La présente invention a pour objet un procédé pour le dosage fluo- ri étrique des endotoxines (lipopolysaccharides ou lipσpolyosides bactériens) mettant en oeuvra un peptide portant un fluorophore. L'invention concerne également de nouveaux peptides portant un fluorophore utilisables dans ledit procédé et leur méthode de préparation.

Il est connu de doser les endotoxines par mesure de l'élévation de température provoquée chez le lapin (cf. par exemple Pharmacopée Française, IXè édition, 11-235 à 11-238), par mesure du temps de formation d'un gel à partir de lysat d'amébocyte du Liπule (cf. par exemple C00PER, LEVIN, UAGNER, 3. Lab. Cli. Pied, 3uly, 1971, 138-148) et par colorimétrie à l'aide de la p-nitroanilinβ (cf. IUANAGA et al., Haemostasis 7, 183-188, 1978 ; HARADA et al., ^• Progress in clinical and biological research, vol. 29, 1979, 209- 220). Ces méthodes ne sont en général pas quantitatives et d'autre part leur sensibilité est insuffisante pour permettre de détecter de très faibles quantités d'εndotoxines (quantités de l'ordre du picσgramme).

II a également été proposé (cf. le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 4188 264) de déterminer les endotoxines par une méthode fluo- rimétriquβ mettant en oeuvre un substrat peptidiquβ de formule :

R - Gly - Arg - R' (A)

dans laquelle R est un reste d'acide aminé L ou de peptide, dont le groupe amino terminal est protégé par un groupe protecteur, et R' est le reste ^' de la β-naphtylamiπe ou d'un composé hydrcxylé fluo¬ rescent choisi parmi les α- et β-naphtαl, l'indoxyle, le N-méthyl indoxyle, la méthyl-4 umbelliférαne et la résorufiπe. Les substrats peptidiques de formule (A) pour lesquels R' représente le reste

d'un composé hydrαxylé fluorescent présentent l'inconvénient de ^* s'hydrolyser spontanément en solution aqueuse.

Il a maintenant été trouvé, conformément à la présente invention, un procédé de dosage fluorimétrique des endotoxines dans les liquides qui permet de déterminer quantitativement le ^"' s endoto¬ xines avec une sensibilité très élevée. Ce procédé ne présente pas l'inconvénient signalé ci-dessus pour la méthode fluorimé¬ trique mettant en oeuvre les substrats peptidiques de formule (A) pour lesquels R' est le reste d'un composé hydroxylé fluorescent. En outre il présente une sensibilité nettement supérieure à celle de la méthode fluorimétrique mettant en oeuvre les substrats peptidiques de formule (A) pour lesquels R' est le reste de la β-naphtylamine.

Le procédé selon l'invention consiste à mettre en contact, à une température située dans l'intervalle 20°C-40°C, le liquide à analyser avec un lysat d'amébocytes du limule et une solution aqueuse d'un peptide de formule :

T ept-3- /-»

dans laquelle désigne une chaîne peptidique hydrophobe, π est égal à 1, 2, 3, 4 ou 5, 8 est un radical

- NH - C ^* ^ ou - N—R , ., R- et R, désignant des

NH,

atomes d'hydrogène ou des groupes méthyle, - H - ArJ désigne le reste d'une ^* a iné hétéroaromatique fluorescente Ar-NH. contenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi les atomes d'oxygène, de soufre et d'azote, dont le spectre de fluorescence est fortement déplacé par acylatiαn de- l'aminé, et X ® désigne un anion, en

particulier l ¹ anion Cl ^ , à régler si nécessaire le pH du milieu ainsi obtenu à une valeur comprise dans l'intervalle 5-10, et à doser par fluαrimétrie l'a iné hétéroaromatique Ar-NH_ formée.

Dans le procédé selon l'invention, la mise en contact a lieu de préférence à une température située dans l'intervalle 25 ^a C-37°C et le pH du milieu est réglé de préférence à une valeur située dans l'intervalle 6-7,5.

Par aminé hétéroaromatique fluorescente Ar-NH_ dont le spectre de fluorescence est fortement déplacé par acylation de l'aminé on entend, dans le cadre de la présente invention, toute aminé hétéroaromatique primaire dont l'intensité de fluorescence à la longueur d'onde d'émission de ladite aminé libre est au moins 100 fois plus grande que l'intensité de fluorescence, à cette mime longueur d'onde, des composés de formule (I) correspondants. Pour que cette condition soit remplie, il faut en général que la longueur d'onde correspondant au maximum d'émission de l'aminé libre soit déplacée d'au moins 50 πm vers les plus grandes lon- gueurs d'onde par rapport à la longueur d'onde correspondant au maximum d'émission des composés de formule (I) correspondants. Comme aminés hétéroaromatiques fluorescentes Ar-NH_ remplissant • la condition précitée on peut citer par exemple l'amino-7 méthyl-4 coumarine, l'aminσ-7 trifluorométhyl-4 coumariπβ, l'aminα-7 nitro-4 oxa-2 benzodiazole-1 ,3 et plus particulièrement l'amino-3 éthyl-9 carbazole.

Dans la formule (I) ci-dessus, "n" est de préférence égal à 3 et

«_ B est de préférence un groupe -NH - C .

\ H ₂

Le nombre dés chaînons acides aminés de la chaîne peptidique [PεptJ des peptides de formule (I) n'est pas limité. Ce nombre est toutefois égal de préférence à 1 ou 2. Comme exemples de chaîne peptidique hydrαphobβ TPept^j- on peut citer lès chaînes suivantes :

- 4 -

ual - Leu J- se (OBz) ^r- lle - Glu ( - 0CH ₃ )^-

C ^su 3-

10 chaînes dans lesquelles Val désigne le chaînon valine, Leu le chaînon leucine, Ile le chaînon isoleucine, Ser le chaînon s rine, Sβr (OBz) le chaînon serine dans lequel le groupe CH OH est rempla¬ cé par le groupe CH_ - 0 - CH_ - C-Hg, et Glu (y-OCH,) le chaînon acide glutamique dans lequel le groupe COOH en position^est

15 remplacé par le groupe C00CH,.

Dans les exemples de chaîne peptidique hydrophobe ^" Pεptj- ci-dessus, le groupe amino NH du chaînon acide aminé, lorsqu'il n'y a qu'un seul chaînon, et le groupe amino NH- du chaînon acide aminé de

20 gauche, lorsqu'il y a deux-chaînons, peuvent être non substitués ou substitués par un groupe tertiαbutyloxycarbonyle (t Boc), ben- zyloxycarboπyle, benzyle, tαsyle ou acyle, en particulier acétyle ou benzoyle.

25 Le procédé de dosage des endotoxines selon l'invention est basé sur la propriété que possèdent les endotoxines de rendre active une protéase contenue dans le lysat d'amébocytεs du limule (Limulus polyphemus). En l'absence d'endotσxine, la protéase n'agit pas sur les pεptides de formule (I). En présence d'εndotoxine, la protéase

30 réalise l'hydrolyse des peptides de formule (I) avec libération d'une part des peptides de formule :

dans laquelle {_Pep 3* . ⁿ t B et X ^ont les mimes significations que dans la formule (I), et d'autre part de l'aminé hétéroarαma- .tique fluorescente Ar NH_. L'activité de la protéase est stricte¬ ment proportionnelle à la concentration en endotoxinε du milieu. Par suite la concentration du milieu en aminé ArNH_ libérée et l'intensité de fluorescence mesurée à la longueur d'onde d'émis¬ sion de ladite aminé libre sont, à un moment déterminé après la mise en contact du liquide contenant l'endotoxine, du lysat d'amé- bocytes du limule et du peptide de formule (I), strictement prα- portionnelles à la concentration en endotoxine du milieu.

Selon un premier mode de réalisation du procédé selon l'invention, le liquide à analyser, le lysat d'a ébocytes du limule et la solution aqueuse du peptide de formule (I) sont laissés en contact, après réglage éventuel du pH et à la température indiquée précé¬ demment, pendant un temps déterminé fixé à l'avance, qui est de préférence de 10 minutes à 30 minutes, puis on ajoute au milieu un composé qui arrête l'hydrolyse du peptide de formule (I) sans gêner la fluorescence de l'aminé hétéroaromatique Ar-NH_ formée, et on dose l'aminé hétéroaromatique Ar-NH_ formée en mesurant l'intensité de fluorescence à la longueur d'onde d'émission de l'aminé libre _* Comme composés arrêtant l'hydrolyse du peptide de formule' (I) sans gêner la fluorescence de l'aminé hétéroaroma¬ tique Ar-NH_ formée on peut citer la benzamidine, l'ortho-amiπo benzamidine et la para-amino benzamidine.

Selon un deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention, l'intensité de fluores ^c ence è la longueur d'onde d'émission de l'aminé libre est enregistrée en continu dès la mise en contact du liquide à analyser, du lysat d'amébocytes du limule et de la solution aqueuse du peptide de formule (l) et la r glage éventuel du pH, la température' tant maintenue constante à une valeur située dans l'intervalle défini précédemment. Cette deuxième façon d'opé- rar, dite méthode cinétique, permet d'ajuster Sans tâtonnements la durée de l'hydrolyse à la quantité d'endotαxines présente dans l'échantillon à analyser.

- 6

Le procédé selon l'invention permet de doser les endotoxines dans des liquides divers (solutions aqueuses injectables de produits naturels ou de synthèse, solutions de protéines, liquides physiologiques tels que sérum, plasma, urine, etc.). Il est 5 particulièrement sensible puisqu'il permet de détecter des quan- tités d'endotαxine de l'ordre du centième de picogram e. 0e plus il permet une détermination quantitative des endotoxines avec une précision de l'ordre de quelques pour cent, il est rapide et peut être rendu automatique. A titre de comparaison, la méthode 10 basés sur la mesure du temps de formation d'un gel ne permet pas de détecter des quantités d'endotoxine inférieures à 30 pico- grammes, est relativement longue (durée : 1 heure) et n'est .que semi-quantitative.

15 Les peptides de formule (I) pour lesquels n est égal à 3, B est

le reste - NH - C ^ ^m et - rNH - Ar1J est le reste de l'amino-7 méthyl-4 coumarine ou de l'amiπα-7 trifluorométhyl-4

20 coumarine sont des produits connus qui ont été préconisés pour le dosage fluorimétrique de certaines enzymes (cf. les demandes de brevet européen publiées sous les numéros 0000063 et 0018112 et la demande de brevet internationale publiée sous le numéro

25

Les peptides de formule (I) pour lesquels -£NH - ArH est le reste de l'aminα-7 nitro-4 oxa-2 benzodiazole-1,3 ou de l'amino-3 éthyl-9 carbazαle sont des produits nouveaux et font partie en tant que tels de l'invention.

30

De façon générale, les peptides de formule générale (I), et en particulier ceux qui sont nouveaux, peuvent être préparés par action, en présence d'un composé activateur du groupe C00H et d'hydroxy-1 benzαtriazole, de l'aminé hétéroaromatique fluores- 35 cents Ar-NH sur les peptides de formule générale :

^p εptjNH - CH„ - CO - NH (n)

dans laquelle j_Psptτ _> ^π » --• ^e ^ ont les mimes significations que dans la formule (I). Comme composés activateurs ;du groupe COOH utilisables, on peut citer ceux mentionnés par KONIG Iii., GEIGER R., Chem. Ber., .103, (1970), 788-798 et par GROSS E., MEIENHOFER 3. (The peptidεs : Aπalysis, synthesis and biology. I. Major methods of peptide bond formation, Académie Press, 1979, p.435), et en particulier ls dicyclohexylcarbodiimidε.

Les peptides de formule générale (il) sont des produits connus qui peuvent être obtenus par les procédés classiques de synthèse peptidique (cf. KONIG li/., GEIGER R. et GROSS E., MEIENHOFER 0., déjà cités).

Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter.

EXEMPLE 1

Préparation des peptide3 de formule (I) ^'

Une millimole du peptide de formule

(t Boc) Val - Leu3-NH-CH ₂ -C0-NH ( )

^ \

H ₂ N NH,

Θ

dans laquelle Leu désigne le chaînon leueine et (t Boc) Val le chaînon valiπe dans. lequel le groupe amino NH_ est substitué par

^* un groupe tertiobutyloxycarbαnyle, et une millimole d'acide p- toluènesulfoπiquε sont dissoutes dans 2 ml de diméthylformamide redistillé dépourvu d'aminés. A cette solution, refroidie à 0°C e et maintenue sous atmosphère d'azote, on ajoute une millimole d'araino-3 éthyl-9 carbazole, une millimole d'hydroxy-1 benzo- triazole et une millimole de dicyclohexylcarbodiimide. Le mélange réactionnel est maintenu 2 heures à 0°C, puis 18 heures à 25°C. La dicyclohexylurée formée est précipitée en maintenant le mélange à 0°C pendant 24 heures, puis est séparée par filtration ou cen- trifugation. Le diméthylformamide est éliminé par évaporatioπ sous pression réduite. Le résidu obtenu, qui contient, à l'état brut, le peptide portant le fluorophore, est dissous dans un mélange contenant 80 parties en volume de chloroforme, 20 parties en volume de méthanol et 3 parties en volume d'eau, puis est fixé sur une colonne de gel de silice, et on élue avec le mélange ci-dessus. Les fractions contenant le peptide portant le fluoro¬ phore sont évaporées sous pression réduite.

On obtient ainsi, à l'état pur, le peptide de formule

Rt Boc)

La pureté et l'identité du produit obtenu sont prouvées par, entre autres, l'analyse par chro atαgraphie en couche mince et les spectres d'absorption et de fluorescεncε. Contrairement à l'amino-3 éthyl-9 carbazole qui, lorsqu'il est excité à 362 πm, présente une fluorescence très intense (200 unités de fluorescsncε)

OMPI

à 460 n , le peptide de formule (IV), lorsqu'il est excité à 362 nm, ne présente qu'une fluorescence très faible (1 unité de fluorεscsπce) à 460 nm.

EXEMPLES 2 à 4 t

Préparation des peptides de formule (I)

En opérant comme dans l'exemple 1, mais en remplaçant l'amiπo-3 éthyl-9 carbazole par l'amino-7 méthyl-4 coumarine, l'amino-7 trifluorométhyl-4 coumarine ou l'amiπα-7 πitro-4 oxa-2 beπzodia- zole-1,3, on obtient respectivement les peptides de formules (V), (VI) et (VII) ci-après.

t Boc) Val

^OMH

- -

EXEMPLE 5

Application des peptides de formule (I) au dosaoe des endotoxines

On dissout dans l'eau une quantité de peptide de formule (IV) telle que la solution obtenue présentε, en cuve d'épaisseur 1 cm et à la longueur d'αnde de 340 nm, une absorption égale à 0,1.

A 400 μl de cette solution on ajoute 200 μl de lysat d'amébocytes • de limule (lysat pour test Limulus commercialisé par PIALLENKR0DT) et 200 μl du liquide à analyser contenant des endotoxines, liquide dont le pH est ajusté au préalable, si nécessaire, à une valeur comprise entre 6 et 7,5. Le mélange ainsi obtenu est alors traité suivant l'un ou l'autre des modes opératoires a) et b) suivants :

a) Le mélange est maintenu à 25 ^D C (ou 37°C) pendant 30 minutas, puis on ajoute 0,2 ml d'une solution 25 mf de benzamidine dans le diméthylformamide pour arrêter la réaction d'hydrolyse, et on lit, dans l'heure qui suit, l'intensité de fluorescence à la ^* longueur d'onde 460 nm, la longueur d'onde d'excitation étant 362 nm et la solution étant maintenu à température constante (par exemple 25°C) au moment de la lecture.

b) Le mélange est maintenu à 37°C et l'on enrεgistre en continu l'intensité de fluorescence à la longueur d'απde de 460 nm, la longueur d'onde d'excitation étant 362 nm.

Dans les deux cas, l'intensité de fluorescence obtenue est comparée à celle fournie, dans les mêmes.conditions, par un mé¬ lange réactionnel contenant 400 μl de la solution du peptide de formule (IV), 200 μl de lysat d'amébocytes du limule et 200 μl d'une solution étalon d'endotoxine à 50 pg/ml. De la comparaison des résultats on déduit la teneur en eπdαtαxine du liquide à . analyser.

Il est possible d'éliminer l'interférence éventuelle sur le dosage des endotoxines de prσtéases contenues dans le liquide à analyser, en particulier dans le cas où ce liquide est un liquide physiologique, en procédant à l'essai suivant :

Le liquide à analyser, dont le pH est ajusté si nécessaire à 7,0, est porté à l'ébullition à 100°C pendant 10 minutes. Le précipité formé éventuellement est éliminé par centrifugatioπ et la partie surnageante est utilisée pour le dosage des endotoxines suivant la technique décrite précédemment. Si le résultat obtenu est le même que celui obtenu en utilisant le liquide physiologique non traité à 100°C, le résultat obtenu avec le liquide non traité est correct. Si le résultat obtenu avec le liquide traité à 100°C est inférieur à celui obtenu avec le liquide non traité, seul sera retenu le résultat obtenu avec le liquide traité à 100°C.

II est également possible de vérifier l'absence dans le liquida à analyser de protéases ou au contraire de produits inhibant l'hydrolyse du peptide de formule (IV) et de tenir compta dans le cas contraire, lors du dosage des endotoxines, de la présence de ces protéases ou produits dans l'échantillon à analyser en opérant comme suit :

On prépare les solutions A, B, C, D dont la composition est indiquée dans le tableau ci-après.

Les solutions A, B, C, D sont ensuite traitées suivant l'un ou l'autre des modes opératoires a) et b) précédemment définis. L'essai avec la solution A permet de déceler la présence éven¬ tuelle de protéases dans l'échantillon à analyser et de tenir compte de cette présence lors du dosage des endotoxines dans l'échantillon (essai avec la solution D). L'essai avec la solu¬ tion C, qui contient un étalon interne, permet, par comparaison avec les essais relatifs aux solutions B et D, de déceler la pré¬ sence éventuelle dans l'échantillon à analyser de produits inhi¬ bant l'hydrolyse du peptide de formule (IV) et de tenir compte de cette présence lors du dosage des endotoxines.

EXEMPLES 6 à 8

Application des peptidεs de formule (I) - au dosage des endotoxines

_*

On opère comme à l'exemple 5 an remplaçant au départ le peptide de formule (IV) par l'un des peptides de formules (V), (VI), (VII), La longueur d'onde d'excitation et la longuεur d'onde à laquelle s'effectue la mesure de l'intensité de fluorescence, longueur d'onde qui est la longueur d'onde d'émission de l'amin _é libre,

sont alors les suivantes

^• OM