ist. Verfügbare FACS-Geräte können jedoch mit Mikroskopietechniken bislang nicht kombiniert werden, weshalb nur "low-content"- Marker und keine "high-content"-Marker erfasst werden können. Aufgrund der Komplexität biologischer Prozesse reicht die FACS-Technik für viele Fragen der Biomedizin daher nicht aus, um einzelne Zelltypen bzw. Subpopulationen hinreichend voneinander abzugrenzen.

Eine Kombination mit Mikroskopietechnik ist für viele fluidische Mikrosysteme mit planaren Kanalstrukturen möglich. Mittels dieser Systeme können Mikroskop-Bilddaten aus Mikroskopietechniken oder Messdaten aus anderen komplexen Messtechniken somit direkt für die Identifizierung und Sortierung von Zellen anhand von "high-content"-Markern genutzt werden. Die Sortierung von sich hintereinander in einem Kanal eines fluidischen Mikrosystems bewegenden suspendierten Zellen kann mit mikromechanischen ([3]), optischen ([5]), hydrodynamischen ([7], [8] oder [9]), elektrokinetischen [2] oder anderen [10] Kräften erfolgen.

Während mikromechanische Ansätze aufwändig und kostenintensiv in der Fertigung sind, können hydrodynamische Kräfte oft nur mit geringer Präzision eingesetzt werden, und sie erfordern große bzw. aufwändig zu justierende mikromechanische Aktuatoren, was einer einfachen Parallelisierung derartiger Verfahren im Wege steht. Optische Kräfte sind sehr schwach und daher nur bei geringen Strömungsgeschwindigkeiten und im Sehfeld eines Mikroskops anwendbar, was den Anwendungsbereich stark einschränkt. Elektrokinetische Kräfte besitzen den Vorteil, dass sie mit im Kanal integrierten Elektroden hochparallel und mit einer hohen lokalen Präzision und Integrationsdichte unabhängig von der Messung der Zellen, insbesondere vom optischen Sehfeld eines Mikroskops, erzeugt werden können. Die Anwendung von elektrokinetischen Kräften basiert z. B. auf Dielektrophorese, bei der eine Kraftwirkung durch eine Polarisation der Zellen in inhomogenen hochfrequenten elektrischen Feldern erzeugt wird ([6]).

Typischerweise werden in einem Kanal eines fluidischen Mikrosystems zur Erzeugung dielektrophoretischer Kräfte auf der Ober- und Unterseite des Kanals angeordnete Elektroden mit hochfrequenten elektrischen Feldern beaufschlagt, so dass abstoßende Kräfte auf die Zellen ausgeübt werden und durch die Elektroden eine Feldbarriere gebildet wird (negative Dielektrophorese, siehe z. B. [4], [11], [12] und [13]).

Ein Beispiel eines Kanals 10' eines fluidischen Mikrosystems 100' mit zwei Paaren von Elektroden 21A', 21B' ist in Figur 2 (Stand der Technik, siehe z. B. [11], [12] und [13]) gezeigt, wobei nur die Elektroden an der Kanalunterseite dargestellt sind. Je nachdem, ob ein elektrisches Feld an den Elektroden 21A', 21B' anliegt oder nicht, ist es suspendierten Zellen I ¹ unmöglich oder möglich, die jeweiligen Feldbarrieren zu passieren. Beispielsweise können die Zellen I ¹ die nicht aktivierten Elektroden 21A ¹ passieren und die aktivierten Elektroden 21B ¹ nicht passieren. Da die Elektroden 21A', 21B' mit einem Ablenkwinkel a' schräg zur Strömungsrichtung im Kanal angeordnet sind, werden die Zellen durch die Überlagerung der Strömungskräfte in der Strömung der Suspensionsflüssigkeit und der dielektrophoretischen Kräften entlang den Elektroden bzw. Feldbarrieren auf eine andere Strömungsbahn im Kanal geführt, oder sie folgen weiterhin ihrer ursprünglichen Strömungsbahn.

Bei einer Sortierungsanwendung, die beispielhaft in Figur 3 (Stand der Technik, siehe z. B. [11], [12] und [13]) gezeigt ist, sollen Zellen 1A ¹ , 1B ¹ im fluidischen Mikrosystem 100' aufeinander folgend durch den mit einem Mikroskop 40' ausgestatteten planaren Kanal 10' gespült und an einer Weiche mit einer Elektrode 21' in Abhängigkeit von mit dem Mikroskop 40' erfassten Eigenschaften der Zellen 1A', 1B' zu unterschiedlichen Teilkanälen 11', 12' des Mikrosystems 100' gelenkt werden. Die Abfolge der Zellen 1A', 1B' im Kanal 10' sollte wenigstens im Zeitintervall zwischen der Bildaufnahme mit dem Mikroskop 40' und dem Sortiervorgang (insbesondere während des für die Bildverarbeitung benötigten Zeitraums) aufrechterhalten oder zumindest messtechnisch verfolgt werden, da andernfalls eine korrekte Zuordnung zwischen erfasster und analysierter und zu sortierender Zelle kaum möglich ist.

Die Zuverlässigkeit der Elektrodenfunktion, mit der die Partikel von ihren hydrodynamischen Strömungslinien (Bewegungsbahnen) bei gegebener Strömungsgeschwindigkeit abgelenkt werden können, hängt vom Ablenkwinkel der ablenkenden Elektrode relativ zur Kanal- und Strömungsrichtung (Winkel zwischen Kanalrichtung und Längsrichtung der Elektrodenausdehnung) ab. Je kleiner der Ablenkwinkel ist, desto zuverlässiger arbeitet die Elektrode. Dies bedeutet, dass bei Vorgabe eines bestimmten Zielversatzes (Verschiebung der Partikel senkrecht zur Strömungsrichtung) mit sinkendem Ablenkwinkel die erforderliche Wechselwirkungslänge (oder: Erfassungslänge) der Elektrode größer wird. Die Zuverlässigkeit insbesondere der Sortierfunktion der Elektrode 21' steht somit insbesondere mit der Wechselwirkungslänge L' der Elektrode 21' in Längsrichtung (Strömungsrichtung) des Kanals 10' in Zusammenhang. Die Elektrode 21' gemäß Figur 3 hat eine größere Wechselwirkungslänge L' und damit eine größere Zuverlässigkeit der Sortierfunktion als die Elektrode 21B' gemäß Figur 2.

Die Wechselwirkungslänge L' bestimmt allerdings auch den minimalen Abstand der hintereinander im Kanal 10' strömenden Zellen 1', für den die einzelnen Zellen 1' noch unabhängig voneinander gehandhabt werden können und ihre fehlerfreie Sortierung ermöglicht wird, ohne nachfolgende Zellen 1A' ebenfalls zu erfassen oder zu beeinflussen. Beispielsweise ist in der in Figur 3 gezeigten Situation die Zelldichte so hoch, dass die verschiedenen Zellen 1A', 1B' nicht wie gewünscht getrennt und zu den unterschiedlichen Teilkanälen 11', 12' gelenkt werden können.

Es besteht ein Interesse, Durchfluss-Sortier-Verfahren mit einem möglichst hohen Durchsatz (Anzahl der prozessierten Zellen pro Zeiteinheit) auszuführen. Der Durchsatz ist gleich dem Produkt aus Strömungsgeschwindigkeit und Zelldichte der Probe. Zwischen beiden Größen besteht ein Zielkonflikt: Eine hohe Strömungsgeschwindigkeit erfordert zur Erhaltung der Zuverlässigkeit der Sortierfunktion eine große Wechselwirkungslänge der Elektrode, während für eine hohe Zelldichte eine geringe Wechselwirkungslänge der Elektrode wünschenswert ist. Zur Erzielung eines hohen Durchsatzes, d. h. für eine Sortierung mit hoher Zelldichte und hoher Strömungsgeschwindigkeit, besteht also ein Interesse, Elektroden mit einer geringen Wechselwirkungslänge zu verwenden und zugleich eine Beeinträchtigung der Zuverlässigkeit der Elektrodenfunktion bei der hohen Strömungsgeschwindigkeit zu vermeiden. Die herkömmlichen Techniken, z. B. gemäß [11], [12] und [13], zeichnen sich jedoch durch eine relativ große Wechselwirkungslänge der Elektroden aus, so dass die genannten Anforderungen bei der Manipulation von Zellen durch dielektrophoretische Kräfte nicht oder nur beschränkt erfüllt werden können.

Aus [12] und [13] ist bekannt, Elektroden, deren Gesamtlänge den Partikeldurchmesser mit einem Faktor 20 bis 50 übersteigt, in einzelne Elektrodensegmente zu unterteilen. Die Funktion der herkömmlichen Unterteilung ist es, mit den Elektrodensegmenten zusätzliche Freiheitsgrade bei der Gestaltung eines von einer Elektrode erzeugten Feldes oder der Form der Feldbarriere zu schaffen. Beispielweise können bei der Ansteuerung von Elektrodensegmenten gemäß [12] einzelne Elektrodensegmente deaktiviert (abgeschaltet) werden, um Partikel auf eine bestimmte Trajekto- rie im Kanal des Mikrosystems durchzulassen, während alle anderen Elektrodensegmenten gemeinsam aktiviert sind. In [13] wird ein flächiges Array von punktförmigen Elektrodensegmenten beschrieben, das eine flexible Gestaltung der Form der Feldbarriere durch Ansteuerung ausgewählter Elektrodensegmente innerhalb des Arrays erlaubt. Die herkömmliche Segmentierung der Elektroden erlaubt jedoch keine gleichzeitige Erhöhung des Durchsatzes und der Zuverlässigkeit der Partikelmanipulation.

Die genannten Beschränkungen der herkömmlichen Techniken treten nicht nur bei der Manipulation biologischer Zellen, sondern auch bei nicht-biologischen Partikeln, wie z. B. künstlichen Mikrokompartimenten oder Trägerpartikeln von chemischen Substanzen auf.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zum Betrieb eines fluidischen Mikrosystems zur dielektrophoretischen Manipulierung von suspendierten Partikeln in einer Suspensionsflüssigkeit und/oder ein verbessertes fluidisches Mikrosystem zur dielektrophoretischen Manipulierung von suspendierten Partikeln bereitzustellen, mit denen Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden. Die dielektrophoretische Manipulierung der suspendierten Partikeln soll insbesondere mit einer erhöhten Partikeldichte erfolgen können, ohne die Zuverlässigkeit der Elektrodenfunktion zu beeinträchtigen. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Betrieb eines fluidischen Mikrosystems bzw. durch ein fluidisches Mikrosystem gelöst, welche die Merkmale der unabhängigen Ansprüche aufweisen. Bevorzugte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Verfahren zum Betrieb eines fluidischen Mikrosystems zur dielektrophoretischen Manipulierung von suspendierten Partikeln mit einem vorbestimmten Partikeldurchmesser in einer Suspensionsflüssigkeit gelöst. Das fluidische Mikrosystem umfasst einen Kanal mit einer Längsrichtung, eine Elektrodeneinrichtung mit einer langgestreckten Elektrode (Ablenkelektrode), deren Längsausdehnung von der Längsrichtung des Kanals abweicht und die eine Vielzahl von einzeln ansteuerbaren Elektrodensegmenten (Teilelektroden) zur Erzeugung von auf die Partikel wirkenden, dielektrophoretischen Kräften aufweist, wobei jedes Elektrodensegment einen Ablenkwinkel (Elektrodenwinkel) («^relativ zu der Längsrichtung des Kanals und eine Segmentlänge (si) aufweist, die einen Segmentversatz (Di) quer zur Längsrichtung des Kanals bestimmen, und eine Steuereinrichtung, mit der die Elektrodensegmenten ansteuerbar sind.

Das Verfahren zum Betrieb des fluidischen Mikrosystems umfasst die Schritte Erzeugung einer Strömung der Suspensionsflüssigkeit mit einer Strömungsgeschwindigkeit in dem Kanal, so dass die suspendierten Partikel aufeinanderfolgend einen Wechselwirkungsbereich der Elektrode passieren, der von den Elektrodensegmenten aufgespannt wird, und Ansteuerung der Elektrodensegmente zur Ablenkung der Partikel im Kanal jeweils auf vorbestimmte Bewegungsbahnen, die durch eine Überlagerung von Strömungskräften in der Strömung der Suspensionsflüssigkeit und von den dielektrophoretischen Kräften bestimmt werden, die an den Elektrodensegmenten erzeugt werden.

Gemäß der Erfindung wird bei der Passage jedes Partikels jedes der Elektrodensegmente, an denen das Partikel aufeinanderfolgend vorbeitritt, mit der Steuereinrichtung in Abhängigkeit von der gewünschten Bewegungsbahn jeweils für eine vorbestimmte Aktivierungsdauer getaktet angesteuert. Die Aktivierungsdauer jedes Elektrodensegments wird durch den Quotienten aus der Segmentlänge (si) des Elektrodensegments und der Strömungsgeschwindigkeit bestimmt. Des Weiteren sind gemäß der Erfindung die Elektrodensegmente so dimensioniert, dass der Segmentversatz (Di) von jedem Elektrodensegment kleiner als der Partikeldurchmesser ist, und für die Ablenkung der Partikel jeweils mindestens zwei aufeinanderfolgende Elektrodensegmente Zusammenwirken. Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein fluidisches Mikrosystem gelöst, das zur dielektrophoretischen Manipulierung von Partikeln mit einem vorbestimmten Partikeldurchmesser in einer Suspensionsflüssigkeit eingerichtet ist. Das Mikrosystem umfasst einen Kanal mit einer Längsrichtung, eine Elektrodeneinrichtung mit einer langgestreckten Elektrode, deren Längsausdehnung von der Längsrichtung des Kanals abweicht und die eine Vielzahl von einzeln ansteuerbaren Elektrodensegmenten zur Erzeugung von auf die Partikel wirkenden, dielektrophoretischen Kräfte aufweist, wobei jedes Elektrodensegment einen Ablenkwinkel (aj relativ zu der Längsrichtung des Kanals und eine Segmentlänge (si) aufweist, die einen Segmentversatz (Di) quer zur Längsrichtung des Kanals bestimmen, und eine Steuereinrichtung, mit der die Elektrodensegmente ansteuerbar sind. Der Kanal ist zur Aufnahme einer Strömung der Suspensionsflüssigkeit mit einer Strömungsgeschwindigkeit derart eingerichtet, dass die suspendierten Partikel aufeinanderfolgend einen Wechselwirkungsbereich der Elektrode durchlaufen, der von den Elektrodensegmenten aufgespannt wird. Die Steuereinrichtung ist zur Ansteuerung der Elektrodensegmente zur Ablenkung der Partikel im Kanal jeweils auf vorbestimmte Bewegungsbahnen eingerichtet, die durch eine Überlagerung von Strömungskräften in der Strömung der Suspensionsflüssigkeit und von den dielektrophoretischen Kräften bestimmt werden, die an den Elektrodensegmenten erzeugt werden.

Gemäß der Erfindung ist die Steuereinrichtung dazu eingerichtet, bei der Passage jedes Partikels jedes der Elektrodensegmente, an denen das Partikel aufeinanderfolgend vorbeitritt, in Abhängigkeit von der gewünschten Bewegungsbahn jeweils für eine vorbestimmte Aktivierungsdauer getaktet anzusteuern, wobei die Aktivierungsdauer jedes Elektrodensegments durch den Quotienten aus der Segmentlänge (si) des Elektrodensegments und der Strömungsgeschwindigkeit bestimmt wird. Des Weiteren sind gemäß der Erfindung die Elektrodensegmente so dimensioniert, dass der Segmentversatz (Di) von jedem Elektrodensegment kleiner als der Partikeldurchmesser ist. Des Weiteren ist gemäß der Erfindung die Steuereinrichtung dazu eingerichtet, die Elektrodensegmente so anzusteuern, dass für die Ablenkung der Partikel jeweils mindestens zwei aufeinanderfolgende Elektrodensegmente Zusammenwirken.

Vorzugsweise wird das Verfahren gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder einer seiner bevorzugten Ausführungsformen mit dem fluidischen Mikrosystem gemäß dem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder einer seiner bevorzugten Ausführungsformen ausgeführt. Vorteilhafterweise wird die Aufgabe der Erfindung insbesondere dadurch gelöst, dass die Elektrodensegmente einer Elektrode Partikel-spezifisch getaktet, d. h. jeweils für die vorbestimmte Aktivierungsdauer, angesteuert werden. Die Aktivierungsdauer ist mindestens gleich dem Zeitintervall, welches ein Partikel für die Passage eines Elektrodensegments benötigt. Jedes Partikel tritt an jedem der Elektrodensegmente für ein bestimmtes Zeitintervall vorbei, das durch die Segmentlänge und die Strömungsgeschwindigkeit bestimmt wird. Da die Zeitintervalle der Passage jedes Partikels an jedem der Elektrodensegmente und somit auch die Lage der Zeitintervalle relativ zueinander vorgegeben sind, können die Elektrodensegmente für die Aktivierungsdauern einzeln spezifisch angesteuert werden.

Im Unterschied zu [12] ist erfindungsgemäß vorgesehen, alle Elektrodensegmente laufend Partikel-spezifisch anzusteuern. Die Ansteuerung der Elektrodensegmente wandert mit den Partikeln mit, welche an die Elektrode gelangen. Die Ansteuerung eines Elektrodensegments zu einem bestimmten Zeitpunkt wirkt sich ausschließlich auf das Partikel aus, welches das betrachtete Elektrodensegment passiert. Zugleich bleibt die Ansteuerung des Elektrodensegments ohne Einfluss auf Partikel, die sich zu dem Zeitpunkt an anderen Elektrodensegmenten der Elektrode befinden. Entsprechend können die Partikel mit einer größeren Zelldichte (Anzahl von Zellen pro Länge im Kanal) an der Elektrode vorbeitreten, so dass der Durchsatz steigt. Die Elektrode hat für jedes Partikel eine spezifische, ggf. unterschiedliche Wirkung, selbst wenn sich mehrere Partikel innerhalb der Wechselwirkungslänge der Gesamtelektrode befinden.

Da des Weiteren abweichend von [12] der Segmentversatz (Di) von jedem Elektrodensegment kleiner als der Partikeldurchmesser ist und für die Ablenkung jedes Partikels jeweils mindestens zwei aufeinanderfolgende Elektrodensegmente Zusammenwirken, kann erfindungsgemäß die Strömungsgeschwindigkeit im Mikrosystem relativ hoch gewählt sein, ohne dass Nachteile aufgrund der dadurch hohen Gesamt-Wechselwirkungslänge der Elektrode in Bezug auf die Partikeldichte in Kauf genommen werden müssen.

Vorteilhafterweise wird der o. g. Zielkonflikt zwischen der Strömungsgeschwindigkeit und der Zelldichte der Probe gelöst. Es können Proben mit einer vergrößerten Dichte auch bei hoher Strömungsgeschwindigkeit zuverlässig manipuliert, insbesondere sortiert werden.

Die dielektrophoretische Manipulierung der Partikel umfasst allgemein eine Verschiebung von Partikeln durch das Zusammenwirken der dielektrophoretischen Kräfte und der Strömungskräfte auf vorbestimmte Bewegungsbahnen innerhalb des Kanals des Mikrosystems, beispielsweise für eine Verteilung der Partikel auf die Bewegungsbahnen, eine Änderung der Reihenfolge der Partikel oder vorzugsweise eine Sortierung der Partikel in verschiedene Kanäle stromabwärts von der Elektrodeneinrichtung. Um ein Partikel ausgehend von einer anfänglichen Bewegungsbahn auf eine andere Bewegungsbahn innerhalb des Kanals des Mikro systems zu bewegen, werden mit der Steuereinrichtung die Elektrodensegmente, an denen das Partikel aufeinanderfolgend vorbeitritt, aufeinanderfolgend aktiviert, bis das Partikel durch den Segmentversatz an jeweils aktivierten Elektrodensegmenten die gewünschte Bewegungsbahn erreicht, und das in dieser befindliche Elektrodensegment nicht aktiviert.

Vorteilhafterweise ist die Erfindung mit verschiedenen Arten von Partikeln anwendbar, die z. B. biologische Partikel, wie biologische Zellen oder deren Bestandteile, oder nicht-biologische Partikel, wie Trägerpartikel mit chemischen Substanzen oder Makromoleküle, umfassen. Alle Partikel können den gleichen Durchmesser haben (homogene Partikelprobe). Alternativ können die Partikel jeweils verschiedene Durchmesser haben (heterogene Partikelprobe), wobei in diesem Fall der Segmentversatz kleiner als der kleinste Partikeldurchmesser ist. Die Partikel umfassen allgemein Mikroobjekte mit einer charakteristischen Größe, z. B. Durchmesser, die vorzugsweise gleich oder größer 1 pm und/oder gleich oder kleiner 1 mm ist. Dieser Größenbereich hat insbesondere Vorteile in Bezug auf die Beobachtbarkeit der Partikel mit einem ausreichenden optisches Auflösungsvermögen, die dielektrophoretischen Kräfte, und/oder die Erhaltung laminarer Strömungsbedingungen. Die Partikel können biologische Partikel, wie z. B. tierische oder pflanzliche Zellen oder Bakterien oder Zellcluster, umfassen. Die Durchmesser von biologischen Zellen liegen z. B. im Bereich von 5 pm bis 25 pm, und die Durchmesser von Zellclustern liegen z. B. im Bereich von 25 pm bis 250 pm. Alternativ oder zusätzlich können die Partikel nicht-biologische Mikroobjekte, wie z. B. Kunststoffpartikel und/oder Halbleiterpartikel, umfassen. Die Suspensionsflüssigkeit ist ein flüssiges Medium, wie z. B. eine wässrige Lösung, im Fall der Manipulierung biologischer Zellen insbesondere eine physiologisch verträgliche Flüssigkeit oder ein Kultivierungsmedium.

Eine "Elektrode" ist typischerweise aus zwei zueinander kongruenten Gruppen von Elektrodensegmenten an einander gegenüberliegenden Kanalwänden, z. B. Kanalunterseite und Kanaloberseite, gebildet. Alternativ kann eine Elektrode eine einzige Gruppe von Elektrodensegmenten an einer einzigen Kanalwand umfassen. Die langgestreckte Elektrode, deren Längsausdehnung von der Längsrichtung des Kanals abweicht, hat typischerweise die Form eines geraden, stückweise geraden oder gekrümmten, aus den aufeinanderfolgend angeordneten Elektrodensegmenten zusammengesetzten Streifens, der mit der Längsrichtung des Kanals den Ablenkwinkel einschließt. Zueinander weisende Enden der Elektrodensegmente sind voneinander getrennt und elektrisch isoliert. Die Elektrodensegmente können sämtlich den gleichen oder jeweils verschiedene Ablenkwinkel aufweisen. Im Fall gekrümmter Elektrodensegmente kann der Ablenkwinkel durch eine Tangente am Elektrodensegment, zum Beispiel an einem seiner Enden oder seiner Mitte, bestimmt werden.

Mit der Elektrode erfolgt die Ablenkung der Partikel im Kanal jeweils auf vorbestimmte Bewegungsbahnen. Die Bewegungsbahnen sind Strömungswege oder Trajektorien der Partikel, die im Kanal in Strömungsrichtung nebeneinander angeordnet sind. Im Bereich der Elektrodeneinrichtung hat der Kanal bevorzugt einen geraden Verlauf, und die Bewegungsbahnen verlaufen entsprechend dem Strömungsprofil einer im Kanal gebildeten laminaren Strömung parallel.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können die folgenden Merkmale einzeln oder in Kombination vorgesehen sein. Die Segmentlängen (si) der Elektrodensegmente können kleiner oder gleich dem 10-fachen Partikeldurchmesser, insbesondere kleiner oder gleich dem doppelten oder sogar kleiner oder gleich dem einfachen Partikeldurchmesser, sein. Vorteilhafterweise werden damit kürzere lokale Wechselwirkungslängen der einzelnen Elektrodensegmente als im Stand der Technik realisiert. Die Erfassungslänge wird verkürzt und der Platzbedarf im Mikrosystem wird verringert. Die Segmentlängen (si) der Elektrodensegmente können z. B. kleiner oder gleich 50 pm, insbesondere kleiner oder gleich 10 pm, sein. Des Weiteren sind die Segmentlängen vorzugsweise mindestens gleich oder größer als der zehnte Teil des Partikeldurchmessers. Alternativ oder zusätzlich können die Ablenkwinkel (a der Elektrodensegmente geringer als 10°, insbesondere geringer als 5° bis nahezu 0° sein. Die Ablenkwinkel (aj der Elektrodensegmente sind insbesondere deutlich geringer als die Ablenkwinkel, die z. B. in [12] offenbart sind. Vorteilhafterweise werden durch die geringen Ablenkwinkel die Zuverlässigkeit der von der Elektrode gebildeten Feldbarriere und die Zuverlässigkeit der Manipulierung der Partikel verbessert.

Die Aktivierungsdauern der Elektrodensegmente können in Abhängigkeit von der Partikelgröße und der Strömungsgeschwindigkeit gewählt werden. Beispielsweise können, insbesondere bei einem Partikeldurchmesser von 100 pm und einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mm / s, die Aktivierungsdauern der Elektrodensegmente gleich oder kleiner 100 ms, insbesondere gleich oder kleiner 50 ms, sein, besonders bevorzugt bei 20 ms oder 30 ms oder sogar darunter gewählt sein. Vorteilhafterweise ermöglichen derart kurze Aktivierungsdauern der Elektrodensegmente eine Erhöhung des Durchsatzes der Partikelmanipulierung aufgrund einer höher wählbaren Vortriebsgeschwindigkeit / Strömungsgeschwindigkeit. Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind eine Positionserfassung zur Ermittlung mindestens einer Partikelposition jedes Partikels und eine Ansteuerung der Elektrodensegmente in Abhängigkeit von der mindestens einen Partikelposition jedes Partikels vorgesehen. Vorteilhafterweise kann durch die Positionserfassung eine Folge von Zeitabschnitten, in denen das jeweilige Partikel an den einzelnen Elektrodensegmenten vorbeitritt, ermittelt werden. Die Aktivierungsdauern der Elektrodensegmente entsprechen den erfassten Zeitabschnitten. Die Elektrodensegmente können für jedes Partikel für die Dauer der jeweiligen Zeitabschnitte aktiviert oder nicht aktiviert werden.

Vorzugsweise ist das fluidische Mikrosystem entsprechend mit einer Positionserfassungseinrichtung ausgestattet, mit der die mindestens eine Partikelposition jedes Partikels erfassbar ist, wobei die Steuereinrichtung zur Ansteuerung der Elektrodensegmente in Abhängigkeit von der mindestens einen Partikelposition jedes Partikels eingerichtet ist.

Gemäß einer vorteilhaften Variante umfasst die Positionserfassung eine Beobachtung des Wechselwirkungsbereiches der Elektrode mit einer Mikroskopeinrichtung, wobei die Elektrodensegmente, an denen das Partikel aufeinanderfolgend vorbeitritt, mit der Mikroskopeinrichtung unmittelbar erfasst werden. Entsprechend umfasst die Positionserfassungseinrichtung des Mikrosystems die Mikroskopeinrichtung, die zur Beobachtung des Wechselwirkungsbereiches der Elektrode und zur unmittelbaren Erfassung der Elektrodensegmente angeordnet ist, an denen das Partikel aufeinanderfolgend vorbeitritt. Diese Variante ist besonders von Vorteil, wenn die Positionserfassung zugleich eine Sortierentscheidung in Echtzeit, d. h. ohne oder mit vernachlässigbar geringer Verzögerung erlaubt.

Gemäß einer alternativen, besonders bevorzugten Variante umfasst die Positionserfassung eine Beobachtung eines Beobachtungsbereichs stromaufwärts von dem Wechselwirkungsbereich der Elektrode mit einer Mikroskopeinrichtung, wobei der Beobachtungsbereich von jedem der Elektrodensegmente durch eine vorbestimmte Kanallänge beabstandet ist und die Elektrodensegmente, an denen das Partikel aufeinanderfolgend vorbeitritt, aus einer Beobachtungs-Zeit der Partikel in dem Beobachtungsbereich, den Kanallängen und der Strömungsgeschwindigkeit ermittelt werden. Entsprechend bildet die Mikroskopeinrichtung eine Positionserfassungseinrichtung des Mikrosystems, die stromaufwärts von der Elektrode angeordnet ist. Vorteilhafterweise kann die Positionserfassung mit einer Bildverarbeitung zur Erkennung von Partikelmerkmalen kombiniert werden, wobei durch die Laufzeit jedes Partikels entlang der Kanallänge genügend Zeit für die Bildverarbeitung und z. B. eine Sortierentscheidung zur Verfügung steht. Gemäß einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Erfassung mindestens einer Partikeleigenschaft jedes Partikels vorgesehen, wobei die Ansteuerung der Elektrodensegmente in Abhängigkeit von der mindestens einen Partikeleigenschaft erfolgt. Vorzugsweise ist die Steuereinrichtung zur Ansteuerung der Elektrode in Abhängigkeit von mindestens einer Partikeleigenschaft eingerichtet. Die Partikeleigenschaft umfasst vorzugsweise mindestens eines von einer Partikelstruktur und mindestens einer Partikelsubstanz.

Die Partikeleigenschaft wird beispielsweise mit optischen und/oder photonischen Verfahren, z. B. Streuungsmessungen, und/oder mit linsenloser Röntgenbeugung erfasst. Besonders bevorzugt wird die Partikeleigenschaft mit der Mikroskopeinrichtung in Verbindung mit einer Bildanalyseeinrichtung erfasst, mit der mindestens eine Partikeleigenschaft aus Bilddaten jedes Partikels ermittelbar sind.

Eine Bilddaten-basierte Partikelsortierung, insbesondere Zellsortierung, mit hohem Durchsatz ist für alle Bereiche der Lebenswissenschaften und zellbasierten Medizin von großem Vorteil. Eine präzise und sichere Isolierung von Zellen insbesondere im klinischen Kontext liefert neue zelltherapeutische Wege und Standards mit hohem gesellschaftlichen und wirtschaftlichen Potential (z.B. bei der CAR-T-Zell-Therapie). Die Bilddaten-basierte Sortierung von Zellen hat des Weiteren Anwendungen in der biomedizinischen Grundlagenforschung, insbesondere in der Wirkstoffentwicklung, wie z.B. die Bereiche Drug-Screening, der Immunonkologie oder der Stammzellherstellung.

Vorzugsweise wird eine Verteilung der Partikel im Mikrosystem derart gewählt, dass sich im Wechselwirkungsbereich der Elektrode mehrere Partikel befinden, wobei sich im zeitlichen Mittel an jedem Elektrodensegment höchstens eines der Partikel befindet. Vorteilhafterweise kann die Verteilung der Partikel gleichzeitig mit der Erfassung mindestens einer Partikeleigenschaft ermittelt werden. Partikel mit einem derart geringen Abstand, dass mindestens zwei Partikel gleichzeitig ein Elektrodensegment passieren, können erkannt und verworfen werden.

Gemäß einer bevorzugten Anwendung der Erfindung bei der Partikelsortierung ist vorgesehen, dass sich der Kanal des Mikrosystems stromabwärts von dem Wechselwirkungsbereich der Elektrode in mehrere Teilkanäle aufteilt und jedes der Partikel durch die Ansteuerung der Elektrodensegmente in Abhängigkeit von der jeweiligen mindestens einen Partikeleigenschaft in einen der Teilkanäle bewegt wird. In diesem Fall ist die Steuereinrichtung eingerichtet, jedes der Partikel durch die Ansteuerung der Elektrode in Abhängigkeit von der mindestens einen Partikeleigenschaft des Partikels in einen der Teilkanäle zu bewegen. Vorteilhafterweise kann die Sortierfunktion der Elektrode Partikel-spezifisch erfüllt werden, selbst wenn sich mehrere Partikel innerhalb der Wechselwirkungslänge der Elektrode befinden. Jedes Elektrodensegment, an dem sich ein Partikel aktuell befindet, wird entsprechend der erfassten Partikeleigenschaft und Sortierentscheidung angesteuert (aktiviert oder nicht aktiviert).

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die Strömungsgeschwindigkeit der Suspension mit einem Regelkreis auf einen vorgegeben konstanten Wert eingestellt. Vorzugsweise ist das Mikrosystem, insbesondere die Steuereinrichtung, mit dem Regelkreis gekoppelt. Vorteilhafterweise erlaubt eine konstante Strömungsgeschwindigkeit eine erhöhte Genauigkeit der Einstellung der Aktivierungsdauer der Elektrodensegmente.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Die Zeichnungen zeigen in:

Figur 1: eine schematische Illustration von Merkmalen von Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen fluidischen Mikrosystems; und

Figuren 2 und 3: schematische Illustrationen von herkömmlichen fluidischen Mikrosystemen.

Merkmale von Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden beispielhaft unter Bezug auf eine Sortierung von biologischen Zellen an einer Y-Verzweigung eines Kanals eines fluidischen Mikrosystems in zwei Teilkanäle beschrieben. Es wird betont, dass die Anwendung der Erfindung nicht auf dieses Beispiel beschränkt, sondern entsprechend bei einer anderen Manipulierung von Partikeln, z. B. für deren Verschiebung auf eine von mehr als zwei Bewegungsbahnen im Kanal, z. B. für eine Umverteilung oder Änderung der Partikelabstände, möglich ist. Anstelle der Manipulation biologischer Zellen kann erfindungsgemäß eine Manipulation anderer, insbesondere nichtbiologischer Partikel vorgesehen sein. Bei der Umsetzung der Erfindung in der Praxis können insbesondere Größen und Formen der Teile des Mikrosystems in Abhängigkeit von den Anforderungen der konkreten Anwendung gewählt werden. Einzelheiten des Aufbaus und des Betriebs fluidischen Mikrosystems, insbesondere der Erzeugung hochfrequenter elektrischer Felder zur Elektrodenansteuerung, und der Erfassung von Partikeleigenschaften, z. B. durch eine Verarbeitung von Messdaten eines Mikroskops, werden nicht beschrieben, da diese an sich aus dem Stand der Technik bekannt sind.

Figur 1 zeigt in schematischer Draufsicht den Kanal 10 des fluidischen Mikrosystems 100 mit einer Elektrodeneinrichtung 20, einer Steuereinrichtung 30 und einer Mikroskopeinrichtung 40. Der Kanal 10 erstreckt sich gerade in einer Längsrichtung z bis zu einer Verzweigung in Teilkanäle 11, 12. Der Kanal 10 hat z. B. einen rechteckigen Querschnitt mit einer Breite im Bereich von 20 pm bis 1000 mm und einer Höhe im Bereich von 5 pm bis 1 mm. Die ebene Unterseite wird auch als Kanalboden 13 und die ebene Oberseite als Deckfläche (nicht gezeigt) bezeichnet. Im Kanal befinden sich Zellen 1, 1A, die in einer Suspensionsflüssigkeit 2 suspendiert sind. Bei Betätigung einer Pumpeinrichtung 14 wird im Kanal 10 eine Strömung der Suspensionsflüssigkeit mit einer Strömungsrichtung erzeugt, die mit der Längsrichtung z übereinstimmt.

Die Elektrodeneinrichtung 20 umfasst die Elektrode 21, die in eine Vielzahl von Elektrodensegmenten 22 unterteilt ist. Im dargestellten Beispiel hat die Elektrode 21 die Form eines geraden Streifens, der durch die aufgereihten geraden Elektrodensegmente 22 gebildet wird. In Figur 1 ist nur die Elektrode 21 am Kanalboden 13 gezeigt. An der Deckfläche ist vorzugsweise eine weitere Elektrode (nicht gezeigt) mit der gleichen Größe und Form und Ausrichtung relativ zum Kanal 10 oder alternativ eine flächige Gegenelektrode angeordnet. Die Längsausdehnung der Elektrode 21 bildet mit der Längsrichtung z des Kanals 10 einen Ablenkwinkel a _L , der wegen der geraden Elektrodenform den Ablenkwinkel «Jedes Elektrodensegments 22 bildet. Die Elektrodensegmente 22 haben entlang der Längsrichtung z des Kanals 10 eine Segmentlänge s; und quer zur Längsrichtung z des Kanals 10 einen Segmentversatz Di. Entsprechend ist jedem Elektrodensegment 22 eine Wechselwirkungslänge zugeordnet. Die Wechselwirkungslänge (Erfassungslänge) L der gesamten Elektrode 21 ergibt sich aus der Summe der einzelnen Wechselwirkungslängen der Elektrodensegmente 22 und deren gegenseitigen Abständen. Im dargestellten Beispiel haben alle Elektrodensegmente 22 die gleiche Wechselwirkungslängen .

Die Elektrode 21 ist in die Elektrodensegmente 22 unterteilt, um bei einem möglichst geringen Ablenkwinkel mit einer möglichst hohen Zelldichte arbeiten zu können, wodurch eine stufenweise Ablenkung der Zellen bei minimaler Breite des Segmentversatzes D; (Sortierfenster) möglich wird. Idealerweise erfolgt die Unterteilung so, dass die Breite des Segmentversatzes D; in der Größenordnung des Zelldurchmessers liegt. Die einzelnen Elektrodensegmente 22 können nacheinander an- bzw. wieder ausgeschaltet werden, so dass immer nur dasjenige Elektrodensegment 22 aktiv ist, an dem sich die zu sortierende Zelle befindet. Auch sehr dicht nachfolgende Zellen können so unabhängig von der vorausgehenden Zelle gehandhabt werden. In einer konkreten Ausführungsform sind z. B. 20 Elektrodensegmente 22 jeweils mit einer Segmentlänge s; von 20 pm und einem Ablenkwinkel a, von 3° vorgesehen, wobei sich eine Wechselwirkungslänge L der gesamten Elektrode 21 von 0,2 mm ergibt. Die Breite der Elektrode 21 beträgt z. B. 10 pm.

Die Steuereinrichtung 30 umfasst eine Elektrodenspannungsquelle 31 und eine Computereinheit 32. Mit der Computereinheit 32 werden die Elektrodenspannungsquelle 31, die Mikroskopeinrichtung 40 und die Pumpeinrichtung 14 angesteuert. Des Weiteren ist die Computereinheit 32 zur Analyse von Bilddaten der Mikroskopeinrichtung 40, zur Erfassung von Partikeleigenschaften der Zellen 1, 1A und zur Erzeugung einer Sortierentscheidung in Abhängigkeit von den erfassten Partikeleigenschaften ausgelegt. Die Elektrodenspannungsquelle 31 ist zur Erzeugung hochfrequenter elektrischer Spannungen zur Ansteuerung der Elektrode 21 ausgelegt. Erfindungsgemäß wird jedes Elektrodensegment 22 einzeln angesteuert. Hierzu weist die Elektrodenspannungsquelle 31 eine Gruppe von Ausgangskanälen auf, deren Anzahl gleich der Anzahl der Elektrodensegmente 22 ist. Jeder Ausgangskanal ist jeweils mit einem der Elektrodensegmente 22 der Elektrode 21 und mit einem der Elektrodensegmente der nicht gezeigten Elektrode an der Deckfläche des Kanals 10 verbunden.

Die Mikroskopeinrichtung 40 umfasst z. B. ein Durchlicht- oder Fluoreszenz-Mikroskop, das zur Bilderfassung in einem Beobachtungsbereich stromaufwärts von dem Wechselwirkungsbereich der Elektrode 21 angeordnet ist. Im Beobachtungsbereich ist die Deckfläche des Kanals 10 transparent. Zugleich bildet die Mikroskopeinrichtung 40 eine Positionserfassungseinrichtung, mit der die Partikelposition der Zellen 1, 1A erfassbar ist. Hierzu werden die Passage der Zellen 1, 1A durch den Beobachtungsbereich und die zugehörige Beobachtungs-Zeit erfasst. In Verbindung mit der Strömungsgeschwindigkeit im Kanal 10 und den Segmentlängen ergeben sich die Zeitintervalle, zu denen die Partikel 1, 1A die Elektrodensegmente 22 passieren.

Im Zeitabschnitt zwischen der Beobachtungs-Zeit und dem Erreichen des ersten Elektrodensegments 22 führt die Computereinheit 32 die Analyse der Bilddaten der Mikroskopeinrichtung 40, die Erfassung von Partikeleigenschaften der Zellen 1, 1A, wie z. B. Größe, Form, Co-Lokalisation von fluoreszenzgefärbten Membranproteinen und die Sortierentscheidung aus.

Zur Zellsortierung im Kanal 10 strömen die in der Suspensionsflüssigkeit 2, wie z. B. Zellkulturmedium, Pufferlösung etc., suspendierte Zellen 1, 1A durch den Beobachtungsbereich der Mikroskopeinrichtung 40 zu der Elektrodeneinrichtung 20. Jeder Zelle werden eine Partikeleigenschaft und die Zeitintervalle der Passage an den Elektrodensegmenten 22 zugeordnet. Die Elektrodensegmente 22 werden durch Beaufschlagung mit hochfrequenten elektrischen Spannungen für Aktivierungsdauern gleich den jeweiligen Zeitintervallen der Passage angesteuert. Wird kein Feld an einem Elektrodensegment 22 erzeugt (die Elektrode 21 ist lokal inaktiv), so können die Zellen das Elektrodensegment 22 frei passieren. Wird ein Feld an einem Elektrodensegment 22 erzeugt (die Elektrode 21 ist lokal aktiv), werden die Zellen durch negative Dielektrophorese an der Passage gehindert und entsprechend der Elektrodengeometrie und dem hydrodynamischen Vortrieb auf eine andere Bewegungsbahn gelenkt. Durch die Aufteilung der Elektrode 21 in die Elektrodensegmente 22 mit einem relativ geringen Ablenkwinkel c wird die effektive Erfassungslänge der Elektrode 21 minimiert, so dass auch dicht aufeinanderfolgende Zellen 1, 1A individuell sortiert werden können und korrekt getrennt die Teilkanäle 11, 12 erreichen.

Im Gegensatz zu bisher beschriebenen Verfahren (z.B. [8]) ermöglicht die Nutzung der beschriebenen Sortierfunktion die Verarbeitung von sehr dichten Zellproben. In Kombination mit einer (einfach zu realisierenden) Parallelisierung des Systems kann der gleiche Durchsatz daher mit deutlich niedrigeren Strömungsgeschwindigkeiten erzielt werden, was die optische Bildakquise sowie den Umgang mit potentiell durch die Bildverarbeitung bedingten Totzeiten erleichtert. Zudem entfallen die bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten erforderlichen, aufwändigen mikrofluidischen Steuerelemente, was die Komplexität des Verfahrens weiter reduziert und somit die Kompaktheit, Kosten und Bedienbarkeit des Systems erheblich verbessert.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination oder Unterkombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.